Summary
En in vitro-modell av benmargens vaskulære nisje etableres ved å så mesenkymale og endotelceller på prefabrikerte 3D PEG-hydrogeler. Endotelnettverkene, ECM-komponentene og ALP-aktiviteten til nisjene varierer avhengig av vekstfaktoren som brukes. Plattformen kan brukes til avanserte kreftmodeller.
Abstract
Benet og benmargen er svært vaskulariserte og strukturelt komplekse organer, og er steder for kreft og metastasedannelse. In vitro-modeller som rekapitulerer bein- og benmargsspesifikke funksjoner, inkludert vaskularisering, som er kompatible med legemiddelscreening, er svært ønskelig. Slike modeller kan bygge bro over gapet mellom forenklede, strukturelt irrelevante todimensjonale (2D) in vitro-modeller og de dyrere, etisk utfordrende in vivo-modellene . Denne artikkelen beskriver en kontrollerbar tredimensjonal (3D) samkulturanalyse basert på konstruerte poly (etylenglykol) (PEG) matriser for generering av vaskulariserte, osteogene beinmargnisjer. PEG-matrisedesignet tillater utvikling av 3D-cellekulturer gjennom et enkelt cellesåingstrinn som ikke krever innkapsling, og muliggjør dermed utvikling av komplekse samkultursystemer. Videre er matrisene gjennomsiktige og prefabrikkerte på 96-brønns bildeplater med glassbunn, noe som gjør systemet egnet for mikroskopi. For analysen beskrevet her, dyrkes humane benmargsavledede mesenkymale stromale celler (hBM-MSC) først til et tilstrekkelig utviklet 3D-cellenettverk dannes. Deretter tilsettes GFP-uttrykkende humane navlestrengendotelceller (HUVEC). Kulturutviklingen følges av lysfelt- og fluorescensmikroskopi. Tilstedeværelsen av hBM-MSC-nettverket støtter dannelsen av vaskulære strukturer som ellers ikke ville dannes og som forblir stabile i minst 7 dager. Omfanget av vaskulær-lignende nettverksdannelse kan enkelt kvantifiseres. Denne modellen kan justeres mot en osteogen benmargsnisje ved å supplere kulturmediet med benmorfogenetisk protein 2 (BMP-2), som fremmer osteogen differensiering av hBM-MSC, vurdert ved økt alkalisk fosfatase (ALP) aktivitet på dag 4 og dag 7 av samkultur. Denne cellulære modellen kan brukes som en plattform for å dyrke ulike kreftceller og studere hvordan de samhandler med bein- og benmargsspesifikke vaskulære nisjer. Videre er det egnet for automatisering og analyser med høyt innhold, noe som betyr at det vil muliggjøre kreftmedisinscreening under svært reproduserbare kulturforhold.
Introduction
Benet og benmargen er strukturelt og funksjonelt komplekse organer som er sentrale for menneskers helse. Dette gjenspeiles av eksistensen av forskjellige nisjer som regulerer hematopoiesis og beinvedlikehold1. Det er nå allment akseptert at i sunn benmarg styres vedlikehold og utvidelse av hematopoietiske og skjelettstamceller, så vel som deres avkom, av forskjellige nisjer. Disse nisjene omfatter forskjellige celletyper, inkludert osteolineære celler, mesenkymale stamceller, endotel- og perivaskulære celler, nevron- og gliaceller, adipocytter, osteoklaster, makrofager og nøytrofiler2. Ikke overraskende er disse for det meste vaskulaturassosierte nisjer også involvert i utviklingen av ulike typer leukemi3 og er stedet for metastase for forskjellige kreftformer4. På grunn av sine spesifikke roller i beindannelse, remodellering og vedlikehold av bein (marg), har den beinassosierte vaskulaturen distinkte spesialiserte strukturer som er forskjellige fra vaskulaturen som finnes andre steder i kroppen 5,6,7. Dermed kan anti-angiogene eller vaskulaturmodulerende legemidler anvendt systemisk ha forskjellige effekter innenfor disse spesialiserte miljøene8. Derfor er modeller for å undersøke molekylære mekanismer involvert i å opprettholde ben- og benmargens fysiologiske egenskaper, ben- og benmargregenerering og respons på terapeutiske behandlinger svært ønskelig.
Klassiske todimensjonale (2D) vevskulturer og in vivo undersøkelser ved hjelp av dyremodeller har gitt uvurderlig innsikt i rollene til forskjellige celler og molekylære aktører involvert i utviklingen av bein og benmarg 9,10. Modeller som tillater eksperimenter med høy gjennomstrømning med relevante humane celler, kan forbedre vår forståelse av hvordan man modulerer utvalgte parametere i disse svært komplekse systemene.
I det siste tiåret har prinsipper avledet fra vevsteknikk blitt brukt til å generere 3D-vevsmodeller11,12. Disse har for det meste basert seg på innkapsling av vevsrelevante celler i biomaterialer for å etablere 3D-mono- eller kokulturer13. Blant de mest brukte biomaterialene er fibrin 14, kollagen 15 og Matrigel16,17, som alle er svært biokompatible og gir passende forhold for vekst av mange celletyper. Disse biomaterialene har evnen til å generere in vitro-modeller som rekapitulerer viktige aspekter ved de forskjellige vaskulære nisjene som finnes in vivo18. Videre har bruken av mikrofluidiske enheter for å generere perfuserte vaskulære ben- og benmargsmodeller bidratt til generering av in vitro-modeller med høyere kompleksitet 19,20,21,22.
Vanskeligheten med å kontrollere sammensetningen og konstruere egenskapene til naturlig forekommende biomaterialer har inspirert utviklingen av syntetiske analoger som kan utformes rasjonelt med forutsigbare fysiske, kjemiske og biologiske egenskaper23,24. Vi har utviklet helsyntetiske faktor XIII (FXIII) tverrbundne poly (etylenglykol) (PEG) -baserte hydrogeler, som er funksjonalisert med RGD-peptider og matriksmetalloprotease (MMP) spaltningssteder for å lette cellefeste og ombygging25,26. Den modulære utformingen av disse biomaterialene har blitt brukt til å optimalisere forholdene for dannelsen av 3D-vaskulariserte bein- og benmargsmodeller27,28.
For testing av et større antall forskjellige kulturbetingelser og nye terapier, er det nødvendig med modeller med høyere gjennomstrømningsevne. Vi har nylig vist at FXIII kryssbinding av vår PEG-hydrogel kan styres gjennom en elektrokjemisk prosess slik at en dyptgående hydrogelstivhetsgradient dannes29. Når celler legges på toppen av slike hydrogeler, migrerer de mot det indre og utvikler seg gradvis til svært sammenkoblede3D-mobilnettverk 30. Eliminering av behovet for å innkapsle celler i hydrogelen, som vanligvis er tilstede med andre 3D-stillas, forenkler ikke bare eksperimentell design, men tillater også sekvensiell tilsetning av forskjellige celletyper på forskjellige tidspunkter for å generere komplekse samkultursystemer. Disse hydrogelene er tilgjengelige forhåndsstøpt på 96-brønns bildeplater med glassbunn, noe som gjør etableringen av 3D-kulturer oppnåelige ved manuelle så vel som automatiserte cellesåprotokoller. Den optiske gjennomsiktigheten til PEG-hydrogelene gjør plattformen kompatibel med mikroskopi.
