Summary
En in vitro-model af knoglemarvsvaskulær niche etableres ved såning af mesenkymale og endotelceller på præfabrikerede 3D PEG-hydrogeler. Nichernes endotelnetværk, ECM-komponenter og ALP-aktivitet varierer afhængigt af den anvendte vækstfaktor. Platformen kan bruges til avancerede kræftmodeller.
Abstract
Knogle og knoglemarv er stærkt vaskulariserede og strukturelt komplekse organer, og er steder for kræft og metastase dannelse. In vitro-modeller , der rekapitulerer knogle- og knoglemarvsspecifikke funktioner, herunder vaskularisering, der er kompatible med lægemiddelscreening, er meget ønskelige. Sådanne modeller kan bygge bro mellem forenklede, strukturelt irrelevante todimensionelle (2D) in vitro-modeller og de dyrere, etisk udfordrende in vivo-modeller . Denne artikel beskriver et kontrollerbart tredimensionelt (3D) cokulturassay baseret på konstruerede poly(ethylenglycol) (PEG) matricer til generering af vaskulariserede, osteogene knoglemarvsnicher. PEG-matrixdesignet muliggør udvikling af 3D-cellekulturer gennem et simpelt cellesåningstrin, der ikke kræver indkapsling, hvilket muliggør udvikling af komplekse samkultursystemer. Desuden er matricerne gennemsigtige og præfabrikerede på glasbundne 96-brønds billeddannelsesplader, hvilket gør systemet egnet til mikroskopi. Til analysen beskrevet her dyrkes humane knoglemarvsafledte mesenkymale stromale celler (hBM-MSC'er) først, indtil der dannes et tilstrækkeligt udviklet 3D-cellenetværk. Derefter tilsættes GFP-ekspressive humane navlestrengendotelceller (HUVEC'er). Kulturudviklingen efterfølges af lysfelt- og fluorescensmikroskopi. Tilstedeværelsen af hBM-MSC-netværket understøtter dannelsen af vaskulære strukturer, der ellers ikke ville dannes, og som forbliver stabile i mindst 7 dage. Omfanget af vaskulær netværksdannelse kan let kvantificeres. Denne model kan indstilles mod en osteogen knoglemarvsniche ved at supplere dyrkningsmediet med knoglemorfogenetisk protein 2 (BMP-2), som fremmer den osteogene differentiering af hBM-MSC'erne, vurderet ved øget alkalisk fosfatase (ALP) aktivitet på dag 4 og dag 7 af co-kultur. Denne cellulære model kan bruges som en platform til dyrkning af forskellige kræftceller og studere, hvordan de interagerer med knogle- og knoglemarvsspecifikke vaskulære nicher. Desuden er det velegnet til automatisering og analyser med højt indhold, hvilket betyder, at det ville muliggøre screening af kræftmedicin under meget reproducerbare dyrkningsforhold.
Introduction
Knogle- og knoglemarven er strukturelt og funktionelt komplekse organer, der er centrale for menneskers sundhed. Dette afspejles af eksistensen af forskellige nicher, der regulerer hæmatopoiesis og knoglevedligeholdelse1. Det er nu almindeligt accepteret, at i sund knoglemarv styres vedligeholdelse og udvidelse af hæmatopoietiske og skeletale stamceller såvel som deres afkom af forskellige nicher. Disse nicher omfatter forskellige celletyper, herunder osteolineageceller, mesenkymale stamceller, endotel- og perivaskulære celler, neuronale og gliaceller, adipocytter, osteoklaster, makrofager og neutrofiler2. Ikke overraskende er disse for det meste vaskulaturassocierede nicher også involveret i udviklingen af forskellige typer leukæmi3 og er stedet for metastase for forskellige kræftformer4. På grund af dets specifikke roller i knogledannelse, ombygning og vedligeholdelse af knogler (marv) har den knogleassocierede vaskulatur forskellige specialiserede strukturer, der adskiller sig fra vaskulaturen, der findes andre steder i kroppen 5,6,7. Således kan antiangiogene eller vaskulaturmodulerende lægemidler, der anvendes systemisk, have forskellige virkninger inden for disse specialiserede miljøer8. Derfor er modeller til at undersøge de molekylære mekanismer, der er involveret i at opretholde knogler og knoglemarvs fysiologiske egenskaber, knogler og knoglemarvsregenerering og reaktioner på terapeutiske behandlinger meget ønskelige.
Klassiske todimensionelle (2D) vævskulturer og in vivo-undersøgelser ved hjælp af dyremodeller har givet uvurderlig indsigt i rollerne for forskellige celler og molekylære aktører, der er involveret i udviklingen af knogle- og knoglemarv 9,10. Modeller, der giver mulighed for high-throughput eksperimenter med relevante humane celler, kan forbedre vores forståelse af, hvordan man modulerer udvalgte parametre i disse meget komplekse systemer.
I det sidste årti er principper afledt af vævsteknik blevet anvendt til at generere 3D-vævsmodeller11,12. Disse har for det meste været afhængige af indkapsling af vævsrelevante celler i biomaterialer for at etablere 3D-mono- eller cokulturer13. Blandt de mest anvendte biomaterialer er fibrin14, kollagen 15 og Matrigel16,17, som alle er meget biokompatible og giver passende betingelser for vækst af mange celletyper. Disse biomaterialer har evnen til at generere in vitro-modeller, der rekapitulerer nøgleaspekter af de forskellige vaskulære nicher, der findes in vivo18. Desuden har brugen af mikrofluidiske anordninger til generering af perfunderede vaskulære knogle- og knoglemarvsmodeller bidraget til genereringen af in vitro-modeller med højere kompleksitet 19,20,21,22.
Vanskeligheden ved at kontrollere sammensætningen og konstruere egenskaberne af naturligt forekommende biomaterialer har inspireret udviklingen af syntetiske analoger, der rationelt kan designes med forudsigelige fysiske, kemiske og biologiske egenskaber23,24. Vi har udviklet fuldt syntetiske faktor XIII (FXIII) tværbundne poly (ethylenglycol) (PEG) -baserede hydrogeler, som er funktionaliseret med RGD-peptider og matrixmetalloprotease (MMP) spaltningssteder for at lette cellebinding og ombygning25,26. Det modulære design af disse biomaterialer er med succes blevet brugt til at optimere betingelserne for dannelsen af 3D vaskulariserede knogle- og knoglemarvsmodeller27,28.
Til test af et større antal forskellige dyrkningsforhold og nye behandlinger kræves modeller med en højere gennemstrømningskapacitet. Vi har for nylig vist, at FXIII-tværbindingen af vores PEG-hydrogel kan styres gennem en elektrokemisk proces, således at der dannes en dybtgående hydrogelstivhedsgradient29. Når celler tilsættes oven på sådanne hydrogeler, migrerer de mod det indre og udvikler sig gradvist til stærkt sammenkoblede 3D-cellulære netværk30. Afskaffelsen af behovet for at indkapsle celler i hydrogelen, som normalt er til stede med andre 3D-stilladser, forenkler ikke kun det eksperimentelle design, men tillader også sekventiel tilsætning af forskellige celletyper på forskellige tidspunkter for at generere komplekse samkultursystemer. Disse hydrogeler er tilgængelige præfabrikerede på glasbundne 96-brønds billeddannelsesplader, hvilket gør etableringen af 3D-kulturer opnåelig ved manuelle såvel som automatiserede cellesåningsprotokoller. Den optiske gennemsigtighed af PEG-hydrogelerne gør platformen kompatibel med mikroskopi.
