Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Enkel etablering av en vaskulariserad osteogen benmärgsnisch med användning av prefabricerade poly (etylenglykol) (PEG) hydrogeler i en bildmikroplatta

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65413
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Obstetrics, University Hospital Zurich, University of Zurich, 2Ectica Technologies AG

Summary

En in vitro-modell av benmärgens vaskulära nisch etableras genom sådd av mesenkymala och endotelceller på prefabricerade 3D PEG-hydrogeler. Endotelnätverken, ECM-komponenterna och ALP-aktiviteten hos nischerna varierar beroende på vilken tillväxtfaktor som används. Plattformen kan användas för avancerade cancermodeller.

Abstract

Benet och benmärgen är mycket vaskulariserade och strukturellt komplexa organ och är platser för cancer- och metastasbildning. In vitro-modeller som rekapitulerar ben- och benmärgsspecifika funktioner, inklusive vaskularisering, som är kompatibla med läkemedelsscreening är mycket önskvärda. Sådana modeller kan överbrygga klyftan mellan förenklade, strukturellt irrelevanta tvådimensionella (2D) in vitro-modeller och de dyrare, etiskt utmanande in vivo-modellerna . Denna artikel beskriver en kontrollerbar tredimensionell (3D) samodlingsanalys baserad på konstruerade poly (etylenglykol) (PEG) matriser för generering av vaskulariserade, osteogena benmärgsnischer. PEG-matrisdesignen möjliggör utveckling av 3D-cellkulturer genom ett enkelt cellsåddsteg som inte kräver någon inkapsling, vilket möjliggör utveckling av komplexa samodlingssystem. Dessutom är matriserna transparenta och prefabricerade på 96-brunnsplattor med glasbotten, vilket gör systemet lämpligt för mikroskopi. För den analys som beskrivs här odlas humana benmärgshärledda mesenkymala stromaceller (hBM-MSC) först tills ett tillräckligt utvecklat 3D-cellnätverk bildas. Därefter tillsätts GFP-uttryckande humana navelvenendotelceller (HUVEC). Kulturutvecklingen följs av ljusfälts- och fluorescensmikroskopi. Närvaron av hBM-MSC-nätverket stöder bildandet av vaskulära strukturer som annars inte skulle bildas och som förblir stabila i minst 7 dagar. Omfattningen av vaskulärliknande nätverksbildning kan lätt kvantifieras. Denna modell kan ställas in mot en osteogen benmärgsnisch genom att komplettera odlingsmediet med benmorfogenetiskt protein 2 (BMP-2), vilket främjar den osteogena differentieringen av hBM-MSC, bedömd genom ökad alkalisk fosfatas (ALP) aktivitet vid dag 4 och dag 7 av samkulturen. Denna cellulära modell kan användas som en plattform för att odla olika cancerceller och studera hur de interagerar med ben- och benmärgsspecifika vaskulära nischer. Dessutom är det lämpligt för automatisering och analyser med högt innehåll, vilket innebär att det skulle möjliggöra screening av cancerläkemedel under mycket reproducerbara odlingsförhållanden.

Introduction

Benet och benmärgen är strukturellt och funktionellt komplexa organ som är centrala för människors hälsa. Detta återspeglas av förekomsten av distinkta nischer som reglerar hematopoies och benunderhåll1. Det är nu allmänt accepterat att i frisk benmärg styrs underhåll och expansion av hematopoetiska och skelettstamceller, liksom deras avkomma, av distinkta nischer. Dessa nischer omfattar olika celltyper, inklusive osteolineageceller, mesenkymala stamceller, endotel- och perivaskulära celler, neuronala och gliaceller, adipocyter, osteoklaster, makrofager och neutrofiler2. Inte överraskande är dessa mestadels vaskulaturassocierade nischer också involverade i utvecklingen av olika typer av leukemi3 och är platsen för metastaser för olika cancerformer4. På grund av dess specifika roller i benbildning, ombyggnad och ben (märg) underhåll, har den benassocierade vaskulaturen distinkta specialiserade strukturer som skiljer sig från den vaskulatur som finns någon annanstans i kroppen 5,6,7. Således kan antiangiogena eller vaskulaturmodulerande läkemedel som appliceras systemiskt ha olika effekter inom dessa specialiserade miljöer8. Därför är modeller för att undersöka de molekylära mekanismerna som är involverade i att upprätthålla ben- och benmärgsfysiologiska egenskaper, ben- och benmärgsregenerering och svar på terapeutiska behandlingar mycket önskvärda.

Klassiska tvådimensionella (2D) vävnadskulturer och in vivo-undersökningar med djurmodeller har gett ovärderlig insikt i rollerna hos olika celler och molekylära aktörer som är involverade i utvecklingen av ben och benmärg 9,10. Modeller som möjliggör experiment med hög genomströmning med relevanta mänskliga celler kan förbättra vår förståelse för hur man modulerar utvalda parametrar i dessa mycket komplexa system.

Under det senaste decenniet har principer som härrör från vävnadsteknik använts för att generera 3D-vävnadsmodeller11,12. Dessa har främst förlitat sig på inkapsling av vävnadsrelevanta celler i biomaterial för att etablera 3D-mono- eller samkulturer13. Bland de mest använda biomaterialen är fibrin 14, kollagen15 och Matrigel16,17, som alla är mycket biokompatibla och ger lämpliga förutsättningar för tillväxt av många celltyper. Dessa biomaterial har förmågan att generera in vitro-modeller som rekapitulerar viktiga aspekter av de olika vaskulära nischerna som finns in vivo18. Dessutom har användningen av mikrofluidiska anordningar för att generera perfuserade vaskulära ben- och benmärgsmodeller bidragit till genereringen av in vitro-modeller med högre komplexitet 19,20,21,22.

Svårigheten att kontrollera sammansättningen och konstruera egenskaperna hos naturligt förekommande biomaterial har inspirerat utvecklingen av syntetiska analoger som kan utformas rationellt med förutsägbara fysiska, kemiska och biologiska egenskaper23,24. Vi har utvecklat helsyntetiska faktor XIII (FXIII) tvärbundna poly(etylenglykol) (PEG)-baserade hydrogeler, som är funktionaliserade med RGD-peptider och matrismetalloprotease (MMP) klyvningsställen för att underlätta cellbindning och ombyggnad25,26. Den modulära designen av dessa biomaterial har framgångsrikt använts för att optimera förhållandena för bildandet av 3D-vaskulariserade ben- och benmärgsmodeller27,28.

För testning av ett större antal olika odlingsförhållanden och nya terapier krävs modeller med högre genomströmningskapacitet. Vi har nyligen visat att FXIII-tvärbindningen av vår PEG-hydrogel kan styras genom en elektrokemisk process så att en djupgående hydrogelstyvhetsgradient bildas29. När celler läggs ovanpå sådana hydrogeler migrerar de mot det inre och utvecklas gradvis till mycket sammankopplade 3D-cellulära nätverk30. Elimineringen av behovet av att kapsla in celler i hydrogelen, som vanligtvis finns med andra 3D-byggnadsställningar, förenklar inte bara den experimentella designen utan möjliggör också sekventiell tillsats av olika celltyper vid olika tidpunkter för att generera komplexa samodlingssystem. Dessa hydrogeler är tillgängliga prefabricerade på glasbottnade 96-brunnsavbildningsplattor, vilket gör upprättandet av 3D-kulturer uppnåeligt genom manuella såväl som automatiserade cellsåddprotokoll. Den optiska transparensen hos PEG-hydrogelerna gör plattformen kompatibel med mikroskopi.