Her presenterer vi en enkel metode for generering og karakterisering av vaskulariserte osteogene nisjer innenfor denne bruksklare, syntetiske plug-and-play-plattformen. Vi viser at utviklingen av vaskulære nettverk kan stimuleres med en vekstfaktor som vanligvis brukes til å indusere in vitro osteogenese, benmorfogenetisk protein-2 (BMP-2), mens osteogen differensiering kan forebygges ved tilskudd av fibroblastvekstfaktor 2 (FGF-2)27,31. De dannede nettverkene er forskjellige sammenlignet med FGF-2-stimulerte nettverk når det gjelder det generelle utseendet, samt celle- og ECM-fordelingen. Videre overvåket vi osteogen induksjon med alkalisk fosfatase som markør. Vi demonstrerer det økte uttrykket av denne markøren over tid og sammenligner uttrykket med det i FGF-2-stimulerte nettverk ved hjelp av kvalitative og kvantitative metoder. Til slutt demonstrerer vi egnetheten til de genererte nisjene i denne modellen for to potensielle applikasjoner. For det første utførte vi en proof-of-concept legemiddelsensitivitetsanalyse ved å legge bevacizumab til forhåndsformede nisjer og overvåke nedbrytningen av de vaskulære nettverkene i dens nærvær. For det andre la vi MDA-MB-231 brystkreft og U2OS osteosarkomceller til forhåndsformede osteogene nisjer, noe som viser at nisjene kan brukes til å studere interaksjoner mellom kreftceller og deres miljø.
Protocol
Figur 1 oppsummerer følgende protokolldeler.
1. Etablering av 3D stromal monokultur
- Forbered hBM-MSC-cellesuspensjonen.
- Vokse hBM-MSC til et konfluensnivå på 70% -90% i MEMα supplert med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin og 5 ng / ml FGF-2 i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i en fuktet atmosfære. Cellene kan brukes frem til passering 6.
- Vask cellene med PBS, og løsne dem med 0,05% Trypsin-EDTA i 3-5 min ved 37 °C. Stopp løsrivelsesprosessen ved å skylle med basalmedium (MEMα supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin). Samle de suspenderte cellene i et 50 ml konisk sentrifugerør.
- Telle cellene ved hjelp av et hematocytometer eller en automatisert celleteller, og bestem totalt antall celler i suspensjonen.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 200 x g i 5 minutter. Fjern supernatanten forsiktig.
- Resuspender cellene i et passende volum basalmedium for å oppnå en konsentrasjon på 1 x 107 celler/ml stamoppløsning.
- Klargjør 50 ml koniske sentrifugerør som inneholder det nødvendige volumet av basalmedium supplert med de respektive vekstfaktorene (FGF-2 og BMP-2 ved definerte konsentrasjoner, f.eks. 0 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml, 100 ng / ml eller 200 ng / ml). Per brønn kreves 200 μL. Hvis cellesåing skal utføres ved hjelp av en automatisert væskehåndterer, må du også vurdere instrumentets dødvolum. For manuell cellesåing er et volumoverskudd på 10% tilstrekkelig.
- Tilsett hBM-MSC fra stamløsningen ved en fortynning på 1:66,67 for å oppnå en konsentrasjon på 1,5 x 105 celler/ml.
- Forbered platen for såing.
- Fjern polypropylenlimfilmen som dekker hydrogelplaten med 96 brønner.
- Aspirer forsiktig lagringsbufferen som dekker hydrogelene. For denne oppgaven, bruk en mikroplatevaskemaskin; Manuell håndtering er imidlertid mulig.
- Når du bruker en manuell aspirator eller flerkanals pipette, plasser spissen mot veggen av brønnen, og beveg deg sakte ned mot kanten av den indre brønnen mens du aspirerer bufferen. Dette vil unngå å skade hydrogeloverflaten.
- Når du bruker en automatisert platevasker, må du stille aspirasjonsdysene minst 3,8 mm fra plateholderen (dette tilsvarer 0,8 mm fra den indre ringen på hydrogelplaten) og mot kanten av brønnen. Se produsentens håndbok for mer detaljerte instruksjoner og for å få platetegningene til 96-brønns hydrogelplaten.
- Tilsett 200 μL/brønn av cellesuspensjonen fremstilt i trinn 1.1.7 etter grundig blanding for å sikre at cellene er homogent fordelt. Under såing, for å unngå ujevn sedimentering av cellene i ett område av underlaget, må du ikke vippe platen. For manuell såing, bland regelmessig cellesuspensjonen (etter sådd tre brønner) for å holde blandingen homogen. For automatisert såing, bland med en serologisk pipett umiddelbart før dispensering for å dispensere volumer som inneholder like mange celler.
- Oppretthold kulturene ved 37 °C og 5 % CO2 i en fuktet atmosfære.
- Overvåk utviklingen av kulturene ved lysfeltmikroskopi med et 5x objektiv etter ønske. Skaff referansebilder ca. 30 minutter etter såing for å evaluere antall celler som er lagt til.
2. Etablering av 3D stromal-endotelcelle co-kultur
- Forbered GFP-HUVEC-cellesuspensjonen.
- Forbered kolber til HUVEC-kulturen ved å belegge med en løsning bestående av 150 μg/ml rottehalekollagen I i 0,02 M eddiksyre i 30 minutter ved 37 °C. Skyll en gang med PBS før bruk.
- Øk GFP-HUVEC til et sammenløpsnivå på 80% -100% i EGM-2 supplert med 10% FBS i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i en fuktet atmosfære. Cellene kan brukes frem til passering 7.
- Vask cellene med PBS, og løsne dem med 0,05 % trypsin-EDTA i 2-3 minutter ved 37 °C. Stopp løsrivelsesprosessen ved å skylle med basalmedium (MEMα supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin). Samle de suspenderte cellene i et 50 ml konisk sentrifugerør.
- Telle cellene ved hjelp av et hematocytometer eller en automatisert celleteller, og bestem det totale antall celler som er tilstede i suspensjonen.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 200 x g i 5 minutter. Fjern supernatanten forsiktig.
- Resuspender cellene i et passende volum basalmedium for å oppnå en konsentrasjon på 1 x 107 celler/ml stamoppløsning.
- Klargjør 50 ml koniske sentrifugerør som inneholder det nødvendige volumet av basalmedium supplert med de respektive vekstfaktorene (FGF-2 og BMP-2 ved definerte konsentrasjoner, f.eks. 0 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml eller 200 ng/ml) som beskrevet for hBM-MSC i trinn 1.1.6.
- Tilsett GFP-HUVEC fra stamløsningen ved en fortynning på 1:66,67 for å oppnå en konsentrasjon på 1,5 x 105 celler/ml, som beskrevet for hBM-MSC i trinn 1.1.7.
- Aspirer mediet fra platen som inneholder den stromale monokulturen, som beskrevet for bufferfjerning i trinn 1.2.2.
- Tilsett 200 μL/brønn av GFP-HUVEC-cellesuspensjonen klargjort i trinn 2.1.8 som beskrevet for hBM-MSC-addisjonen i trinn 1.3.
- Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i fuktet atmosfære. Bytt medium hver 3-4 dager.
- Overvåk utviklingen av kulturen ved lysfelt- og fluorescensmikroskopi ved hjelp av et 5x objektiv etter ønske. Oppretthold kulturene til dag 4 eller dag 7 av samkultur for henholdsvis tidlige eller mellomliggende karakteriseringer, eller etter ønske.
3. Karakteriseringsprosedyre 1: Kvantifisering av endotelcellenettverksdannelse
- På de ønskede tidspunktene, ta GFP-signalet fra GFP-HUVECs med fluorescensmikroskopi ved hjelp av innstillinger som er egnet for kvantifisering (dvs. best fokus, høy kontrast og lav forstørrelse [f.eks. 5x] for større synsfelt).
- Forbehandle alle bildene som ble tatt på samme dag (f.eks. ved hjelp av Fiji32) for å forbedre kontrasten ytterligere. Merk at GFP-signalet kan bli svakere med kulturtiden; Derfor kan bilder som er anskaffet på forskjellige dager, trenge forskjellig behandling.
- Hvis du bruker Fiji eller ImageJ, åpner du alle GFP-kanalbildene med samme tidspunkt og åpner menyen Lysstyrke og kontrast . Velg et bilde som representerer en middels tilstand (ikke det svakeste og ikke det lyseste signalet), og juster kontrasten automatisk ved å velge Auto. Velg Angi, og merk av for Overfør til alle andre åpne bilder.
- Vurder visuelt om det valgte området passer til alle bildene i gjeldende tidsperiode, og juster og flytt manuelt til alle bildene etter behov.
