Summary
Realtidsanalys av levande vävnad ger viktiga funktionella och mekanistiska data. Denna artikel beskriver protokollen och kritiska variabler för att säkerställa korrekt och reproducerbar generering av data av ett nytt och pumpfritt flerkanaligt fluidiksystem som underhåller och utvärderar ett brett spektrum av vävnads- och cellmodeller.
Abstract
Många in vitro-modeller som används för att undersöka vävnadsfunktion och cellbiologi kräver ett flöde av media för att ge tillräcklig syresättning och optimala cellförhållanden som krävs för att upprätthålla funktion och viabilitet. För detta ändamål har vi utvecklat ett flerkanaligt flödesodlingssystem för att hålla vävnad och celler i odling och kontinuerligt bedöma funktion och viabilitet genom antingen in-line-sensorer och/eller insamling av utflödesfraktioner. Systemet kombinerar 8-kanals, kontinuerlig optisk avkänning av syreförbrukningshastigheten med en inbyggd fraktionsuppsamlare för att samtidigt mäta produktionshastigheten för metaboliter och hormonutsöndring. Även om den kan upprätthålla och bedöma ett brett spektrum av vävnads- och cellmodeller, inklusive öar, muskler och hypotalamus, beskriver vi här dess funktionsprinciper och de experimentella förberedelser/protokoll som vi har använt för att undersöka bioenergetisk reglering av isolerad musnäthinna, musretinalt pigmentepitel (RPE)-choroid-sclera och odlade humana RPE-celler. Innovationer i utformningen av systemet, såsom pumplöst vätskeflöde, har lett till en kraftigt förenklad drift av ett flerkanaligt flödessystem. Videor och bilder visas som illustrerar hur man monterar, förbereder instrumentet för ett experiment och laddar de olika vävnads-/cellmodellerna i perifusionskamrarna. Dessutom beskrivs och diskuteras riktlinjer för val av betingelser för protokoll- och vävnadsspecifika experiment, inklusive inställning av rätt förhållande mellan flöde och vävnad för att erhålla konsekventa och stabila odlingsförhållanden och noggranna bestämningar av konsumtions- och produktionshastigheter. Kombinationen av optimalt vävnadsunderhåll och realtidsbedömning av flera parametrar ger mycket informativa datamängder som kommer att ha stor nytta för forskning inom ögats fysiologi och läkemedelsutveckling för behandling av nedsatt syn.
Introduction
Perifusionssystem har en lång historia inom livsvetenskaperna. I synnerhet för studier av öars sekretoriska funktion har de använts för att karakterisera kinetiken för insulinutsöndring som svar på sekretagoger1. Förutom att samla in utflödesfraktioner för efterföljande analys av hormoner och metaboliter har realtidssensorer införlivats, främst för detektion av syreförbrukning 2,3,4. Utbredda ansträngningar för att bättre förstå mekanismer som medierar sjukdomar i ögat har begränsats av en brist på fysiologiskt relevanta metoder för att bedöma metabolisk reglering och dysreglering av de olika isolerade komponenterna i ögat, inklusive näthinnan, retinal pigmentepitel (RPE)-choroid-sclera och odlade RPE-celler. Statiska system avsedda för odlade celler har anpassats för vävnad5, men vävnad kräver flöde för tillräcklig syresättning. Flödessystem har varit framgångsrika när det gäller att noggrant och reproducerbart mäta realtidssvar i syreförbrukningshastighet (OCR) av näthinnan och RPE-choroid-sclera, och vävnaderna förblir metaboliskt stabila i mer än 8 timmar, vilket möjliggör mycket informativa protokoll som involverar flera testföreningar 4,6,7,8,9 . Icke desto mindre har driften av fluidiksystem historiskt sett krävt en skräddarsydd apparat och utbildad teknisk personal i icke-standardiserade metoder. Sådana system har inte antagits som standardmetod i de flesta laboratorier. BaroFuse är ett nyutvecklat fluidiksystem som inte förlitar sig på pumpar, utan snarare på gastryck för att driva flödet genom flera kanaler och vävnadskammare (figur 1). Varje kanal övervakas kontinuerligt för OCR, och utflödet samlas upp med en plattbaserad fraktionsuppsamlare för efterföljande analys av innehållet. Det är viktigt att instrumentets vävnadsperifusionskamrar är utformade för att rymma vävnader av olika geometrier och storlekar.
Hjärtat i instrumentet är fluidiksystemet, där flödet drivs från en förseglad, trycksatt behållare genom små slangar med innerdiameter (ID) (vilket bidrar med det mest betydande flödesmotståndet i vätskekretsen) upp i glasvävnadskamrarna som rymmer vävnaden. Trycket till mediereservoarmodulen (MRM) tillförs av lågtrycks- och högtrycksregulatorer anslutna till en gasflaska som innehåller en blandning av gaser (vanligtvis 21 %O2, 5 % CO 2, balans N2), och behållaren förseglas uppifrån av perifusionskammarmodulen (PCM) som håller vävnadskammarenheterna (TCA). Flödeshastigheten styrs av längden och ID på motståndsrören och tryckinställningen för en lågtrycksregulator. Utflödesrör som är anslutna till toppen av vävnadskamrarna levererar vätska till antingen en avfallsbehållare (som vägs kontinuerligt för automatisk bestämning av flödeshastigheten) eller till brunnar på en 96-hålsplatta som styrs av fraktionsuppsamlaren. O2-detektionssystemet mäter livslängden för ettO2-känsligt färgämne målat på insidan av var och en av glasvävnadskamrarna nedströms vävnaden. Denna information används sedan för att kontinuerligt beräkna OCR. Hela fluidiksystemet finns i en temperaturkontrollerad kapsling och gastanken, fraktionsuppsamlaren och datorn är de viktigaste komponenterna i instrumentet (figur 2A). Slutligen tjänar programvara som kör instrumentet till att styra dess funktion (inklusive beredning och timing av injicerade testföreningar, flödesmätningssystem och fraktionsuppsamlartid), samt bearbetning och grafering av OCR-data och andra kompletterande mätningar.
I den här artikeln beskriver vi protokollen för att använda fluidiksystemet för att perifuse och bedöma OCR och laktatproduktionshastighet (LPR) för olika isolerade komponenter i ögat. LPR är en parameter som återspeglar glykolytisk hastighet som är mycket komplementär till OCR, där paret står för de två huvudgrenarna av energigenerering från kolhydrater i cellen10. Eftersom beredning av vävnaden och laddning av den i vävnadskamrarna bäst lärs genom att titta på proceduren, kommer videon att hjälpa till att illustrera flera av de kritiska stegen som utförs under installation och drift som inte lätt kan förmedlas med enbart text.
Beskrivningen av protokollet är uppdelad i 8 avsnitt som motsvarar olika faser i försöket (figur 2B): 1. Förberedelse före försöket. 2. Beredning/jämvikt av perifusatet. 3. Instrumentets uppbyggnad. 4. Jämvikt mellan vävnader. 5. Experimentellt protokoll. 6. Instrumentets haveri. 7. Behandling av uppgifter. och 8. analyser av utflödesfraktioner.