Här presenterar vi en enkel metod för generering och karakterisering av vaskulariserade osteogena nischer inom denna färdiga, syntetiska plug-and-play-plattform. Vi visar att utvecklingen av vaskulära nätverk kan stimuleras med en tillväxtfaktor som vanligen används för att inducera in vitro osteogenes, benmorfogenetiskt protein-2 (BMP-2), medan osteogen differentiering kan förhindras genom tillskott av fibroblasttillväxtfaktor 2 (FGF-2)27,31. De nätverk som bildas är olika jämfört med FGF-2-stimulerade nätverk när det gäller det övergripande utseendet, liksom cell- och ECM-fördelningen. Dessutom övervakade vi den osteogena induktionen med alkaliskt fosfatas som markör. Vi demonstrerar det ökade uttrycket av denna markör över tid och jämför uttrycket med det i FGF-2-stimulerade nätverk med kvalitativa och kvantitativa metoder. Slutligen demonstrerar vi lämpligheten hos de genererade nischerna i denna modell för två potentiella applikationer. För det första utförde vi en proof-of-concept läkemedelskänslighetsanalys genom att tillsätta bevacizumab till förformade nischer och övervaka nedbrytningen av de vaskulära nätverken i dess närvaro. För det andra lade vi till MDA-MB-231 bröstcancer och U2OS osteosarkomceller till förformade osteogena nischer, vilket visar att nischerna kan användas för att studera interaktioner mellan cancerceller och deras miljö.

Protocol

I figur 1 sammanfattas följande protokollavsnitt.

1. Etablering av 3D-stromamonokultur

  1. Bered hBM-MSC-cellsuspensionen.
    1. Odla hBM-MSC till en sammanflödesnivå på 70% -90% i MEMα kompletterat med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin och 5 ng / ml FGF-2 i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad atmosfär. Cellerna kan användas fram till passage 6.
    2. Tvätta cellerna med PBS och lossa dem med 0,05% trypsin-EDTA i 3-5 minuter vid 37 °C. Stoppa avskiljningsprocessen genom att spola med basalmedium (MEMα kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin). Samla upp de suspenderade cellerna i ett 50 ml koniskt centrifugrör.
    3. Räkna cellerna med hjälp av en hematocytometer eller en automatiserad cellräknare och bestäm det totala antalet celler i suspensionen.
    4. Pellet cellerna genom centrifugering vid 200 x g i 5 min. Ta försiktigt bort supernatanten.
    5. Suspendera cellerna på nytt i en lämplig volym basalmedium för att uppnå en koncentration på 1 x 107 celler/ml stamlösning.
    6. Bered 50 ml koniska centrifugrör som innehåller erforderlig volym bassubstrat kompletterat med respektive tillväxtfaktor (FGF-2 och BMP-2 vid definierade koncentrationer, t.ex. 0 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml eller 200 ng/ml). Per brunn krävs 200 μL. Om cellsådd ska utföras med hjälp av en automatiserad vätskehanterare, överväga också instrumentets döda volym. För manuell cellsådd är ett volymöverskott på 10% tillräckligt.
    7. Tillsätt hBM-MSC från stamlösningen vid en spädning av 1:66,67 för att uppnå en koncentration på 1,5 x 105 celler/ml.
  2. Förbered plattan för sådd.
    1. Ta bort den självhäftande polypropenfilmen som täcker hydrogelplattan med 96 brunnar.
    2. Aspirera försiktigt lagringsbufferten som täcker hydrogelerna. För denna uppgift, använd en mikroplattbricka; Manuell hantering är dock möjlig.
      1. När du använder en manuell aspirering eller flerkanalig pipett, placera spetsen mot brunnens vägg och rör dig långsamt ner mot kanten av den inre brunnen medan du aspirerar bufferten. Detta undviker att skada hydrogelytan.
      2. När du använder en automatiserad plattbricka, ställ in aspirationsmunstyckena minst 3,8 mm från plattbäraren (detta motsvarar 0,8 mm från hydrogelplattans inre ring) och mot brunnens kant. Se tillverkarens handbok för mer detaljerade instruktioner och för att få plattritningarna av hydrogelplattan med 96 brunnar.
  3. Tillsätt 200 μl/brunn av cellsuspensionen som beretts i steg 1.1.7 efter noggrann blandning för att säkerställa att cellerna är homogent fördelade. Under sådd, för att undvika ojämn sedimentering av cellerna i en region av substratet, luta inte plattan. För manuell sådd, blanda regelbundet cellsuspensionen (efter sådd av tre brunnar) för att hålla blandningen homogen. För automatiserad sådd, blanda med en serologisk pipett omedelbart före dosering för att fördela volymer som innehåller lika många celler.
  4. Håll kulturerna vid 37 °C och 5%CO2 i en fuktad atmosfär.
  5. Övervaka utvecklingen av kulturerna genom ljusfältmikroskopi med ett 5x mål efter önskemål. Hämta referensbilder cirka 30 minuter efter sådd för att utvärdera antalet celler som läggs till.

2. Etablering av 3D-samodling av stromalendotelceller

  1. Bered GFP-HUVEC-cellsuspensionen.
    1. Bered kolvar för HUVEC-kulturen genom att belägga med en lösning bestående av 150 μg/ml råttsvanskollagen I i 0,02 M ättiksyra i 30 minuter vid 37 °C. Skölj en gång med PBS före användning.
    2. Odla GFP-HUVECs till en sammanflödesnivå på 80% -100% i EGM-2 kompletterat med 10% FBS i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad atmosfär. Cellerna kan användas fram till passage 7.
    3. Tvätta cellerna med PBS och lossa dem med 0,05% trypsin-EDTA i 2-3 min vid 37 °C. Stoppa avskiljningsprocessen genom att spola med basalmedium (MEMα kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin). Samla upp de suspenderade cellerna i ett 50 ml koniskt centrifugrör.
    4. Räkna cellerna med hjälp av en hematocytometer eller en automatiserad cellräknare och bestäm det totala antalet celler som finns i suspensionen.
    5. Pellet cellerna genom centrifugering vid 200 x g i 5 min. Ta försiktigt bort supernatanten.
    6. Suspendera cellerna på nytt i en lämplig volym basalmedium för att uppnå en koncentration på 1 x 107 celler/ml stamlösning.
    7. Bered 50 ml koniska centrifugrör som innehåller erforderlig volym bassubstrat kompletterat med respektive tillväxtfaktor (FGF-2 och BMP-2 vid definierade koncentrationer, t.ex. 0 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml eller 200 ng/ml) enligt beskrivningen för hBM-MSC i steg 1.1.6.
    8. Tillsätt GFP-HUVEC från stamlösningen vid en spädning på 1:66,67 för att uppnå en koncentration på 1,5 x 105 celler/ml, såsom beskrivs för hBM-MSC i steg 1.1.7.
  2. Aspirera mediet från plattan som innehåller stromamonokulturen enligt beskrivningen för borttagning av bufferten i steg 1.2.2.
  3. Tillsätt 200 μl/brunn av GFP-HUVEC-cellsuspensionen som beretts i steg 2.1.8 enligt beskrivningen för hBM-MSC-tillsatsen i steg 1.3.
  4. Inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 i en fuktad atmosfär. Byt medium var 3-4: e dag.
  5. Övervaka utvecklingen av kulturen genom ljusfälts- och fluorescensmikroskopi med ett 5x objektiv efter önskemål. Behåll kulturerna fram till dag 4 eller dag 7 av samkulturen för tidiga respektive mellanliggande karakteriseringar, eller efter önskemål.