- Lagre de justerte bildene som TIF-filer, og gjenta trinn 3.2.1 og trinn 3.2.2 for de andre innhentede tidspunktene.
- Bruk et filter for median uskarphet (f.eks. radius 3 for 2048x2048-bilder) på alle bildene for å unngå artefaktgjenkjenning nedstrøms og dermed legge til rette for nøyaktig nettverksidentifikasjon. Reduser størrelsen ved binning (2x2), og lagre alle forhåndsbehandlede bilder som TIF-filer i gråtoner i en mappe for kvantifisering. Disse trinnene kan gjøres manuelt eller i batch-modus ved hjelp av makroer som forfatterne vil dele på forespørsel.
- Analyser alle bildene i mappen som ble opprettet i trinn 3.1–3.3, ved hjelp av gruppeprosessmodusen i angiogeneseanalysatoren for ImageJ33. Merk at avhengig av størrelsen på bildene og tilgjengelig arbeidsminne, kan dette ta noen minutter per bilde.
- Valider kvantifiseringsresultatene ved å undersøke overleggene til de anerkjente strukturene og originalbildene. Hvis algoritmen gjenkjenner kunstige strukturer, hvor bare noen få eller ingen celler kan sees i det opprinnelige bildet, juster forhåndsbehandlingsparametrene og analyser de opprinnelige bildene på nytt, eller ekskluder slike problematiske områder og / eller replikere bilder fra analysen.
- Normaliser de oppnådde verdiene til et område på 1 mm 2 ved å multiplisere verdiene for hver prøve med forholdet mellom det analyserte området og 1 mm2. Dette trinnet er spesielt viktig hvis bilder av forskjellige størrelser brukes.
- Trekk ut ulike nettverksparametere, for eksempel total nettverkslengde, antall kryss, antall segmenter, antall isolerte segmenter, forgreningsintervall og gjennomsnittlig maskestørrelse, fra analysen, og bruk dem til å karakterisere endotelnettverket på forskjellige tidspunkter og under forskjellige kulturforhold.
4. Karakteriseringsprosedyre 2: Vurdering av ECM-avsetning
- Ved de ønskede slutttidspunktene bør du vurdere ECM-avsetning ved hjelp av immunfluorescens. Legg til primære antistoffer mot forskjellige ECM-molekyler i 100 μL av kulturmediet i løpet av de siste 6 dyrkningstimene eller etter fiksering, som beskrevet nedenfor.
- Vask kulturene en gang med 200 μL / brønn av PBS i 5 min ved RT, og fest dem med 100 μL / brønn på 4% paraformaldehyd under en kjemisk avtrekkshette i 30 min ved RT. Merk at det anbefales å fikse alle brønnene på en plate samtidig, da de omkringliggende kulturene kan bli skadet i løpet av dette trinnet. Vask de faste kulturene med 200 μL/brønn PBS ved RT tre ganger i 5 minutter hver gang, og oppbevar ved 4 °C i 200 μL/brønn PBS, eller fortsett umiddelbart til neste trinn.
- Før inkubering med primære antistoffer mot ECM-molekyler etter fiksering, inkuber de faste kulturene med 200 μL / brønn på 1% BSA i PBS som en blokkeringsløsning i 30 minutter ved RT.
- Aspirer blokkeringsoppløsningen og inkuber med 100 μL/brønn av den primære antistoffløsningen i 1 % BSA i PBS over natten ved 4 °C. Vask med 200 μL/brønn PBS tre ganger i henholdsvis 5 minutter, minst 3 timer og 5 minutter ved RT.
MERK: Det lange vasketrinnet er nødvendig for fullstendig diffusjon av det ubundne antistoffet ut av hydrogelen.
- Aspirer blokkeringsoppløsningen og inkuber med 100 μL/brønn av den primære antistoffløsningen i 1 % BSA i PBS over natten ved 4 °C. Vask med 200 μL/brønn PBS tre ganger i henholdsvis 5 minutter, minst 3 timer og 5 minutter ved RT.
- For å lette penetrasjonen av den sekundære fargeløsningen, inkludert intracellulære motflekker, permeabiliserer kulturen ved å bruke 0,3% Triton X-100 og 1% BSA i PBS i 30-90 minutter ved RT, avhengig av kulturens cellulære tetthet.
MERK: For antistoffbasert farging av intracellulære molekyler bør dette trinnet utføres før inkubasjonen med det primære antistoffet beskrevet i trinn 4.1.2. - Forbered sekundære fargeløsninger som inneholder de respektive sekundære antistoffene og motflekkene etter ønske (f.eks. en kjernefysisk flekk som DAPI og en cytoskjelettflekk som falloidin-rhodamin).
- Forbered en fargebuffer bestående av 0,1% Triton X-100, 1% BSA i PBS og motflekker (f.eks. 1 μg / ml DAPI og 1: 4,000 falloidin-rhodamin), og tilsett de respektive sekundære antistoffene ved anbefalte fortynninger.
- Tilsett 100 μL/brønn sekundærfargeløsning, og rug over natten ved 4 °C. I likhet med prosedyren etter den primære antistoffinkubasjonen, vask med 200 μL / brønn PBS tre ganger i henholdsvis 5 minutter, minst 3 timer og 5 minutter ved RT.
- For 3D-oppløsning av strukturene, skaff deg konfokale stabler som starter ved glassbunnen med et z-trinn på 2,5 μm og når en endelig høyde på 500 μm, bruk et 10x-mål og en 0,75x digital zoom. For å generere en 3D-rekonstruksjon av GFP- og F-aktinsignalet på Fiji, terskel hver kanal separat før du lager en kompositt og genererer rekonstruksjonen ved hjelp av Fiji 3D Viewer.
- For visualisering av den deponerte ECM fra immunfargingene, skaff deg konfokale stabler med en høyde på 100 μm med et z-trinn på 5 μm, et 10x mål og en 1.5x digital zoom. Generer projeksjoner for maksimal intensitet, og juster lysstyrken og kontrasten for hver kanal separat på Fiji før du oppretter en sammensetning.
- Utfør direkte fargefarging av det ekstracellulære miljøet.
- Tilsett 200 μL/brønn av Picrosirius rødfargeløsning til de paraformaldehydfaste brønnene, og inkuber i 1 time ved RT.
- Deretter vasker du de fargede brønnene fem ganger med destillert vann, etterfulgt av vask to ganger hver dag eller annenhver dag i 3-4 dager mens du overvåker fargeryddingen. Hold tallerkenene på 4 °C under de lange vasketrinnene (dvs. alt som overstiger 6 timer).
- Skaff bilder av de fargede prøvene ved hjelp av et lysfeltmikroskop utstyrt med et fargekamera, og oppretthold en lik hvitbalanse over forholdene. For å få oversikt over prøvene, bruk en lav forstørrelse (f.eks. 2,5x) for å skanne hele brønnen. Hvis mikroskopet ikke kommer med programvare som støtter automatisert søm, gjør det manuelt (f.eks. ved hjelp av Pairwise Stitching på Fiji34).
MERK: Brønnene som tidligere ble brukt til immunfluorescens kan brukes til dette, forutsatt at fluorescensbildeinnsamlingen er fullført. - Følg de samme trinnene som er beskrevet for Picrosirius Red-farging i trinn 4.2.1-4.2.3 for å utføre Alizarin Red-farging, vasking og avbildning.
5. Karakteriseringsprosedyre 3: Vurdering av osteogen differensiering ved å overvåke ALP-aktivitet
- Ved ulike kulturer slutttidspunkt (f.eks. dag 4 og dag 7 av samkultur), vurder kvantitativt ALP-aktivitet ved å bruke 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (BCIP) / nitroblått tetrazolium (NBT) farging.
- Vask kulturene én gang med 200 μL/brønn PBS før inkubering med BCIP/NBT-substratløsningen, som skal tilberedes i henhold til produsentens instruksjoner. Inkuber ved 37 °C mens fargeutviklingen overvåkes regelmessig. Når fargen begynner å utvikle seg under ikke-osteogene forhold, vask umiddelbart en gang med 200 μL / brønn PBS før du fikserer med 4% paraformaldehyd, som beskrevet i trinn 4.1.1.