Protocol
Alla procedurer för att skörda vävnad från råttor och möss godkändes av University of Washington Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Beredning före försök
OBS: Följande uppgifter ska utföras minst en dag före experimentet.
- Utformning av det experimentella protokollet
- Tilldelning av vävnadsplacering i kanaler: Välj vävnads- eller cellmodell som ska placeras i 3 av de 4 kanalerna på varje sida av MRM. En vävnadskammare på varje sida körs utan vävnad som ska användas för baslinjekorrigering.
- Ordna proverna med hjälp av en av de två typiska designerna - olika testföreningsprotokoll på varje sida (t.ex. kanaler på ena sidan av MRM tar emot testföreningar medan kanalerna på andra sidan fungerar som en kontroll); Samma injektionsprotokoll för testsubstans på båda sidor av MRM, men olika vävnads- eller vävnadsmodell jämfört med kontroll på vardera sidan av MRM.
- Val av flödeshastighet och vävnadsmängd för optimal OCR-mätning: Justera flödeshastigheten tills förändringen i livstidsförhållandet gånger 100 är cirka 3.
OBS: Typiska mängder vävnad och motsvarande flödeshastigheter visas i tabell 1 för komponenter i ögat, där instrumentet fungerar bäst vid flödeshastigheter mellan 6-80 μL/min/kanal. - Beräkning av erforderlig medie-/buffertvolym: Beräkna volymen av media som ska läggas till varje MRM-insats i början av experimentet enligt
VolymMRM = 30 ml + protokollets varaktighet (i min) x flödeshastighet (i ml/min) x 4 kanaler (ekv.1)
Till exempel, vid 0,01 ml/min, kommer en60 ml startvolym MRM att möjliggöra ett 12,5 timmars protokoll (där 30 ml kommer att vara uttömda, medan 30 ml kommer att finnas kvar), medan vid 0,04 ml/min, 90 ml startvolymMRM möjliggör ett 6 timmars protokoll (med 30 ml kvar). - Injektionsprotokoll för testföreningar: Välj ut de testföreningar som ska bedömas, den koncentration som ska testas (som vanligtvis väljs för att ge nära maximal respons eller som koncentrationsberoende) och exponeringens varaktighet. Tänk på löslighet och fyll på lager i önskat lösningsmedel som vatten, DMSO eller etanol.
- Välj tidpunkt för injektioner och efterföljande injektioner så att svaret når ett stabilt tillstånd innan ett efterföljande medel tillsätts. När du upprepar protokollen, matcha tidpunkten för injektionerna så att flera tidsförlopp kan beräknas som medelvärde.
OBS: Föreningarna som används här är från ett tidigare mitokondriellt (Mito) stresstest 11 och både oligomycin och karbonylcyanid 4-(trifluormetoxi)fenylhydrazon (FCCP) kräver DMSO både i stamlösningarna och det slutliga perifusatet. - Utflödesprovtagningstider: Välj önskade fraktionsuppsamlingsintervall (från 1-60 min/sample), där snabbare samplingshastigheter väljs för snabba förändringar och längre tidsintervall väljs när steady state närmar sig. Använd tillräckliga brunnsvolymer (0.3 till 1.5 ml) för att undvika översvämning under samplingsintervallet (välj volymer som är större än flödeshastigheten x tidsintervallet).
OBS: Provtagningstiderna varierar beroende på val av protokoll, men för ett Mito-stresstest har vi vanligtvis använt 5 minuters intervall under baslinjen och 15 minuters intervall under injektionerna (-15, -10, -5, 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, där varje tid är början på provtagningsintervallet). - Ange de valda värdena för testföreningar och fraktionssamling som beskrivs ovan i användargränssnittet (UI), som genererar grafiska representationer av denna information. Exportera och sprida filer för grupputvärdering och diskussioner (kompletterande figur 1).
- Ställ ut tillbehör och förbrukningsdelar
- Ange de förbrukningsmaterial som tillhandahålls och förpackas aseptiskt av tillverkaren och som inkluderar: TCA (förpackning med 8), utflödesslangar (förpackning med 8 rör), injektionsslang för testmassa (2), pincett, slangklämmor (3), MRM, MRM-insatser (2), omrörningsstänger (2) och avluftningsslang (placerad i ett biologiskt säkerhetsskåp).
- Återanvänd inte engångsdelar som kommer i kontakt med vätska, eftersom detta kommer att leda till en ökning av experimentella misslyckanden. Återanvänd pincetten och omrörarstängerna genom att rengöra och autoklavera dem mellan experimenten.
2. Beredning och jämvikt av perifusat (Tid: 30 min exklusive inkubationstid)
- Bered mediet eller Krebs-Ringer bikarbonatbufferten (KRB) dagen innan baserat på beräkningar från ekvation 1, vanligtvis 200 ml, och inkubera sedan över natten i en 39 °C/5 % CO2 inkubator i T225 vävnadsodlingskolvar med högst 90 ml i varje kolv.
- Om du använder kommersiellt framställd KRB eller media (uppvärmt till rumstemperatur), bered perifusatet på morgonen för experimentet och placera det i 5 % CO2 -inkubatorn i minst 1 timme. Bered alla lösningar aseptiskt.
OBS: Alla vätskor och delar av fluidiksystemet som kommer i kontakt med vätska är sterila i början av experimentet. Montering av systemet och laddning av vävnaden utförs dock öppet för luften.
3. Jämvikt mellan temperatur och upplöst gas för att ställa in instrumentet (Tid: 75 min)
- Montering av slangenheter på MRM
- Placera MRM och ett fluidikpaket på bänken bredvid instrumentet. Se till att slangen clamps (3), omrörningsstänger (2) och pincett är redan på verktygsbrickan.
- Placera en oanvänd MRM-insats med en omrörningsstång på varje sida av MRM (se figur 3).
- Fäst TCA:erna på injektionsportarna i båda ändarna av MRM så att änden av slangen är placerad direkt över omrörningsstången. Se till att den längre av de två injektionsenheterna för testmassa sitter på baksidan av MRM.
- Fäst sedan gasinflödesmatningsledningen och avluftningsslangen till de bakre respektive främre lediga portarna (se figur 4A).
- Placering av MRM/slangenheter i kapslingen
- Placera MRM (med slangenheterna monterade) i MRM-värmaren (Figur 4B).
- Placera de fyra slangenheterna i spåren på väggarna i botten av höljet (två på varje sida) så att de sticker ut till utsidan av höljet när det mellersta höljet sätts på plats.
- Fäst MRM mellan clamps genom att dra åt de två hjulen på detektorstativet.
- Mata den längre injektionsenheten för testmassan som sticker ut från baksidan av höljet genom de två rörstyrningarna på sidan av höljet så att rörens öppning är vänd framåt (Figur 4C).
- Clamp var och en av de slutna testföreningsinsprutningsenheterna.
- Montering av kapslingen och aktivering av temperaturregulatorerna
- Växla grenuttaget som levererar ström till alla elektriska enheter i höljet till ON-läget. Fläkten på detektorstativet slås PÅ och MRM-temperaturregulatorn ska tändas och visa ett inställt värde på 38 °C (Figur 5).
