Summary
Sanntidsanalyse av levende vev gir viktige funksjonelle og mekanistiske data. Denne rapporten beskriver protokollene og kritiske variabler for å sikre nøyaktig og reproduserbar generering av data ved hjelp av et nytt og pumpefritt flerkanals fluidikksystem som vedlikeholder og vurderer et bredt spekter av vevs- og cellemodeller.
Abstract
Mange in vitro-modeller som brukes til å undersøke vevsfunksjon og cellebiologi krever en strøm av medier for å gi tilstrekkelig oksygenering og optimale celleforhold som kreves for å opprettholde funksjon og levedyktighet. For dette formål har vi utviklet et flerkanals strømningskultursystem for å opprettholde vev og celler i kultur og kontinuerlig vurdere funksjon og levedyktighet ved enten inline-sensorer og/eller innsamling av utstrømningsfraksjoner. Systemet kombinerer 8-kanals, kontinuerlig optisk sensing av oksygenforbruk med en innebygd fraksjonskollektor for samtidig å måle produksjonshastigheter av metabolitter og hormonsekresjon. Selv om det er i stand til å opprettholde og vurdere et bredt spekter av vevs- og cellemodeller, inkludert øyer, muskler og hypothalamus, beskriver vi her driftsprinsippene og de eksperimentelle preparatene / protokollene som vi har brukt til å undersøke bioenergetisk regulering av isolert musenetthinne, mus retinal pigmentepitel (RPE) -choroid-sclera, og dyrkede humane RPE-celler. Innovasjoner i utformingen av systemet, for eksempel pumpeløs væskestrøm, har produsert en sterkt forenklet drift av et flerkanals strømningssystem. Det vises videoer og bilder som illustrerer hvordan man monterer, klargjør instrumentet for et eksperiment og laster de forskjellige vevs-/cellemodellene inn i perifusjonskamrene. I tillegg er retningslinjer for valg av betingelser for protokoll- og vevsspesifikke eksperimenter avgrenset og diskutert, inkludert innstilling av riktig strømningshastighet til vevsforhold for å oppnå konsistente og stabile kulturforhold og nøyaktige bestemmelser av forbruk og produksjonshastigheter. Kombinasjonen av optimalt vevsvedlikehold og sanntidsvurdering av flere parametere gir svært informative datasett som vil ha stor nytte for forskning i øyets fysiologi og legemiddelforskning for behandling av nedsatt syn.
Introduction
Perifusjonssystemer har en lang historie innen biovitenskap. Spesielt for studiet av sekretorisk funksjon av øyer, har de blitt brukt til å karakterisere kinetikken til insulinsekresjon som respons på sekretagoger1. I tillegg til å samle utstrømningsfraksjoner for påfølgende analyse av hormoner og metabolitter, har sanntidssensorer blitt innlemmet, hovedsakelig for påvisning av oksygenforbruk 2,3,4. Utbredt innsats for å bedre forstå mekanismer som medierer øyesykdommer har vært begrenset av mangel på fysiologisk relevante metoder for å vurdere metabolsk regulering og dysregulering av de forskjellige isolerte komponentene i øyet, inkludert retina, retinal pigmentepitel (RPE) -choroid-sclera og dyrkede RPE-celler. Statiske systemer designet for dyrkede celler er tilpasset vev5, men vev krever strømning for tilstrekkelig oksygenering. Strømningssystemer har lykkes med nøyaktig og reproduserbar måling av sanntidsresponser i oksygenforbrukshastighet (OCR) av retina og RPE-choroid-sclera, og vevene forblir metabolsk stabile i mer enn 8 timer, noe som tillater svært informative protokoller som involverer flere testforbindelser 4,6,7,8,9 . Ikke desto mindre har driften av fluidikksystemer historisk krevd et skreddersydd apparat og utdannet teknisk personale i ikke-standardiserte metoder. Slike systemer er ikke tatt i bruk som standardmetodikk i de fleste laboratorier. BaroFuse er et nyutviklet fluidikksystem som ikke er avhengig av pumper, men heller på gasstrykk for å drive strømning gjennom flere kanaler og vevskamre (figur 1). Hver kanal overvåkes kontinuerlig for OCR, og utstrømningen samles med en platebasert fraksjonssamler for påfølgende analyse av innhold. Det er viktig at vevsperifusjonskamrene for instrumentet er utformet for å imøtekomme vev av forskjellige geometrier og størrelser.
Hjertet i instrumentet er fluidikksystemet, hvor strømmen drives fra et forseglet, trykksatt reservoar gjennom slanger med liten indre diameter (ID) (som bidrar til den mest signifikante strømningsmotstanden i væskekretsen) opp i glassvevskamrene som huser vevet. Trykk til mediereservoarmodulen (MRM) leveres av lavtrykks- og høytrykksregulatorer koblet til en gassflaske som inneholder en blanding av gasser (typisk 21%O2, 5% CO 2, balanse N2), og reservoaret er forseglet fra toppen av perifusjonskammermodulen (PCM) som holder vevskammerenhetene (TCA). Strømningshastigheten styres av lengden og ID-en til motstandsrørene og trykkinnstillingen til en lavtrykksregulator. Utstrømningsrør koblet til toppen av vevskamre leverer væske til enten en avfallsbeholder (som kontinuerlig veies for automatisk bestemmelse av strømningshastighet) eller inn i brønner på en 96-brønnsplate kontrollert av fraksjonssamleren. O 2-deteksjonssystemet måler levetiden til et O2-følsomt fargestoff malt på innsiden av hvert av glassvevkamrene nedstrøms for vevet. Denne informasjonen brukes deretter til å beregne OCR kontinuerlig. Hele fluidikksystemet ligger i et temperaturkontrollert kabinett, og bensintanken, fraksjonskollektoren og datamaskinen er hovedkomponentene i instrumentet (figur 2A). Til slutt tjener programvare som kjører instrumentet til å kontrollere driften (inkludert forberedelse og timing av injiserte testforbindelser, strømningsmålesystem og fraksjonskollektortiming), samt behandling og grafer av OCR-dataene og andre supplerende målinger.
I denne artikkelen beskriver vi protokollene for bruk av fluidikksystemet til å perifisere og vurdere OCR- og laktatproduksjonshastighet (LPR) for ulike isolerte komponenter i øyet. LPR er en parameter som reflekterer glykolytisk hastighet som er svært komplementær til OCR, hvor paret står for de to hovedgrenene av energiproduksjon fra karbohydrater i cellen10. Siden klargjøring av vevet og lasting av det i vevskamrene læres best ved å se på prosedyren, vil videoen bidra til å illustrere flere av de kritiske trinnene som utføres under oppsett og drift som ikke lett kan formidles med tekst alene.
Beskrivelsen av protokollen er delt opp i 8 seksjoner som tilsvarer ulike faser av eksperimentet (figur 2B): 1. pre-eksperimentell forberedelse; 2. forberedelse / likevekt av perifusatet; 3. instrument satt opp; 4. vev likevekt; 5. eksperimentell protokoll; 6. instrument bryte ned; 7. Databehandling; og 8. analyser av utstrømningsfraksjoner.