3. Karakteriseringsförfarande 1: Kvantifiering av endotelcellnätverksbildning

  1. Vid önskade tidpunkter, hämta GFP-signalen från GFP-HUVECs med fluorescensmikroskopi med hjälp av inställningar som är lämpliga för kvantifiering (dvs. bästa fokus, hög kontrast och låg förstoring [t.ex. 5x] för större synfält).
  2. Förbehandla alla bilder som förvärvats samma dag (t.ex. med Fiji32) för att ytterligare förbättra kontrasten. Observera att GFP-signalen kan bli svagare med odlingstiden; Därför kan bilder som förvärvats på olika dagar behöva olika bearbetning.
    1. Om du använder Fiji eller ImageJ öppnar du alla GFP-kanalbilder från samma tidpunkt och öppnar menyn Ljusstyrka och kontrast . Välj en bild som representerar ett mellanliggande tillstånd (inte den svagaste och inte den ljusaste signalen) och justera kontrasten automatiskt genom att välja Auto. Välj Ange och markera Sprid till alla andra öppna bilder.
    2. Utvärdera visuellt om det valda intervallet passar alla bilder i den aktuella tidpunkten och justera och sprid manuellt till alla bilder efter behov.
    3. Spara de justerade bilderna som TIF-filer och upprepa steg 3.2.1 och 3.2.2 för de andra tidpunkterna.
  3. Använd ett medianfilter för oskärpa (t.ex. radie 3 för bilder med 2048 × 2048) på alla bilder för att undvika artefaktigenkänning nedströms och därmed underlätta korrekt nätverksidentifiering. Minska storleken genom att gruppera (2x2) och spara alla förbehandlade bilder som RGB Color TIF-filer i gråskala i en mapp för kvantifiering. Dessa steg kan göras manuellt eller i batchläge med hjälp av makron som författarna delar på begäran.
  4. Analysera alla bilder i mappen som skapades i steg 3.1-3.3 med hjälp av batchprocessläget i Angiogenesis Analyzer för ImageJ33. Observera att beroende på bildernas storlek och tillgängligt arbetsminne kan detta ta några minuter per bild.
  5. Validera kvantifieringsresultaten genom att undersöka överlagringarna av de igenkända strukturerna och originalbilderna. Om algoritmen känner igen artificiella strukturer, där endast några eller inga celler kan ses i originalbilden, justera förbehandlingsparametrarna och analysera originalbilderna igen, eller uteslut sådana problematiska områden och/eller replikera bilder från analysen.
  6. Normalisera de erhållna värdena till ett område av 1 mm 2 genom att multiplicera värdena för varje prov med förhållandet mellan det analyserade området och 1 mm2. Detta steg är särskilt viktigt om bilder av olika storlekar används.
  7. Extrahera olika nätverksparametrar, såsom total nätverkslängd, antal korsningar, antal segment, antal isolerade segment, förgreningsintervall och genomsnittlig maskstorlek, från analysen och använd dem för att karakterisera endotelnätverket vid olika tidpunkter och under olika kulturförhållanden.

4. Karakteriseringsförfarande 2: Bedömning av ECM-deponering

  1. Vid önskade slutpunkter, utvärdera ECM-avsättning med immunofluorescens. Lägg till primära antikroppar mot olika ECM-molekyler i 100 μl odlingsmedium under de sista 6 timmarna av odlingen eller efter fixering, enligt beskrivningen nedan.
    1. Tvätta kulturerna en gång med 200 μL/brunn PBS i 5 minuter vid rumstemperatur och fixera dem med 100 μl/brunn med 4% paraformaldehyd under ett kemiskt dragskåp i 30 minuter vid rumstemperatur. Observera att det rekommenderas att fixera alla brunnar på en platta samtidigt, eftersom de omgivande kulturerna kan skadas under detta steg. Tvätta de fasta kulturerna med 200 μl/brunn PBS vid rumstemperatur tre gånger i 5 minuter varje gång och förvara vid 4 °C i 200 μl/brunn PBS, eller fortsätt omedelbart till nästa steg.
    2. Före inkubation med primära antikroppar mot ECM-molekyler efter fixering, inkubera de fasta kulturerna med 200 μl/brunn med 1% BSA i PBS som en blockerande lösning i 30 minuter vid RT.
      1. Aspirera blockeringslösningen och inkubera med 100 μl/brunn av den primära antikroppslösningen i 1 % BSA vid PBS över natten vid 4 °C. Tvätta med 200 μl/brunn PBS tre gånger i 5 min, minst 3 timmar respektive 5 minuter vid rumstemperatur.
        OBS: Det långa tvättsteget krävs för fullständig diffusion av den obundna antikroppen ut ur hydrogelen.
    3. För att underlätta penetrationen av den sekundära färgningslösningen, inklusive intracellulära motfläckar, permeabilisera kulturerna med 0,3% Triton X-100 och 1% BSA i PBS i 30-90 minuter vid RT, beroende på kulturernas cellulära densitet.
      OBS: För antikroppsbaserad färgning av intracellulära molekyler bör detta steg utföras före inkubationen med den primära antikroppen som beskrivs i steg 4.1.2.
    4. Bered sekundära färgningslösningar som innehåller respektive sekundära antikroppar och motfläckar efter önskemål (t.ex. en nukleär fläck såsom DAPI och en cytoskelettfläck såsom falloidin-rodamin).
      1. Bered en färgningsbuffert bestående av 0,1 % Triton X-100, 1 % BSA i PBS och motfläckar (t.ex. 1 μg/ml DAPI och 1:4 000 falloidin-rodamin) och tillsätt respektive sekundära antikroppar vid rekommenderade utspädningar.
      2. Tillsätt 100 μl/brunn sekundär färgningslösning och inkubera över natten vid 4 °C. I likhet med proceduren efter den primära antikroppsinkubationen, tvätta med 200 μl/brunn PBS tre gånger i 5 min, minst 3 timmar respektive 5 minuter vid RT.
    5. För 3D-upplösning av strukturerna, skaffa konfokala staplar som börjar vid glasbotten med ett z-steg på 2,5 μm som når en slutlig höjd på 500 μm, använd ett 10x mål och en 0,75x digital zoom. För att generera en 3D-rekonstruktion av GFP- och F-aktinsignalen i Fiji, tröskel varje kanal separat innan du skapar en komposit och genererar rekonstruktionen med Fiji 3D Viewer.
    6. För visualisering av den deponerade ECM från immunfärgningarna, skaffa konfokala staplar med en höjd av 100 μm med ett z-steg på 5 μm, ett 10x mål och en 1,5x digital zoom. Generera projektioner med maximal intensitet och justera ljusstyrkan och kontrasten för varje kanal separat i Fiji innan du skapar en komposit.
  2. Utför direkta färgfärgningar av den extracellulära miljön.
    1. Tillsätt 200 μl/brunn Picrosirius Red-färgningslösning till de paraformaldehydfixerade brunnarna och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
    2. Tvätta sedan de färgade brunnarna fem gånger med destillerat vatten, följt av tvättning två gånger varje dag eller varannan dag i 3-4 dagar medan du övervakar provfärgningen. Håll plattorna vid 4 °C under de långa tvättstegen (dvs. allt som överstiger 6 timmar).
    3. Ta bilder av de färgade proverna med hjälp av ett ljusfältmikroskop utrustat med en färgkamera och behåll en jämn vitbalans över förhållandena. För att få översikter över proverna, använd en låg förstoring (t.ex. 2,5x) för att skanna hela brunnen. Om mikroskopet inte levereras med programvara som stöder automatiserad sömnad, gör det manuellt (t.ex. med parvis sömnad i Fiji34).
      OBS: De brunnar som tidigare använts för immunofluorescens kan användas för detta, förutsatt att fluorescensbildinsamlingen är klar.
    4. Följ samma steg som beskrivs för Picrosirius Red-färgning i steg 4.2.1-4.2.3 för att utföra Alizarin Red-färgning, tvättning och avbildning.