Her præsenterer vi en ligetil metode til generering og karakterisering af vaskulariserede osteogene nicher inden for denne brugsklare, syntetiske plug-and-play-platform. Vi viser, at udviklingen af vaskulære netværk kan stimuleres med en vækstfaktor, der almindeligvis anvendes til at inducere in vitro osteogenese, knoglemorfogenetisk protein-2 (BMP-2), mens osteogen differentiering kan forhindres ved tilskud af fibroblastvækstfaktor 2 (FGF-2)27,31. De dannede netværk er forskellige sammenlignet med FGF-2-stimulerede netværk med hensyn til det overordnede udseende såvel som celle- og ECM-fordelingen. Desuden overvågede vi den osteogene induktion ved hjælp af alkalisk fosfatase som markør. Vi demonstrerer det øgede udtryk for denne markør over tid og sammenligner udtrykket med det i FGF-2-stimulerede netværk ved hjælp af kvalitative og kvantitative metoder. Endelig demonstrerer vi egnetheden af de genererede nicher i denne model til to potentielle applikationer. For det første udførte vi et proof-of-concept lægemiddelfølsomhedsassay ved at tilføje bevacizumab til præformede nicher og overvåge nedbrydningen af de vaskulære netværk i dets tilstedeværelse. For det andet tilføjede vi MDA-MB-231 brystkræft og U2OS osteosarkomceller til præformede osteogene nicher, hvilket viser, at nicherne kan bruges til at studere interaktioner mellem kræftceller og deres miljø.
Protocol
Figur 1 opsummerer følgende protokolafsnit.
1. Etablering af 3D stromalmonokultur
- Klargør hBM-MSC-cellesuspensionen.
- Dyrk hBM-MSC'er til et sammenløbsniveau på 70%-90% i MEMα suppleret med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin og 5 ng/ml FGF-2 i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2 i en befugtet atmosfære. Cellerne kan anvendes indtil passage 6.
- Cellerne vaskes med PBS, og afmonteres med 0,05% trypsin-EDTA i 3-5 minutter ved 37 °C. Stop løsrivelsesprocessen ved at skylle med basalmedium (MEMα suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin). De suspenderede celler samles i et 50 ml konisk centrifugerør.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmatocytometer eller en automatiseret celletæller, og bestem det samlede antal celler i suspensionen.
- Ppellet cellerne ved centrifugering ved 200 x g i 5 min. Supernatanten fjernes forsigtigt.
- Resuspender cellerne i en passende mængde basalmedium for at opnå en koncentration på 1 x 107 celler/ml stamopløsning.
- Der fremstilles 50 ml koniske centrifugeglas indeholdende det krævede volumen basalmedium suppleret med de respektive vækstfaktorer (FGF-2 og BMP-2 ved definerede koncentrationer, f.eks. 0 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml eller 200 ng/ml). Pr. brønd kræves 200 μL. Hvis cellesåning skal udføres ved hjælp af en automatiseret væskehåndterer, skal du også overveje instrumentets døde volumen. Til manuel cellesåning er et volumenoverskud på 10% tilstrækkeligt.
- Der tilsættes hBM-MSC'erne fra stamopløsningen ved en fortynding på 1:66,67 for at opnå en koncentration på 1,5 x 105 celler/ml.
- Forbered pladen til såning.
- Fjern polypropylenklæbefilmen, der dækker hydrogelpladen med 96 brønde.
- Aspirer forsigtigt opbevaringsbufferen, der dækker hydrogelerne. Brug en mikropladeskive til denne opgave; Manuel håndtering er dog mulig.
- Når du bruger en manuel aspirator eller multikanalpipette, skal du placere spidsen mod brøndens væg og langsomt bevæge dig ned mod kanten af den indre brønd, mens bufferen suges. Dette undgår at beskadige hydrogeloverfladen.
- Når du bruger en automatiseret pladevasker, skal du indstille aspirationsdyserne mindst 3,8 mm fra pladebæreren (dette svarer til 0,8 mm fra hydrogelpladens indre ring) og mod kanten af brønden. Se producentens manual for mere detaljerede instruktioner og for at få pladetegningerne af 96-brønds hydrogelpladen.
- Der tilsættes 200 μL/hul af cellesuspensionen fremstillet i trin 1.1.7 efter grundig blanding for at sikre, at cellerne fordeles homogent. Under såning, for at undgå ujævn sedimentering af cellerne i et område af substratet, må du ikke vippe pladen. Til manuel såning blandes cellesuspensionen regelmæssigt (efter såning af tre huller) for at holde blandingen homogen. Til automatiseret såning blandes med en serologisk pipet umiddelbart før dispensering for at dispensere volumener, der indeholder lige mange celler.
- Kulturerne holdes på 37 °C og 5% CO2 i en befugtet atmosfære.
- Overvåg udviklingen af kulturerne ved lysfeltmikroskopi med et 5x mål efter ønske. Hent referencebilleder ca. 30 minutter efter såning for at evaluere antallet af tilføjede celler.
2. Etablering af 3D stromal-endotelcelle co-kultur
- Forbered GFP-HUVE-cellesuspensionen.
- Der fremstilles kolber til HUVEC-kulturen ved overtrækning med en opløsning bestående af 150 μg/ml rottehalekollagen I i 0,02 M eddikesyre i 30 minutter ved 37 °C. Skyl én gang med PBS før brug.
- Væksten i GFP-HUVEC'erne til et sammenløbsniveau på 80-100 % i EGM-2 suppleret med 10 % FBS i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i en befugtet atmosfære. Cellerne kan anvendes indtil passage 7.
- Cellerne vaskes med PBS, og afmonteres med 0,05% Trypsin-EDTA i 2-3 minutter ved 37 °C. Stop løsrivelsesprocessen ved at skylle med basalmedium (MEMα suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin). De suspenderede celler samles i et 50 ml konisk centrifugerør.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmatocytometer eller en automatiseret celletæller, og bestem det samlede antal celler, der er til stede i suspensionen.
- Ppellet cellerne ved centrifugering ved 200 x g i 5 min. Supernatanten fjernes forsigtigt.
- Resuspender cellerne i en passende mængde basalmedium for at opnå en koncentration på 1 x 107 celler/ml stamopløsning.
- Der fremstilles 50 ml koniske centrifugeglas indeholdende det krævede volumen basalmedium suppleret med de respektive vækstfaktorer (FGF-2 og BMP-2 ved definerede koncentrationer, f.eks. 0 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml eller 200 ng/ml) som beskrevet for hBM-MSC'erne i trin 1.1.6.
- GFP-HUVEC'erne fra stamopløsningen tilsættes i en fortynding på 1:66,67 for at opnå en koncentration på 1,5 x 105 celler/ml som beskrevet for hBM-MSC'erne i trin 1.1.7.
- Substratet suges ud af pladen med stromalmonokulturen som beskrevet for bufferfjernelsen i trin 1.2.2.
- Der tilsættes 200 μL/hul af GFP-HUVEC-cellesuspensionen fremstillet i trin 2.1.8 som beskrevet for hBM-MSC-tilsætningen i trin 1.3.
- Der inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i befugtet atmosfære. Skift mediet hver 3-4 dage.
- Overvåg udviklingen af kulturen ved lysfelt- og fluorescensmikroskopi ved hjælp af et 5x mål efter ønske. Bevar kulturerne indtil dag 4 eller dag 7 i samkulturen for henholdsvis tidlige eller mellemliggende karakteriseringer eller efter ønske.
3. Karakteriseringsprocedure 1: Kvantificering af dannelse af endotelcellenetværk
- På de ønskede tidspunkter erhverves GFP-signalet fra GFP-HUVEC'erne med fluorescensmikroskopi ved hjælp af indstillinger, der er egnede til kvantificering (dvs. bedste fokus, høj kontrast og lav forstørrelse [f.eks. 5x] for større synsfelter).
- Forbehandle alle de billeder, der er taget samme dag (f.eks. ved hjælp af Fiji32) for yderligere at forbedre kontrasten. Bemærk, at GFP-signalet kan blive svagere med kulturtid; Derfor kan billeder, der er erhvervet på forskellige dage, have brug for forskellig behandling.
- Hvis du bruger Fiji eller ImageJ, skal du åbne alle GFP-kanalbilleder med samme tidspunkt og åbne menuen Lysstyrke og kontrast . Vælg et billede, der repræsenterer en mellemliggende tilstand (ikke det svageste og ikke det klareste signal), og juster kontrasten automatisk ved at vælge Auto. Vælg Indstil, og markér Overfør til alle andre åbne billeder.