Protocol
Alle prosedyrer for høsting av vev fra rotter og mus ble godkjent av University of Washington Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Pre-eksperimentell forberedelse
MERK: Følgende oppgaver fullføres minst en dag før eksperimentet.
- Utforme den eksperimentelle protokollen
- Tildeling av vevsplassering i kanaler: Velg vev eller cellemodell som skal plasseres i 3 av de 4 kanalene på hver side av MRM. Ett vevskammer på hver side kjøres uten vev som skal brukes til baseline korreksjon.
- Ordne prøvene ved hjelp av en av de to typiske designene - forskjellige testforbindelsesprotokoller på hver side (f.eks. kanaler på den ene siden av MRM mottar testforbindelser mens kanalene på den andre siden fungerer som en kontroll); samme test sammensatte injeksjonsprotokoll på begge sider av MRM, men forskjellige vev eller vevsmodell versus kontroll på hver side av MRM.
- Valg av strømningshastighet og vevsmengde for optimal OCR-måling: Juster strømningshastigheten til endringen i levetidsforholdet ganger 100 er ca. 3.
MERK: Typiske mengder vev og tilsvarende strømningshastigheter er vist i tabell 1 for øyekomponenter, der instrumentet fungerer best ved strømningshastigheter mellom 6-80 μL/min/kanal. - Beregning av nødvendig medie-/buffervolum: Beregn volumet av medier som skal legges til hver MRM-innsats i begynnelsen av eksperimentet som
VolumMRM = 30 ml + protokollvarighet (min) x strømningshastighet (i ml/min) x 4 kanaler (Eq.1)
For eksempel, ved 0,01 ml / min, vil en 60 ml startvolum MRM tillate en 12,5 timers protokoll (hvor 30 ml vil være oppbrukt, mens 30 ml vil være igjen), mens ved 0,04 ml / min, 90 ml startervolum MRM vil tillate en 6 timers protokoll (med 30 ml gjenstående). - Injeksjonsprotokoll for testforbindelser: Velg testforbindelser som skal vurderes, konsentrasjonen som skal testes (vanligvis valgt for å gi nær maksimal respons eller som konsentrasjonsavhengigheter) og varigheten av eksponeringen. Vurder løselighet og utgjør lagre i ønsket løsningsmiddel som vann, DMSO eller etanol.
- Velg tidspunkt for injeksjoner og påfølgende injeksjoner slik at responsen når en jevn tilstand før du legger til et påfølgende middel. Når du gjentar protokoller, må du tilpasse tidspunktet for injeksjoner slik at flere tidsforløp kan gjennomsnittliggjøres.
MERK: Forbindelsene som brukes her er fra en tidligere mitokondriell (Mito) stresstest 11 , og både oligomycin og karbonylcyanid 4- (trifluormetoksy)fenylhydrazon (FCCP) krever DMSO både i stamløsningene, så vel som det endelige perifusatet. - Prøvetakingstider for utstrømning: Velg ønsket fraksjonsintervall (fra 1-60 min/prøve), der raskere prøvetakingshastigheter velges for raske endringer, og lengre tidsintervaller velges når steady state nærmer seg. Bruk tilstrekkelige brønnvolumer (0,3 til 1,5 ml) for å unngå overløp under prøvetakingsintervallet (velg volum som er større enn strømningshastighet x tidsintervallet).
MERK: Prøvetakingstider vil variere med valg av protokoll, men for en Mito-stresstest har vi ofte brukt 5 minutters intervaller under baseline og 15 minutters intervaller under injeksjonene (-15, -10, -5, 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, hvor hver gang er starten på prøvetakingsintervallet). - Angi de valgte verdiene for testforbindelser og brøksamling beskrevet ovenfor i brukergrensesnittet (UI), som genererer grafiske representasjoner av denne informasjonen. Eksportere og formidle filer for gruppeevaluering og diskusjoner (tilleggsfigur 1).
- Sett ut tilbehør og forbruksdeler
- Angi utstyret som leveres og er ferdigpakket aseptisk av produsenten, som inkluderer: TCA (pakning med 8), utløpsslangeenheter (pakning med 8 tuber), testsammensatt injeksjonsslange (2), tang, slangeklemmer (3), MRM, MRM-innsatser (2), rørestenger (2) og spyleslangeenhet (plassert i et biologisk sikkerhetsskap).
- Ikke bruk engangsdeler som kommer i kontakt med væske, da dette vil føre til en økning i eksperimentell feil. Gjenbruk tangen og rørestengene ved å rengjøre og autoklavere dem mellom eksperimentene.
2. Tilberedning og likevekt av perifusat (Tid: 30 min ikke inkludert inkubasjonstid)
- Forbered mediet eller Krebs-Ringer bikarbonatbuffer (KRB) dagen før basert på beregninger fra ligning 1, typisk 200 ml, og inkuber deretter over natten i en 39 ° C / 5% CO2 -inkubator i T225 vevskulturflasker med ikke mer enn 90 ml i hver kolbe.
- Hvis du bruker kommersielt tilberedt KRB eller media (oppvarmet til romtemperatur), må du forberede perifusatet om morgenen av forsøket og plassere i 5% CO2 -inkubatoren i minst 1 time. Forbered alle oppløsninger aseptisk.
MERK: Alle væsker og deler av fluidics-systemet som kommer i kontakt med væske er sterile i begynnelsen av eksperimentet. Montering av systemet og lasting av vevet utføres imidlertid åpen for luften.
3. Likevekt av temperatur og oppløst gass for å sette opp instrumentet (Tid: 75 min)
- Festing av røraggregater til MRM
- Plasser MRM og en fluidics-pakke på benken ved siden av instrumentet. Forsikre deg om at slangeklemmer (3), rørebjelker (2) og tang allerede er på verktøybrettet.
- Plasser en ubrukt MRM-innsats med en rørestang på hver side av MRM (se figur 3).
- Fest TCA til injeksjonsporter i begge ender av MRM slik at enden av slangen er plassert rett over rørestangen. Forsikre deg om at den lengste av de to testsammensatte injeksjonsenhetene er på baksiden av MRM.
- Deretter fester du tilførselsledningen for gass og spyleslangen til henholdsvis de ledige portene bak og foran (se figur 4A).
- Plassering av MRM/røraggregater i kabinettet
- Plasser MRM (med slangeaggregatene festet) inn i MRM-varmeren (figur 4B).
- Plasser de fire røraggregatene i sporene på veggene i bunnen av kabinettet (to på hver side) slik at de vil stikke gjennom til utsiden av kabinettet når midtkabinettet er satt på plass.
- Fest MRM mellom klemmene ved å stramme de to hjulene på detektorstativet.
- Før den lengre testforbindelsen som stikker ut fra baksiden av kabinettet gjennom de to rørføringene på siden av kabinettet, slik at åpningen av rørene vender fremover (figur 4C).
- Klem hver av de lukkede testsammensatte injeksjonsenhetene.
- Montering av kabinettet og aktivering av temperaturregulatorene
- Bytt grenuttaket som leverer strøm til alle elektriske apparater i kabinettet til PÅ-posisjon. Viften på detektorstativet slås PÅ og MRM-temperaturregulatoren skal lyse og vise en innstilt verdi på 38 °C (figur 5).