5. Karakteriseringsförfarande 3: Bedömning av osteogen differentiering genom övervakning av ALP-aktivitet

  1. Vid olika tidpunkter för kulturens slut (t.ex. dag 4 och dag 7 av samkulturen) bedömer kvantitativt ALP-aktiviteten genom att använda 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (BCIP) / nitroblå tetrazolium (NBT) färgning.
    1. Tvätta kulturerna en gång med 200 μl/brunn PBS innan de inkuberas med BCIP/NBT-substratlösningen, som bör beredas enligt tillverkarens anvisningar. Inkubera vid 37 °C med regelbunden övervakning av färgutvecklingen. När färgen börjar utvecklas under icke-osteogena förhållanden, tvätta omedelbart en gång med 200 μl/brunn PBS innan du fixerar med 4% paraformaldehyd, enligt beskrivningen i steg 4.1.1.
    2. Ta färgbilder av de färgade proverna enligt beskrivningen i steg 4.2.3 för färgning av Picrosirius Red.
  2. Vid olika tidpunkter för kulturens slut (t.ex. dag 4 och dag 7 av samkulturen) kvantifierar ALP-aktiviteten i celllysaterna.
    1. Tvätta kulturerna tre gånger med 200 μl/brunn PBS innan de inkuberas med 200 μl/brunn med 0,25 % trypsin-EDTA vid 37 °C. Var 10: e minut, agitera kulturerna genom att kraftigt pipettera upp och ner för att underlätta matsmältningen och övervaka odlingsmorfologin med ett standardcellodlingsmikroskop.
    2. När en flytande, encellssuspension utan långsträckta cellulära strukturer i brunnarna har erhållits (vanligtvis efter 20-30 minuter), överför proverna till 2 ml rör, tillsätt 200 μL MSC-basalmedium för att hämma trypsinet och centrifugera vid 500 x g i 5 minuter för att pellet de hämtade cellerna. Häll av supernatanten och frys pelletsen vid −80 °C eller fortsätt direkt till steg 5.2.3.
    3. Tina cellpellets som erhållits i steg 5.2.2 och inkubera med 500 μL lysbuffert bestående av 0,56 M 2-amino-2-metyl-1-propanol, 0,2% Triton X-100, pH 10, i 30 minuter på is. Centrifugera sedan vid 16 100 x g i 10 minuter vid 4 °C och förvara proverna på is. Efter de mätningar som beskrivs i steg 5.2.7 fryss proverna vid −20 °C eller −80 °C, eller fortsätt direkt med DNA-kvantifieringen enligt beskrivningen i steg 5.2.8.
      OBS: Lysbufferten kan beredas i förväg, sterilfiltreras och förvaras vid 4 °C.
    4. Bered ALP-reagenset bestående av 20 mM 4-nitrofenylfosfatdinatriumsalthexahydrat och 4 mMMgCl2 i lysbuffert.
      OBS: Det är bäst att bereda denna lösning färsk på kvantifieringsdagen.
    5. Utan att störa pelleterat skräp, fördela 50 μL av celllysatsupernatanten beredd i steg 5.2.3 i brunnarna på en standard, genomskinlig 96-brunnsplatta med vävnadskultur i två exemplar. Lägg till lysbuffert i två brunnar som tomma kontroller.
    6. Tillsätt 50 μl/brunn ALP-reagens med en flerkanalig pipett till de brunnar som fyllts i steg 5.2.5. Skaka plattan kort och inkubera vid 37 °C i 10 minuter skyddad från ljus. Brunnar med högre ALP-aktivitet visas gula. Avbryt reaktionen genom att tillsätta 100 μl/brunn med 1 M NaOH med hjälp av en flerkanalig pipett.
    7. Avläs den optiska densiteten vid 410 nm med en plattläsare. Beräkna medelvärdet av de tekniska dubbletterna och subtrahera medelvärdet av blankproverna.
    8. Utför DNA-kvantifiering för att normalisera ALP-aktiviteten som bestämts i föregående steg mot det totala cellantalet. Här beskrivs en metod baserad på fluorescensmätningar, men alla andra metoder för DNA-kvantifiering i celllysater är kompatibla med analysen. Bered de reagenser och DNA-standarder som krävs för DNA-kvantifiering med kommersiellt tillgängliga satser enligt tillverkarens anvisningar.
      OBS: Det rekommenderas att använda lysbuffert för att förbereda DNA-standarderna.
    9. Om de prover som används för ALP-kvantifiering enligt steg 5.2.3 fryses, tina dem, centrifugera vid 16 100 x g i 2 minuter vid 4 °C och lägg dem på is. Utan att störa något pellettat skräp, fördela 50 μL av celllysatsupernatanten i brunnarna på en svart 96-brunnsplatta i duplikat. Frys proverna vid −20 °C eller −80 °C och upprepa ALP- och DNA-kvantifieringarna om så krävs. Lägg till DNA-standarderna i duplikat.
    10. Tillsätt 50 μL av DNA-färgningsmedlet med en flerkanalig pipett, inkubera och läs fluorescensintensiteten enligt tillverkarens instruktioner. Med hjälp av standardkurvvärdena bestäms och tillämpas omvandlingen av de uppmätta intensitetsvärdena till DNA-koncentrationerna.
    11. Normalisera ALP-värdena som erhållits i steg 5.2.7 genom att dividera dem med respektive DNA-koncentration för varje prov.

6. Ansökan 1: Utföra läkemedelskänslighetsanalyser

  1. När endotelnätverken är fullt utvecklade (vanligtvis vid dag 4 av stromalendotelcellernas samkulturer), tillsätt antiangiogena föreningar, såsom bevacizumab, till kulturerna i färskt odlingsmedium och testa deras aktivitet över tid och under olika förhållanden (t.ex. olika koncentrationer av FGF-2 eller BMP-2).
    1. Förbered färskt odlingsmedium som innehåller samma tillväxtfaktorer som används för respektive kultur fram till den punkten.
      1. Bered en kontrolllösning bestående av spädningsmedlet för den berörda föreningen (t.ex. för bevacizumab: 60 mg/ml α-trehalosdihydrat, 0,4 mg/ml Tween20, 5,8 mg/ml natriumfosfat, monobasiskt och monohydrat, och 1,2 mg/ml natriumfosfat dibasiskt, vattenfritt) och sterilfiltrera det.
      2. Tillsätt föreningen av intresse vid önskad koncentration (t.ex. 10 μg/ml bevacizumab) och en lika stor volym av kontrolllösningen till odlingsmediet avsett för test- respektive kontrollförhållandena.
  2. Aspirera mediet från kulturen och tillsätt 200 μl/brunn av det medium som nyligen beretts i steg 6.1.1. Inkubera under en tid som är lämplig för föreningen som ska testas (t.ex. för bevacizumab: 2 dagar). Övervaka kulturens utveckling och karakterisera endotelnätverken enligt beskrivningen i avsnitt 3. Bedöm substansens effektivitet när det gäller att hämma angiogenes eller ablera de förformade strukturerna med hjälp av GFP-bilderna och de kvantitativa nätverksparametrarna extraherade från analysen som beskrivs i steg 3.7.

7. Tillämpning 2: Etablering av avancerade samodlingssystem med olika cancercellstyper

  1. Vid dag 4 av samodling, när endotelnätverken mestadels är etablerade, lägg till andra celltyper, såsom MDA-MB-231 eller U2OS-cancerceller, till kulturerna i färskt odlingsmedium.
    1. Märk cancercellerna med ett cellkompatibelt levande färgämne enligt tillverkarens instruktioner för att kunna skilja dem från GFP-märkta HUVECs och icke-märkta hBM-MSC i samkulturerna.
    2. Bered en suspension av cancerceller i en koncentration av 1,5 x 104 celler/ml i färskt odlingsmedium som innehåller samma tillväxtfaktorer som används för respektive kultur fram till den punkten.
  2. Övervaka odlingsutveckling och lokalisering av cancerceller efter önskemål.
    OBS: Beroende på cancertyp, aktivitet och miljö kan det ta några dagar för dem att nå de vaskulära strukturerna i stromalendotelcellens samkulturer (t.ex. 2 dagar för MDA-BM-231 och U2OS). Därför bör time-lapse-avbildningen för att visualisera de cancer-vaskulära cellinteraktionerna tidsinställas i enlighet därmed.

Representative Results

Vaskulära nischkulturer etablerades genom sekventiell sådd av hBM-MSC och GFP-HUVECs på prefabricerade PEG-baserade hydrogeler med en styvhetsgradient inom en 96-brunns bildplatta (figur 1). Kulturerna övervakades longitudinellt via levande epifluorescensmikroskopi och karakteriserades vidare vid utvalda tidpunkter. Det extracellulära facket bedömdes via direkta färgfärgningar och antikroppsbaserade fläckar. ALP-aktiviteten kvantifierades efter att cellerna hämtats och lyserats från de genererade nischerna. Vidare demonstrerar vi lämpligheten av denna plattform för antiangiogena läkemedelskänslighetsanalyser och som grund för cancersamkulturmodeller.