- Slå PÅ omrörarna till 70 rpm med hjälp av användargränssnittet för att säkerställa att omrörningsstängerna roterar smidigt. När korrekt omrörning har observerats, stäng av omrörarna.
- Placera den mellersta delen av höljet ovanpå basen.
- Anslut kabeln på den mellersta delen av höljet till kabeln från elboxen för att koppla ström till omgivningstemperaturregulatorns strömbrytare och tillföra ström till omgivningstemperaturvärmaren.
- Placera locket på höljet och displayen på den övre temperaturregulatorn (omgivningstemperaturregulatorn) tänds och visar 36 °C. Starta en timer på 30 min, den tid det tar för MRM-värmaren att nå börvärdestemperatur.
- Sätta in TCA:erna i PCM
- Använd TCA-insättningsverktyget för att sätta in var och en av de 8 TCA:erna i PCM-hålen genom att trycka hårt på adaptern med insättningsverktygets yta tills toppen av slanghylsan som är lindad runt vävnadskammaren vidrör ytan som omskriver hålen i PCM.
- Sätt i en TCA helt innan du sätter i nästa. Lägg den delvis monterade PCM åt sidan bredvid PCM-stödet och 6 skruvar.
OBS: Ofullständig insättning av en TCA kommer att förhindra att huvudutrymmet når tryckbörvärdet och perifusat kommer inte att flöda.
- Fyllning av de två insatserna i MRM med föreklibrerat perifusat
- För att göra detta, 30 minuter efter att kammaren monterats och MRM har nått temperatur, överför du det förjämviktade perifusatet till den förvärmda MRM-insatsen genom att försiktigt mata ut vätskan längs sidorna med en 50 ml pipett.
ANM.: Dessa steg, liksom de i avsnitt 3.6, bör utföras omedelbart för att undvika överföring av gas mellan perifusatet i MRM och atmosfären.
- För att göra detta, 30 minuter efter att kammaren monterats och MRM har nått temperatur, överför du det förjämviktade perifusatet till den förvärmda MRM-insatsen genom att försiktigt mata ut vätskan längs sidorna med en 50 ml pipett.
- Montering av MRM/PCM för att skapa en gastät tätning och placering av O2 -detektorn
- Placera PCM på MRM genom att föra in motståndsrören på TCA:erna som kommer från botten av PCM i MRM-insatserna, 4 på varje sida av MRM-delaren. Rikta PCM så att vävnadskamrarna kan vila mot O2 -detektorn när den väl är placerad.
- Fäst PCM och PCM-stödstödet med de 6 skruvarna med den elektriska skruvmejseln.
- Fäst TCA:erna i PCM-stödfenorna med det elastiska bandet genom att sträcka det runt PCM-fenorna i nivå med gummipackningarna (Figur 6).
- Placera O2 -detektorn på detektorstativet så att dess yta vilar mot PCM:s fenor. Kontrollera att LED-/fotodetektorparen är i linje med detO2-känsliga färgämnet i vävnadskamrarna. Justera vid behov O 2 -detektorns sidostyrningar efter att ha lossat ställskruvarna på sidan av O2 -detektorhållaren.
- Placera locket ovanpå höljet.
- Jämvikt mellan gasen i huvudutrymmet i MRM och perifusatet
- Med högtrycksventilen helt säkrad och stängd, öppna bensintankens ventil genom att vrida flaskventilen ovanpå tanken moturs.
- Justera högtrycksregulatorn till ett tryck på 10 psi med hjälp av vredet på regulatorn.
- Trycksätt MRM genom att ställa in lågtrycksregulatorn på 1.0 psi (Figur 7A).
- Lossa avluftningsröret (Figur 7B) så att gasen från tanken kan ersätta luften i MRM-utrymmet (testföreningsinjektorerna förblir fastspända) i 15 minuter. Bekräfta gasflödet genom att sänka ner änden av reningsröret i en bägare med vatten för att observera bubblor.
- När flödet har bekräftats, starta O2-detektorn enligt beskrivningen nedan i avsnitt 3.8.
- Efter 15 minuter sätter du på omröraren med 70 varv per minut och låter den gå under resten av experimentet. Efter ytterligare 15 minuter, clamp avluftningsslangen (Figur 7C).
- Sänk trycket på lågtrycksregulatorn till det arbetstryck som uppnår önskat vätskeflöde (enligt specifikationen från experimentpaketet - vanligtvis mellan cirka 0,5-0,7 psi). Om flödeshastigheten är över 20 μL/min, ställ tillfälligt in trycket på 0,3 psi för att ge tid att ladda vävnaden utan att kamrarna svämmar över. Detta är inte nödvändigt om vävnaden belastas inom 15 minuter efter att klämman placerats.
OBS: Låt inte bufferten rinna ner på utsidan av vävnadskammaren, eftersom vätskan kan störa O 2-avkänningen.
- Starta O2 -detektorn
- Aktivera programvaran för O2-detektorn på den bärbara datorn genom att klicka på ikonen märkt Syredetektor.
- När programmet har öppnats (tilläggsfigur 2), bekräfta att rätt COM-port har valts. Om det behövs kan COM-porten identifieras genom att koppla ur och ansluta O 2-detektorn från datorn så att portnumret visas. Om COM-porten kopplas bort medan programmet körs måste programmet stängas och öppnas igen innan det används.
- Klicka på Start och sedan på Spela in (och spara data i säkerhetskopieringsmappen). Klicka sedan på Graf.
- Ändra medelvärdet längst ned till vänster i livstidsdiagrammet till 5 (vilket instruerar programmet att beräkna ett glidande medelvärde med 5 på varandra följande punkter). När en minut har gått och den första datapunkten visas på grafskärmen klickar du på Autoskala.
4. Vävnadsladdning och jämviktsperiod (Tid: 90 min)
- Placering av frittor i vävnadskamrarna
- Ta bort locket och de mellersta delarna av höljet.
- Efter att perifusatet i vävnadskamrarna har stigit över toppen av den förpositionerade frittan, tryck ner frittan med frittasignalen genom att knacka lätt på toppen av frittan för att ta bort eventuella luftbubblor som bildats under eller i frittan.
- Placera frittorna cirka 0.25 tum ovanför botten av vävnadskammaren.
- Laddning av vävnad i vävnadskamrarna
- När medienivån är 0.5 tum från toppen, ladda vävnaden i kammaren.
- Laddar näthinnan eller RPE-choroid-sclera: Skörda näthinnan eller RPE-choroid-sclera enligt beskrivningen i 6. För att ladda vävnaden, använd en finpunktstång för att försiktigt placera vävnaden i varje kammare, var noga med att inte vika vävnaden, samtidigt som du använder en vävnadsservett för att förhindra att vätska från vävnadskammaren droppar på O2 -sensorn. Observera vävnad som sjunker mot och på frittan.