- Slå PÅ omrørerne til 70 o / min ved hjelp av brukergrensesnittet for å sikre at rørestengene roterer jevnt. Når riktig omrøring er observert, slå av omrørerne.
- Plasser den midterste delen av kabinettet på toppen av basen.
- Koble kabelen på den midtre delen av kabinettet til kabelen fra den elektriske boksen for å koble strøm til omgivelsestemperaturregulatorens spakbryter og levere strøm til omgivelsestemperaturvarmeren.
- Plasser lokket på kabinettet, og displayet til den øvre temperaturregulatoren (omgivelsestemperaturregulatoren) vil lyse og lese 36 °C. Start en timer i 30 min, tiden det tar for MRM-varmeren å nå innstilt temperatur.
- Sette inn TCA i PCM
- Bruk TCA-innsettingsverktøyet til å sette hver av de 8 TCA-ene inn i PCM-hullene ved å trykke bestemt på adapteren med innføringsverktøyets forside til toppen av slangehylsen viklet rundt vevkammeret berører overflaten som omkranser hullene i PCM.
- Sett inn én TKF helt før du setter inn neste. Sett den delvis monterte PCM til side ved siden av PCM-støtten og 6 skruer.
MERK: Ufullstendig innsetting av en TCA vil forhindre at hodeplassen når trykksettpunktet, og perifusat vil ikke strømme.
- Fylling av de to innleggene i MRM med pre-likevekts perifusat
- For å gjøre dette, 30 minutter etter at kapslingen ble montert og MRM har nådd temperatur, overfør det forhåndslikevektede perifusatet til den forvarmede MRM-innsatsen ved forsiktig å dispensere væsken ned på sidene ved hjelp av en 50 ml pipette.
MERK: Disse trinnene, så vel som de i avsnitt 3.6, bør utføres umiddelbart for å unngå overføring av gass mellom perifusatet i MRM og atmosfæren.
- For å gjøre dette, 30 minutter etter at kapslingen ble montert og MRM har nådd temperatur, overfør det forhåndslikevektede perifusatet til den forvarmede MRM-innsatsen ved forsiktig å dispensere væsken ned på sidene ved hjelp av en 50 ml pipette.
- Montering av MRM/PCM for å skape en gasstett forsegling og posisjonering av O 2-detektoren
- Plasser PCM på MRM ved å sette motstandsrørene til TCAene som kommer fra bunnen av PCM inn i MRM-innsatsene, 4 på hver side av MRM-skillelinjen. Orienter PCM slik at vevskamrene kan hvile mot O 2-detektoren når den er plassert.
- Fest PCM og PCM Support Brace med de 6 skruene ved hjelp av den elektriske skrutrekkeren.
- Fest TCA-ene i PCM-støttefinnene med det elastiske båndet som følger med ved å strekke det rundt finnene på PCM på gummipakningsnivået (figur 6).
- Plasser O 2-detektoren på detektorstativet slik at ansiktet på den hviler mot finnene på PCM. Kontroller at LED/fotodetektorparene er på linje med detO2-følsomme fargestoffet i vevskamrene. Juster om nødvendig O 2-detektorens sideføringer etter å ha løsnet settskruene på siden av O2-detektorholderen.
- Plasser lokket på toppen av kabinettet.
- Likevekter gassen i hoderommet i MRM med perifusatet
- Når høytrykksventilen er helt sikret og lukket, åpner du bensintankventilen ved å vri sylinderventilen på toppen av tanken mot klokken.
- Juster høytrykksregulatoren til et trykk på 10 psi ved hjelp av knappen på regulatoren.
- Trykk MRM ved å sette lavtrykksregulatoren til 1,0 psi (figur 7A).
- Løsne spylerøret (figur 7B) slik at gassen fra tanken erstatter luften i MRM-headspace (testforbindelsesinjektorene forblir fastspent) i 15 minutter. Bekreft gasstrømmen ved å senke enden av spylerøret i et beger med vann for å observere boblende.
- Når strømningen er bekreftet, starter du O 2-detektoren som beskrevet nedenfor i avsnitt 3.8.
- Etter 15 min, slå på omrøreren ved 70 o / min og la den løpe resten av eksperimentet. Etter ytterligere 15 minutter klemmer du på spyleslangen (figur 7C).
- Senk trykket på lavtrykksregulatoren til driftstrykket som oppnår ønsket væskestrømningshastighet (som spesifisert av eksperimentell pakke - vanligvis mellom ca. 0,5-0,7 psi). Hvis strømningshastigheten er over 20 μL/min, må du midlertidig stille trykket til 0,3 psi for å gi tid til å belaste vevet uten at kamrene overfylles. Dette er ikke nødvendig hvis vevet lastes innen 15 minutter etter at klemmen er plassert.
MERK: Ikke la bufferen renne ned på utsiden av vevkammeret, siden væsken kan forstyrreO2-sensing .
- Starte O 2-detektoren
- Aktiver O 2-detektorprogramvaren på den bærbare datamaskinen ved å klikke på ikonet merket oksygendetektor.
- Når programmet åpnes (tilleggsfigur 2), bekrefter du at riktig COM-port er valgt. Om nødvendig kan COM-porten identifiseres ved å koble O 2-detektoren fra datamaskinen slik at portnummeret vises. Hvis COM-porten kobles fra mens programmet kjører, må programmet lukkes og åpnes på nytt før bruk.
- Klikk Start og deretter Record (og lagre dataene i sikkerhetskopimappen). Deretter klikker du på Graf.
- Endre gjennomsnittsverdien nederst til venstre i levetidsgrafen til 5 (som instruerer programmet om å beregne et glidende gjennomsnitt med 5 påfølgende poeng). Når det har gått et minutt og det første datapunktet vises på skjermbildet for grafer, klikker du på Autoskalering.
4. Vevsbelastning og likevektsperiode (Tid: 90 min)
- Plassering av frits i vevskamrene
- Fjern lokket og midtseksjonene av kabinettet.
- Etter at perifusatet i vevskamrene har steget over toppen av den forhåndsplasserte friten, skyv friten ned med fritsignalet ved å banke lett på toppen av friten for å fjerne eventuelle luftbobler som dannet seg under eller i friten.
- Posisjon frits ca 0,25 tommer over bunnen av vev kammeret.
- Laster vev inn i vevskamrene
- Når medienivået er 0,5 tommer fra toppen, legger du vevet inn i kammeret.
- Laster retina eller RPE-choroid-sclera: Harvest Retina eller RPE-choroid-sclera som beskrevet i 6. For å laste vevet, bruk finpunkttang for å forsiktig plassere vevet i hvert kammer, vær forsiktig så du ikke bretter vevet, mens du bruker en vevsserviett for å forhindre at væske fra vevkammeret drypper på O2-sensoren . Observer vev som synker mot og på friten.