Samkulturer av hBM-MSC och GFP-uttryckande HUVECs etablerades genom sådd av 3 x 104 celler/brunn i frånvaro av tillväxtfaktorer eller i närvaro av antingen FGF-2 eller BMP-2 vid 50 ng/ml, enligt beskrivningen i protokollet. Från en tidig tidpunkt kunde skillnader mellan kulturerna observeras både från ljusfälts- och fluorescensbilderna som endast visade GFP-HUVECs (figur 2A). Genom att observera samma områden i längdriktningen kunde skillnader i utvecklingen av kulturerna noteras, såsom en snabbare utveckling i närvaro av FGF-2. I allmänhet verkade kulturerna mindre utvecklade i frånvaro av någon tillväxtfaktor, med färre celler av endera typen som sprider sig och närvaron av acellulära områden. Däremot visade ljusfältbilderna de tätaste kulturerna i närvaro av BMP-2. Emellertid bildades vaskulära liknande nätverk i både tillväxtfaktorinnehållande förhållanden, och de mest omfattande och sammankopplade nätverken bildades med FGF-2. Dessa observerade skillnader kunde också kvantifieras med hjälp av Angiogenesis Analyzer för ImageJ. Den totala nätverkslängden var högst i närvaro av FGF-2 och lägst i frånvaro av tillväxtfaktorer (figur 2B). Antalet korsningar som anger förgreningspunkter i näten följde samma trend som den totala längden (figur 2C). Omvänt innehöll båda tillväxtfaktorhaltiga förhållanden betydligt färre isolerade segment, vilket indikerar högre sammanlänkning än tillståndet utan någon tillväxtfaktor (figur 2D). Dessutom avslöjade 3D-konfokal avbildning starkare endotelcellspenetration när det gäller djup i det FGF-2-stimulerade tillståndet (figur 2E).

hBM-MSC/GFP-HUVEC-samkulturer upprätthölls i 7 dagar i närvaro av FGF-2 eller BMP-2 innan de fixerades och färgades för ECM-komponenter. Immunocytokemiska färgningar följt av konfokal laserskanningsmikroskopi visade slående skillnader i odlingsmorfologi beroende på typen av tillväxtfaktortillskott (figur 3A). Med FGF-2 organiserades kulturen i kondenserade mikrovaskulära strukturer, som var täta i både endotel- och mesenkymala celler, medan hBM-MSC i närvaro av BMP-2 sträckte sig över ett mycket större område, vilket framgår av de mer omfattande F-aktinpositiva och GFP-negativa områdena. ECM-proteinerna fibronektin och kollagen I lokaliserades på liknande sätt, medan laminin och kollagen IV var mer koncentrerade runt endotelstrukturerna. Denna ökade koncentration runt endotelstrukturerna var emellertid mycket mer uttalad i närvaro av FGF-2 än i närvaro av BMP-2. Förutom de antikroppsbaserade färgningarna utfördes direkta färgfärgningar för att bedöma ECM: s övergripande fibrotiska tillstånd (Picrosirius Red staining; Figur 3B), liksom avsättningen av Ca på ECM (Alizarin Red färgning; Figur 3C) av de bildade nischerna. Picrosirius Red-färgningen var starkare och mer omfattande i nischerna odlade med BMP-2, och Alizarin Red-färgningen följde samma trend.

Därefter karakteriserades kulturerna med avseende på deras osteogena potential genom att bedöma ALP-aktivitet som en tidig osteogen markör. På dag 4 och dag 7 av samodling hämtades celler från nischerna genom att smälta hydrogelerna med trypsin. För att kvantifiera ALP-aktiviteten lyserades de hämtade cellerna och en pNPP-analys utfördes. De erhållna värdena normaliserades mot det totala DNA för varje prov för att ta hänsyn till potentiella skillnader i cellantalet över förhållandena. Faktum är att små skillnader mellan DNA-innehållet i förhållandena kunde observeras, och de minsta cellerna hämtades från tillståndet utan någon tillväxtfaktor (visas inte). Den normaliserade ALP-aktiviteten varierade dock kraftigt mellan förhållandena, med en trend av ökande aktivitet med högre koncentrationer av BMP-2 och en platå vid 100 ng / ml (figur 4A, B). De lägsta aktivitetsnivåerna identifierades för tillståndet innehållande 50 ng/ml FGF-2. Medan liknande trender kunde observeras för båda de bedömda tidpunkterna, ökade alla värden signifikant över tiden i kulturen från dag 4 till dag 7. Förutom den kvantitativa analysen kan ALP-aktiviteten visualiseras kvalitativt med direkt färgfärgning baserat på BCIP / NBT-substratomvandlingen. Mer omfattande och mer intensiv lila färgning observerades i närvaro av BMP-2 jämfört med FGF-2 (figur 4C).

För att demonstrera två potentiella tillämpningar av de karakteriserade osteogena nischerna utfördes en proof-of-concept läkemedelskänslighetsstudie och cancersamkulturer. För läkemedelskänslighetsanalysen tillsattes bevacizumab eller en kontrolllösning bestående av spädningsvätskan av bevacizumabformuleringen till odlingsmediet innehållande färsk BMP-2. På dag 4, när etablerade nätverk bildades i närvaro av 50 ng / ml BMP-2, tillsattes antingen kontrolllösningen eller det bevacizumab-innehållande mediet under den regelbundna medieförändringen och kulturerna övervakades med hjälp av fluorescensavbildning. Tillsatsen av 10 μg/ml bevacizumab ledde till indragning eller ablation av det tidigare bildade nätverket, medan kontrollförhållandena fortfarande innehöll omfattande nätverk 2 dagar efter medieförändringen (figur 5A,B). Dessa förändringar kan också kvantifieras genom att spåra den totala längden på nätverken med hjälp av Angiogenesis Analyzer för ImageJ på fluorescensbilder som förvärvats dagligen (figur 5C). Alternativt kan bevacizumab eller någon annan förening också tillsättas från början av samkulturen för att bedöma deras inflytande på bildandet av nätverken. När det gäller bevacizumab hämmade detta fullständigt bildandet av endotelnätverk (visas inte).

För den andra applikationen tillsattes MDA-MB-231 bröstcancer eller U2OS osteosarkomceller till dag 4 samkulturer med en densitet av 1,5 x 103 celler / brunn i färskt odlingsmedium innehållande 50 ng / ml BMP-2. För att skilja dem från de GFP-märkta HUVECs och de icke-märkta hBM-MSC: erna, inkuberades cancercellerna med CellTrace FarRed strax före sådden på de osteogena nischerna. Kulturerna övervakades med fluorescensmikroskopi; I början lokaliserade de flesta cancercellerna nära substratets yta, men efter 2 dagar kunde de hittas närmare skikten som innehåller de vaskulära samkulturerna. Således valdes dag 2 som utgångspunkt för time-lapse-mikroskopi för att visa dynamiken i interaktionerna mellan cancercellerna och cellerna inom den vaskulära nischen. Intressant nog kunde MDA-MB-231-cellerna ses både närma sig och röra sig bort från endotelstrukturer och därmed möjligen undersöka eller omforma sin miljö (figur 5D). Med hjälp av CellTrace FarRed som etikett för cancercellerna, GFP som etikett för HUVEC, och ytterligare färgning för F-aktin, kunde alla celltyper särskiljas med hjälp av konfokal laserskanningsmikroskopi (figur 5E).