OBS: Mellan tidpunkten för skörd av vävnaden och laddning av vävnad i kamrarna, se till att trauma mot vävnaden undviks genom att inte lämna vävnaden i en bikarbonatbaserad buffert/media utanför inkubatorn i mer än 10 minuter och se till att vävnaden badar i tillräckligt med buffert/media (minst 1 ml/10 mg vävnad) för att förhindra att vävnaden blir syrefattig och förhindrar exponering för luft. - Laddning av RPE-celler på transwell-membran: Förbered RPE-celler enligt beskrivningen tidigare 12 och i kompletterande fil 1. Passageceller med 0,25 % trypsin-EDTA och frö på polyetentereftalat, spåretsade filter (cellodlingsinsatser, porstorlek 0,4 mm) med minst 2,0 x 105 celler/cm2. På dagen för experimentet skärs membranen i tre lika breda remsor och belastas med tång i vävnadskamrarna (se figur 8A).
- Fästa utflödesslangarna på vävnadskamrarna
- Ta ut utflödesslangarna ur förpackningen och placera separatorn för utflödesslangen på kanten på den mellersta delen av höljet så att utflödesslangadaptrarna är på insidan av höljet (Figur 8B,C).
- Var försiktig så att du inte trycker för hårt på TCA:erna (annars lossnar de från MRM), fäst utflödesslangadaptrarna på toppen av vävnadskamrarnas TCA (Figur 8D). Sätt tillbaka mitten av höljet och anslut kontrollkabeln för omgivningstemperaturen igen.
- Innan du sätter tillbaka locket på höljet, kontrollera att komponenterna i fluidiksystemet inuti höljet inklusiveO2-detektorn , PCM, vävnadskammare, utflödesrör, MRM och värmare, alla är korrekt placerade som visas i figur 8E.
- Sätt tillbaka locket på höljet. Mata de åtta utloppsrören genom fraktionsuppsamlarens styrarm.
- Aktivera fraktionsuppsamlaren
- Se till att fraktionsuppsamlaren är centrerad i förhållande till kapslingens högra vägg och utloppsrörshållaren: det vänstra stödet på fraktionsuppsamlarbasen ska vila mot kanten på kapslingsväggen.
- På den bärbara datorn klickar du på genvägen till användargränssnittet så öppnas sidan med experimentell information (tilläggsbild 3 överst).
- Fyll i informationen i lämpliga rutor på sidan med experimentinformation (detta kan göras innan experimentet startar) och klicka sedan på sidan Flow & Fraction Collector högst upp (Kompletterande figur 3 längst ner).
- Ställa in parametrar för automatisk flödesmätning
- Välj önskad integrationstid i listrutan för samplingstid längst upp i mitten som balanserar den önskade noggrannheten (som är proportionell mot integrationstiden) och den tidsmässiga upplösningen.
- Om inga utflödesfraktioner kommer att samlas in i experimentet klickar du på Start och går till avsnitt 4.7. Om utflödesfraktioner kommer att samlas in, utför stegen i avsnitt 4.6.
- Uppsamling av utflödesfraktioner
- I UI-programvaran, kontrollera Samla in bråk? på antingen sidan Experimentinformation eller sidan Flödes- och fraktionsinsamlare. Klicka sedan på knappen Compute FC Settings .
- När det nya fönstret öppnas fyller du i tiden för den första injektionen i protokollet (definierad som tid = 0) och flödeshastigheten per kanal, samt tidsintervallen för varje prov. Klicka sedan på Beräkning.
- När intervallen för samlingen har verifierats klickar du på Generera och starta.
- Mätning av flöden för enskilda kanaler (tillval)
- Om flödeshastigheter för enskilda kanaler ska mätas (som under normala förhållanden varierar med endast några få procent), väg åtta (eller mindre) mikrocentrifugrör och registrera deras vikt.
- Ställ in rörhållaren som innehåller de vägda mikrocentrifugrören på plattvagnen. Klicka på Mät flödeshastighet manuellt i avsnittet för andra verktyg.
- Välj mätningens varaktighet och klicka sedan på Generera mall. Stäng fönstret och klicka på Starta. Fraktionsuppsamlaren kommer att samla upp vätska från utflödesrören under mättiden och sedan återgår armen till sitt utgångsläge.
- Väg mikrofugerören efter uppsamlingen och beräkna flödeshastigheten (där 1 mg = 1 μL) med viktskillnaden dividerad med mättiden.
- Stabilisering av baslinjen
- När vävnaden och/eller cellerna har laddats in i vävnadskamrarna, låt systemet vara i jämvikt i 90 minuter för att fastställa en jämn utgångsnivå förO2-förbrukningen , vid vilken tidpunkt den första testsubstansen kan injiceras (anses vara tid = 0).
- 30 minuter före den första injektionen anger du det genomsnittliga värdet för de senaste 3 FR per kanal på injektionssidan för beredning av injektioner av testsubstansen.
5. Experimentellt protokoll (Tid: 2-6 timmar)
OBS: När baslinjestabiliseringen är igång är nästa uppgift att injicera testföreningarna och byta plattor på fraktionsuppsamlaren om mer än en kommer att användas.
- Beredning av testsubstans injektat
- Ange namnen på föreningarna, önskade koncentrationer (slut- och stamlösningar) och injektionstider för testföreningarna i tabellen i användargränssnittet på injektionssidan. Bekräfta informationen som visas i programmet, inklusive volymer i MRM som finns kvar vid injektionstillfället och hur mycket stamlösning som ska injiceras för att uppnå önskade koncentrationer (tilläggsfigur 4).
- För att beräkna hur mycket perifusat och lager som behövs för injektionen, fyll i de vita rutorna i injektionstabellen och klicka på Beräkna. Späd stamlösningen av testsubstansen med perifusat före injektion med hjälp av de beräknade värdena så att den injicerade volymen är 5 % av volymen i MRM efter injektionen.
- Bered varje testförening genom att blanda stamlösningen och perifusatet. Ladda sprutorna i minst 10 minuter före injektionstiden och förvara dem i en CO2 -inkubator (som hålls vid temperaturer mellan 37 och 40 °C) tills de är redo att injiceras.
- Injicering av testföreningar
- Anslut sprutan som innehåller testmedlet till injektionsslangarna (Figur 9A). Lossa den mjukväggiga fanerslangen som leder till injektionsledningen och injicera långsamt testföreningarna (figur 9B) med en hastighet av cirka 3 ml/min. Kläm fast slangen på injektionsslangen igen och ta sedan bort sprutan (Figur 9C). Upprepa för den andra sidan av MRM.
- Efter injektion av varje testförening, förbered varje efterföljande testförening som ska injiceras enligt UI-injektionssidan.
- Bestämning av inflöde O2-signal för varje kanal
- I slutet av varje experiment injiceras andningshämmaren KCN (3 mM) för att bestämma inflödeslivstidssignalen för varje kanal som används för att korrigera för variationen i sensorns livslängd vid baslinjen och icke-mitokondriell förbrukning av syre.
6. Avsluta experimentet och bryta ner systemet (Tid: 30 min)
- Spara syredata
- Klicka på knappen Spara längst upp till vänster i graffönstret på syredetektorns programvara; Namnge filen och lagra den i mappen där filen ska lagras. Klicka på Stoppa inspelning knappen i huvudfönstret för att spara säkerhetskopian.