MERK: Mellom tidspunktet for høsting av vevet og lasting av vev i kamrene, må du sørge for at traumer til vevet unngås ved ikke å forlate vevet i en bikarbonatbasert buffer / media ut av inkubatoren i mer enn 10 minutter og sikre at vevet er badet i nok buffer / media (minst 1 ml / 10 mg vev) for å holde vevet fra å bli hypoksisk og forhindre eksponering for luft. - Lasting av RPE-celler på transbrønnmembraner: Forbered RPE-celler som beskrevet tidligere 12 og i tilleggsfil 1. Passasjeceller med 0,25 % trypsin-EDTA og frø på polyetylentereftalat, sporetsede filtre (cellekulturinnsatser, porestørrelse 0,4 mm) med minimum 2,0 x 105 celler/cm2. På forsøksdagen kuttes membranene i tre strimler med lik bredde og belastning med tang i vevskamrene (se figur 8A).
- Feste utstrømningsrøraggregatene til vevskamre
- Fjern utløpsrørsenhetene fra emballasjen og plasser utløpsrørseparatoren på leppen på den midtre delen av kabinettet slik at utløpsslangeadapterne er på innsiden av kabinettet (figur 8B, C).
- Vær forsiktig så du ikke presser for hardt på TCA (ellers vil de løsne fra MRM), fest utstrømningsslangeadapterne på toppen av vevskamrene TCA (figur 8D). Sett på plass midten av kabinettet og koble til kontrollkabelen for omgivelsestemperatur igjen.
- Før du setter på lokket på kabinettet, må du bekrefte at komponentene i fluidikksystemet inne i kabinettet, inkludert O 2-detektoren, PCM, vevskamre, utstrømningsrør, MRM og varmeapparat, alle er riktig plassert som vist i figur 8E.
- Sett lokket på kabinettet på nytt. Før de åtte utstrømningsrørene gjennom fraksjonskollektorstyrearmen.
- Aktivere fraksjonssamleren
- Forsikre deg om at fraksjonskollektoren er sentrert i forhold til høyre vegg i kabinettet og utstrømningsrørholderen: Den venstre støtten til fraksjonskollektorbasen skal hvile mot kanten av kapslingsveggen.
- På den bærbare datamaskinen klikker du på UI-snarveien, og siden for eksperimentell informasjon åpnes (tilleggsfigur 3 øverst).
- Fyll ut informasjonen i de aktuelle boksene på siden med eksperimentell informasjon (dette kan gjøres før eksperimentet starter), og klikk deretter siden Flyt og brøkinnsamling øverst (tilleggsfigur 3 nederst).
- Angi parametere for automatisk strømningshastighetsmåling
- Velg ønsket integreringstidspunkt i rullegardinmenyen for prøveanskaffelsestid øverst til midten som balanserer ønsket nøyaktighet (som er proporsjonal med integreringstiden) og den tidsmessige oppløsningen.
- Hvis ingen utstrømningsfraksjoner samles inn i eksperimentet, klikker du på Start og går til seksjon 4.7. Hvis utstrømningsfraksjoner skal samles inn, utfør deretter trinnene i avsnitt 4.6.
- Oppsamling av utstrømningsfraksjoner
- I UI-programvaren, sjekk Samle fraksjoner? -boksen på siden med eksperimentinformasjon eller innsamlingssiden for flyt og brøk. Klikk deretter på Compute FC Settings-knappen .
- Når det nye vinduet åpnes, fyller du ut tidspunktet for den første injeksjonen i protokollen (definert som tid = 0) og strømningshastigheten per kanal, samt tidsintervallene for hver prøve. Klikk deretter Beregn.
- Når intervallene for samlingen er bekreftet, klikker du på Generer og Start.
- Måle strømningshastigheter for individuelle kanaler (valgfritt)
- Hvis strømningshastigheter for individuelle kanaler skal måles (som under normale forhold varierer med bare noen få prosent), veier åtte (eller mindre) mikrosentrifugerør og registrerer vekten.
- Sett rørholderen som inneholder de forhåndsveide mikrosentrifugerørene på platevognen. Klikk på Mål strømningshastighet manuelt i delen andre verktøy.
- Velg målvarigheten, og klikk deretter Generer mal. Lukk vinduet og klikk Start. Fraksjonssamleren vil samle væske fra utstrømningsrørene i målevarigheten, og deretter vil armen gå tilbake til sin hjemmeposisjon.
- Vei mikrofugerørene etter oppsamling og bruk forskjellen i vekt delt på målevarigheten for å beregne strømningshastigheten (hvor 1 mg = 1 μL).
- Stabilisering ved baseline
- Når vevet og/eller cellene er lastet inn i vevskamrene, la systemet balansere i 90 minutter for å etablere en flat baseline avO2-forbruk , da den første testforbindelsen kan injiseres (anses å være tid = 0).
- Ved 30 minutter før den første injeksjonen, skriv inn gjennomsnittlig siste 3 FR per kanalverdi på injeksjonssiden for å forberede testsammensatte injeksjoner.
5. Eksperimentell protokoll (Tid: 2-6 timer)
MERK: Når baseline stabilisering er i gang, er de neste oppgavene å injisere testforbindelsene og bytte plater på fraksjonskollektoren hvis mer enn en skal brukes.
- Forbereder testforbindelse injektere
- Skriv inn navnene på forbindelsene, ønskede konsentrasjoner (endelige løsninger og stamløsninger) og injeksjonstider for testforbindelsene i tabellen i brukergrensesnittet på injeksjonssiden. Bekreft informasjonen som vises i programmet, inkludert volum i MRM som var igjen på injeksjonstidspunktet og hvor mye stamoppløsning som skal injiseres for å oppnå de ønskede konsentrasjonene (tilleggsfigur 4).
- For å beregne hvor mye perifusat og lager som trengs for injeksjonen, fyll ut de hvite boksene i injeksjonstabellen og klikk på Beregn. Bruk de beregnede verdiene til å fortynne stamoppløsningen med perifusat før injeksjon slik at injisert volum er 5 % av volumet i MRM etter injeksjon.
- Forbered hver testforbindelse ved å blande stamløsningen og perifusatet. Legg sprøytene i minst 10 minutter før injeksjonstiden og oppbevar i en CO2 -inkubator (opprettholdes ved temperaturer mellom 37-40 °C) til de er klare til å injiseres.
- Injisere testforbindelser
- Koble sprøyten med testforbindelsen til injeksjonsslangene (figur 9A). Løsne de mykveggede harmedede slangene som fører til injeksjonsslangen, og injiser testforbindelsene langsomt (figur 9B) med en hastighet på ca. 3 ml/min. Fest slangen på injeksjonsslangen igjen og fjern deretter sprøyten (figur 9C); gjenta for den andre siden av MRM.
- Etter å ha injisert hver testforbindelse, klargjør du hver påfølgende testforbindelse som skal injiseres i henhold til UI-injeksjonssiden.
- Bestemme tilstrømning O2-signal for hver kanal
- På slutten av hvert eksperiment injiserer du respirasjonshemmeren KBBC (3 mM) for å bestemme signalet for innstrømningslevetid for hver kanal, som brukes til å korrigere for variasjonen i baseline sensorens levetid og ikke-mitokondrielt oksygenforbruk.
6. Avslutte eksperimentet og bryte ned systemet (Tid: 30 min)
- Lagre oksygendata
- Klikk på Lagre-knappen øverst til venstre i grafvinduet på oksygendetektorprogramvaren; Navngi filen og lagre den i mappen der filen skal oppbevares. Klikk på Stop Recording -knappen i hovedvinduet for å lagre sikkerhetskopifilen.