Figure 1
Figur 1: Ett enkelt tillvägagångssätt för tillförlitlig generering av vaskulariserade, osteogena nischer. Förgjutna syntetiska hydrogeler med en djupgående styvhetsgradient möjliggör generering av 3D-kulturer via sekventiell cellsådd utan behov av direkt inkapsling. hBM-MSC förkultiveras i 3 dagar innan GFP-uttryckande HUVECs läggs till. Kulturerna övervakas genom att förvärva ljusfälts- och GFP-signaler i längdriktningen. Vid utvalda tidpunkter utvärderas nischerna ytterligare för deras ECM-deponering och osteogena tillstånd. Alkalisk fosfatasaktivitet bedöms via direkt färgfärgning och genom att hämta celler från nischerna och utföra en pNPP-analys på celllysaterna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Stimulering av vaskulära nätverk med FGF-2 eller BMP-2. (A) Ljusfälts- och fluorescensbilder (GFP) förvärvades dag 2, dag 4 och dag 6 av samodlingen av celler som odlats i frånvaro av tillväxtfaktorer eller i närvaro av FGF-2 eller BMP-2, båda vid 50 ng / ml. Skalstapel: 400 μm. (B-D) Kvantifierade parametrar för GFP-HUVEC-nätverken avbildade på dag 4 av samkulturen, analyserade med hjälp av Angiogenesis Analyzer för ImageJ. Data representeras som medelvärde ± standardavvikelse. Den statistiska analysen utfördes med hjälp av GraphPad Prism 9.5.1. En vanlig enkelriktad ANOVA med Dunnetts multipla jämförelsetest utfördes med n ≥ 4; * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. (E) Tredimensionella rekonstruktioner genererade från konfokala staplar (total höjd: 547,5 μm; z-steg: 2,5 μm) av GFP- och F-aktinsignalerna för FGF-2- (övre raden) och BMP-2- (nedre raden) stimulerade förhållanden. Skalstång: 300 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Induktion av avlokaliserad hBM-MSC-spridning och ECM-deponering med BMP-2. (A-C) De 7-dagars samkulturer som odlades i närvaro av antingen FGF-2 eller BMP-2 utsattes för (A) immunofluorescens eller (B, C) direkt färgfärgning. (A) Kulturerna färgades för F-aktin och ECM-proteinerna fibronektin, laminin, kollagen I och kollagen IV. Bilderna visar de maximala intensitetsprojektionerna för de konfokala staplarna (total höjd: 100 μm; z-steg: 5 μm). Skalstapel: 200 μm. (B,C) Kulturerna färgades med (B) Picrosirius Red och (C) Alizarin Red. Den översta raden visar sydda, heltäckande översikter över bilderna som förvärvats med 2,5x förstoring (skalstapel: 1 000 μm), medan den nedre raden visar ett synfält som förvärvats vid 5x förstoring (skalstapel: 400 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Biokemisk bedömning av BMP-2-inducerad ALP-aktivitet genom direkt färgfärgning. (A,B) ALP-aktiviteten bestämdes i celllysaterna i kulturer som odlats i frånvaro av tillväxtfaktorer eller i närvaro av BMP-2 vid olika koncentrationer eller FGF-2 vid 50 ng/ml i (A) 4 dagar eller (B) 7 dagars samkultur. ALP-aktiviteten visas normaliserad till DNA-innehållet i varje lysatprov. Data representeras som medelvärde ± standardavvikelse. Den statistiska analysen utfördes med hjälp av GraphPad Prism 9.5.1. En vanlig enkelriktad ANOVA med Dunnetts multipla jämförelsetest utfördes med n = 5; P < 0,0001. (C) Direkt färgfärgning av ALP-aktiviteten i nischer odlade i närvaro av 50 ng / ml FGF-2 eller BMP-2 under 7 dagars samkultur. Bilderna på vänster sida visar sydda helbrunnsöversikter av bilder som förvärvats med 2,5x förstoring (skalstapel: 1 000 μm), medan bilderna på höger sida visar ett synfält som förvärvats vid 5x förstoring (skalstapel: 400 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Sysselsättning av osteogena, vaskulariserade nischer i avancerade cancermodeller. (A) GFP-signalerna från kulturer odlade i närvaro av BMP-2 avbildades på dag 4 av samkulturen innan en kontrolllösning (vänster) eller bevacizumab vid 10 μg/ml (höger) tillsattes under 2 dagar, varefter kulturerna avbildades igen (dag 6 av samkulturen). Skalstapel: 600 μm. (B) Bilder med högre förstoring av de bevacizumabbehandlade kulturerna visas i A. Skalstapel: 250 μm. (C) Den totala längden av endotelnätverken som visas i A kvantifierades med hjälp av Angiogenesis Analyzer för ImageJ från bilder som förvärvats dagligen; n ≥ 3. (D) CellTrace FarRed-märkta MDA-MB-231 bröstcancerceller tillsattes till de 4-dagars samkulturerna som odlades i närvaro av BMP-2, och time-lapse-bilder förvärvades med början 2 dagar efter tillsatsen av cancerceller. Skalstapel: 100 μm. (E) Projektioner för maximal intensitet av konfokala staplar (total höjd: 70 μm; z-steg: 2,4 μm) av trippelsamkulturer genererade enligt beskrivningen i D och fixerade och färgade för F-aktin. Vänster: nischer med MDA-MB-231 bröstcancerceller; höger: nischer med U2OS osteosarkomceller. Skalstreck för bilder till vänster: 200 μm; Skalstreck för bilder till höger: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Här beskriver vi ett protokoll för etablering av en in vitro-modell av högvaskulariserade ben- och benmärgsnischer i en helt syntetisk och kontrollerbar 3D PEG-baserad matris, som har en mängd olika tillämpningar inom ben- och benmärgsbiologiforskning, vävnadsteknik och cancerforskning. Denna modell bygger på en syntetisk PEG-baserad hydrogel som är funktionaliserad med RGD-peptider och MMP-klyvningsställen och gjuts med en djupgående densitetsgradient på glasbottnade 96-brunnsavbildningsplattor30. Denna plug-and-play-plattform visade sig möjliggöra etablering av mycket sammankopplade 3D-mobilnät utan att behöva kapsla in celler i hydrogelen. I likhet med det tidigare beskrivna cellinkapslingsprotokollet visar vi i detta arbete ombyggnad av substratet med en cellinneboende ECM28 för att skapa en celltypspecifik mikromiljö. Med denna metod kan således läkemedelsscreeninganalyser och analyser med högt innehåll enkelt utföras under mycket reproducerbara, organotypiska 3D-odlingsförhållanden. De glasbottnade 96-brunnsplattorna och de optiskt transparenta hydrogelerna gör plattformen kompatibel med automatisering av vätskehantering och mikroskopi med hög genomströmning.

Det första steget i att generera en osteogen vaskulär benmärgsnisch är förkulturen av hBM-MSC på PEG-hydrogelen i minst 3 dagar. Under denna tid fäster de vid hydrogelen, tränger in i den och börjar etablera cell-cellkontakter och ECM-avsättning. Innan hBM-MSC seedas måste lagringsbufferten tas bort. Eftersom hydrogelen är belägen inuti en inre brunn i standardbrunnen på 96-brunnsavbildningsplattan är det säkert att sätta in aspirationsspetsen längs brunnens sida tills den vidrör den inre brunnsringen. En vakuumpump kan användas för aspiration om den är inställd på lägsta möjliga sugkraft. Alternativt kan en automatiserad plattbricka med munstyckshöjden justerad till minst 0,8 mm ovanför den inre brunnsringen användas för att aspirera bufferten från hydrogelplattan. Användning av automatisering för vätskehantering kan minimera skador på hydrogelytan och leda till högre reproducerbarhet av de resulterande kulturerna. Små defekter på hydrogelytan blir synliga när cellerna sätter sig på hydrogelen och visas på ett lägre fokusplan i defekta hydrogelområden. Därför fungerar förvärv av referensbilder på dag 0 som en god kvalitetskontroll för cellsåddhomogeniteten och hydrogelytans integritet. Medan små hydrogelytdefekter inte utesluter vidare användning av brunnen, tenderar cellerna att kluster på de defekta områdena och kan växa till icke-representativa mönster eller snabbare nå bottenglaset, där de växer till ett monolager. Dessa artefakter måste noteras vid användning/utvärdering av dessa brunnar. Liknande överväganden gäller för alla medieförändringar som utförs under hela testets varaktighet.