- Skaff fargebilder av de fargede prøvene, som beskrevet i trinn 4.2.3 for Picrosirius Rødfarging.
- Ved ulike kulturers sluttidspunkter (f.eks. dag 4 og dag 7 i samkultur) kvantifiserer man ALP-aktiviteten i cellelysatene.
- Vask dyrkningen tre ganger med 200 μL/brønn PBS før inkubering med 200 μL/brønn på 0,25 % trypsin-EDTA ved 37 °C. Hvert 10. minutt, agiter kulturene ved kraftig pipettering opp og ned for å lette fordøyelsen, og overvåke kulturmorfologien med et standard cellekulturmikroskop.
- Når en flytende, encellet suspensjon uten langstrakte cellulære strukturer i brønnene er oppnådd (vanligvis etter 20-30 minutter), overfør prøvene til 2 ml rør, tilsett 200 μL MSC basalmedium for å hemme trypsinet og sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter for å pelletere de hentede cellene. Dekanter supernatanten, og frys pelletsene ved -80 °C, eller fortsett direkte til trinn 5.2.3.
- Tine cellepellets oppnådd i trinn 5.2.2, og inkuber med 500 μL lysisbuffer bestående av 0,56 M 2-amino-2-metyl-1-propanol, 0,2% Triton X-100, pH 10, i 30 minutter på is. Deretter sentrifugerer du ved 16 100 x g i 10 min ved 4 °C, og oppbevarer prøvene på is. Etter målingene beskrevet i trinn 5.2.7, frys prøvene ned ved −20 °C eller −80 °C, eller fortsett direkte med DNA-kvantifiseringen, som beskrevet i trinn 5.2.8.
MERK: Lysisbufferen kan klargjøres på forhånd, sterilefiltreres og lagres ved 4 °C. - Klargjør ALP-reagenset bestående av 20 mM 4-nitrofenylfosfatdinatriumsaltheksahydrat og 4 mMMgCl2 i lysisbuffer.
MERK: Det er best å forberede denne løsningen frisk på kvantifiseringsdagen. - Uten å forstyrre pelletert rusk, dispenser 50 μL av cellelysatsupernatanten fremstilt i trinn 5.2.3 i brønnene til en standard, gjennomsiktig, vevskultur 96-brønnplate i duplikater. Legg til lysisbuffer i to brønner som tomme kontroller.
- Med en flerkanalspipette tilsettes 50 μL/brønn ALP-reagens til brønnene fylt i trinn 5.2.5. Rist platen kort, og rug ved 37 °C i 10 minutter, beskyttet mot lys. Brønner med høyere ALP-aktivitet vil se gule ut. Stopp reaksjonen ved å tilsette 100 μL/brønn på 1 M NaOH ved hjelp av en flerkanalspipette.
- Les av den optiske tettheten ved 410 nm ved hjelp av en plateleser. Beregne gjennomsnittet av de tekniske duplikatene, og trekk fra gjennomsnittet av de tomme kontrollene.
- Utfør DNA-kvantifisering for å normalisere ALP-aktiviteten bestemt i de forrige trinnene mot det totale cellenummeret. Her beskrives en metode basert på fluorescensmålinger, men enhver annen metode for DNA-kvantifisering i cellelysater er kompatibel med analysen. Forbered reagensene og DNA-standardene som kreves for DNA-kvantifisering ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Det anbefales å bruke lysisbuffer for å forberede DNA-standardene. - Hvis prøvene som ble brukt til ALP-kvantifisering beskrevet i trinn 5.2.3 ble frosset, tine dem, sentrifugere ved 16 100 x g i 2 minutter ved 4 °C og legge dem på is. Uten å forstyrre pellettert rusk, dispenserer 50 μL av cellelysatsupernatanten i brønnene til en svart 96-brønnplate i duplikater. Frys prøvene ved -20 °C eller -80 °C, og gjenta ALP- og DNA-kvantifiseringene om nødvendig. Legg til DNA-standardene i duplikater.
- Tilsett 50 μL av DNA-fargestoffet med en flerkanalspipete, inkuber og les fluorescensintensiteten i henhold til produsentens instruksjoner. Ved hjelp av standard kurveverdier, bestem og bruk konverteringen av de målte intensitetsverdiene til DNA-konsentrasjonene.
- Normaliser ALP-verdiene oppnådd i trinn 5.2.7 ved å dele dem med den respektive DNA-konsentrasjonen av hver prøve.
6. Søknad 1: Utføre legemiddelsensitivitetsanalyser
- Når endotelnettverkene er fullt utviklet (vanligvis på dag 4 i stromal-endotelcelle-cokulturer), legg til anti-angiogene forbindelser, som bevacizumab, til kulturene i ferskkulturmedium, og test deres aktivitet over tid og under forskjellige forhold (f.eks. forskjellige konsentrasjoner av FGF-2 eller BMP-2).
- Forbered ferskt kulturmedium som inneholder de samme vekstfaktorene som brukes for de respektive kulturene til det tidspunktet.
- Lag en kontrollløsning som består av fortynningsvæsken av forbindelsen av interesse (f.eks. for bevacizumab: 60 mg/ml α-trehalosedihydrat, 0,4 mg/ml Tween20, 5,8 mg/ml natriumfosfat, monobasisk og monohydrat og 1,2 mg/ml natriumfosfat dibasisk, vannfritt), og sterilt filter det.
- Tilsett forbindelsen av interesse ved ønsket konsentrasjon (f.eks. 10 μg / ml bevacizumab) og et likt volum av kontrollløsningen til kulturmediet som er angitt for henholdsvis test- og kontrollforholdene.
- Forbered ferskt kulturmedium som inneholder de samme vekstfaktorene som brukes for de respektive kulturene til det tidspunktet.
- Aspirer mediet fra kulturen, og tilsett 200 μL/brønn av mediet som er nytilberedt i trinn 6.1.1. Inkuber i en tid som er egnet for forbindelsen som skal testes (f.eks. for bevacizumab: 2 dager). Overvåke kulturutviklingen, og karakterisere endotelnettverkene som beskrevet i avsnitt 3. Vurdere effektiviteten av forbindelsen ved å hemme angiogenese eller ablatere de forhåndsformede strukturer ved hjelp av GFP-bildene og de kvantitative nettverksparametrene ekstrahert fra analysen beskrevet i trinn 3.7.
7. Anvendelse 2: Etablering av avanserte samkultursystemer med ulike kreftcelletyper
- På dag 4 av samkultur, når endotelnettverkene for det meste er etablert, legger du til andre celletyper, som MDA-MB-231 eller U2OS kreftceller, til kulturene i friskkulturmedium.
- Merk kreftcellene ved hjelp av et cellekompatibelt levende fargestoff i henhold til produsentens instruksjoner for å kunne skille dem fra GFP-merkede HUVECer og ikke-merkede hBM-MSC i samkulturer.
- Tilbered en suspensjon av kreftceller i en konsentrasjon på 1,5 x 104 celler/ml i friskt dyrkningsmedium som inneholder de samme vekstfaktorene som ble brukt for de respektive kulturene frem til det tidspunktet.
- Overvåk kulturutvikling og kreftcellelokalisering etter ønske.
MERK: Avhengig av krefttype, aktivitet og miljø, kan det ta noen dager for dem å nå vaskulære strukturer i stromal-endotelcelle-cokulturer (f.eks. 2 dager for MDA-BM-231 og U2OS). Derfor bør time-lapse-avbildningen for å visualisere kreft-vaskulære celleinteraksjoner tidsberegnes tilsvarende.