- Lagre den eksperimentelle informasjonsfilen for brukergrensesnittet
- Klikk på Lagre profil-knappen øverst til venstre på brukergrensesnittets generelle side; Navngi filen og lagre den i mappen der filen skal oppbevares. På brøkdelen og flytsiden i brukergrensesnittet klikker du på rullegardinmenyen Verktøy og deretter Lagre. Behold det genererte navnet eller velg et annet og lagre filen der du ønsker. Om nødvendig er det sikkerhetskopifiler som kan nås og lagres.
- Bryte ned instrumentet
- Siden KBBC er flyktig, kast væskeenheter i en avtrekkshette; hell medier fra MRM og FC avfallsbrett i en avfallsbeholder, og skyll MRM-innsatsene og rørestengene grundig med vann. Hell innholdet i avfallsbeholderen (som inneholder KBBC) i en merket kjemisk avfallsbeholder for senere avhending ved kjemisk sikkerhet. Før neste eksperiment, rengjør og autoklav rørestengene og tangene grundig.
7. Databehandling (Tid: 15-45 min)
- Åpne dataprosessorprogrammet på en Mac- eller PC-datamaskin. Velg den .csv datafilen som genereres av et eksperiment. Hvis protokollen for dette eksperimentet ligner på et tidligere analysert eksperiment, velger du innstillingsfilen og klikker på Neste trinn. Ellers klikker du bare på Neste trinn for å begynne å angi innstillingene for eksperimentet.
- Fyll ut de ulike innstillingene for eksperimentet. Ved fastsettelse av referansetidspunkt velger du tidspunktet rett før Kommunalbanken trådte i kraft og levetidsverdiene ble redusert. Velg dette punktet ved hjelp av en glidebryter eller ved å skrive inn tidsverdien i boksen.
- Klikk Beregn for å generere OCR-grafer i henhold til ligning 2:
OCR = ([O 2]in- [O 2]ut) x FR = (217 nmol/ml - [O 2]ut) x FR/vevsbasis (Eq. 2)
hvor O 2 konsentrasjon i KRB når i likevekt med 21% O2 ved 37 ° C er 217 nmol / ml, FR er strømningshastigheten (i ml / min), vevsbasis er mengden vev lastet inn i kammeret (dvs. antall retinas, RPE-choroid-sclera eller RPE-celler). - Lagre grafene som .pdf filer ved å trykke på Eksporter graf-knappen . Tegn OCR som absolutte verdier eller som en brøkdel av en stabil tilstandsverdi ved å merke av i boksene som tilsvarer testforbindelsen som skal settes til 1 på siden for redigeringsinnstillinger.
8. Analyser av utstrømningsfraksjoner
- Hvis prøvene ikke kan analyseres umiddelbart etter forsøket, plasser platene ved 4 ° C hvis de analyseres neste dag, eller frosset hvis de lagres lenger. Hvis platene er frosset, tine prøvene ved 4 °C (slik at prøvene forblir kalde).
- Når analysene er utført på de valgte utstrømningsfraksjonene, legges datakolonnene (en per kanal) inn i en .csv-fil med tid (i min) i kolonnen lengst til venstre og konsentrasjon til høyre (i enten nmol/ml eller ng/ml); En lenke i databehandlingsprogrammet når du trykker på den, laster opp en mal.
- Last opp denne filen til databehandleren for å beregne og plotte dataene.
Representative Results
For å illustrere oppløsningen av dataene generert fra isolerte komponenter i øyet, ble OCR og LPR målt med tre typer vev (retina, RPE-choroid-sclera og RPE-celler) etter en vanlig protokoll (mitokondriell stresstest10; Figur 10, figur 11 og figur 12). Mengden vev som brukes for hvert vev er vist i tabell 1. Data ble behandlet og grafet ved hjelp av programvarepakken som ble utviklet for fluidics-systemet. Fremstillingen av retina og RPE-choroid-sclera er relativt rett frem og tar mindre enn 20 minutter for hver vevstype. OCR var konstant i løpet av tiden testforbindelsene ble injisert, noe som indikerer stabil helse og funksjon av vevet og støtter metodens validitet (figur 10). Når det er validert for hver vevstype, har vi ikke funnet det nødvendig å kjøre kontroller der ingen testforbindelser injiseres for hvert eksperiment. I samsvar med data oppnådd ved bruk av mer konvensjonelle perifusjonsmetoder 6,8,13, reduserte OCR responsen på oligomycin og økte OCR som respons på FCCP. Endringer i LPR var i motsatt retning av de som ble observert for OCR: oligomycin økte LPR, som deretter reduserte (men bare litt) som respons på FCCP (figur 11). For å sammenligne den statistiske signifikansen av effekten av hver sekvensielle testforbindelse, ble t-tester utført (som beregnes automatisk av programvaren som følger med instrumentet). Siden målet med papiret var å beskrive hvordan man utfører metoden, var antall replikater som ble båret ikke alltid høyt nok til å produsere statistisk signifikans. Generelt, når antall replikater var 3 eller mer, var effekten av FCCP og oligomycin på både OCR og LPR signifikant.
RPE-celler har ikke tidligere blitt analysert med strømningssystemer, men reagerte på samme måte som RPE-choroid-sclera (i samsvar med oppfatningen om at en stor del av OCR skyldes RPE-celler; Figur 11). Disse illustrerende eksemplene fremhever systemets evne til å opprettholde vevets levedyktighet som reflektert av stabiliteten til OCR i kontrollkanalene, og det høye signal-støyforholdet for endringer i OCR av størrelsen indusert av oligomycin og FCCP, som var mer enn 100 til 1. I tillegg kan analyser av utstrømningsfraksjoner brukes til å korrelere opptakshastigheten eller produksjonen av et bredt spekter av forbindelser som utveksler med det ekstracellulære væsken, er komplementære til OCR (i dette tilfellet LPR). Disse egenskapene til instrumentet tillot nøyaktig kvantifisering av karakteristiske forskjeller i vevsresponser mellom vevstyper utført parallelt. OCR fra RPE-choroid-sclera og RPE-celler er konsekvent mer følsomme for oligomycin enn retina (figur 11 og figur 12), men for RPE-choroid-sclera var varigheten av eksponeringen for FCCP ikke lang nok til å nå steady state. Et poeng å vurdere oppsto ved bruk av DMSO som løsningsmiddel. Ved høyere konsentrasjoner (0,2 %) hadde DMSO en forbigående effekt på OCR fra netthinnen (noe som antagelig reflekterer en effekt av en endring i osmotisk trykk forårsaket av DMSOs effekt på membranpermeabilitet).
Basert på antagelsen om at KBBC fullstendig hemmer respirasjonen ved sin direkte virkning på cytokrom c-oksidase, er OCR ved slutten av KBBC-eksponeringen satt til 0 og alle OCR-verdier beregnes basert på endringen i forhold til KCN-verdien. OCR kan oppstå uavhengig av respirasjonskjeden og cytokrom c-oksidase. Imidlertid er størrelsen på dette bidraget til total OCR generelt ikke mer enn noen få prosent (data ikke vist), og den utvidede tiden vevet blir utsatt for KBBC sikrer at substrater av oksidaser som ikke er en del av elektrontransportkjeden, er utarmet.