- Vurder visuelt, om det område, der automatisk vælges, passer til alle billederne på det aktuelle tidspunkt, og juster og formidl manuelt til alle billederne efter behov.
- Gem de justerede billeder som TIF-filer, og gentag trin 3.2.1 og trin 3.2.2 for de andre erhvervede tidspunkter.
- Anvend et mediansløringsfilter (f.eks. radius 3 for 2048x2048-billeder) på alle billederne for at undgå artefaktgenkendelse nedstrøms og dermed lette nøjagtig netværksidentifikation. Reducer størrelsen ved at binning (2x2), og gem alle forbehandlede billeder som gråtone-RGB Color TIF-filer i en mappe til kvantificering. Disse trin kan udføres manuelt eller i batchtilstand ved hjælp af makroer, som forfatterne deler efter anmodning.
- Analysér alle billederne i den mappe, der blev oprettet i trin 3.1-3.3, ved hjælp af tilstanden Batchproces i angiogeneseanalysatoren til ImageJ33. Bemærk, at afhængigt af størrelsen på billederne og den tilgængelige arbejdshukommelse kan dette tage et par minutter pr. billede.
- Valider kvantificeringsresultaterne ved at undersøge overlejringerne af de anerkendte strukturer og de originale billeder. Hvis algoritmen genkender kunstige strukturer, hvor kun få eller ingen celler kan ses i det originale billede, skal du justere forbehandlingsparametrene og analysere de originale billeder igen eller udelukke sådanne problematiske områder og / eller replikere billeder fra analysen.
- Normaliser de opnåede værdier til et areal på 1 mm 2 ved at multiplicere værdierne for hver prøve med forholdet mellem det analyserede område og 1 mm2. Dette trin er af særlig betydning, hvis der bruges billeder i forskellige størrelser.
- Uddrag forskellige netværksparametre, såsom den samlede netværkslængde, antal kryds, antal segmenter, antal isolerede segmenter, forgreningsinterval og gennemsnitlig maskestørrelse, fra analysen, og brug dem til at karakterisere endotelnetværket på forskellige tidspunkter og under forskellige dyrkningsforhold.
4. Karakteriseringsprocedure 2: Vurdering af ECM-deponering
- Ved de ønskede sluttidspunkter vurderes ECM-aflejring ved hjælp af immunofluorescens. Der tilsættes primære antistoffer mod forskellige ECM-molekyler i 100 μL af dyrkningsmediet i løbet af de sidste 6 timers dyrkning eller efter fiksering, som beskrevet nedenfor.
- Kulturerne vaskes én gang med 200 μL/hul PBS i 5 minutter ved RT, og fikseres med 100 μL/hul 4% paraformaldehyd under en kemisk damphætte i 30 minutter ved RT. Bemærk, at det anbefales at fastgøre alle hullerne på en plade på samme tid, da de omgivende kulturer kan blive beskadiget under dette trin. De faste kulturer vaskes med 200 μL/hul PBS ved RT tre gange i 5 minutter hver gang, og der opbevares PBS ved 4 °C i 200 μL/hul, eller fortsæt straks til næste trin.
- Før inkubation med primære antistoffer mod ECM-molekyler efter fiksering inkuberes de faste kulturer med 200 μL/hul 1% BSA i PBS som en blokerende opløsning i 30 minutter ved RT.
- Den blokerende opløsning suges til syn, og den primære antistofopløsning inkuberes med 100 μL/hul i 1 % BSA i PBS natten over ved 4 °C. Der vaskes med 200 μL/hul PBS tre gange i henholdsvis 5 min, mindst 3 timer og 5 minutter ved RT.
BEMÆRK: Det lange vasketrin er nødvendigt for fuldstændig diffusion af det ubundne antistof ud af hydrogelen.
- Den blokerende opløsning suges til syn, og den primære antistofopløsning inkuberes med 100 μL/hul i 1 % BSA i PBS natten over ved 4 °C. Der vaskes med 200 μL/hul PBS tre gange i henholdsvis 5 min, mindst 3 timer og 5 minutter ved RT.
- For at lette penetrationen af den sekundære farvningsopløsning, herunder intracellulære modpletter, permeabiliseres kulturerne ved hjælp af 0,3% Triton X-100 og 1% BSA i PBS i 30-90 minutter ved RT, afhængigt af kulturernes cellulære tæthed.
BEMÆRK: Ved antistofbaseret farvning af intracellulære molekyler skal dette trin udføres før inkubation med det primære antistof, der er beskrevet i trin 4.1.2. - Forbered sekundære farvningsopløsninger, der indeholder de respektive sekundære antistoffer og modpletter efter ønske (f.eks. En nuklear plet såsom DAPI og en cytoskeletal plet såsom phalloidin-rhodamin).
- Forbered en farvningsbuffer bestående af 0,1% Triton X-100, 1% BSA i PBS og modpletter (f.eks. 1 μg / ml DAPI og 1: 4.000 phalloidin-rhodamine), og tilsæt de respektive sekundære antistoffer ved de anbefalede fortyndinger.
- Der tilsættes 100 μL/hul sekundær farvningsopløsning, og der inkuberes natten over ved 4 °C. I lighed med proceduren efter den primære antistofinkubation vaskes med 200 μL/hul PBS tre gange i henholdsvis 5 min, mindst 3 timer og 5 minutter ved RT.
- Til 3D-opløsning af strukturerne skal du erhverve konfokale stabler, der starter ved glasbunden med et z-trin på 2,5 μm, der når en endelig højde på 500 μm, bruge et 10x mål og en 0,75x digital zoom. For at generere en 3D-rekonstruktion af GFP- og F-actin-signalet i Fiji skal du reducere hver kanal separat, før du opretter en sammensætning og genererer rekonstruktionen ved hjælp af Fiji 3D Viewer.
- Til visualisering af den deponerede ECM fra immunfarvningerne erhverves konfokale stakke med en højde på 100 μm med et z-trin på 5 μm, et 10x mål og en 1,5x digital zoom. Generer maksimale intensitetsfremskrivninger, og juster lysstyrken og kontrasten for hver kanal separat i Fiji, før du opretter en sammensætning.
- Udfør direkte farvefarvninger af det ekstracellulære miljø.
- Der tilsættes 200 μL/hul Picrosirius Red farvningsopløsning til de paraformaldehydfikserede huller, og der inkuberes i 1 time ved RT.
- Vask derefter de farvede brønde fem gange med destilleret vand, efterfulgt af vask to gange hver dag eller hver anden dag i 3-4 dage, mens du overvåger prøvens farverensning. Opbevar pladerne ved 4 °C under de lange vasketrin (dvs. alt, hvad der overstiger 6 timer).
- Få billeder af de farvede prøver ved hjælp af et lysfeltmikroskop udstyret med et farvekamera, og oprethold en lige hvidbalance på tværs af forholdene. For at få overblik over prøverne skal du bruge en lav forstørrelse (f.eks. 2,5x) til at scanne hele brønden. Hvis mikroskopet ikke leveres med software, der understøtter automatiseret syning, skal du gøre det manuelt (f.eks. Brug af parvis syning i Fiji34).
BEMÆRK: De brønde, der tidligere blev brugt til immunfluorescens, kan bruges til dette, forudsat at fluorescensbilledoptagelsen er afsluttet. - Følg de samme trin, der er beskrevet for Picrosirius Red-farvning i trin 4.2.1-4.2.3 for at udføre Alizarin Red-farvning, vask og billeddannelse.
5. Karakteriseringsprocedure 3: Vurdering af osteogen differentiering ved overvågning af ALP-aktivitet
- Ved forskellige kultursluttidspunkter (f.eks. Dag 4 og dag 7 af samkultur) skal du kvantitativt vurdere ALP-aktivitet ved hjælp af 5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) / nitroblå tetrazolium (NBT) farvning.
- Kulturerne vaskes én gang med 200 μL/hul PBS, før de inkuberes med BCIP/NBT-substratopløsningen, som skal fremstilles efter fabrikantens anvisninger. Der inkuberes ved 37 °C, mens farveudviklingen overvåges periodisk. Når farven begynder at udvikle sig under ikke-osteogene forhold, vaskes straks en gang med 200 μL/hul PBS, før den fikseres med 4% paraformaldehyd, som beskrevet i trin 4.1.1.
- Hent farvebilleder af de farvede prøver som beskrevet i trin 4.2.3 til Picrosirius Red-farvning.
- Ved forskellige kultursluttidspunkter (f.eks. Dag 4 og dag 7 i samkultur) kvantificeres ALP-aktiviteten i cellelysaterne.
- Kulturerne vaskes tre gange med 200 μL/hul PBS, før de inkuberes med 200 μL/hul med 0,25% trypsin-EDTA ved 37 °C. Hvert 10. minut omrøres kulturerne ved kraftigt at pipettere op og ned for at lette fordøjelsen og overvåge kulturmorfologien med et standard cellekulturmikroskop.
- Når en flydende, enkeltcellesuspension uden aflange cellulære strukturer i brøndene er opnået (typisk efter 20-30 min), overføres prøverne til 2 ml rør, tilsættes 200 μL MSC basalmedium for at hæmme trypsinet, og centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter for at pelletere de udtagne celler. Supernatanten dekanteres, pellets fryses ved -80 °C, eller trin 5.2.3 fortsættes direkte.
- Cellepillerne opnået i trin 5.2.2 optøs, og der inkuberes med 500 μL lysisbuffer bestående af 0,56 M 2-amino-2-methyl-1-propanol, 0,2% Triton X-100, pH 10, i 30 minutter på is. Derefter centrifugeres ved 16.100 x g i 10 minutter ved 4 °C, og prøverne opbevares på is. Efter målingerne beskrevet i trin 5.2.7 fryses prøverne ved -20 °C eller -80 °C eller fortsættes direkte med DNA-kvantificeringen som beskrevet i trin 5.2.8.
BEMÆRK: Lysisbufferen kan fremstilles på forhånd, sterilfiltreres og opbevares ved 4 °C. - Der fremstilles ALP-reagenset bestående af 20 mM 4-nitrophenylphosphatdinatriumsalthexahydrat og 4 mMMgCl2 i lysisbuffer.
BEMÆRK: Det er bedst at forberede denne opløsning frisk på kvantificeringsdagen. - Uden at forstyrre pelleteret affald hældes 50 μL af cellelysatsupernatanten, der er fremstillet i trin 5.2.3, i hullerne i en standardplade med 96 huller i vævskultur i to eksemplarer. Føj lysisbuffer til to brønde som tomme kontrolelementer.
- Med en multikanalpipette tilsættes 50 μL/hul ALP-reagens til hullerne, der er påfyldt trin 5.2.5. Ryst pladen kortvarigt, og inkuber ved 37 °C i 10 min beskyttet mod lys. Brønde med højere ALP-aktivitet vises gule. Reaktionen standses ved tilsætning af 100 μL/hul 1 M NaOH ved hjælp af en multikanalpipette.
- Den optiske tæthed ved 410 nm aflæses ved hjælp af en pladelæser. Beregne gennemsnittet af de tekniske dubletter og trække gennemsnittet af de tomme kontrolelementer fra.
- Udfør DNA-kvantificering for at normalisere ALP-aktiviteten bestemt i de foregående trin mod det samlede cellenummer. Her beskrives en metode baseret på fluorescensmålinger, men enhver anden metode til DNA-kvantificering i cellelysater er kompatibel med analysen. Forbered de reagenser og DNA-standarder, der kræves til DNA-kvantificering ved hjælp af kommercielt tilgængelige sæt i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge lysisbuffer til fremstilling af DNA-standarderne. - Hvis prøverne anvendt til ALP-kvantificering som beskrevet i trin 5.2.3 var frosne, tøs de op, centrifugeres ved 16 100 x g i 2 minutter ved 4 °C, og de lægges på is. Uden at forstyrre pelleteret affald hældes 50 μL af cellelysatsupernatanten i hullerne på en sort plade med 96 brønde i to eksemplarer. Prøverne fryses ved -20 °C eller -80 °C, og om nødvendigt gentages ALP- og DNA-kvantificeringerne. Tilføj DNA-standarderne i dubletter.
- Med en multikanalpipette tilsættes 50 μL DNA-farvningsmiddel, inkuberes og læses fluorescensintensiteten i henhold til producentens anvisninger. Brug standardkurveværdierne til at bestemme og anvende konverteringen af de målte intensitetsværdier til DNA-koncentrationerne.
- ALP-værdierne opnået i trin 5.2.7 normaliseres ved at dividere dem med den respektive DNA-koncentration af hver prøve.
6. Anvendelse 1: Udførelse af lægemiddelfølsomhedsanalyser
- Når endotelnetværkene er fuldt udviklede (typisk på dag 4 i stromalendotelcellesamkulturerne), tilsættes antiangiogene forbindelser, såsom bevacizumab, til kulturerne i frisk dyrkningsmedium og testes deres aktivitet over tid og under forskellige betingelser (f.eks. forskellige koncentrationer af FGF-2 eller BMP-2).
- Indtil da fremstilles et frisk dyrkningsmedium, der indeholder de samme vækstfaktorer, som anvendes til de respektive kulturer.
- Forbered en kontrolopløsning bestående af fortyndingsmidlet af det pågældende stof (f.eks. til bevacizumab: 60 mg/ml α-trehalosedihydrat, 0,4 mg/ml Tween20, 5,8 mg/ml natriumphosphat, monobasisk og monohydrat og 1,2 mg/ml natriumphosphatdibasisk, vandfrit), og filtrer det sterilt.
- Der tilsættes den relevante forbindelse ved den ønskede koncentration (f.eks. 10 μg/ml bevacizumab) og et tilsvarende volumen kontrolopløsning til det dyrkningsmedium, der er beregnet til henholdsvis test- og kontrolbetingelserne.
- Indtil da fremstilles et frisk dyrkningsmedium, der indeholder de samme vækstfaktorer, som anvendes til de respektive kulturer.
- Substratet suges ud af kulturen, og der tilsættes 200 μL/hul af det frisklavede substrat i trin 6.1.1. Inkuber i et tidsrum, der er passende for det stof, der skal testes (f.eks. for bevacizumab: 2 dage). Overvåge kulturudviklingen og karakterisere endotelnetværkene som beskrevet i afsnit 3. Vurder forbindelsens effektivitet til at hæmme angiogenese eller ablere de præformede strukturer ved hjælp af GFP-billederne og de kvantitative netværksparametre ekstraheret fra analysen beskrevet i trin 3.7.
7. Anvendelse 2: Etablering af avancerede samkultursystemer med forskellige kræftcelletyper
- På dag 4 af co-kultur, når endotelnetværkene for det meste er etableret, tilføj andre celletyper, såsom MDA-MB-231 eller U2OS kræftceller, til kulturerne i frisk dyrkningsmedium.
- Mærk kræftcellerne ved hjælp af et cellekompatibelt levende farvestof i henhold til producentens anvisninger for at kunne skelne dem fra GFP-mærkede HUVEC'er og ikke-mærkede hBM-MSC'er i co-kulturerne.
- Der fremstilles en suspension af kræftceller i en koncentration på 1,5 x 104 celler/ml i frisk dyrkningsmedium, der indeholder de samme vækstfaktorer, som anvendes til de respektive kulturer, indtil dette tidspunkt.
- Overvåg kulturudviklingen og lokaliseringen af kræftceller efter ønske.
BEMÆRK: Afhængigt af kræfttype, aktivitet og miljø kan det tage et par dage for dem at nå de vaskulære strukturer i stromalendotelcelle-cokulturerne (f.eks. 2 dage for MDA-BM-231 og U2OS). Derfor bør time-lapse-billeddannelsen til visualisering af kræft-vaskulære celleinteraktioner tidsindstilles i overensstemmelse hermed.