Representative Results
Vaskulære nisjekulturer ble etablert ved sekvensielt såing av hBM-MSC og GFP-HUVEC på prefabrikerte PEG-baserte hydrogeler med stivhetsgradient i en 96-brønns bildeplate (figur 1). Dyrkningen ble overvåket i lengderetningen via levende epifluorescensmikroskopi og videre karakterisert ved utvalgte tidspunkter. Det ekstracellulære rommet ble vurdert via direkte fargefarging og antistoffbaserte farginger. ALP-aktivitet ble kvantifisert etter å ha hentet og lysert cellene fra de genererte nisjene. Videre demonstrerer vi egnetheten til denne plattformen for anti-angiogene legemiddelsensitivitetsanalyser og som grunnlag for kreft-samkulturmodeller.
Kokulturer av hBM-MSC og GFP-uttrykkende HUVEC ble etablert ved såing 3 x 104 celler/brønn i fravær av vekstfaktorer eller i nærvær av enten FGF-2 eller BMP-2 ved 50 ng/ml, som beskrevet i protokollen. Fra et tidlig tidspunkt kunne forskjeller mellom kulturene observeres både fra lysfelt- og fluorescensbilder som bare viste GFP-HUVECs (figur 2A). Ved å observere de samme områdene i lengderetningen, kan forskjeller i utviklingen av kulturene noteres, for eksempel en raskere utvikling i nærvær av FGF-2. Generelt virket kulturene mindre utviklet i fravær av noen vekstfaktor, med færre celler av begge typer som spredte seg og tilstedeværelsen av acellulære områder. I kontrast viste lysfeltbildene de tetteste kulturer i nærvær av BMP-2. Imidlertid dannet vaskulære nettverk i begge vekstfaktorholdige forhold, og de mest omfattende og sammenkoblede nettverkene ble dannet med FGF-2. Disse observerte forskjellene kan også kvantifiseres ved hjelp av angiogeneseanalysator for ImageJ. Faktisk var den totale nettverkslengden høyest i nærvær av FGF-2 og lavest i fravær av vekstfaktorer (figur 2B). Antall knutepunkter som indikerer forgreiningspunkter i nettene fulgte samme trend som totallengden (figur 2C). Omvendt inneholdt begge vekstfaktorholdige forholdene signifikant færre isolerte segmenter, noe som indikerer høyere sammenkobling enn tilstanden uten vekstfaktor (figur 2D). I tillegg viste 3D konfokal avbildning sterkere endotelcellepenetrasjon når det gjelder dybde i FGF-2-stimulert tilstand (figur 2E).
hBM-MSC/GFP-HUVEC kokulturer ble opprettholdt i 7 dager i nærvær av FGF-2 eller BMP-2 før de ble fiksert og farget for ECM-komponenter. Immuncytokjemiske farginger etterfulgt av konfokal laserskanningsmikroskopi viste påfallende forskjeller i kulturmorfologi avhengig av type vekstfaktortilskudd (figur 3A). Med FGF-2 ble kulturen organisert i kondenserte mikrovaskulære strukturer, som var tette i både endotel- og mesenkymale celler, mens i nærvær av BMP-2 strakte hBM-MSCene seg over et mye større område, som det fremgår av de mer omfattende F-aktinpositive og GFP-negative områdene. ECM-proteinene fibronektin og kollagen I ble lokalisert på lignende måte, mens laminin og kollagen IV var mer konsentrert rundt endotelstrukturene. Imidlertid var denne økte konsentrasjonen rundt endotelstrukturene mye mer uttalt i nærvær av FGF-2 enn i nærvær av BMP-2. I tillegg til antistoffbaserte farginger ble det utført direkte fargefarging for å vurdere den generelle fibrotiske tilstanden til ECM (Picrosirius Red farging; Figur 3B), samt avsetning av Ca på ECM (Alizarin Red farging; Figur 3C) av de dannede nisjene. Picrosirius Red-fargingen var sterkere og mer omfattende i nisjene dyrket med BMP-2, og Alizarin Red-fargingen fulgte samme trend.
Deretter ble kulturene karakterisert med hensyn til deres osteogene potensial ved å vurdere ALP-aktivitet som en tidlig osteogen markør. På dag 4 og dag 7 av samkultur ble celler hentet fra nisjene ved å fordøye hydrogelene med Trypsin. For å kvantifisere ALP-aktiviteten ble de innhentede cellene lysert, og en pNPP-analyse ble utført. De oppnådde verdiene ble normalisert mot det totale DNA for hver prøve for å ta hensyn til potensielle forskjeller i cellenumrene på tvers av forhold. Faktisk kunne små forskjeller mellom DNA-innholdet i tilstandene observeres, og færrest celler ble hentet fra tilstanden uten noen vekstfaktor (ikke vist). Den normaliserte ALP-aktiviteten varierte imidlertid sterkt på tvers av tilstander, med en trend med økende aktivitet med høyere konsentrasjoner av BMP-2 og et platå på 100 ng / ml (figur 4A, B). De laveste aktivitetsnivåene ble identifisert for tilstanden som inneholdt 50 ng/ml FGF-2. Mens lignende trender kunne observeres for begge tidspunktene som ble vurdert, økte alle verdiene betydelig over tid i kultur fra dag 4 til dag 7. I tillegg til den kvantitative analysen kunne ALP-aktiviteten visualiseres kvalitativt ved hjelp av direkte fargefarging basert på BCIP/NBT-substratkonverteringen. Mer omfattende og mer intens lilla farging ble observert i nærvær av BMP-2 sammenlignet med FGF-2 (figur 4C).
For å demonstrere to potensielle anvendelser av de karakteriserte osteogene nisjene, ble det utført en proof-of-concept legemiddelfølsomhetsstudie og kreftkulturer. For legemiddelsensitivitetsanalysen ble bevacizumab eller en kontrolloppløsning bestående av fortynningsvæsken av bevacizumabformuleringen tilsatt til kulturmediet inneholdende fersk BMP-2. På dag 4, da etablerte nettverk ble dannet i nærvær av 50 ng / ml BMP-2, ble enten kontrollløsningen eller bevacizumabholdig medium tilsatt under den vanlige mediumendringen, og kulturene ble overvåket ved hjelp av fluorescensavbildning. Tillegg av 10 μg/ml bevacizumab førte til tilbaketrekning eller ablasjon av det tidligere dannede nettverket, mens kontrolltilstanden fortsatt inneholdt omfattende nettverk 2 dager etter middelsendringen (figur 5A,B). Disse endringene kan også kvantifiseres ved å spore den totale lengden på nettverkene ved hjelp av angiogeneseanalysator for ImageJ på fluorescensbilder tatt daglig (figur 5C). Alternativt kan bevacizumab eller andre forbindelser også tilsettes fra begynnelsen av samkulturen for å vurdere deres innflytelse på dannelsen av nettverkene. Når det gjelder bevacizumab, hemmet dette fullstendig dannelsen av endotelnettverk (ikke vist).
For den andre applikasjonen ble MDA-MB-231 brystkreft eller U2OS osteosarkomceller lagt til dag 4 kokulturer ved en tetthet på 1,5 x 103 celler / brønn i ferskt kulturmedium inneholdende 50 ng / ml BMP-2. For å skille dem fra de GFP-merkede HUVEC-ene og de ikke-merkede hBM-MSC-ene, ble kreftcellene inkubert med CellTrace FarRed like før såing på de osteogene nisjene. Dyrkningen ble overvåket ved fluorescensmikroskopi; I begynnelsen lokaliserte de fleste kreftcellene nær overflaten av substratet, men etter 2 dager kunne de bli funnet i nærheten av lagene som inneholder vaskulære samkulturer. Dermed ble dag 2 valgt som utgangspunkt for time-lapse-mikroskopi for å vise dynamikken i interaksjonene mellom kreftcellene og cellene i den vaskulære nisjen. Interessant nok kunne MDA-MB-231-cellene sees både nærme seg og bevege seg bort fra endotelstrukturer og dermed muligens undersøke eller omforme miljøet (figur 5D). Ved å bruke CellTrace FarRed som etikett for kreftcellene, GFP som etikett for HUVEC og tilleggsfarging for F-aktin, kunne alle celletypene skilles ved hjelp av konfokal laserskanningsmikroskopi (figur 5E).