Det andra steget i protokollet innebär tillägg av GFP-HUVECs till den förformade hBM-MSC-monokulturen (dag 0 av samkulturen). ECM deponerad av hBM-MSC ger en stor ställning för tillväxt av endotelceller, som i detta arbete, även i närvaro av hBM-MSC-konditionerat medium, endast kunde bilda runda cellkluster på hydrogelerna (visas inte). Vid sådd på hBM-MSC-kulturerna integreras HUVECs och bildar mikrokärlliknande strukturer jämförbara med de som observerats i samkulturer genererade genom cellinkapsling27,28. Vanligtvis bildas välutvecklade 3D-mikrovaskulära nätverk inom 4 dagar efter samkultur, och detta kan övervakas longitudinellt med hjälp av GFP-märkta HUVEC. Dessa strukturer kan bibehållas i minst 7 dagar i odling, vilket innebär att det finns tillräckligt med tid att följa förändringar i den vaskulära nätverksorganisationen som svar på behandlingar, såsom för screening av antiangiogena läkemedel. De morfologiska elementen i endotelnätverket kan kvantifieras i batchläge genom att segmentera GFP-bilderna med hjälp av väletablerade verktyg, såsom Angiogenesis Analyzer-plugin i ImageJ33, och deras parametrar kan användas för att utvärdera till exempel läkemedelseffektivitet och farmakodynamik.

En betydande fördel med den beskrivna cellulära modellen för många potentiella applikationer är dess plasticitet. Att helt enkelt komplettera odlingsmediet med olika tillväxtfaktorer kan förändra samkulturens utseende. Exempelvis skapar närvaron av BMP-2 under hela mono- och samodlingsperioden en osteogen vaskulär nisch, som visar ökad ALP-aktivitet, extracellulär kalciumavsättning samt ECM-montering och avsättning. Tvärtom, i närvaro av FGF-2 är de osteogena markörerna frånvarande, och samkulturen bildar färre laterala cellföreningar men visar mer uttalad 3D-celltillväxt. Det faktum att FGF-2 undertrycker ALP-aktivitet medan BMP-2 framkallar starkare ALP-aktivitet jämfört med ingen tillväxtfaktorbehandling är i enlighet med tidigare observationer27. Trots dessa stora skillnader i hBM-MSC-stromakomponenten var omfattningen av det mikrovaskulära nätverket mycket likartat för de två tillväxtfaktorbehandlade tillstånden i detta arbete. I kontrollkulturerna bildades endast några korta vaskulära nätverk, som kanske representerar en dåligt vaskulariserad benmärgsnisch. Detta tyder på att genom att helt enkelt ändra typen, koncentrationen och tidpunkten för tillväxtfaktorerna som läggs till odlingsmediet, kan en rad väldefinierade vaskulariserade benmärgsnischer, som skulle krävas för jämförande studier, produceras. För att säkerställa reproducerbara resultat är det dock viktigt att notera att odlingsprogressionen och morfologin kan variera beroende på de använda cellernas historia (t.ex. passagenummer och avskiljningsmetod som används vid rutinmässigt kulturunderhåll), och det är tillrådligt att kontrollera för sådana faktorer under analysdesignen.

Här, som en första tillämpning av denna modell, demonstrerar vi känsligheten hos de konstruerade mikrovaskulära nätverken för behandling med 10 μg / ml bevacizumab. Det är särskilt viktigt att bekräfta att algoritmen som används exakt kan känna igen endotelnätverket, eftersom artefakter ofta genereras i bilder med dåligt utvecklade nätverk. Om så är fallet måste parametrarna som används för bildbehandling (före och under segmentering) finjusteras, ofta på försök och fel.

Som en andra tillämpning presenterar vi en avancerad samkulturmodell bildad av sekventiell sådd av mesenkymala, endotelala och cancerceller. Denna modell gör det möjligt att studera interaktionerna mellan cancerceller, stroma och benmärgens vaskulatur, vilket kan vara viktiga faktorer under metastaser. Dessutom kan denna modell användas för läkemedelsscreeningapplikationer och testföreningar med mål bortom angiogenes.

I 2D-kulturer får celler inte fysiologiska mikromiljösignaler, förvärvar inte naturligt förekommande cellmorfologier och differentierar följaktligen annorlunda jämfört med celler i ursprungliga 3D-miljöer35. När de odlas i konstruerade 3D-hydrogeler deponerar cellerna tidigt en inneboende ECM, vilket ger vidhäftningsställen och kan aktivt omformas28,36. Här, för att etablera en förenklad 3D-modell för screeningapplikationer, såddes kärlbildande celler på ytan av konstruerade hydrogeler och fick etablera vaskulära nätverk i frånvaro av perfusion. De avbildningsbaserade utvärderingarna utfördes på 2D-projektioner av endotelcellerna som bidrar till vaskulära strukturer. Endast konfokala bilder avslöjade emellertid den mindre uttalade inväxten av 3D-vaskulära nätverk i BMP-2-stimulerade prover jämfört med FGF-2-stimulerade prover. Detta tyder på att längden på de bildade vaskulära strukturerna underskattades, medan deras anslutning överskattades. Dessutom har interaktioner mellan perivaskulära celler och endotelceller och vaskulär lumenbildning inte undersökts. Dessa aspekter, särskilt när det gäller svar på missbruksbehandling, kommer att kräva ytterligare uppmärksamhet. Slutligen skulle förfinade protokoll för att först etablera omfattande 3D-vaskulära nätverk och först därefter inducera deras osteogena differentiering vara önskvärda för att generera mer fysiologiska ben- och benmärgsmodeller.

Sammantaget är modellen som presenteras här mycket mångsidig och kan enkelt skräddarsys för specifika applikationer. Till exempel kan mesenkymala och endotelceller från olika källor användas. Det är känt att MSC för fettvävnad och MSC för navelsträng uttrycker olika angiogena faktorer jämfört med BM-MSC, och de kan lätt ersättas som en alternativ stromakomponent37. Endotelceller isolerade från redan definierade benmärgsnischer kan också användas istället för HUVEC. Man kan också etablera samkulturen med patienthärledda, matchande benmärgsmesenkymala och endotelceller för personliga medicinska tillämpningar, vilket nyligen har föreslagits för vaskulariserade muskelsamkulturer38. Dessutom möjliggör hydrogelplattans utformning longitudinell övervakning av kulturen med både ljusfälts- och fluorescensmikroskopi, vilket ger användaren möjlighet att förkorta eller förlänga odlingstiden beroende på applikationen. Alternativt kan celldensiteterna som används för sådd justeras i enlighet därmed för att påskynda eller fördröja bildandet av cellnätverket om kortare eller längre observationstider behövs än de i detta protokoll. I vilket fall som helst krävs försiktighet för att undvika cellöverväxt i arkliknande strukturer, vilket kan leda till sammandragning av hydrogelen och eventuell cellavskiljning.

Slutligen kan ett brett spektrum av analyser utföras med hjälp av denna modell. Förutom immunofluorescens och mikroskopi som utförs i levande eller fasta kulturer kan 3D-kulturerna enzymatiskt smältas och cellerna kan extraheras och utsättas för någon typ av biokemisk analys. Här demonstrerar vi bestämningen av ALP-aktivitet och DNA-innehållskvantifiering i celllysater med hjälp av kolorimetriska / fluorometriska analyser, men systemet är kompatibelt med många andra tekniker, inklusive PCR, RNAseq och proteomik. Om känsligheten hos den önskade analysen inte är särskilt hög kan man slå samman prover från mer än en brunn för att öka mängden prov som är tillgängligt för analysen. Om den önskade applikationen kräver snabbare gelupplösning kan orbital skakning av plattan appliceras i kombination med mindre volymer av matsmältningslösningen för att säkerställa virvelbildning i brunnarna, förutsatt att alla brunnar på plattan kommer att användas på detta sätt (levande kulturer är känsliga för sådan hård hantering). Sammanfattningsvis presenterar vi här ett protokoll som, om det används enligt beskrivningen, garanterar genereringen av en in vitro-modell som rekapitulerar de viktigaste aspekterna av osteogena vaskulära nischer men också är mångsidig nog att modifieras för skräddarsydda applikationer.