Statistisk analyse
Enkelteksperimenter ble vist som angitt i figurene, men med flere kanaler som var gjennomsnittet. Data ble deretter grafisk fremstilt som gjennomsnitt ± standardfeilen (SE; beregnet som SD/√n).
Figur 1. Skjematisk fremstilling av fluidikk/vurderingssystem. Hovedkomponenter inkluderer kapsling, temperaturkontrollelementer, fluidikk og vevskammersystemer, regulering av gasstrykk i hoderommet over perifusat, fraksjonskollektor / strømningshastighetsovervåking og O2-detektorer. Forkortelser: MRM = Media Reservoir Module, PCM = Perifusion Chamber Module, TCA = Tissue Chamber Assemblies. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. (A) Bilde av instrumentets hovedkomponenter. Hovedkomponentene består av gasstank (trykkregulatorer), kapsling, fraksjonssamler og datamaskin. (B) Eksperimentelt flytskjema som viser hovedkategoriene av trinn og tiden det tar å fullføre dem. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Utsikt over MRM. MRM vises med en MRM-innsats (venstre) og rørestenger (høyre) plassert i bunnen av MRM-innsatsene (plassert på hver side av MRM-skillelinjen). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Rørmontering og spylerørsmontering i MRM. (A) Test sammensatt injeksjonsrørmontering og spyleslangemontering festet til porter på MRM. (B-C) Testforbindelsen og spylseslangeenheten (B) er plassert i sporet foran på kabinettet (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Slå på MRM-temperaturregulatoren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. Vevskamre og bensintank. Plassering av O 2-detektoren på detektorstativet (som også støtter MRM og PCM), og plassering av båndet rundt finnene på PCM som bidrar til å sikre vevskamrene på plass. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7. (A) Høy- og lavtrykksregulatorer på bensintanken. (B-C) Renserør. Spylerøret gjør at headspace i MRM kan tømme luft og fylles med gass fra tilførselstanken. Bilder som viser åpent spylerør (B) og lukket renserør (C). Testsammensatt injeksjonsenhet forblir lukket gjennom renseprosessen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8. Vevskammer og utstrømningsoppsettet. (A) Dimensjoner på Transwell-membranen etter at den er kuttet i tre strimler med samme bredde. (B) Utstrømning av flerrørsstøtte. (C) Utstrømning av flerrørsstøtte plassert på leppen av kabinettet med slangeadapterne nær vevkamrene. (D) Bilde av utstrømningsrøraggregater festet til vevskamrene. (E) Flyfoto av kabinettet uten lokket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9. Injeksjon av forbindelse i MRM. Injisere en testforbindelse gjennom injeksjonsporten inn i MRM ved hjelp av en 5 ml sprøyte. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10. OCR- og LPR-kurver som respons på testforbindelser. OCR og LPR av retina isolert fra mus (1 retina/kanal) som respons på tilstedeværelse eller fravær (kontroll) av testforbindelser som indisert. Hver kurve er gjennomsnittet av 6 replikater fra et enkelt eksperiment (feilfelt er SE; p-verdier beregnes ved å utføre parvise t-tester som sammenligner steady state-verdier for hver testagent med den forrige testagenten). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11. OCR-kurver. OCR av RPE-choroid-sclera og retina isolert fra mus (1 retina eller 2 RPE-choroid-sclera/channel) målt parallelt som respons på testforbindelser som indikert. Data er gjennomsnittet av replikater fra et enkelt eksperiment (n = 2 og 4 for henholdsvis RPE-choroid-sclera og retina; p-verdier beregnes ved å utføre parede t-tester som sammenligner steady state-verdier for hvert testmiddel med det forrige testmiddelet). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 12. OCR- og LPR-kurver fra RPE-celler. OCR og LPR fra RPE-celler festet til transbrønnmembraner som ble kuttet i strimler og lastet inn i perifusjonskamrene. Data er gjennomsnittet av replikater fra et enkelt eksperiment (n = 3, med 1,5 membraner/kanal (360 000 celler/kanal); p-verdier beregnes ved å utføre parede t-tester som sammenligner steady state-verdier for hver testagent med verdiene for det forrige testmiddelet). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| VEV/CELLE | Mengde/kanal | STRØMNINGSHASTIGHET: ml/min |
| Netthinnen (mus) | 1 | 0.025 |
| RPE-choroid-sclera (mus) | 2 | 0.02 |
| RPE-celler på transbrønnmembraner | 360 000 celler (4 x 1/3 filterstrimler) | 0.016 |
Tabell 1. Anbefalte driftsspesifikasjoner for forskjellige vev.
Tilleggsfigur 1. Grafisk fremstilling av eksperimentell design. Tidspunkt og sammensetning av eksponering for testforbindelser, og tidspunkt for fraksjonsinnsamling. Konsentrasjonsøkning (Conc Inc) er endringen i konsentrasjon som skal implementeres. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2. Brukergrensesnitt ved oppstart. UI i oppstartsvinduet til O 2-deteksjonsprogramvaren som overvåker O2 i vevskamrene satt inn i PCM. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3. Brukergrensesnitt for eksperimentinnstillinger. Brukergrensesnitt for å angi eksperimentell informasjon (venstre) og velge tidspunkter for innsamling av utstrømningsfraksjoner (høyre). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 4. Brukergrensesnitt for injeksjonssiden. Injeksjonsside som beregner injeksjonsvolum basert på ønskede konsentrasjoner av testforbindelse og gjenværende volum i MRM. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 1: Metoder for fremstilling av vevsprøver. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
På grunn av viktigheten av bioenergetikk i alle aspekter av cellefunksjon og vedlikehold av ulike komponenter i øyet, er det et kritisk behov for metoder for å studere reguleringen. Spesielt er nevral retina og RPE avhengig av metabolisme for både generering av energi samt intra- og intercellulær signalering14,15,16,17. På grunn av deres høye oksidative kapasitet er isolert vev i øyet ikke godt vedlikeholdt under statiske forhold18,19 og derfor krever studier av isolerte komponenter i øyet strømningssystemer som både kan opprettholde og vurdere metabolske prosesser. Fluidics-systemet ble utviklet for å generere OCR- og LPR-data fra et bredt spekter av vevstyper, og i dette papiret presenterte vi detaljerte protokoller som ble funnet å gi optimale resultater.
Den viktigste determinanten for å generere robuste data ved hjelp av strømningssystemet inkluderer pre-likevekt av CO2-baserte medier / buffer ved 39 ° C (for å sikre at perifusat ikke er overmettet med oppløst gass som ville degas under forsøket). Spesielt vil medier eller KRB-buffer lagret ved 4 °C være overmettet i forhold til 37 °C og vil avgasse under forsøket hvis pre-likevektstidene er utilstrekkelige. I tillegg må vev som lastes inn i vevskamrene ikke traumatiseres ved feil isolering av vev på grunn av rive eller ufullstendig separasjon av vev, eller ved å utsette vev i lav mengde bikarbonatbasert buffer for atmosfærisk luft for lenge. Temperaturkontroll, strømningsstabilitet og pålitelighet av O 2-deteksjon har liten variabilitet, og disse faktorene bidrar ikke vesentlig til feilraten.