Figur 1: En enkel tilnærming for pålitelig generering av vaskulariserte, osteogene nisjer. Prefabrikkerte syntetiske hydrogeler med en dyptgående stivhetsgradient tillater generering av 3D-kulturer via sekvensiell cellesåing uten behov for direkte innkapsling. hBM-MSC er pre-dyrket i 3 dager før GFP-uttrykkende HUVECs legges til. Kulturene overvåkes ved å anskaffe lysfelt- og GFP-signaler i lengderetningen. På utvalgte tidspunkter evalueres nisjene ytterligere for ECM-avsetning og osteogen tilstand. Alkalisk fosfataseaktivitet vurderes via direkte fargefarging og ved å hente celler fra nisjene og utføre en pNPP-analyse på cellelysatene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Stimulering av vaskulære nettverk med FGF-2 eller BMP-2. (A) Bilder av lysfelt og fluorescens (GFP) ble tatt på dag 2, dag 4 og dag 6 av samkulturen av celler dyrket i fravær av vekstfaktorer eller i nærvær av FGF-2 eller BMP-2, begge ved 50 ng / ml. Skala bar: 400 μm. (B-D) Kvantifiserte parametere for GFP-HUVEC-nettverkene avbildet på dag 4 av kokultur, analysert ved hjelp av angiogeneseanalysator for ImageJ. Dataene er representert som gjennomsnitt ± standardavvik. Den statistiske analysen ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 9.5.1. En vanlig enveis ANOVA med Dunnetts multiple sammenligningstest ble utført med n ≥ 4; * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. (E) Tredimensjonale rekonstruksjoner generert fra konfokale stabler (total høyde: 547,5 μm; z-trinn: 2,5 μm) av GFP- og F-aktinsignalene for FGF-2- (øverste rad) og BMP-2- (nederste rad) stimulerte forhold. Skala bar: 300 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Induksjon av delokalisert hBM-MSC-spredning og ECM-avsetning av BMP-2. (A-C) De 7-dagers kokulturene dyrket i nærvær av enten FGF-2 eller BMP-2 ble utsatt for (A) immunfluorescens eller (B,C) direkte fargefarging. (A) Kulturene ble farget for F-aktin og ECM-proteinene fibronektin, laminin, kollagen I og kollagen IV. Bildene viser de maksimale intensitetsprojeksjonene til konfokalstablene (total høyde: 100 μm; z-trinn: 5 μm). Skala bar: 200 μm. (B,C) Kulturene ble farget med (B) Picrosirius Red og (C) Alizarin Red. Den øverste raden viser sammensydde, helbrønnsoversikter over bildene som er oppnådd ved 2,5x forstørrelse (skalalinje: 1,000 μm), mens den nederste raden viser ett synsfelt oppnådd ved 5x forstørrelse (skala bar: 400 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Biokjemisk vurdering av BMP-2-indusert ALP-aktivitet gjennom direkte fargefarging. (A,B) ALP-aktiviteten ble bestemt i cellelysater av kulturer dyrket i fravær av vekstfaktorer eller i nærvær av BMP-2 ved forskjellige konsentrasjoner eller FGF-2 ved 50 ng / ml i (A) 4 dager eller (B) 7 dager med samkultur. ALP-aktiviteten er vist normalisert til DNA-innholdet i hver lysatprøve. Dataene er representert som gjennomsnitt ± standardavvik. Den statistiske analysen ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 9.5.1. En ordinær enveis ANOVA med Dunnetts multiple sammenligningstest ble utført med n = 5; P < 0,0001. (C) Direkte fargefarging av ALP-aktiviteten i nisjer dyrket i nærvær av 50 ng / ml FGF-2 eller BMP-2 i 7 dager med samkultur. Bildene på venstre side viser sydde helbrønnsoversikter over bilder oppnådd ved 2,5x forstørrelse (skala bar: 1000 μm), mens bildene på høyre side viser ett synsfelt oppnådd ved 5x forstørrelse (skala bar: 400 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sysselsetting av osteogene, vaskulariserte nisjer i avanserte kreftmodeller. (A) GFP-signalene til kulturer dyrket i nærvær av BMP-2 ble avbildet på dag 4 av samkultur før en kontrollløsning (venstre) eller bevacizumab ved 10 μg / ml (høyre) ble tilsatt i 2 dager, hvoretter kulturene ble avbildet igjen (dag 6 av samkultur). Skala bar: 600 μm. (B) Høyere forstørrelse bilder av bevacizumab-behandlede kulturer er vist i A. Skala bar: 250 μm. (C) Den totale lengden på endotelnettverkene som vist i A ble kvantifisert ved hjelp av angiogeneseanalysator for ImageJ fra bilder tatt daglig; n ≥ 3. (D) CellTrace FarRed-merkede MDA-MB-231 brystkreftceller ble lagt til 4-dagers kokulturer dyrket i nærvær av BMP-2, og time-lapse-bilder ble anskaffet fra 2 dager etter kreftcelletilsetningen. Skala bar: 100 μm. (E) Projeksjoner av maksimal intensitet av konfokale stabler (total høyde: 70 μm; z-trinn: 2,4 μm) av trippel kokulturer generert som beskrevet i D og fast og farget for F-aktin. Venstre: nisjer med MDA-MB-231 brystkreftceller; høyre: nisjer med U2OS osteosarkomceller. Skala barer for bilder til venstre: 200 μm; Skala barer for bilder til høyre: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Her beskriver vi en protokoll for etablering av en in vitro-modell av svært vaskulariserte bein- og benmargnisjer i en helsyntetisk og kontrollerbar 3D PEG-basert matrise, som har en rekke anvendelser innen bein- og benmargsbiologisk forskning, vevsteknikk og kreftforskning. Denne modellen bygger på en syntetisk PEG-basert hydrogel som er funksjonalisert med RGD-peptider og MMP-spaltningssteder og er støpt med en dyptgående tetthetsgradient på glassbunn 96-brønns bildeplater30. Denne plug-and-play-plattformen ble vist å tillate etablering av svært sammenkoblede 3D-mobilnettverk uten behov for å innkapsle celler i hydrogelen. I likhet med den tidligere beskrevne celleinnkapslingsprotokollen, viser vi i dette arbeidet ombyggingen av substratet med et celleiboende ECM28 for å skape et celletypespesifikt mikromiljø. Med denne metoden kan derfor medikamentscreeningsanalyser og høyinnholdsanalyser enkelt utføres under svært reproduserbare, organotypiske 3D-kulturforhold. Glassbunnplatene med 96 brønner og de optisk transparente hydrogelene gjør plattformen kompatibel med automatisering av væskehåndtering og mikroskopi med høy gjennomstrømning.
Det første trinnet i å generere en osteogen vaskulær benmargnisje er prekulturen av hBM-MSC på PEG-hydrogelen i minst 3 dager. I løpet av denne tiden fester de seg til hydrogelen, trenger inn i den og begynner å etablere cellekontakter og ECM-avsetning. Før såing av hBM-MSC-ene, må lagringsbufferen fjernes. Siden hydrogelen ligger inne i en indre brønn innenfor standardbrønnen til 96-brønns bildeplaten, er det trygt å sette inn aspirasjonsspissen langs siden av brønnen til den berører den indre brønnringen. En vakuumpumpe kan brukes til aspirasjon hvis den er satt på lavest mulig sugekraft. Alternativt kan en automatisert platevasker med dysehøyden justert til minst 0,8 mm over den indre brønnringen brukes til å aspirere bufferen fra hydrogelplaten. Bruk av automatisering for væskehåndtering kan minimere skade på hydrogeloverflaten og føre til høyere reproduserbarhet av de resulterende kulturer. Små defekter på hydrogeloverflaten blir synlige når cellene legger seg på hydrogelen og vises på et lavere fokusplan i defekte hydrogelområder. Derfor tjener innhenting av referansebilder på dag 0 som en god kvalitetskontroll for cellesåingshomogeniteten og hydrogeloverflatens integritet. Mens små hydrogeloverflatedefekter ikke utelukker videre bruk av brønnen, har cellene en tendens til å klynge seg på de defekte områdene og kan vokse til ikke-representative mønstre eller raskere nå bunnglasset, hvor de vokser til et monolag. Disse artefaktene må noteres ved bruk/evaluering av disse brønnene. Lignende hensyn gjelder for eventuelle middels endringer som utføres i løpet av hele analysens varighet.
Det andre trinnet i protokollen innebærer tilsetning av GFP-HUVECs til den forhåndsformede hBM-MSC monokulturen (dag 0 av samkultur). ECM avsatt av hBM-MSC gir et flott stillas for vekst av endotelceller, som i dette arbeidet, selv i nærvær av hBM-MSC-betinget medium, bare kunne danne runde celleklynger på hydrogelene (ikke vist). Ved såing på hBM-MSC-kulturene integrerer og danner HUVECene mikrofartøylignende strukturer som er sammenlignbare med de som observeres i kokulturer generert ved celleinnkapsling27,28. Vanligvis dannes velutviklede 3D-mikrovaskulære nettverk innen 4 dager etter samkultur, og dette kan overvåkes i lengderetningen ved bruk av GFP-merkede HUVEC. Disse strukturene kan opprettholdes i minst 7 dager i kultur, noe som betyr at det er tilstrekkelig tid til å følge endringer i den vaskulære nettverksorganisasjonen som respons på behandlinger, for eksempel for screening av anti-angiogene legemidler. De morfologiske elementene i endotelnettverket kan kvantifiseres i batchmodus ved å segmentere GFP-bildene ved hjelp av veletablerte verktøy, for eksempel Angiogenesis Analyzer-plugin for ImageJ33, og deres parametere kan brukes til å evaluere for eksempel legemiddeleffektivitet og farmakodynamikk.
En betydelig fordel ved den beskrevne cellulære modellen for mange potensielle applikasjoner er dens plastisitet. Bare å supplere kulturmediet med forskjellige vekstfaktorer kan endre utseendet til samkulturen. For eksempel skaper tilstedeværelsen av BMP-2 gjennom mono- og samkulturperioden en osteogen vaskulær nisje, som viser økt ALP-aktivitet, ekstracellulær kalsiumavsetning, samt ECM-montering og avsetning. Tvert imot, i nærvær av FGF-2, er de osteogene markørene fraværende, og samkulturen danner færre laterale celleforeninger, men viser mer uttalt 3D-cellevekst. At FGF-2 demper ALP-aktivitet mens BMP-2 utløser sterkere ALP-aktivitet sammenlignet med ingen vekstfaktorbehandling, er i samsvar med tidligere observasjoner27. Likevel, til tross for disse store forskjellene i hBM-MSC stromalkomponenten, var omfanget av det mikrovaskulære nettverket svært likt for de to vekstfaktorbehandlede forholdene i dette arbeidet. I kontrollkulturene dannet det seg bare noen få korte vaskulære nettverk, noe som kanskje representerte en dårlig vaskularisert benmargsnisje. Dette antyder at ved ganske enkelt å endre type, konsentrasjon og timing av vekstfaktorene som legges til kulturmediet, kan en rekke veldefinerte vaskulariserte benmargnisjer, som ville være nødvendig for komparative studier, bli produsert. For å sikre reproduserbare resultater er det imidlertid viktig å merke seg at kulturprogresjonen og morfologien kan variere avhengig av historien til cellene som brukes (f.eks. passasjenummer og løsrivelsesmetode som brukes under rutinemessig kulturvedlikehold), og det anbefales å kontrollere for slike faktorer under analysedesignet.
Her, som en første anvendelse av denne modellen, demonstrerer vi sensitiviteten til de konstruerte mikrovaskulære nettverkene til behandling med 10 μg / ml bevacizumab. Spesielt er det viktig å bekrefte at algoritmen som brukes, nøyaktig kan gjenkjenne endotelnettverket, da artefakter ofte genereres i bilder med dårlig utviklede nettverk. Hvis dette er tilfelle, må parametrene som brukes til bildebehandling (før og under segmentering) finjusteres, ofte på prøve-og-feile-basis.
Som en annen applikasjon presenterer vi en avansert samkulturmodell dannet av sekvensiell såing av mesenkymale, endotel- og kreftceller. Denne modellen gjør det mulig å studere interaksjonene mellom kreftceller, stroma og benmargens vaskulatur, noe som kan være viktige faktorer under metastase. I tillegg kan denne modellen brukes til narkotikascreeningsapplikasjoner og testing av forbindelser med mål utover angiogenese.
I 2D-kulturer mottar ikke celler fysiologiske mikromiljøsignaler, får ikke naturlig forekommende cellemorfologier, og skiller seg følgelig annerledes sammenlignet med celler i innfødte 3D-miljøer35. Når de vokser i konstruerte 3D-hydrogeler, deponerer cellene tidlig en iboende ECM, som gir vedheftsteder og kan aktivt omformes 28,36. Her, for å etablere en forenklet 3D-modell for screeningapplikasjoner, ble fartøydannende celler sådd på overflaten av konstruerte hydrogeler og tillatt å etablere vaskulære nettverk i fravær av perfusjon. De bildebaserte evalueringene ble utført på 2D-projeksjoner av endotelceller som bidrar til vaskulære strukturer. Imidlertid viste bare konfokale bilder den mindre uttalte innveksten av 3D-vaskulære nettverk i BMP-2-stimulerte prøver sammenlignet med FGF-2-stimulerte prøver. Dette antyder at lengden på de dannede vaskulære strukturer ble undervurdert, mens deres tilkobling ble overvurdert. I tillegg er interaksjoner mellom perivaskulære og endotelceller og vaskulær lumendannelse ikke undersøkt. Disse aspektene, særlig når det gjelder tiltak mot narkotikabehandling, vil kreve ytterligere oppmerksomhet. Til slutt vil raffinerte protokoller for først å etablere omfattende 3D-vaskulære nettverk og først deretter indusere deres osteogene differensiering være ønskelig for å generere flere fysiologiske ben- og benmargsmodeller.
Samlet sett er modellen som presenteres her svært allsidig og kan enkelt skreddersys mot spesifikke applikasjoner. For eksempel kan mesenkymale og endotelceller fra forskjellige kilder brukes. Det er kjent at fettvev MSC og navlestrengs-MSC uttrykker forskjellige angiogene faktorer sammenlignet med BM-MSC, og de kan lett erstattes som en alternativ stromalkomponent37. Endotelceller isolert fra allerede definerte benmargsnisjer kan også brukes i stedet for HUVEC. Man kan også etablere samkulturen med pasientavledede, matchende benmargsmesenkymale og endotelceller for persontilpassede medisinapplikasjoner, som nylig har blitt foreslått for vaskulariserte muskelkulturer38. I tillegg tillater utformingen av hydrogelplaten langsgående overvåking av kulturen med både lysfelt og fluorescensmikroskopi, og gir dermed brukeren muligheten til å forkorte eller forlenge kulturtiden avhengig av applikasjonen. Alternativt kan celletettheten som brukes til såing justeres tilsvarende for å akselerere eller forsinke dannelsen av cellenettverket dersom det er behov for kortere eller lengre observasjonstider enn de i denne protokollen. I alle fall er det nødvendig med forsiktighet for å unngå celleovervekst i arklignende strukturer, noe som kan føre til sammentrekning av hydrogelen og eventuell celleavløsning.