- Spara den experimentella informationsfilen för användargränssnittet
- Klicka på knappen Spara profil längst upp till vänster på användargränssnittets allmänna sida. Namnge filen och lagra den i mappen där filen ska lagras. På sidan Bråk och flöde i användargränssnittet klickar du på rullgardinsmenyn Verktyg och sedan på Spara. Behåll det genererade namnet eller välj ett annat och lagra filen där du vill. Vid behov finns det säkerhetskopior som kan nås och sparas.
- Bryter ner instrumentet
- Eftersom KCN är flyktigt, kassera fluidikenheter i ett dragskåp; häll media från MRM- och FC-avfallsbrickan i en avfallsbehållare och skölj MRM-insatserna och omrörningsstängerna noggrant med vatten. Häll innehållet i avfallsbehållaren (som innehåller KCN) i en märkt kemikalieavfallsbehållare för efterföljande bortskaffande av kemikaliesäkerhet. Före nästa experiment, rengör och autoklavera omrörningsstängerna och pincetten noggrant.
7. Databehandling (Tid: 15-45 min)
- Öppna databehandlingsprogrammet på en Mac- eller PC-dator. Välj datafilen .csv som genererats av ett experiment. Om experimentets protokoll liknar ett tidigare analyserat experiment väljer du inställningsfilen och klickar på Nästa steg. Annars klickar du bara på Nästa steg för att börja ange experimentets inställningar.
- Fyll i de olika inställningarna för experimentet. Vid bestämning av referenstidpunkt väljer du tidpunkten direkt innan KCN trädde i kraft och livstidsvärdena minskade. Välj den här punkten med hjälp av ett skjutreglage eller genom att skriva in tidsvärdet i rutan.
- Klicka på Beräkna för att generera OCR-grafer enligt ekvation 2:
OCR = ([O 2]in- [O 2]ut) x FR = (217 nmol/ml - [O 2]ut) x FR/vävnadsbas (ekv. 2)
därO2-koncentrationen i KRB i jämvikt med 21 % O2 vid 37 °C är 217 nmol/ml, FR är flödeshastigheten (i ml/min), vävnadsbas är mängden vävnad som laddas in i kammaren (dvs. antalet näthinnor, RPE-choroid-sclera eller RPE-celler). - Spara graferna som .pdf -filer genom att trycka på knappen Exportera graf . Rita OCR som antingen absoluta värden eller som en bråkdel av ett steady state-värde genom att markera rutorna som motsvarar testblandningen som ska ställas in på 1 på sidan för redigeringsinställningar.
8. Analyser av utflödesfraktioner
- Om proverna inte kan analyseras omedelbart efter försöket, placera plattorna vid 4 °C om de analyseras nästa dag, eller frysta om de förvaras längre. Om plattorna är frysta, tina proverna vid 4 °C (så att proverna förblir kalla).
- När analyser har utförts på de valda utflödesfraktionerna matas datakolumnerna (en per kanal) in i en .csv -fil med tid (i min) i kolumnen längst till vänster och koncentration i höger (i antingen nmol / ml eller ng / ml); En länk i databehandlingsprogrammet laddar upp en mall när du trycker på den.
- Ladda upp den här filen till dataprocessorn för att beräkna och plotta data.
Representative Results
För att illustrera upplösningen av data som genererades från isolerade komponenter i ögat mättes OCR och LPR med tre typer av vävnad (näthinna, RPE-choroid-sclera och RPE-celler) enligt ett vanligt använt protokoll (mitokondriellt stresstest10; Figur 10, Figur 11 och Figur 12). Mängden vävnad som används för varje vävnad visas i tabell 1. Data bearbetades och plottades med hjälp av det mjukvarupaket som utvecklats för fluidiksystemet. Beredningen av näthinnan och RPE-choroid-sclera är relativt enkel och tar mindre än 20 minuter för varje vävnadstyp. OCR var konstant under den tid som testsubstanserna injicerades, vilket tyder på stabil hälsa och funktion hos vävnaden och stöder metodens validitet (Figur 10). När vi väl har validerat för varje vävnadstyp har vi inte funnit det nödvändigt att genomföra kontroller där inga testsubstanser injiceras för varje experiment. I överensstämmelse med data erhållna med mer konventionella perifusionsmetoder 6,8,13, minskade OCR som svar på oligomycin och ökade OCR som svar på FCCP. Förändringar i LPR var i motsatt riktning mot de som observerades för OCR: oligomycin ökade LPR, som sedan minskade (men bara något) som svar på FCCP (Figur 11). För att jämföra den statistiska signifikansen av effekten av varje sekventiell testförening utfördes t-tester (som beräknas automatiskt av programvaran som medföljer instrumentet). Eftersom målet med uppsatsen var att beskriva hur man skulle utföra metoden var antalet burna replikat inte alltid tillräckligt högt för att ge statistisk signifikans. I allmänhet, när antalet replikat var 3 eller fler, var effekterna av FCCP och oligomycin på både OCR och LPR signifikanta.
RPE-celler har inte tidigare analyserats med flödessystem men svarat på liknande sätt på RPE-choroid-sclera (i överensstämmelse med uppfattningen att en stor del av OCR beror på RPE-celler; Figur 11). Dessa illustrativa exempel belyser systemets förmåga att upprätthålla vävnadens viabilitet, vilket återspeglas av OCR-stabiliteten i kontrollkanalerna och det höga signal-brusförhållandet för förändringar i OCR av den storleksordning som induceras av oligomycin och FCCP, vilket var mer än 100 till 1. Dessutom kan analyser av utflödesfraktioner användas för att korrelera upptagshastigheten eller produktionen av ett brett spektrum av föreningar som utbyter med den extracellulära vätskan är komplementära till OCR (i detta fall LPR). Dessa egenskaper hos instrumentet möjliggjorde noggrann kvantifiering av karakteristiska skillnader i vävnadsrespons mellan vävnadstyper som utfördes parallellt. OCR av RPE-choroid-sclera och RPE-celler är genomgående känsligare för oligomycin än näthinnan (Figur 11 och Figur 12), även om exponeringstiden för RPE-choroid-sclera inte var tillräckligt lång för att nå steady state. En punkt att tänka på uppstod när man använde DMSO som lösningsmedel. Vid högre koncentrationer (0,2 %) hade DMSO en övergående effekt på OCR via näthinnan (vilket förmodligen återspeglar en effekt av en förändring i osmotiskt tryck som orsakas av DMSO:s effekt på membranpermeabiliteten).
Baserat på antagandet att KCN helt hämmar andningen genom sin direkta verkan på cytokrom c-oxidas, sätts OCR i slutet av KCN-exponeringen till 0 och alla OCR-värden beräknas baserat på förändringen i förhållande till KCN-värdet. OCR kan förekomma oberoende av andningskedjan och cytokrom c-oxidas. Storleken på detta bidrag till den totala OCR är dock i allmänhet inte mer än några få procent (data visas inte) och den förlängda tid som vävnad exponeras för KCN säkerställer att substrat av oxidaser som inte ingår i elektrontransportkedjan har utarmats.