Instrumentet har åtte strømningskanaler/vevskamre som går samtidig som forsynes med perifusat fra to reservoarer, fire vevskamre for hvert reservoar. For å få de mest nøyaktige tidsforløpene til OCR, er kinetiske kurver baseline korrigert av kamre som ikke er lastet med vev. Dermed vil en typisk eksperimentell protokoll involvere to grupper med tre vevskamre. Protokoller generelt faller inn i to kategorier: den ene er de forskjellige testforbindelsesprotokollene på hver side (for eksempel narkotika / kjøretøy på den ene siden av MRM, og bare kjøretøy på den andre); den andre er samme testsammensatte injeksjonsprotokoll på begge sider av MRM, men forskjellig vevs- eller vevsmodell på hver side av MRM. I dette papiret ble effekten av oligomycin og FCCP på retina sammenlignet med OCR av vev som ikke ble utsatt for noen testforbindelser, og to vev ble samtidig vurdert under samme protokoll og betingelser for å identifisere vevsspesifikk oppførsel. Sistnevnte ble illustrert i denne studien ved å vise økt dynamisk område av metabolsk hastighet av RPE-choroid-sclera i forhold til retina parallelt i samme eksperiment. Andre rapporter har beskrevet et bredere spekter av studiedesign, inkludert måling av effektene varierendeO2-nivåer på OCR og LPR, og konsentrasjonsavhengigheter av drivstoff, narkotika og toksiner20,21. I tillegg, selv om vi har begrenset analysen av utstrømningsfraksjoner til måling av laktat og beregning av LPR, øker informasjonsinnholdet i et eksperiment sterkt hvis flere forbindelser og klasser av forbindelser i utstrømningsfraksjonene analyseres som hormoner, nevrotransmittere, cellesignaler og metabolitter som kan gå ut av cellene20,22, 23.
Belastningen av isolert retina eller RPE-choroid-sclera er grei, og når de er isolert, blir disse vevene ganske enkelt plassert i toppen av vevskamrene med tang og får lov til å synke ned til frit. RPE-celler dyrket på filterinnsatser utvikler passende polarisering og markører for RPE-modenhet etter 4-8 uker i kultur. Det er ikke mulig å fjerne RPE for levende celleanalyse når den er festet til transbrønnmembranen, hvis RPE-modenhet og polarisasjon skal opprettholdes24. Perifusjonskammeret kan ta imot strimler av transbrønnmembranen som er kuttet med en skalpell mens de er nedsenket i buffer og raskt satt inn i vevkamrene. Selv om skjærefilterstrimler er plassert i et statisk system24, er det ingen annen fluidikkmetode for å vurdere disse viktige celletypene tilgjengelig. Responsene til RPE-celler var raske og mer dynamiske enn både retina eller RPE-choroid-sclera, sannsynligvis delvis på grunn av umiddelbar tilgang til både apikale og basale aspekter av RPE-cellene konfigurert som et monolag på membraninnsatsen.
En annen faktor for å sikre at data har det høyeste signalet til støy, er å velge det optimale forholdet mellom vev lastet inn i perifusjonskamrene i forhold til strømningshastigheten. For lite vev i forhold til strømningshastigheten resulterer i en forskjell i oppløstO2-konsentrasjon mellom innstrømning og utstrømning som er svært liten og vanskelig å måle pålitelig. I kontrast, hvis strømmen er for langsom, blir konsentrasjonen avO2 så lav at vevet påvirkes av hypoksi. Ikke desto mindre kan den gasstrykkdrevne væskestrømmen opprettholdes ved strømningshastigheter ned til 5 ml / min, noe som bare krever små mengder vev for nøyaktige OCR- og LPR-målinger. I forsøkene vist her ble det brukt ca. 20 ml / min / kanal som var egnet for enten en retina, to RPE-choroid-scleras, eller 360.000 RPE-celler. For å minimere systemeffektene som forsinker og sprer eksponeringen av vevet til den injiserte testforbindelsen, tilføres flere størrelser av vevskamrene, slik at mengden vev (og strømningshastighet) samsvarer med riktig størrelse på kammeret.
Data fra analysene vist i denne artikkelen ble representert på to måter: absolutt størrelse med hensyn til hastighet, eller brøkendringer i forhold til en steady-state eller baseline. Fokus var på illustrasjon av måling av respons på testforbindelser. Fluidikksystemet er imidlertid godt egnet til å vurdere og sammenligne effekter av vevsbehandling før perifusjonsanalysen, for eksempel genetiske modifikasjoner. Testing av om en behandling er forskjellig fra kontroll er mest robust hvis effekten av behandlingen på normaliserte responser av testforbindelser analyseres. Hvis analysen krever absolutte størrelser, maksimeres den statistiske styrken til analysene av prøver som er forbehandlet dersom deres vurdering og kontroller utføres i samme perifusjonseksperiment.
Bortsett fra omrøreren, leveres alle deler som kommer i kontakt med væske av produsenten som forbruksvarer og har blitt sterilisert. Disse delene bør ikke gjenbrukes, da eksperimenter noen ganger vil gå tapt på grunn av ufullstendig rengjøring og forurensede overflater. Systemet i begynnelsen av installasjonen er sterilt. Imidlertid tilsettes media til MRM, og vev lastes i kamrene under ikke-sterile forhold. Vi har målt OCR i systemet som er satt sammen med deler som er sterile, men hvor selve forsøket utføres under ikke-sterile forhold. Det tar omtrent 14 timer for bakterier å akkumulere til det punktet at de har målbar OCR (upubliserte resultater). Hvis det brukes protokoller som er mindre enn 10 timer eller så, vil opphopning av bakterier og eventuelle effekter på grunn av disse være ubetydelig.
Mange forskere bruker instrumenter som er designet for å måle OCR under statisk inkubasjon av et monolag av celler med en relativt høy gjennomstrømning25,26. I motsetning til dette opprettholder fluidikkinstrumentet vi har testet og beskrevet i dette papiret vev ved å sikre tilstrekkeligO2-levering som er kritisk for de større diffusjonsavstandene som er tilstede i vevsprøver. I tillegg er det i stand til å samle fraksjoner som tillater vurdering av flere parametere parallelt med OCR, noe som i stor grad forbedrer evnen til å studere forhold mellom dem. Endelig kan oppløste gasskonsentrasjoner (somO2 og CO 2) kontrolleres, noe som øker varigheten av eksperimenter med bikarbonatbaserte medier og buffer, slik at brukeren kan studere effekten av O2. Det bør påpekes at en begrensning for begge metodene er manglende evne til å studere utvasking av testforbindelser, en funksjonalitet som andre perifusjonssystemer har 4,27,28. En annen vurdering når man bestemmer den optimale analysemodaliteten er det faktum at fluidics-systemer bruker flere medier og testforbindelser enn statiske systemer. Den ekstra kostnaden minimeres med dagens fluidics-systemer, men på grunn av de lave strømningshastighetene som systemet kan brukes.