Til slutt kan et bredt spekter av analyser utføres ved hjelp av denne modellen. I tillegg til immunfluorescens og mikroskopi utført i levende eller faste kulturer, kan 3D-kulturene fordøyes enzymatisk, og cellene kan hentes og underkastes enhver form for biokjemisk analyse. Her demonstrerer vi bestemmelsen av ALP-aktivitet og DNA-innholdskvantifisering i cellelysater ved hjelp av kolorimetriske / fluorometriske analyser, men systemet er kompatibelt med mange andre teknikker, inkludert PCR, RNAseq og proteomikk. Hvis sensitiviteten til den ønskede analysen ikke er veldig høy, kan man samle prøver fra mer enn en brønn for å øke mengden prøve som er tilgjengelig for analysen. Hvis den ønskede applikasjonen krever raskere geloppløsning, kan orbital risting av platen påføres i kombinasjon med mindre volumer av fordøyelsesløsningen for å sikre vortexdannelse i brønnene, forutsatt at alle brønner på platen vil bli brukt på denne måten (levende kulturer er følsomme for slik hard håndtering). Oppsummert presenterer vi her en protokoll som, hvis den brukes som beskrevet, garanterer generering av en in vitro-modell som rekapitulerer de viktigste aspektene ved osteogene vaskulære nisjer, men er også allsidig nok til å bli modifisert for skreddersydde applikasjoner.
Disclosures
Ectica Technologies AG er produsenten av 3DProSeed hydrogel brønnplate og har kommersielle interesser. Benjamin R. Simona og Martin Ehrbar er aksjonærer i Ectica Technologies AG.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Riccardo Urbanet for teknisk assistanse med væskehåndteringsanordningene og Rodi Odabasi for støtte med epifluorescensmikroskopien. Dette arbeidet ble finansiert av Swiss National Science Foundation (tilskuddsnummer 310030E_202429 og 205321_204318) og Ectica Technologies AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 2 mL microtubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 2-Amino-2-methyl-1-propanol | Sigma | A9199 | |
| 3DProSeed hydrogel well plate | Ectica Technologies | ECT.PS1.001.096 | |
| 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma | 71768 | |
| Alizarin Red S | Sigma | A5533 | |
| Anti-Collagen IV antibody | Abcam | ab6311 | |
| Anti-Laminin 1+2 antibody | Abcam | ab7463 | |
| Automated plate washer | Agilent Biotek | ELχ50 | |
| Automated washer/dispenser | Agilent Biotek | MULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette | |
| Bevacizumab | Evidentic | ID PS-E07-2019-00119 A009 | |
| BMP-2 | Peprotech | 120-02C | |
| BSA | AppliChem | A1391 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | To centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Stellaris 5 | |
| Conical 50 mL centrifuge tubes | TPP | 91050 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 406406 | |
| DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 405312 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Epifluorescence microscope | Leica | DMI6000B | |
| FBS | Gibco | 10500-064 | |
| FGF-2 | Peprotech | 100-18B | |
| Fibronectin (IST-9) | Santa Cruz | sc-59826 | |
| GFP-HUVECs | PELOBiotech | PB-CAP-0001GFP | |
| hBM-MSCs | - | - | Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359 |
| Inverted microscope | Zeiss | 200M | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cell line | - | Kindly obtained from J Massagué at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | |
| MEMα | Gibco | 22571-038 | |
| Multimode imaging reader | Agilent Biotek | Cytation 1 | For automated imaging |
| Multimode imaging reader - fluorescence and absorbance | Agilent Biotek | Cytation 5 | For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis |
| Paraformaldehyde | Artechemis | US 040 | |
| PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phalloidin-rhodamine | Invitrogen | R415 | |
| Picro-Sirius Red Solution | Abcam | ab246832 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | ThermoFisher Scientific | P7589 | |
| Recombinant Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab260043 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Sigma | B5655-25TAB | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1064981000 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Sigma | S-0876 | |
| Sodium phosphate monobasic, monohydrate | Merck | 1.06346 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween20 | AppliChem | A4974 | |
| U2OS osteosarcoma cell line | - | Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich | |
| α-trehalose dihydrate | Sigma | 90208 |
References
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Calvi, L. M., Link, D. C. Cellular complexity of the bone marrow hematopoietic stem cell niche. Calcified Tissue International. 94 (1), 112-124 (2014).
- Behrmann, L., Wellbrock, J., Fiedler, W. Acute myeloid leukemia and the bone marrow niche-take a closer look. Frontiers in Oncology. 8, 444 (2018).
- Yip, R. K. H., et al. Mammary tumour cells remodel the bone marrow vascular microenvironment to support metastasis. Nature Communications. 12 (1), 6920 (2021).
- Potente, M., Makinen, T. Vascular heterogeneity and specialization in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 477-494 (2017).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y. Organotypic vasculature: From descriptive heterogeneity to functional pathophysiology. Science. 357 (6353), (2017).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Barillari, G. The anti-angiogenic effects of anti-human immunodeficiency virus drugs. Frontiers in Oncology. 10, 806 (2020).
- Owen, M., Friedenstein, A. J. Stromal stem-cells - Marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Foundation Symposia. 136, 42-60 (1988).
- Sacchetti, B., et al. Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment. Cell. 131 (2), 324-336 (2007).
- Traore, M. A., George, S. C.
- Bessy, T., Itkin, T., Passaro, D. Bioengineering the bone marrow vascular niche. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 645496 (2021).
- Bray, L. J., et al. A three-dimensional ex vivo tri-culture model mimics cell-cell interactions between acute myeloid leukemia and the vascular niche. Haematologica. 102 (7), 1215-1226 (2017).
- Montano, I., et al. Formation of human capillaries in vitro: The engineering of prevascularized matrices. Tissue Engineering Part A. 16 (1), 269-282 (2010).
- Sun, Z. Y., Kemp, S. S., Lin, P. K., Aguera, K. N., Davis, G. E. Endothelial k-RasV12 expression induces capillary deficiency attributable to marked tube network expansion coupled to reduced pericytes and basement membranes. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 42 (2), 205-222 (2022).
- Kleinman, H. K., et al.
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement-membrane in the morphological-differentiation of human-endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
- Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods in Molecular Biology. 1066, 17-28 (2013).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
- Wang, X. L., et al. Engineering anastomosis between living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Lab on a Chip. 16 (2), 282-290 (2016).
- Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature Biotechnology. 23 (1), 47-55 (2005).
- Kyburz, K. A., Anseth, K. S. Synthetic mimics of the extracellular matrix: How simple is complex enough. Annals of Biomedical Engineering. 43 (3), 489-500 (2015).
- Ehrbar, M., et al. Enzymatic formation of modular cell-instructive fibrin analogs for tissue engineering. Biomaterials. 28 (26), 3856-3866 (2007).
- Ehrbar, M., et al. Biomolecular hydrogels formed and degraded via site-specific enzymatic reactions. Biomacromolecules. 8 (10), 3000-3007 (2007).
- Blache, U., et al. Dual role of mesenchymal stem cells allows for microvascularized bone tissue-like environments in PEG hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 5 (4), 489-498 (2016).
- Blache, U., et al. Notch-inducing hydrogels reveal a perivascular switch of mesenchymal stem cell fate. Embo Reports. 19 (8), e45964 (2018).
- Simona, B. R., et al. Density gradients at hydrogel interfaces for enhanced cell penetration. Biomaterials Science. 3 (4), 586-591 (2015).
- Zhang, N., et al. Soft hydrogels featuring in-depth surface density gradients for the simple establishment of 3d tissue models for screening applications. SLAS Discovery. 22 (5), 635-644 (2017).
- Martin, I., Muraglia, A., Campanile, G., Cancedda, R., Quarto, R. Fibroblast growth factor-2 supports ex vivo expansion and maintenance of osteogenic precursors from human bone marrow. Endocrinology. 138 (10), 4456-4462 (1997).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpentier, G., Martinelli, M., Courty, J., Cascone, I.
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Loebel, C., Mauck, R. L., Burdick, J. A. Local nascent protein deposition and remodelling guide mesenchymal stromal cell mechanosensing and fate in three-dimensional hydrogels. Nature Materials. 18 (8), 883-891 (2019).
- Curtis, M. B., Kelly, N., Hughes, C. C. W., George, S. C. Organotypic stromal cells impact endothelial cell transcriptome in 3D microvessel networks. Scientific Reports. 12 (1), 20434 (2022).
- Wust, R., Terrie, L., Muntefering, T., Ruck, T., Thorrez, L. Efficient co-isolation of microvascular endothelial cells and satellite cell-derived myoblasts from human skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 964705 (2022).