Representative Results
Vaskulære nichekulturer blev etableret ved sekventiel såning af hBM-MSC'er og GFP-HUVEC'er på præfabrikerede PEG-baserede hydrogeler med en stivhedsgradient inden for en 96-brønds billeddannelsesplade (figur 1). Kulturerne blev overvåget i længderetningen via levende epifluorescensmikroskopi og yderligere karakteriseret på udvalgte tidspunkter. Det ekstracellulære rum blev vurderet via direkte farvefarvninger og antistofbaserede farvninger. ALP-aktivitet blev kvantificeret efter hentning og lysering af cellerne fra de genererede nicher. Desuden demonstrerer vi egnetheden af denne platform til antiangiogene lægemiddelfølsomhedsanalyser og som grundlag for kræftkulturmodeller.
Co-kulturer af hBM-MSC'er og GFP-ekspressive HUVEC'er blev etableret ved såning af 3 x 104 celler/brønd i fravær af vækstfaktorer eller i nærvær af enten FGF-2 eller BMP-2 ved 50 ng/ml, som beskrevet i protokollen. Fra et tidligt tidspunkt kunne forskelle mellem kulturerne observeres både fra lysfelts- og fluorescensbillederne, der kun viste GFP-HUVEC'erne (figur 2A). Ved at observere de samme områder i længderetningen kunne forskelle i udviklingen af kulturerne bemærkes, såsom en hurtigere udvikling i nærvær af FGF-2. Generelt syntes kulturerne mindre udviklede i mangel af nogen vækstfaktor, med færre celler af begge typer spredning og tilstedeværelsen af acellulære områder. I modsætning hertil viste lysfeltbillederne de mest tætte kulturer i nærvær af BMP-2. Imidlertid blev vaskulære netværk dannet under både vækstfaktorholdige forhold og de mest omfattende og sammenkoblede netværk dannet med FGF-2. Disse observerede forskelle kunne også kvantificeres ved hjælp af angiogeneseanalysator til ImageJ. Faktisk var den samlede netlængde højest ved tilstedeværelse af FGF-2 og lavest i mangel af vækstfaktorer (figur 2B). Antallet af knudepunkter, der angiver forgreningspunkter i nettene, fulgte samme tendens som den samlede længde (figur 2C). Omvendt indeholdt begge vækstfaktorholdige betingelser signifikant færre isolerede segmenter, hvilket indikerer højere sammenkobling, end tilstanden uden vækstfaktor (figur 2D). Derudover afslørede 3D-konfokal billeddannelse stærkere endotelcellepenetration med hensyn til dybde i den FGF-2-stimulerede tilstand (figur 2E).
hBM-MSC/GFP-HUVEC-cokulturer blev opretholdt i 7 dage i nærværelse af FGF-2 eller BMP-2, før de blev fikseret og farvet til ECM-komponenter. Immunocytokemiske farvninger efterfulgt af konfokal laserscanningsmikroskopi viste slående forskelle i kulturmorfologi afhængigt af typen af vækstfaktortilskud (figur 3A). Med FGF-2 blev kulturen organiseret i kondenserede mikrovaskulære strukturer, som var tætte i både endotel- og mesenkymale celler, mens hBM-MSC'erne i nærvær af BMP-2 strakte sig over et meget større område, som det fremgår af de mere omfattende F-actin-positive og GFP-negative områder. ECM-proteinerne fibronectin og kollagen I blev lokaliseret på en lignende måde, mens laminin og kollagen IV var mere koncentreret omkring endotelstrukturerne. Denne øgede koncentration omkring endotelstrukturerne var imidlertid meget mere udtalt i nærvær af FGF-2 end i nærvær af BMP-2. Ud over de antistofbaserede farvninger blev der udført direkte farvefarvninger for at vurdere den samlede fibrotiske tilstand af ECM (Picrosirius Red farvning; Figur 3B) samt aflejring af Ca på ECM (Alizarin Red farvning; Figur 3C) af de dannede nicher. Picrosirius Red-farvningen var stærkere og mere omfattende i nicherne dyrket med BMP-2, og Alizarin Red-farvningen fulgte den samme tendens.
Dernæst blev kulturerne karakteriseret med hensyn til deres osteogene potentiale ved at vurdere ALP-aktivitet som en tidlig osteogen markør. På dag 4 og dag 7 af co-kultur blev celler hentet fra nicherne ved at fordøje hydrogelerne med Trypsin. For at kvantificere ALP-aktiviteten blev de hentede celler lyseret, og der blev udført et pNPP-assay. De opnåede værdier blev normaliseret mod det samlede DNA for hver prøve for at tage højde for potentielle forskelle i cellenumrene på tværs af betingelser. Faktisk kunne der observeres små forskelle mellem DNA-indholdet af betingelserne, og de færreste celler blev hentet fra tilstanden uden nogen vækstfaktor (ikke vist). Den normaliserede ALP-aktivitet varierede imidlertid meget på tværs af forholdene med en tendens til stigende aktivitet med højere koncentrationer af BMP-2 og et plateau ved 100 ng / ml (figur 4A, B). De laveste aktivitetsniveauer blev identificeret for tilstanden indeholdende 50 ng/ml FGF-2. Mens lignende tendenser kunne observeres for begge de vurderede tidspunkter, steg alle værdierne signifikant over tid i kultur fra dag 4 til dag 7. Ud over det kvantitative assay kunne ALP-aktiviteten kvalitativt visualiseres ved hjælp af direkte farvefarvning baseret på BCIP/NBT-substratkonvertering. Mere omfattende og mere intens lilla farvning blev observeret i nærvær af BMP-2 sammenlignet med FGF-2 (figur 4C).
For at demonstrere to potentielle anvendelser af de karakteriserede osteogene nicher blev der udført en proof-of-concept lægemiddelfølsomhedsundersøgelse og kræftcokulturer. Til lægemiddelfølsomhedsanalysen blev bevacizumab eller en kontrolopløsning bestående af fortyndingsmidlet af bevacizumabformuleringen tilsat til dyrkningsmediet indeholdende frisk BMP-2. På dag 4, da etablerede netværk blev dannet i nærværelse af 50 ng/ml BMP-2, blev enten kontrolopløsningen eller det bevacizumabholdige medium tilsat under den regelmæssige medieændring, og kulturerne blev overvåget ved hjælp af fluorescensbilleddannelse. Tilføjelsen af 10 μg/ml bevacizumab førte til tilbagetrækning eller ablation af det tidligere dannede netværk, mens kontroltilstanden stadig indeholdt omfattende netværk 2 dage efter medieændringen (figur 5A,B). Disse ændringer kan også kvantificeres ved at spore den samlede længde af netværkene ved hjælp af angiogeneseanalysator til ImageJ på fluorescensbilleder, der er taget dagligt (figur 5C). Alternativt kan bevacizumab eller enhver anden forbindelse også tilsættes fra begyndelsen af samkulturen for at vurdere deres indflydelse på dannelsen af netværkene. I tilfælde af bevacizumab hæmmede dette fuldstændigt dannelsen af endotelnetværk (ikke vist).
Til den anden applikation blev MDA-MB-231 brystkræft eller U2OS osteosarkomceller tilsat til dag 4 co-kulturer med en densitet på 1,5 x 103 celler / brønd i frisk dyrkningsmedium indeholdende 50 ng / ml BMP-2. For at skelne dem fra de GFP-mærkede HUVEC'er og de ikke-mærkede hBM-MSC'er blev kræftcellerne inkuberet med CellTrace FarRed lige før såningen på de osteogene nicher. Kulturerne blev overvåget ved fluorescensmikroskopi; I begyndelsen lokaliserede de fleste kræftceller nær overfladen af substratet, men efter 2 dage kunne de findes tættere på lagene indeholdende de vaskulære cokulturer. Således blev dag 2 valgt som udgangspunkt for time-lapse mikroskopi for at vise dynamikken i interaktionerne mellem kræftcellerne og cellerne inden for den vaskulære niche. Interessant nok kunne MDA-MB-231-cellerne ses både nærme sig og bevæge sig væk fra endotelstrukturer og dermed muligvis undersøge eller ombygge deres miljø (figur 5D). Ved hjælp af CellTrace FarRed som en etiket for kræftcellerne, GFP som en etiket for HUVEC'er og yderligere farvning for F-actin kunne alle celletyper skelnes ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi (figur 5E).
Figur 1: En simpel tilgang til pålidelig generering af vaskulariserede, osteogene nicher. Præfabrikerede syntetiske hydrogeler med en dybdegående stivhedsgradient muliggør generering af 3D-kulturer via sekventiel cellesåning uden behov for direkte indkapsling. hBM-MSC'er dyrkes i 3 dage, før GFP-udtrykkende HUVEC'er tilsættes. Kulturerne overvåges ved at erhverve lysfelt- og GFP-signaler i længderetningen. På udvalgte tidspunkter evalueres nicherne yderligere for deres ECM-aflejring og osteogene tilstand. Alkalisk fosfataseaktivitet vurderes via direkte farvefarvning og ved at hente celler fra nicherne og udføre et pNPP-assay på cellelysaterne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Stimulering af vaskulære netværk med FGF-2 eller BMP-2. (A) Bright-field og fluorescens (GFP) billeder blev erhvervet på dag 2, dag 4 og dag 6 af co-kultur af celler dyrket i fravær af vækstfaktorer eller i nærvær af FGF-2 eller BMP-2, begge ved 50 ng / ml. Skalabjælke: 400 μm. (B-D) Kvantificerede parametre for GFP-HUVEC-netværkene afbildet på dag 4 af co-kultur, analyseret ved hjælp af angiogeneseanalysator til ImageJ. Dataene er repræsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. Den statistiske analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 9.5.1. En almindelig envejs ANOVA med Dunnetts multiple sammenligningstest blev udført med n ≥ 4; * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. (E) Tredimensionelle rekonstruktioner genereret fra konfokale stakke (samlet højde: 547,5 μm; z-trin: 2,5 μm) af GFP- og F-actinsignalerne for FGF-2- (øverste række) og BMP-2- (nederste række) stimulerede forhold. Skalabjælke: 300 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Induktion af delokaliseret hBM-MSC-spredning og ECM-aflejring med BMP-2. (A-C) De 7-dages samkulturer, der blev dyrket i nærværelse af enten FGF-2 eller BMP-2, blev udsat for (A) immunofluorescens eller (B,C) direkte farvefarvning. (A) Kulturerne blev farvet for F-actin og ECM-proteinerne fibronectin, laminin, kollagen I og kollagen IV. Billederne viser de maksimale intensitetsfremskrivninger af de konfokale stakke (total højde: 100 μm; z-trin: 5 μm). Skalabjælke: 200 μm. (B,C) Kulturerne blev farvet ved hjælp af (B) Picrosirius Red og (C) Alizarin Red. Den øverste række viser syede, helbrøndsoversigter over de billeder, der er taget ved 2,5x forstørrelse (skalabjælke: 1.000 μm), mens den nederste række viser et synsfelt opnået ved 5x forstørrelse (skalabjælke: 400 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Biokemisk vurdering af BMP-2-induceret ALP-aktivitet gennem direkte farvefarvning. (A,B) ALP-aktiviteten blev bestemt i cellelysater af kulturer dyrket i fravær af vækstfaktorer eller i nærvær af BMP-2 i forskellige koncentrationer eller FGF-2 ved 50 ng/ml i (A) 4 dage eller (B) 7 dages samkultur. ALP-aktiviteten vises normaliseret til DNA-indholdet i hver lysatprøve. Dataene er repræsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. Den statistiske analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 9.5.1. En almindelig envejs ANOVA med Dunnetts multiple sammenligningstest blev udført med n = 5; P < 0,0001. (C) Direkte farvefarvning af ALP-aktiviteten i nicher dyrket i nærværelse af 50 ng / ml FGF-2 eller BMP-2 i 7 dages samkultur. Billederne i venstre side viser syede helbrøndsoversigter over billeder erhvervet ved 2,5x forstørrelse (skalabjælke: 1.000 μm), mens billederne i højre side viser et synsfelt erhvervet ved 5x forstørrelse (skalabjælke: 400 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Anvendelse af osteogene, vaskulariserede nicher i avancerede kræftmodeller. (A) GFP-signalerne fra kulturer dyrket i nærvær af BMP-2 blev afbildet på dag 4 af co-kultur, før en kontrolopløsning (venstre) eller bevacizumab ved 10 μg/ml (højre) blev tilsat i 2 dage, hvorefter kulturerne blev afbildet igen (dag 6 i co-kultur). Skalabjælke: 600 μm. (B) Billeder med højere forstørrelse af de bevacizumab-behandlede kulturer er vist i A. Skalabjælke: 250 μm. (C) Den samlede længde af endotelnetværkene som vist i A blev kvantificeret ved hjælp af angiogeneseanalysator til ImageJ fra billeder taget dagligt; n ≥ 3. (D) CellTrace FarRed-mærket MDA-MB-231 brystkræftceller blev tilføjet til de 4-dages co-kulturer, der blev dyrket i nærværelse af BMP-2, og time-lapse-billeder blev erhvervet startende 2 dage efter kræftcelletilsætningen. Skalabjælke: 100 μm. (E) Fremskrivninger af maksimal intensitet af konfokale stakke (samlet højde: 70 μm; z-trin: 2,4 μm) af tredobbelte cokulturer genereret som beskrevet i D og fastgjort og farvet for F-actin. Til venstre: nicher med MDA-MB-231 brystkræftceller; højre: nicher med U2OS osteosarkomceller. Skalabjælker til billeder til venstre: 200 μm; Skalabjælker til billeder til højre: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Her beskriver vi en protokol for etablering af en in vitro-model af højvaskulariserede knogle- og knoglemarvsnicher i en fuldt syntetisk og kontrollerbar 3D PEG-baseret matrix, som har en række anvendelser inden for knogle- og knoglemarvsbiologiforskning, vævsteknik og kræftforskning. Denne model bygger på en syntetisk PEG-baseret hydrogel, der er funktionaliseret med RGD-peptider og MMP-spaltningssteder og er støbt med en dybdegående densitetsgradient på glasbundne 96-brønds billeddannelsesplader30. Denne plug-and-play-platform viste sig at tillade etablering af stærkt sammenkoblede 3D-cellulære netværk uden behov for at indkapsle celler i hydrogelen. I lighed med den tidligere beskrevne celleindkapslingsprotokol viser vi i dette arbejde ombygningen af substratet med en celleiboende ECM28 for at skabe et celletypespecifikt mikromiljø. Med denne metode kan lægemiddelscreeningsanalyser og analyser med højt indhold således let udføres under meget reproducerbare, organotypiske 3D-kulturbetingelser. Pladerne med 96 brønde med glasbund og de optisk gennemsigtige hydrogeler gør platformen kompatibel med automatisering af væskehåndtering og mikroskopi med høj kapacitet.
Det første skridt i genereringen af en osteogen vaskulær knoglemarvsniche er forkulturen af hBM-MSC'er på PEG-hydrogelen i mindst 3 dage. I løbet af denne tid fastgøres de til hydrogelen, trænger ind i den og begynder at etablere cellecellekontakter og ECM-aflejring. Før såning af hBM-MSC'erne skal opbevaringsbufferen fjernes. Da hydrogelen er placeret inde i en indre brønd inden for standardbrønden på 96-brøndens billeddannelsesplade, er det sikkert at indsætte aspirationsspidsen langs siden af brønden, indtil den berører den indre brøndring. En vakuumpumpe kan bruges til aspiration, hvis den er indstillet til den lavest mulige sugekraft. Alternativt kan en automatiseret pladevasker med dysehøjden justeret til mindst 0,8 mm over den indre brøndring bruges til at opsuge bufferen fra hydrogelpladen. Brug af automatisering til væskehåndtering kan minimere skader på hydrogeloverfladen og føre til højere reproducerbarhed af de resulterende kulturer. Små defekter på hydrogeloverfladen bliver synlige, når cellerne sætter sig på hydrogelen og vises på et lavere fokusplan i defekte hydrogelområder. Derfor tjener erhvervelse af referencebilleder på dag 0 som en god kvalitetskontrol for cellesåningshomogeniteten og hydrogeloverfladeintegriteten. Mens små hydrogeloverfladefejl ikke udelukker yderligere brug af brønden, har cellerne tendens til at klynge sig på de defekte områder og kan vokse til ikke-repræsentative mønstre eller hurtigere nå bundglasset, hvor de vokser til et monolag. Disse artefakter skal noteres, når disse brønde anvendes/evalueres. Lignende overvejelser gælder for eventuelle medieændringer, der udføres i hele assayets varighed.
Det andet trin i protokollen involverer tilsætning af GFP-HUVEC'er til den præformede hBM-MSC-monokultur (dag 0 i co-kultur). ECM deponeret af hBM-MSC giver et stort stillads til vækst af endotelceller, som i dette arbejde, selv i nærvær af hBM-MSC-konditioneret medium, kun kunne danne runde celleklynger på hydrogelerne (ikke vist). Ved såning på hBM-MSC-kulturerne integrerer og danner HUVEC'erne mikrobeholderlignende strukturer, der kan sammenlignes med dem, der observeres i co-kulturer genereret ved celleindkapsling27,28. Typisk dannes veludviklede 3D mikrovaskulære netværk inden for 4 dage efter samkultur, og dette kan overvåges i længderetningen ved brug af GFP-mærkede HUVEC'er. Disse strukturer kan opretholdes i mindst 7 dage i kultur, hvilket betyder, at der er tilstrækkelig tid til at følge ændringer i den vaskulære netværksorganisation som reaktion på behandlinger, såsom til screening af antiangiogene lægemidler. De morfologiske elementer i endotelnetværket kan kvantificeres i batch-tilstand ved at segmentere GFP-billederne ved hjælp af veletablerede værktøjer, såsom Angiogenesis Analyzer-pluginet i ImageJ33, og deres parametre kan bruges til at evaluere for eksempel lægemiddeleffektivitet og farmakodynamik.
En væsentlig fordel ved den beskrevne cellulære model til mange potentielle anvendelser er dens plasticitet. Blot at supplere kulturmediet med forskellige vækstfaktorer kan ændre co-kulturens udseende. For eksempel skaber tilstedeværelsen af BMP-2 i hele mono- og cokulturperioden en osteogen vaskulær niche, der viser øget ALP-aktivitet, ekstracellulær calciumaflejring samt ECM-samling og aflejring. Tværtimod, i nærvær af FGF-2 er de osteogene markører fraværende, og cokulturen danner færre laterale celleforeninger, men viser mere udtalt 3D-cellevækst. Det faktum, at FGF-2 undertrykker ALP-aktivitet, mens BMP-2 fremkalder stærkere ALP-aktivitet sammenlignet med ingen vækstfaktorbehandling, er i overensstemmelse med tidligere observationer27. På trods af disse store forskelle i hBM-MSC stromalkomponenten var omfanget af det mikrovaskulære netværk meget ens for de to vækstfaktorbehandlede tilstande i dette arbejde. I kontrolkulturerne blev der kun dannet nogle få korte vaskulære netværk, der måske repræsenterer en dårligt vaskulariseret knoglemarvsniche. Dette tyder på, at ved blot at ændre typen, koncentrationen og timingen af vækstfaktorerne tilsat dyrkningsmediet, kunne der produceres en række veldefinerede vaskulariserede knoglemarvsnicher, som det ville være nødvendigt for sammenlignende undersøgelser. For at sikre reproducerbare resultater er det imidlertid vigtigt at bemærke, at dyrkningsprogressionen og morfologien kan variere afhængigt af de anvendte cellers historie (f.eks. passagenummer og løsrivelsesmetode, der anvendes under rutinemæssig vedligeholdelse af kulturer), og det tilrådes at kontrollere for sådanne faktorer under analysedesignet.
Her demonstrerer vi som en første anvendelse af denne model følsomheden af de konstruerede mikrovaskulære netværk over for behandling med 10 μg/ml bevacizumab. Det er især vigtigt at bekræfte, at den anvendte algoritme nøjagtigt kan genkende endotelnetværket, da artefakter ofte genereres i billeder med dårligt udviklede netværk. Hvis dette er tilfældet, skal de parametre, der bruges til billedbehandling (før og under segmentering), finjusteres, ofte på trial-and-error-basis.
Som en anden applikation præsenterer vi en avanceret cokulturmodel dannet ved sekventiel såning af mesenkymale, endotel- og kræftceller. Denne model giver mulighed for at studere interaktionerne mellem kræftceller, stromaen og knoglemarvens vaskulatur, hvilket kan være vigtige faktorer under metastaser. Derudover kan denne model bruges til lægemiddelscreeningsapplikationer og testforbindelser med mål ud over angiogenese.
I 2D-kulturer modtager celler ikke fysiologiske mikromiljøsignaler, erhverver ikke naturligt forekommende cellemorfologier og skelner derfor forskelligt sammenlignet med celler i native 3D-miljøer35. Når de dyrkes i konstruerede 3D-hydrogeler, deponerer cellerne tidligt en iboende ECM, som giver vedhæftningssteder og aktivt kan ombygges28,36. Her, for at etablere en forenklet 3D-model til screeningsapplikationer, blev kardannende celler podet på overfladen af konstruerede hydrogeler og tilladt at etablere vaskulære netværk i fravær af perfusion. De billeddannelsesbaserede evalueringer blev udført på 2D-projektioner af endotelcellerne, der bidrager til vaskulære strukturer. Imidlertid afslørede kun konfokale billeder den mindre udtalte indvækst af de 3D vaskulære netværk i BMP-2-stimulerede prøver sammenlignet med de FGF-2-stimulerede prøver. Dette tyder på, at længden af de dannede vaskulære strukturer blev undervurderet, mens deres forbindelse blev overvurderet. Derudover er interaktioner mellem perivaskulære og endotelceller og vaskulær lumendannelse ikke undersøgt. Disse aspekter, navnlig med hensyn til narkotikabehandlingstiltag, vil kræve yderligere opmærksomhed. Endelig ville raffinerede protokoller til først at etablere omfattende 3D-vaskulære netværk og først derefter fremkalde deres osteogene differentiering være ønskelige for at generere mere fysiologiske knogle- og knoglemarvsmodeller.
Samlet set er modellen, der præsenteres her, meget alsidig og kan let skræddersys til specifikke applikationer. For eksempel kan mesenkymale og endotelceller fra forskellige kilder anvendes. Det er kendt, at fedtvævs-MSC'er og navlestrengs-MSC'er udtrykker forskellige angiogene faktorer sammenlignet med BM-MSC'er, og de kan let erstattes som en alternativ stromalkomponent37. Endotelceller isoleret fra allerede definerede knoglemarvsnicher kunne også anvendes i stedet for HUVEC'er. Man kunne også etablere co-kulturen med patientafledte, matchende knoglemarv mesenkymale og endotelceller til personlig medicin applikationer, som det for nylig er blevet foreslået for vaskulariserede muskel co-kulturer38. Derudover tillader hydrogelpladens design langsgående overvågning af kulturen med både lysfelt- og fluorescensmikroskopi, hvilket giver brugeren mulighed for at forkorte eller forlænge dyrkningstiden afhængigt af applikationen. Alternativt kan celletæthederne, der anvendes til såning, justeres i overensstemmelse hermed for at fremskynde eller forsinke dannelsen af cellenetværket, hvis der er behov for kortere eller længere observationstider end dem i denne protokol. Under alle omstændigheder er forsigtighed nødvendig for at undgå celleovervækst i arklignende strukturer, hvilket kan føre til sammentrækning af hydrogelen og eventuel cellefrigørelse.
Endelig kan en bred vifte af assays udføres ved hjælp af denne model. Ud over immunfluorescens og mikroskopi udført i levende eller faste kulturer kan 3D-kulturerne fordøjes enzymatisk, og cellerne kan hentes og udsættes for enhver form for biokemisk analyse. Her demonstrerer vi bestemmelsen af ALP-aktivitet og kvantificering af DNA-indhold i cellelysater ved hjælp af kolorimetriske / fluorometriske assays, men systemet er kompatibelt med mange andre teknikker, herunder PCR, RNAseq og proteomics. Hvis følsomheden af det ønskede assay ikke er særlig høj, kan man samle prøver fra mere end én brønd for at øge mængden af prøve, der er tilgængelig til analysen. Hvis den ønskede anvendelse kræver hurtigere gelopløsning, kan orbital omrystning af pladen påføres i kombination med mindre mængder af fordøjelsesopløsningen for at sikre hvirveldannelse i brøndene, forudsat at alle brønde på pladen vil blive brugt på denne måde (levende kulturer er følsomme over for sådan hård håndtering). Sammenfattende præsenterer vi her en protokol, der, hvis den bruges som beskrevet, garanterer genereringen af en in vitro-model , der rekapitulerer nøgleaspekterne af osteogene vaskulære nicher, men også er alsidig nok til at blive ændret til skræddersyede applikationer.
Disclosures
Ectica Technologies AG er producent af 3DProSeed hydrogel brøndplade og har kommercielle interesser. Benjamin R. Simona og Martin Ehrbar er aktionærer i Ectica Technologies AG.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Riccardo Urbanet for teknisk assistance med væskehåndteringsenhederne og Rodi Odabasi for støtte med epifluorescensmikroskopi. Dette arbejde blev finansieret af Swiss National Science Foundation (bevillingsnumre 310030E_202429 og 205321_204318) og Ectica Technologies AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 2 mL microtubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 2-Amino-2-methyl-1-propanol | Sigma | A9199 | |
| 3DProSeed hydrogel well plate | Ectica Technologies | ECT.PS1.001.096 | |
| 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma | 71768 | |
| Alizarin Red S | Sigma | A5533 | |
| Anti-Collagen IV antibody | Abcam | ab6311 | |
| Anti-Laminin 1+2 antibody | Abcam | ab7463 | |
| Automated plate washer | Agilent Biotek | ELχ50 | |
| Automated washer/dispenser | Agilent Biotek | MULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette | |
| Bevacizumab | Evidentic | ID PS-E07-2019-00119 A009 | |
| BMP-2 | Peprotech | 120-02C | |
| BSA | AppliChem | A1391 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | To centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Stellaris 5 | |
| Conical 50 mL centrifuge tubes | TPP | 91050 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 406406 | |
| DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 405312 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Epifluorescence microscope | Leica | DMI6000B | |
| FBS | Gibco | 10500-064 | |
| FGF-2 | Peprotech | 100-18B | |
| Fibronectin (IST-9) | Santa Cruz | sc-59826 | |
| GFP-HUVECs | PELOBiotech | PB-CAP-0001GFP | |
| hBM-MSCs | - | - | Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359 |
| Inverted microscope | Zeiss | 200M | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cell line | - | Kindly obtained from J Massagué at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | |
| MEMα | Gibco | 22571-038 | |
| Multimode imaging reader | Agilent Biotek | Cytation 1 | For automated imaging |
| Multimode imaging reader - fluorescence and absorbance | Agilent Biotek | Cytation 5 | For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis |
| Paraformaldehyde | Artechemis | US 040 | |
| PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phalloidin-rhodamine | Invitrogen | R415 | |
| Picro-Sirius Red Solution | Abcam | ab246832 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | ThermoFisher Scientific | P7589 | |
| Recombinant Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab260043 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Sigma | B5655-25TAB | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1064981000 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Sigma | S-0876 | |
| Sodium phosphate monobasic, monohydrate | Merck | 1.06346 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween20 | AppliChem | A4974 | |
| U2OS osteosarcoma cell line | - | Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich | |
| α-trehalose dihydrate | Sigma | 90208 |
References
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Calvi, L. M., Link, D. C. Cellular complexity of the bone marrow hematopoietic stem cell niche. Calcified Tissue International. 94 (1), 112-124 (2014).
- Behrmann, L., Wellbrock, J., Fiedler, W. Acute myeloid leukemia and the bone marrow niche-take a closer look. Frontiers in Oncology. 8, 444 (2018).
- Yip, R. K. H., et al. Mammary tumour cells remodel the bone marrow vascular microenvironment to support metastasis. Nature Communications. 12 (1), 6920 (2021).
- Potente, M., Makinen, T. Vascular heterogeneity and specialization in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 477-494 (2017).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y. Organotypic vasculature: From descriptive heterogeneity to functional pathophysiology. Science. 357 (6353), (2017).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Barillari, G. The anti-angiogenic effects of anti-human immunodeficiency virus drugs. Frontiers in Oncology. 10, 806 (2020).
- Owen, M., Friedenstein, A. J. Stromal stem-cells - Marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Foundation Symposia. 136, 42-60 (1988).
- Sacchetti, B., et al. Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment. Cell. 131 (2), 324-336 (2007).
- Traore, M. A., George, S. C.
- Bessy, T., Itkin, T., Passaro, D. Bioengineering the bone marrow vascular niche. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 645496 (2021).
- Bray, L. J., et al. A three-dimensional ex vivo tri-culture model mimics cell-cell interactions between acute myeloid leukemia and the vascular niche. Haematologica. 102 (7), 1215-1226 (2017).
- Montano, I., et al. Formation of human capillaries in vitro: The engineering of prevascularized matrices. Tissue Engineering Part A. 16 (1), 269-282 (2010).
- Sun, Z. Y., Kemp, S. S., Lin, P. K., Aguera, K. N., Davis, G. E. Endothelial k-RasV12 expression induces capillary deficiency attributable to marked tube network expansion coupled to reduced pericytes and basement membranes. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 42 (2), 205-222 (2022).
- Kleinman, H. K., et al.
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement-membrane in the morphological-differentiation of human-endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
- Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods in Molecular Biology. 1066, 17-28 (2013).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
- Wang, X. L., et al. Engineering anastomosis between living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Lab on a Chip. 16 (2), 282-290 (2016).
- Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature Biotechnology. 23 (1), 47-55 (2005).
- Kyburz, K. A., Anseth, K. S. Synthetic mimics of the extracellular matrix: How simple is complex enough. Annals of Biomedical Engineering. 43 (3), 489-500 (2015).
- Ehrbar, M., et al. Enzymatic formation of modular cell-instructive fibrin analogs for tissue engineering. Biomaterials. 28 (26), 3856-3866 (2007).
- Ehrbar, M., et al. Biomolecular hydrogels formed and degraded via site-specific enzymatic reactions. Biomacromolecules. 8 (10), 3000-3007 (2007).
- Blache, U., et al. Dual role of mesenchymal stem cells allows for microvascularized bone tissue-like environments in PEG hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 5 (4), 489-498 (2016).
- Blache, U., et al. Notch-inducing hydrogels reveal a perivascular switch of mesenchymal stem cell fate. Embo Reports. 19 (8), e45964 (2018).
- Simona, B. R., et al. Density gradients at hydrogel interfaces for enhanced cell penetration. Biomaterials Science. 3 (4), 586-591 (2015).
- Zhang, N., et al. Soft hydrogels featuring in-depth surface density gradients for the simple establishment of 3d tissue models for screening applications. SLAS Discovery. 22 (5), 635-644 (2017).
- Martin, I., Muraglia, A., Campanile, G., Cancedda, R., Quarto, R. Fibroblast growth factor-2 supports ex vivo expansion and maintenance of osteogenic precursors from human bone marrow. Endocrinology. 138 (10), 4456-4462 (1997).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpentier, G., Martinelli, M., Courty, J., Cascone, I.
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Loebel, C., Mauck, R. L., Burdick, J. A. Local nascent protein deposition and remodelling guide mesenchymal stromal cell mechanosensing and fate in three-dimensional hydrogels. Nature Materials. 18 (8), 883-891 (2019).
- Curtis, M. B., Kelly, N., Hughes, C. C. W., George, S. C. Organotypic stromal cells impact endothelial cell transcriptome in 3D microvessel networks. Scientific Reports. 12 (1), 20434 (2022).
- Wust, R., Terrie, L., Muntefering, T., Ruck, T., Thorrez, L. Efficient co-isolation of microvascular endothelial cells and satellite cell-derived myoblasts from human skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 964705 (2022).