Samlet er det beskrevet en detaljert beskrivelse av protokollene for å utføre eksperimenter med et nytt strømnings-/vurderingsinstrument. Data generert med retina og RPE-choroid-sclera rekapitulerte tidligere resultater oppnådd med systemer som er mye vanskeligere å bruke (og ikke lett tilgjengelige). Det ble også demonstrert at systemet kan opprettholde og vurdere RPE-celler festet til transbrønnmembraner, en svært viktig cellulær modell som ikke tidligere har blitt analysert med strømningssystemer på grunn av cellens skjørhet. Hoveddelene av protokollen består av en 75 minutters oppsettstid, etterfulgt av en 90 minutters likevektsperiode og den eksperimentelle protokollen som gjør den egnet for rutinemessig bruk av laboratorier som ikke spesialiserer seg på drift av fluidikksystemer. Selv om vi fokuserte på å måle den akutte responsen av vev for å teste forbindelser, er systemet svært egnet til å sammenligne vev fra forskjellige kilder som dyremodeller eller cellemodeller som har blitt genetisk endret eller gjennomgått testbehandlinger / forhold. I tillegg er omfanget av analyser som kan utføres på utstrømningsfraksjonene omfattende og inkluderer metabolitter, cellesignalmolekyler og utskilte hormoner / nevrotransmittere samt multikomponentanalyse generert av massespektrometri på fraksjonene så vel som vevet.
Disclosures
I.R.S., M.G. og K.B. har økonomiske bånd til EnTox Sciences, Inc. (Mercer Island, WA), produsenten/distributøren av BaroFuse perifusjonssystemet beskrevet i denne studien. Alle de andre forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av tilskudd fra National Institutes of Health (R01 GM148741 IRS), U01 EY034591, R01 EY034364, BrightFocus Foundation, Research to Prevent Blindness (JRC) og R01 EY006641, R01 EY017863 og R21 EY032597 (JBH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BIOLOGICAL SAMPLES | |||
| C57BL/6J mice | Envigo Harlan (Indianapolis, IN) | N/A | |
| REAGENTS | |||
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920L9795 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270G | |
| KCN | Sigma-Aldrich | 60178 | |
| Lactate | MilliporeSigma | L6661 | |
| Oliigomycin A | Sigma-Aldrich | 75351L9795 | |
| CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING | |||
| Beuthanasia-D | Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ | N/A | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital | Virbac | RXEUTHASOL | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | 12303C | |
| Hank’s Buffered Salt Solution | GIBCO | 14065056 | |
| Krebs Ringer Bicarbonate (KRB) | Thermo Fisher Scientific | J67795L9795 | |
| Matrigel | ThermoFisher | #CB-40230 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| ROCKi | Selleck Chemicals | Y-27632 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25-200-072 | |
| SUPPLIES | |||
| Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2 | Praxair Distribution, Inc | N/A | |
| Transwell filters | MilliporeSigma | 3470 | |
| COMMERCIAL ASSAYS | |||
| Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit | ThermoFisher | A22189 | |
| Glucose Oxidase from Aerococcus viridans | Invitrogen (Carlsbad, CA) | A22189L9795 | |
| Lactate Oxidase | Sigma-Aldrich | L9795 | |
| EQUIPMENT | |||
| BaroFuse Multi-Channel Perifusion system | EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA | Model 001-08 | |
| Synergy 4 Fluorometer | BioTek (Winooski, VT) | S4MLFPTA |
References
- Lacy, P. E., Walker, M. M., Fink, C. J. Perifusion of isolated rat islets in vitro: Participation of the microtubular system in the biphasic release of insulin. Diabetes. 21 (10), 987-998 (1972).
- Doliba, N. M., et al. Metabolic and ionic coupling factors in amino acid-stimulated insulin release in pancreatic beta-HC9 cells. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (6), E1507-E1519 (2007).
- Sweet, I. R., et al.
- Chertov, A. O., et al.
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Bisbach, C. M., et al. Succinate Can Shuttle Reducing Power from the Hypoxic Retina to the O2-Rich Pigment Epithelium. Cell Reports. 31 (5), 107606 (2020).
- Du, J., et al. Inhibition of mitochondrial pyruvate transport by zaprinast causes massive accumulation of aspartate at the expense of glutamate in the retina. The Journal of Biological Chemistry. 288 (50), 36129-36140 (2013).
- Hass, D. T., et al. Succinate metabolism in the retinal pigment epithelium uncouples respiration from ATP synthesis. Cell Reports. 39 (10), 110917 (2022).
- Kamat, V., et al. Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism. Elife. 10, e66716 (2021).
- Stryer, L. Biochemistry. , 4th edn, Freeman and Company, New York. (1995).
- Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).
- Engel, A. L., et al. Extracellular matrix dysfunction in Sorsby patient-derived retinal pigment epithelium. Experimental Eye Research. 215, 108899 (2022).
- Zhang, R., et al. Inhibition of Mitochondrial Respiration Impairs Nutrient Consumption and Metabolite Transport in Human Retinal Pigment Epithelium. Journal of Proteome Research. 20 (1), 909-922 (2021).
- Hurley, J. B. Retina Metabolism and Metabolism in the Pigmented Epithelium: A Busy Intersection. Annual Review of Vision Science. 7, 665-692 (2021).
- Xiao, J., et al. Autophagy activation and photoreceptor survival in retinal detachment. Experimental Eye Research. 205, 108492 (2021).
- Okawa, H., Sampath, A. P., Laughlin, S. B., Fain, G. L. ATP consumption by mammalian rod photoreceptors in darkness and in light. Current Biology. 18 (24), 1917-1921 (2008).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. , 100846 (2020).
- Yu, J., et al. Emerging strategies of engineering retinal organoids and organoid-on-a-chip in modeling intraocular drug delivery: Current progress and future perspectives. Advanced Drug Delivery Reviews. 197, 114842 (2023).
- Arjamaa, O., Nikinmaa, M. Oxygen-dependent diseases in the retina: role of hypoxia-inducible factors. Experimental Eye Research. 83 (3), 473-483 (2006).
- Kamat, V., et al. A Versatile Multi-Channel Fluidics System for the Maintenance and Real-Time Metabolic and Functional Assessment of Tissue or Cells. Cell Reports Methods. In Press. , (2023).
- Neal, A., et al. Quantification of Low-Level Drug Effects Using Real-Time, in vitro Measurement of Oxygen Consumption Rate. Toxicological Sciences. 148 (2), 594-602 (2015).
- Jung, S. R., et al. Reduced cytochrome C is an essential regulator of sustained insulin secretion by pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 286 (20), 17422-17434 (2011).
- Rountree, A. M., et al. Control of insulin secretion by cytochrome C and calcium signaling in islets with impaired metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 289 (27), 19110-19119 (2014).
- Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).
- Jarrett, S. G., Rohrer, B., Perron, N. R., Beeson, C., Boulton, M. E. Assessment of mitochondrial damage in retinal cells and tissues using quantitative polymerase chain reaction for mitochondrial DNA damage and extracellular flux assay for mitochondrial respiration activity. Methods in Molecular Biology. 935, 227-243 (2013).
- Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2008).
- Doliba, N. M., Qin, W., Vinogradov, S. A., Wilson, D. F., Matschinsky, F. M. Palmitic acid acutely inhibits acetylcholine- but not GLP-1-stimulated insulin secretion in mouse pancreatic islets. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 299 (3), E475-E485 (2010).