Statistisk analys
Enstaka experiment visades som indikeras i figurerna, men med flera kanaler som var medelvärdesbaserade. Data plottades sedan som medelvärdet ± medelfelet (SE; beräknat som SD/√n).
Figur 1. Schematisk bild av fluidik/bedömningssystem. Huvudkomponenterna inkluderar kapsling, temperaturkontrollelement, fluidik- och vävnadskammarsystem, reglering av gastrycket i huvudutrymmet ovanför perifusat, fraktionsuppsamlare/flödeshastighetsövervakning och O2-detektorer . Förkortningar: MRM = Media Reservoir Module, PCM = Perifusion Chamber Module, TCA = Tissue Chamber Assemblies. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. (A) Bild av instrumentets huvudkomponenter. Huvudkomponenterna består av gastank (tryckregulatorer), kapsling, fraktionsuppsamlare och dator. B) Experimentellt flödesschema som visar de viktigaste kategorierna av steg och den tid det tar att slutföra dem. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Vy över MRM. MRM visas med en MRM-insats (vänster) och omrörningsstänger (höger) placerade i botten av MRM-insatserna (placerade på varje sida av MRM-delaren). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Slangmontering och avluftningsslangsmontering i MRM. A) Enhet för insprutningsslang och spolslang för provblandning som är ansluten till portarna på MRM. (B-C) Injektionsenheten för testmassan och avluftningsslangen (B) placeras i spåret på framsidan av höljet (C). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5. Slå på MRM-temperaturregulatorn. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6. Vävnadskammare och gastank. Placering av O2 -detektorn på detektorstativet (som också stöder MRM och PCM), och placering av bandet runt fenorna på PCM som hjälper till att säkra vävnadskamrarna på plats. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7. (A) Hög- och lågtrycksregulatorer på bensintanken. (B-C) Töm röret. Avluftningsröret gör att huvudutrymmet i MRM kan rensas från luft och fyllas med gas från tillförseltanken. Bilder som visar öppet avluftningsrör (B) och stängt avluftningsrör (C). Insprutningsenheten för testmassan förblir stängd under hela reningsprocessen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8. Vävnadskammare och utloppsinställningen. (A) Mått på Transwell-membranet efter att det har skurits i tre remsor med samma bredd. (B) Stöd för utflöde av flera rör. (C) Utflödesstöd med flera rör placerat på höljets kant med slangadaptrarna nära vävnadskamrarna. (D) Bild av utflödesslangar som är fästa vid vävnadskamrarna. (E) Flygfoto av höljet utan lock. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9. Injektion av substans i MRM. Injicera en testförening genom injektionsporten i MRM med hjälp av en 5 ml spruta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10. OCR- och LPR-kurvor som svar på testföreningar. OCR och LPR via näthinnan som isolerats från möss (1 näthinna/kanal) som svar på närvaro eller frånvaro (kontroll) av testföreningar enligt anvisningarna. Varje kurva är medelvärdet av 6 replikat från ett enda experiment (felstaplarna är SE; p-värdena beräknas genom att utföra parade t-tester där steady state-värdena för varje testagent jämförs med värdena för föregående testagent). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 11. OCR-kurvor. OCR med RPE-choroid-sclera och näthinna isolerade från möss (1 näthinna eller 2 RPE-choroid-sclera/kanal) mätt parallellt som svar på testföreningar enligt anvisningarna. Data är medelvärdet av replikat från ett enda experiment (n = 2 och 4 för RPE-choroid-sclera respektive näthinnan; p-värdena beräknas genom att utföra parade t-tester där steady state-värdena för varje testämne jämförs med värdena för föregående testämne). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 12. OCR- och LPR-kurvor från RPE-celler. OCR och LPR från RPE-celler fästa vid transwell-membran som skars i remsor och laddades in i perifusionskamrarna. Data är medelvärdet av replikat från ett enda experiment (n = 3, med 1,5 membran/kanal (360 000 celler/kanal); p-värden beräknas genom att utföra parade t-tester där steady state-värden för varje testagent jämförs med värdena för föregående testmedium). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| VÄVNAD/CELL | Mängd/kanal | FLÖDESHASTIGHET: ml/min |
| Retina (mus) | 1 | 0.025 |
| RPE-choroid-sclera (mus) | 2 | 0.02 |
| RPE-celler på Transwell-membran | 360 000 celler (4 x 1/3 filterremsor) | 0.016 |
Tabell 1. Rekommenderade driftsspecifikationer för olika vävnader.
Kompletterande figur 1. Grafisk representation av experimentell design. Tidpunkt och sammansättning för exponering för testföreningar och tidpunkt för fraktionsinsamling. Koncentrationsökning (Conc Inc) är den förändring av koncentrationen som ska genomföras. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2. Användargränssnitt vid start. UI för startfönstret för O 2-detekteringsprogramvaran som övervakar O2 i vävnadskamrarna som sätts in i PCM. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3. Användargränssnitt för experimentinställningar. UI för inmatning av experimentell information (vänster) och val av tider för insamling av utflödesfraktioner (höger). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 4. Användargränssnitt för injektionssidan. Injektionssida som beräknar injektionsvolymer baserat på önskade koncentrationer av testsubstansen och den volym som finns kvar i MRM. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 1: Metoder för beredning av vävnadsprover. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
På grund av bioenergetikens betydelse för alla aspekter av cellfunktion och underhåll av olika komponenter i ögat finns det ett kritiskt behov av metoder för att studera dess reglering. I synnerhet är neural näthinna och RPE beroende av metabolism för både generering av energi samt intra- och intercellulär signalering14,15,16,17. På grund av deras höga oxidativa kapacitet är isolerade vävnader i ögat inte väl underhållna under statiska förhållanden18,19 och därför kräver studier av isolerade komponenter i ögat flödessystem som både kan upprätthålla och bedöma metaboliska processer. Fluidiksystemet utvecklades för att generera OCR- och LPR-data från ett brett spektrum av vävnadstyper och i denna artikel presenterade vi detaljerade protokoll som visade sig ge optimala resultat.
Den viktigaste faktorn för att generera robusta data med hjälp av flödessystemet inkluderar förjämvikt av CO2-baserade medier/buffert vid 39 °C (för att säkerställa att perifusat inte är övermättat med upplöst gas som skulle avgasas under experimentet). I synnerhet medier eller KRB-buffert som lagras vid 4 °C kommer att vara övermättade i förhållande till 37 °C och kommer att avgasas under experimentet om tiderna före jämvikt är otillräckliga. Dessutom får vävnad som laddas in i vävnadskamrarna inte traumatiseras av felaktig isolering av vävnad på grund av sönderrivning eller ofullständig separation av vävnad, eller genom att vävnad i låg mängd bikarbonatbaserad buffert exponeras för atmosfärisk luft under för lång tid. Temperaturkontrollen, flödesstabiliteten och tillförlitligheten för O2 -detektering har liten variabilitet och dessa faktorer bidrar inte nämnvärt till felfrekvensen.
Instrumentet har åtta flödeskanaler/vävnadskammare som löper samtidigt som förses med perifusat från två reservoarer, fyra vävnadskammare för varje reservoar. För att få de mest exakta tidsförloppen för OCR korrigeras kinetiska kurvor av baslinjekorrigerade av kammare som inte är belastade med vävnad. Således skulle ett typiskt experimentellt protokoll involvera två grupper av tre vävnadskammare. Protokoll kan i allmänhet delas in i två kategorier: den ena är de olika testföreningsprotokollen på varje sida (t.ex. läkemedel/vehikel på ena sidan av MRM och bara vehikel på den andra); Den andra är samma injektionsprotokoll för testsubstans på båda sidor av MRM, men olika vävnads- eller vävnadsmodell på varje sida av MRM. I denna artikel jämfördes effekterna av oligomycin och FCCP på näthinnan med OCR av vävnad som inte exponerades för några testföreningar, och två vävnader utvärderades samtidigt under samma protokoll och förhållanden för att identifiera vävnadsspecifikt beteende. Det senare illustrerades i denna studie genom att visa ökat dynamiskt omfång av ämnesomsättningen av RPE-choroid-sclera i förhållande till näthinnan parallellt i samma experiment. Andra rapporter har beskrivit ett bredare spektrum av studiedesigner, inklusive mätning av effekterna av varierandeO2-nivåer på OCR och LPR, och koncentrationsberoenden av bränslen, droger och toxiner20,21. Dessutom, även om vi har begränsat analysen av utflödesfraktioner till mätning av laktat och beräkning av LPR, ökar informationsinnehållet i ett experiment kraftigt om flera föreningar och klasser av föreningar i utflödesfraktionerna analyseras, såsom hormoner, neurotransmittorer, cellsignaler och metaboliter som kan lämna cellerna20,22, 23. veckor
Laddningen av isolerad näthinna eller RPE-choroid-sclera är okomplicerad, och när de väl har isolerats placeras dessa vävnader helt enkelt i toppen av vävnadskamrarna med pincett och får sjunka ner till frittan. RPE-celler odlade på filterinsatser utvecklar lämplig polarisering och markörer för RPE-mognad efter 4-8 veckor i odling. Det är inte möjligt att ta bort RPE för analys av levande celler när den väl är fäst vid transwell-membranet, om RPE-mognad och polarisering ska bibehållas24. Perifusionskammaren kan rymma remsor av transwell-membranet som skärs av med en skalpell medan de är nedsänkta i buffert och snabbt förs in i vävnadskamrarna. Även om skärning av filterremsor har placerats i ett statiskt system24, finns ingen annan fluidikmetod för att bedöma dessa viktiga celltyper tillgänglig. Responsen från RPE-cellerna var snabb och mer dynamisk än både näthinnan och RPE-choroid-sclera, sannolikt delvis på grund av omedelbar tillgång till både de apikala och basala aspekterna av RPE-cellerna konfigurerade som ett monolager på membraninsatsen.
En annan faktor för att säkerställa att data har den högsta signalen till brus är att välja det optimala förhållandet mellan vävnad som laddas in i perifusionskamrarna i förhållande till flödeshastigheten. För lite vävnad i förhållande till flödeshastigheten resulterar i en skillnad i upplöstO2-koncentration mellan inflöde och utflöde som är mycket liten och svår att mäta på ett tillförlitligt sätt. Däremot, om flödet är för långsamt, blir koncentrationen av O2 så låg att vävnaden påverkas av hypoxi. Ändå kan det gastrycksdrivna vätskeflödet bibehållas vid flödeshastigheter ner till 5 ml/min som endast kräver små mängder vävnad för noggranna OCR- och LPR-mätningar. I experimenten som visas här användes cirka 20 ml/min/kanal vilket var lämpligt för antingen en näthinna, två RPE-choroid-skleror eller 360 000 RPE-celler. För att minimera systemeffekterna som fördröjer och sprider vävnadens exponering för den injicerade testsubstansen, tillförs vävnadskamrarna i flera storlekar, så att mängden vävnad (och flödeshastigheten) matchas med lämplig storlek på kammaren.
Data från analyserna som visas i denna artikel representerades på två sätt: absolut magnitud med avseende på hastighet, eller fraktionella förändringar i förhållande till ett stabilt tillstånd eller baslinje. Fokus låg på illustration av mätning av respons på testsubstanser. Fluidiksystemet är dock väl lämpat för att bedöma och jämföra effekter av vävnadsbehandling före perifusionsanalysen, t.ex. genetiska modifieringar. Att testa om en behandling skiljer sig från kontroll är mest robust om effekterna av behandlingen på normaliserade svar av testsubstanser analyseras. Om analysen kräver absoluta magnituder maximeras den statistiska styrkan i analyserna av prover som förbehandlas om deras bedömning och kontroller utförs i samma perifusionsexperiment.
Förutom omröraren levereras alla delar som kommer i kontakt med vätska av tillverkaren som förbrukningsvaror och har steriliserats. Dessa delar bör inte återanvändas, eftersom experiment ibland kommer att gå förlorade på grund av ofullständig rengöring och förorenade ytor. Systemet i början av installationen är sterilt. Media tillsätts dock till MRM och vävnad laddas i kamrarna under icke-sterila förhållanden. Vi har mätt OCR i systemet som är sammansatt med delar som är sterila, men där själva experimentet utförs under icke-sterila förhållanden. Det tar cirka 14 timmar för bakterier att ackumuleras till den grad att de har mätbara OCR (opublicerade resultat). Om protokoll används som är mindre än 10 timmar eller så, kommer ackumulering av bakterier och eventuella effekter på grund av dessa att vara försumbara.
Många forskare använder instrument som är utformade för att mäta OCR under statisk inkubation av ett monolager av celler med en relativt hög genomströmning25,26. Däremot upprätthåller fluidikinstrumentet som vi har testat och beskrivit i denna artikel vävnad genom att säkerställa adekvatO2-leverans, vilket är avgörande för de större diffusionsavstånden som finns i vävnadsprover. Dessutom kan den samla in fraktioner som möjliggör bedömning av flera parametrar parallellt med OCR, vilket avsevärt förbättrar möjligheten att studera relationer mellan dem. Slutligen kan koncentrationer av lösta gaser (t.ex.O2 och CO 2 kontrolleras, vilket ökar varaktigheten av experiment med bikarbonatbaserade medier och buffert, vilket gör det möjligt för användaren att studera effekterna av O2 . Det bör påpekas att en begränsning för båda metoderna är oförmågan att studera urlakningen av testföreningar, en funktion som andra perifusionssystem har 4,27,28. En annan faktor att ta hänsyn till vid bestämning av den optimala analysmodaliteten är det faktum att fluidiksystem använder mer media och testföreningar än statiska system. Den extra kostnaden minimeras dock med de nuvarande fluidiksystemen på grund av de låga flödeshastigheterna som systemet kan användas.
Sammantaget beskrivs en detaljerad beskrivning av protokollen för att utföra experiment med ett nytt flödes-/bedömningsinstrument. Data som genererats med näthinnan och RPE-choroid-sclera rekapitulerade tidigare resultat som erhållits med system som är mycket svårare att använda (och inte lättillgängliga). Det visades också att systemet kan underhålla och bedöma RPE-celler fästa vid transwell-membran, en mycket viktig cellulär modell som inte tidigare har analyserats med flödessystem på grund av cellernas bräcklighet. Huvuddelarna av protokollet består av en 75 minuters ställtid, följt av en 90 minuters jämviktsperiod och det experimentella protokollet som gör det lämpligt för rutinmässig användning av laboratorier som inte är specialiserade på drift av fluidiksystem. Även om vi fokuserade på att mäta vävnadens akuta respons på testsubstanser, är systemet mycket lämpligt för att jämföra vävnad från olika källor, t.ex. djurmodeller eller cellmodeller som har förändrats genetiskt eller genomgått testbehandlingar/tillstånd. Dessutom är omfattningen av analyser som kan utföras på utflödesfraktionerna omfattande och inkluderar metaboliter, cellsignalmolekyler och utsöndrade hormoner/neurotransmittorer samt flerkomponentsanalys genererad av masspektrometri på fraktionerna såväl som vävnaden.
Disclosures
I.R.S., M.G. och K.B. har ekonomiska band till EnTox Sciences, Inc. (Mercer Island, WA), tillverkaren/distributören av perifusionssystemet BaroFuse som beskrivs i denna studie. Ingen av de övriga författarna uppger att det föreligger några intressekonflikter.
Acknowledgments
Forskningen finansierades av anslag från National Institutes of Health (R01 GM148741 I.R.S.), U01 EY034591, R01 EY034364, BrightFocus Foundation, Research to Prevent Blindness (J.R.C.) och R01 EY006641, R01 EY017863 och R21 EY032597 (J.B.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BIOLOGICAL SAMPLES | |||
| C57BL/6J mice | Envigo Harlan (Indianapolis, IN) | N/A | |
| REAGENTS | |||
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920L9795 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270G | |
| KCN | Sigma-Aldrich | 60178 | |
| Lactate | MilliporeSigma | L6661 | |
| Oliigomycin A | Sigma-Aldrich | 75351L9795 | |
| CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING | |||
| Beuthanasia-D | Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ | N/A | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital | Virbac | RXEUTHASOL | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | 12303C | |
| Hank’s Buffered Salt Solution | GIBCO | 14065056 | |
| Krebs Ringer Bicarbonate (KRB) | Thermo Fisher Scientific | J67795L9795 | |
| Matrigel | ThermoFisher | #CB-40230 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| ROCKi | Selleck Chemicals | Y-27632 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25-200-072 | |
| SUPPLIES | |||
| Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2 | Praxair Distribution, Inc | N/A | |
| Transwell filters | MilliporeSigma | 3470 | |
| COMMERCIAL ASSAYS | |||
| Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit | ThermoFisher | A22189 | |
| Glucose Oxidase from Aerococcus viridans | Invitrogen (Carlsbad, CA) | A22189L9795 | |
| Lactate Oxidase | Sigma-Aldrich | L9795 | |
| EQUIPMENT | |||
| BaroFuse Multi-Channel Perifusion system | EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA | Model 001-08 | |
| Synergy 4 Fluorometer | BioTek (Winooski, VT) | S4MLFPTA |
References
- Lacy, P. E., Walker, M. M., Fink, C. J. Perifusion of isolated rat islets in vitro: Participation of the microtubular system in the biphasic release of insulin. Diabetes. 21 (10), 987-998 (1972).
- Doliba, N. M., et al. Metabolic and ionic coupling factors in amino acid-stimulated insulin release in pancreatic beta-HC9 cells. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (6), E1507-E1519 (2007).
- Sweet, I. R., et al.
- Chertov, A. O., et al.
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Bisbach, C. M., et al. Succinate Can Shuttle Reducing Power from the Hypoxic Retina to the O2-Rich Pigment Epithelium. Cell Reports. 31 (5), 107606 (2020).
- Du, J., et al. Inhibition of mitochondrial pyruvate transport by zaprinast causes massive accumulation of aspartate at the expense of glutamate in the retina. The Journal of Biological Chemistry. 288 (50), 36129-36140 (2013).
- Hass, D. T., et al. Succinate metabolism in the retinal pigment epithelium uncouples respiration from ATP synthesis. Cell Reports. 39 (10), 110917 (2022).
- Kamat, V., et al. Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism. Elife. 10, e66716 (2021).
- Stryer, L. Biochemistry. , 4th edn, Freeman and Company, New York. (1995).
- Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).
- Engel, A. L., et al. Extracellular matrix dysfunction in Sorsby patient-derived retinal pigment epithelium. Experimental Eye Research. 215, 108899 (2022).
- Zhang, R., et al. Inhibition of Mitochondrial Respiration Impairs Nutrient Consumption and Metabolite Transport in Human Retinal Pigment Epithelium. Journal of Proteome Research. 20 (1), 909-922 (2021).
- Hurley, J. B. Retina Metabolism and Metabolism in the Pigmented Epithelium: A Busy Intersection. Annual Review of Vision Science. 7, 665-692 (2021).
- Xiao, J., et al. Autophagy activation and photoreceptor survival in retinal detachment. Experimental Eye Research. 205, 108492 (2021).
- Okawa, H., Sampath, A. P., Laughlin, S. B., Fain, G. L. ATP consumption by mammalian rod photoreceptors in darkness and in light. Current Biology. 18 (24), 1917-1921 (2008).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. , 100846 (2020).
- Yu, J., et al. Emerging strategies of engineering retinal organoids and organoid-on-a-chip in modeling intraocular drug delivery: Current progress and future perspectives. Advanced Drug Delivery Reviews. 197, 114842 (2023).
- Arjamaa, O., Nikinmaa, M. Oxygen-dependent diseases in the retina: role of hypoxia-inducible factors. Experimental Eye Research. 83 (3), 473-483 (2006).
- Kamat, V., et al. A Versatile Multi-Channel Fluidics System for the Maintenance and Real-Time Metabolic and Functional Assessment of Tissue or Cells. Cell Reports Methods. In Press. , (2023).
- Neal, A., et al. Quantification of Low-Level Drug Effects Using Real-Time, in vitro Measurement of Oxygen Consumption Rate. Toxicological Sciences. 148 (2), 594-602 (2015).
- Jung, S. R., et al. Reduced cytochrome C is an essential regulator of sustained insulin secretion by pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 286 (20), 17422-17434 (2011).
- Rountree, A. M., et al. Control of insulin secretion by cytochrome C and calcium signaling in islets with impaired metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 289 (27), 19110-19119 (2014).
- Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).
- Jarrett, S. G., Rohrer, B., Perron, N. R., Beeson, C., Boulton, M. E. Assessment of mitochondrial damage in retinal cells and tissues using quantitative polymerase chain reaction for mitochondrial DNA damage and extracellular flux assay for mitochondrial respiration activity. Methods in Molecular Biology. 935, 227-243 (2013).
- Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2008).
- Doliba, N. M., Qin, W., Vinogradov, S. A., Wilson, D. F., Matschinsky, F. M. Palmitic acid acutely inhibits acetylcholine- but not GLP-1-stimulated insulin secretion in mouse pancreatic islets. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 299 (3), E475-E485 (2010).