Disclosures

Ectica Technologies AG är tillverkaren av 3DProSeed hydrogelbrunnsplattan och har kommersiella intressen. Benjamin R. Simona och Martin Ehrbar är aktieägare i Ectica Technologies AG.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Riccardo Urbanet för teknisk hjälp med vätskehanteringsanordningarna och Rodi Odabasi för stöd med epifluorescensmikroskopin. Detta arbete finansierades av Swiss National Science Foundation (bidragsnummer 310030E_202429 och 205321_204318) och Ectica Technologies AG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-072
2 mL microtubes Eppendorf 30120094
2-Amino-2-methyl-1-propanol Sigma A9199
3DProSeed hydrogel well plate Ectica Technologies ECT.PS1.001.096
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate Sigma 71768
Alizarin Red S Sigma A5533
Anti-Collagen IV antibody Abcam ab6311
Anti-Laminin 1+2 antibody Abcam ab7463
Automated plate washer Agilent Biotek ELχ50
Automated washer/dispenser Agilent Biotek MULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette
Bevacizumab Evidentic ID PS-E07-2019-00119 A009
BMP-2 Peprotech 120-02C
BSA AppliChem A1391
Centrifuge Eppendorf 5415 R To centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis
Confocal laser scanning microscope Leica Stellaris 5
Conical 50 mL centrifuge tubes TPP 91050
DAPI Sigma D9542
DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) Antibody Biolegend 406406
DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody Biolegend 405312
EGM-2 Lonza CC-3162
Epifluorescence microscope Leica DMI6000B
FBS Gibco 10500-064
FGF-2 Peprotech 100-18B
Fibronectin (IST-9) Santa Cruz sc-59826
GFP-HUVECs PELOBiotech PB-CAP-0001GFP
hBM-MSCs - - Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359
Inverted microscope Zeiss 200M
Magnesium chloride Sigma M8266
MDA-MB-231 breast cancer cell line - Kindly obtained from J Massagué at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center
MEMα Gibco 22571-038
Multimode imaging reader Agilent Biotek Cytation 1 For automated imaging
Multimode imaging reader - fluorescence and absorbance Agilent Biotek Cytation 5 For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis
Paraformaldehyde Artechemis US 040
PBS Gibco 10010-015
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Phalloidin-rhodamine Invitrogen R415
Picro-Sirius Red Solution Abcam ab246832
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit ThermoFisher Scientific P7589
Recombinant Anti-Collagen I antibody Abcam ab260043
SIGMAFAST BCIP/NBT Sigma B5655-25TAB
Sodium hydroxide Sigma 1064981000
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Sigma S-0876
Sodium phosphate monobasic, monohydrate Merck 1.06346
Triton X-100 Sigma T8787
Tween20 AppliChem A4974
U2OS osteosarcoma cell line - Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich 
α-trehalose dihydrate Sigma 90208

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
  2. Calvi, L. M., Link, D. C. Cellular complexity of the bone marrow hematopoietic stem cell niche. Calcified Tissue International. 94 (1), 112-124 (2014).
  3. Behrmann, L., Wellbrock, J., Fiedler, W. Acute myeloid leukemia and the bone marrow niche-take a closer look. Frontiers in Oncology. 8, 444 (2018).
  4. Yip, R. K. H., et al. Mammary tumour cells remodel the bone marrow vascular microenvironment to support metastasis. Nature Communications. 12 (1), 6920 (2021).
  5. Potente, M., Makinen, T. Vascular heterogeneity and specialization in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 477-494 (2017).
  6. Augustin, H. G., Koh, G. Y. Organotypic vasculature: From descriptive heterogeneity to functional pathophysiology. Science. 357 (6353), (2017).
  7. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  8. Barillari, G. The anti-angiogenic effects of anti-human immunodeficiency virus drugs. Frontiers in Oncology. 10, 806 (2020).
  9. Owen, M., Friedenstein, A. J. Stromal stem-cells - Marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Foundation Symposia. 136, 42-60 (1988).
  10. Sacchetti, B., et al. Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment. Cell. 131 (2), 324-336 (2007).
  11. Traore, M. A., George, S. C. Tissue engineering the vascular tree. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 23 (6), 505-514 (2017).
  12. Bessy, T., Itkin, T., Passaro, D. Bioengineering the bone marrow vascular niche. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 645496 (2021).
  13. Bray, L. J., et al. A three-dimensional ex vivo tri-culture model mimics cell-cell interactions between acute myeloid leukemia and the vascular niche. Haematologica. 102 (7), 1215-1226 (2017).
  14. Montano, I., et al. Formation of human capillaries in vitro: The engineering of prevascularized matrices. Tissue Engineering Part A. 16 (1), 269-282 (2010).
  15. Sun, Z. Y., Kemp, S. S., Lin, P. K., Aguera, K. N., Davis, G. E. Endothelial k-RasV12 expression induces capillary deficiency attributable to marked tube network expansion coupled to reduced pericytes and basement membranes. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 42 (2), 205-222 (2022).
  16. Kleinman, H. K., et al. Basement-membrane complexes with biological-activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).
  17. Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement-membrane in the morphological-differentiation of human-endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
  18. Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods in Molecular Biology. 1066, 17-28 (2013).
  19. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).
  20. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  21. Wang, X. L., et al. Engineering anastomosis between living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Lab on a Chip. 16 (2), 282-290 (2016).
  22. Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
  23. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature Biotechnology. 23 (1), 47-55 (2005).
  24. Kyburz, K. A., Anseth, K. S. Synthetic mimics of the extracellular matrix: How simple is complex enough. Annals of Biomedical Engineering. 43 (3), 489-500 (2015).
  25. Ehrbar, M., et al. Enzymatic formation of modular cell-instructive fibrin analogs for tissue engineering. Biomaterials. 28 (26), 3856-3866 (2007).
  26. Ehrbar, M., et al. Biomolecular hydrogels formed and degraded via site-specific enzymatic reactions. Biomacromolecules. 8 (10), 3000-3007 (2007).
  27. Blache, U., et al. Dual role of mesenchymal stem cells allows for microvascularized bone tissue-like environments in PEG hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 5 (4), 489-498 (2016).
  28. Blache, U., et al. Notch-inducing hydrogels reveal a perivascular switch of mesenchymal stem cell fate. Embo Reports. 19 (8), e45964 (2018).
  29. Simona, B. R., et al. Density gradients at hydrogel interfaces for enhanced cell penetration. Biomaterials Science. 3 (4), 586-591 (2015).
  30. Zhang, N., et al. Soft hydrogels featuring in-depth surface density gradients for the simple establishment of 3d tissue models for screening applications. SLAS Discovery. 22 (5), 635-644 (2017).
  31. Martin, I., Muraglia, A., Campanile, G., Cancedda, R., Quarto, R. Fibroblast growth factor-2 supports ex vivo expansion and maintenance of osteogenic precursors from human bone marrow. Endocrinology. 138 (10), 4456-4462 (1997).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Carpentier, G., Martinelli, M., Courty, J., Cascone, I. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. 4th ImageJ User and Developer Conference. , Mondorf-les-Bains, Luxembourg. 198-201 (2012).
  34. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  35. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  36. Loebel, C., Mauck, R. L., Burdick, J. A. Local nascent protein deposition and remodelling guide mesenchymal stromal cell mechanosensing and fate in three-dimensional hydrogels. Nature Materials. 18 (8), 883-891 (2019).
  37. Curtis, M. B., Kelly, N., Hughes, C. C. W., George, S. C. Organotypic stromal cells impact endothelial cell transcriptome in 3D microvessel networks. Scientific Reports. 12 (1), 20434 (2022).
  38. Wust, R., Terrie, L., Muntefering, T., Ruck, T., Thorrez, L. Efficient co-isolation of microvascular endothelial cells and satellite cell-derived myoblasts from human skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 964705 (2022).

Tags

Bioengineering Hydrogel benmärg vaskulär nisch angiogenes osteogenes in vitro mikromiljö fenotypisk läkemedelsscreening tumörmikromiljö
Enkel etablering av en vaskulariserad osteogen benmärgsnisch med användning av prefabricerade poly (etylenglykol) (PEG) hydrogeler i en bildmikroplatta
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krattiger, L. A., Mitsi, M., Simona, … More

Krattiger, L. A., Mitsi, M., Simona, B. R., Ehrbar, M. Simple Establishment of a Vascularized Osteogenic Bone Marrow Niche Using Pre-Cast Poly(ethylene Glycol) (PEG) Hydrogels in an Imaging Microplate. J. Vis. Exp. (195), e65413, doi:10.3791/65413 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter