Summary
골수 혈관 틈새의 시험관 내 모델은 중간엽 및 내피 세포를 프리캐스트 3D PEG 하이드로겔에 파종하여 설정됩니다. 틈새의 내피 네트워크, ECM 성분 및 ALP 활성은 사용된 성장 인자에 따라 다릅니다. 이 플랫폼은 진행된 암 모델에 사용할 수 있습니다.
Abstract
뼈와 골수는 혈관이 많이 형성되고 구조적으로 복잡한 기관이며 암과 전이 형성 부위입니다. 약물 스크리닝과 호환되는 혈관 형성을 포함한 뼈 및 골수 특이적 기능을 요약하는 시험관 내 모델이 매우 바람직합니다. 이러한 모델은 단순하고 구조적으로 관련이 없는 2차원(2D) 체외 모델과 더 비싸고 윤리적으로 까다로운 생체 내 모델 간의 격차를 해소할 수 있습니다. 이 기사에서는 혈관 형성, 골형성 골수 틈새 생성을 위해 조작된 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 매트릭스를 기반으로 하는 제어 가능한 3차원(3D) 공동 배양 분석에 대해 설명합니다. PEG 매트릭스 설계를 통해 캡슐화가 필요 없는 간단한 세포 파종 단계를 통해 3D 세포 배양을 개발할 수 있으므로 복잡한 공동 배양 시스템을 개발할 수 있습니다. 또한 매트릭스는 투명하고 유리 바닥의 96웰 이미징 플레이트에 미리 주조되어 있어 현미경 검사에 적합한 시스템을 제공합니다. 여기에 기술된 분석을 위해, 인간 골수-유래 중간엽 기질 세포 (hBM-MSCs)는 충분히 발달된 3D 세포 네트워크가 형성될 때까지 먼저 배양된다. 이어서, GFP-발현 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVECs)가 추가된다. 배양 개발 후에는 명시야 현미경과 형광 현미경이 뒤따릅니다. hBM-MSC 네트워크의 존재는 그렇지 않으면 형성되지 않고 적어도 7일 동안 안정적으로 유지되는 혈관 유사 구조의 형성을 지원합니다. 혈관 유사 네트워크 형성의 정도는 쉽게 정량화할 수 있습니다. 이 모델은 공동 배양 4일째 및 7일째에 증가된 알칼리성 포스파타제(ALP) 활성에 의해 평가된 바와 같이 hBM-MSC의 골형성 분화를 촉진하는 골형성 단백질 2(BMP-2)로 배양 배지를 보충함으로써 골형성 골수 틈새로 조정할 수 있습니다. 이 세포 모델은 다양한 암세포를 배양하고 이들이 뼈 및 골수 특이적 혈관 틈새와 어떻게 상호 작용하는지 연구하기 위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다. 또한 자동화 및 고함량 분석에 적합하므로 재현성이 높은 배양 조건에서 항암제 스크리닝이 가능합니다.
Introduction
뼈와 골수는 구조적으로나 기능적으로 복잡한 기관으로 인간 건강의 중심입니다. 이것은 조혈과 뼈 유지를 조절하는 뚜렷한 틈새의 존재에 의해 반영된다1. 건강한 골수에서 조혈 및 골격 줄기 세포의 유지 및 확장과 자손은 뚜렷한 틈새에 의해 제어된다는 것이 널리 받아들여지고 있습니다. 이러한 틈새는 골계통 세포, 중간엽 줄기 세포, 내피 및 혈관주위 세포, 신경 세포 및 신경교 세포, 지방 세포, 파골세포, 대식세포 및 호중구를 포함한 다양한 세포 유형으로 구성됩니다2. 놀랍지 않게도, 이러한 혈관 구조와 관련된 틈새는 다양한 유형의 백혈병 3의 발병에도 관여하며, 다양한 암4의 전이 부위이기도 하다. 뼈 형성, 리모델링 및 뼈(골수) 유지에 대한 특정 역할로 인해 뼈 관련 혈관 구조는 신체의 다른 곳에서 발견되는 혈관 구조와 다른 뚜렷한 특수 구조를 가지고 있습니다 5,6,7. 따라서, 전신적으로 적용되는 항-혈관신생 또는 혈관구조 조절 약물은 이러한 특수한 환경 내에서 상이한 효과를 가질 수 있다8. 따라서, 모델은 골 및 골수의 생리학적 특성, 골 및 골수 재생, 및 치료적 처치에 대한 반응의 유지에 관여하는 분자 메카니즘을 조사하는 것이 매우 바람직하다.
동물 모델을 사용한 고전적인 2차원(2D) 조직 배양 및 생체 내 조사는 뼈 및 골수 발달에 관여하는 다양한 세포 및 분자 플레이어의 역할에 대한 귀중한 통찰력을 제공했습니다 9,10. 관련 인간 세포에 대한 고처리량 실험을 허용하는 모델은 이러한 고도로 복잡한 시스템에서 선택된 매개변수를 조절하는 방법에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.
지난 10년 동안, 조직 공학으로부터 유도된 원리들이 3D 조직 모델(11,12)을 생성하기 위해 사용되었다. 이들은 주로 조직 관련 세포를 생체 재료로 캡슐화하여 3D 단일 또는 공동 배양을 확립하는 데 의존해 왔습니다13. 가장 많이 사용되는 생체 재료 중에는 피브린 14, 콜라겐 15 및 매트리겔16,17이 있으며, 모두 생체 적합성이 높고 많은 세포 유형의 성장에 적합한 조건을 제공합니다. 이러한 생체 재료는 생체 내에서 발견되는 다양한 혈관 틈새의 주요 측면을 요약하는 시험관 내 모델을 생성할 수 있습니다 18. 더욱이, 관류된 혈관 뼈 및 골수 모델을 생성하기 위한 미세유체 장치의 사용은 더 높은 복잡성의 시험관내 모델의 생성에 기여하였다 19,20,21,22.
자연 발생 생체 재료의 조성을 제어하고 특성을 엔지니어링하는 데 어려움이 있기 때문에 예측 가능한 물리적, 화학적, 생물학적 특성으로 합리적으로 설계할 수 있는 합성 유사체의 개발이 고무되었습니다23,24. 우리는 세포 부착 및 리모델링을 용이하게 하기 위해 RGD 펩타이드 및 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 절단 부위로 기능화된 완전 합성 인자 XIII(FXIII) 가교 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 기반 하이드로겔을 개발했습니다25,26. 이러한 생체 재료의 모듈식 설계는 3D 혈관화된 뼈 및 골수 모델27,28의 형성을 위한 조건을 최적화하는 데 성공적으로 사용되었습니다.
더 많은 수의 다양한 배양 조건과 새로운 치료제를 테스트하려면 더 높은 처리량을 가진 모델이 필요합니다. 우리는 최근 PEG 하이드로겔의 FXIII 가교가 심층적인 하이드로겔 강성 구배가 형성되도록 전기화학적 공정을 통해 제어될 수 있음을 보여주었습니다29. 세포가 이러한 하이드로겔 위에 추가될 때, 세포는 내부로 이동하여 점차 고도로 상호 연결된 3D 세포 네트워크(30)로 발전한다. 일반적으로 다른 3D 스캐폴드와 함께 존재하는 하이드로겔에 세포를 캡슐화할 필요가 없어 실험 설계가 간소화될 뿐만 아니라 서로 다른 시점에서 서로 다른 세포 유형을 순차적으로 추가하여 복잡한 공동 배양 시스템을 생성할 수 있습니다. 이 하이드로겔은 유리 바닥 96웰 이미징 플레이트에 미리 주조되어 사용할 수 있으므로 수동 및 자동 세포 파종 프로토콜을 통해 3D 배양을 설정할 수 있습니다. PEG 하이드로겔의 광학 투명성은 플랫폼이 현미경과 호환되도록 합니다.
여기에서 우리는 즉시 사용할 수 있는 이 합성 플러그 앤 플레이 플랫폼 내에서 혈관화된 골형성 틈새의 생성 및 특성화를 위한 간단한 방법을 제시합니다. 우리는 혈관 네트워크의 발달이 시험관 내 골형성 유도에 일반적으로 사용되는 성장 인자인 뼈 형태 형성 단백질-2(BMP-2)로 자극될 수 있는 반면, 골형성 분화는 섬유아세포 성장 인자 2(FGF-2)27,31의 보충으로 예방할 수 있음을 보여줍니다. 형성된 네트워크는 FGF-2 자극 네트워크와 비교할 때 전체 외관뿐만 아니라 세포 및 ECM 분포 측면에서 다릅니다. 또한, 알칼리성 포스파타제를 마커로 사용하여 골형성 유도를 모니터링했습니다. 우리는 시간이 지남에 따라 이 마커의 증가된 발현을 입증하고 정성적 및 정량적 방법을 사용하여 FGF-2 자극 네트워크에서의 발현과 비교합니다. 마지막으로, 우리는 두 가지 잠재적 응용 프로그램에 대해 이 모델의 생성된 틈새의 적합성을 보여줍니다. 첫째, 우리는 미리 형성된 틈새에 베바시주맙을 추가하고 그 존재 시 혈관 네트워크의 분해를 모니터링하여 개념 증명 약물 민감도 분석을 수행했습니다. 둘째, MDA-MB-231 유방암과 U2OS 골육종 세포를 미리 형성된 골형성 틈새에 추가하여 틈새가 암세포와 환경 간의 상호 작용을 연구하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.
Protocol
그림 1 에는 다음과 같은 프로토콜 섹션이 요약되어 있습니다.
1. 3D 기질 단일 재배 확립
- hBM-MSC 세포 현탁액을 준비한다.
- 가습 분위기에서 37°C 및 5%CO2 의 인큐베이터에서 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 5ng/mL FGF-2가 보충된 MEMα에서 hBM-MSC를 70%-90%의 합류 수준으로 성장시킵니다. 상기 세포는 계대 6까지 사용될 수 있다.
- 세포를 PBS로 세척하고, 37°C에서 3-5분 동안 0.05% Trypsin-EDTA를 사용하여 이들을 분리한다. 기본 배지(10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 MEMα)로 세척하여 분리 과정을 중지합니다. 50mL 원뿔형 원심분리기 튜브에 부유 세포를 수집합니다.
- 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 현탁액의 총 세포 수를 결정합니다.
- 200 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.
- 적절한 부피의 기본 배지에 세포를 재현탁하여 1 x 107 cells/mL의 원액 농도를 달성합니다.
- 각 성장 인자(정의된 농도의 FGF-2 및 BMP-2, 예: 0ng/mL, 25ng/mL, 50ng/mL, 100ng/mL 또는 200ng/mL)가 보충된 필요한 부피의 기본 배지가 들어 있는 50mL 원추형 원심분리기 튜브를 준비합니다. 웰당 200μL가 필요합니다. 자동화된 액체 처리기를 사용하여 세포 파종을 수행해야 하는 경우 기기의 데드 볼륨도 고려하십시오. 수동 세포 파종의 경우 10 %를 초과하는 부피로 충분합니다.
- 1:66.67의 희석으로 원액에서 hBM-MSC를 추가하여 1.5 x 105 cells/mL의 농도를 달성합니다.
- 파종을 위해 접시를 준비하십시오.
- 96-웰 하이드로겔 플레이트를 덮고 있는 폴리프로필렌 접착 필름을 제거한다.
- 하이드로겔을 덮고 있는 저장 완충액을 조심스럽게 흡인합니다. 이 작업에는 마이크로플레이트 와셔를 사용하십시오. 그러나 수동 처리가 가능합니다.
- 수동 흡인기 또는 다채널 피펫을 사용할 때 팁을 웰 벽에 대고 버퍼를 흡입하면서 내부 웰의 가장자리를 향해 천천히 아래로 이동합니다. 이렇게 하면 하이드로겔 표면이 손상되는 것을 방지할 수 있습니다.
- 자동 플레이트 와셔를 사용할 때 흡인 노즐을 플레이트 캐리어에서 최소 3.8mm(하이드로겔 플레이트의 내부 링에서 0.8mm에 해당) 웰 가장자리 쪽으로 설정합니다. 자세한 지침과 96웰 하이드로겔 플레이트의 플레이트 도면을 얻으려면 제조업체 설명서를 참조하십시오.
- 세포가 균질하게 분포되도록 완전히 혼합한 후 1.1.7단계에서 제조된 세포 현탁액의 200μL/well을 추가합니다. 파종 중에 기질의 한 영역에서 세포의 고르지 않은 침전을 피하기 위해 플레이트를 기울이지 마십시오. 수동 파종의 경우, 혼합물을 균질하게 유지하기 위해 주기적으로 세포 현탁액 (3 개의 웰을 파종 한 후)을 혼합하십시오. 자동 파종의 경우, 동일한 수의 세포를 포함하는 부피를 분주하기 위해 분주 직전에 혈청학적 피펫과 혼합하십시오.
- 배양물을 가습 분위기에서 37°C 및 5%CO2 로 유지한다.
- 원하는 대로 5x 대물렌즈로 명시야 현미경으로 배양 진행을 모니터링합니다. 시드 후 약 30분 후에 참조 이미지를 획득하여 추가된 셀 수를 평가합니다.
2. 3D stromal-endothelial cell co-culture 확립
- GFP-HUVEC 세포 현탁액을 준비한다.
- 37°C에서 30분 동안 0.02M 아세트산에 150μg/mL 쥐꼬리 콜라겐 I로 구성된 용액으로 코팅하여 HUVEC 배양을 위한 플라스크를 준비합니다. 사용하기 전에 PBS로 한 번 헹굽니다.
- GFP-HUVECs를 37°C의 인큐베이터에서 10% FBS로 보충된 EGM-2에서 80%-100%의 합류 수준으로, 가습된 분위기에서 5%CO2 로 성장시킵니다. 상기 세포는 계대 7까지 사용될 수 있다.
- 세포를 PBS로 세척하고, 37°C에서 2-3분 동안 0.05% Trypsin-EDTA를 사용하여 이들을 분리한다. 기본 배지(10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 MEMα)로 세척하여 분리 과정을 중지합니다. 50mL 원뿔형 원심분리기 튜브에 부유 세포를 수집합니다.
- 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 현탁액에 존재하는 총 세포 수를 결정합니다.
- 200 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.
- 적절한 부피의 기본 배지에 세포를 재현탁하여 1 x 107 cells/mL의 원액 농도를 달성합니다.
- 각 성장 인자(정의된 농도의 FGF-2 및 BMP-2, 예: 0ng/mL, 25ng/mL, 50ng/mL, 100ng/mL 또는 200ng/mL)가 보충된 필요한 부피의 기본 배지가 들어 있는 50mL 원추형 원추형 원심분리기 튜브를 준비합니다.
- 1.1.7 단계의 hBM-MSC에 대해 설명된 대로 1.5 x 105 cells/mL의 농도를 달성하기 위해 1:66.67의 희석으로 원액에서 GFP-HUVEC를 추가합니다.
- 단계 1.2.2에서 완충액 제거에 대해 기술된 바와 같이 기질 단일배양물을 함유하는 플레이트로부터 배지를 흡인한다.
- 단계 1.3에서 hBM-MSC 첨가에 대해 설명된 바와 같이 단계 2.1.8에서 제조된 GFP-HUVEC 세포 현탁액의 200μL/웰을 추가합니다.
- 가습된 분위기에서 37°C 및 5%CO2 에서 인큐베이션한다. 3-4 일마다 배지를 교체하십시오.
- 원하는 대로 5x 대물렌즈를 사용하여 명시야 및 형광 현미경으로 배양 발달을 모니터링합니다. 초기 또는 중간 특성화를 위해 각각 또는 원하는 대로 공동 배양의 4일 또는 7일까지 배양을 유지합니다.
3. 특성화 절차 1: 내피 세포 네트워크 형성 정량화
- 원하는 시점에서, 정량화에 적합한 설정(즉, 더 넓은 시야를 위한 최적 초점, 고대비 및 저배율[예: 5x])을 사용하여 형광 현미경으로 GFP-HUVEC로부터 GFP 신호를 획득합니다.
- 대비를 더욱 향상시키기 위해 같은 날에 획득된 모든 이미지를 동일하게 사전 처리(예: Fiji32 사용). GFP 신호는 배양 시간에 따라 어두워질 수 있습니다. 따라서 다른 날짜에 획득한 이미지는 다른 처리가 필요할 수 있습니다.
- Fiji 또는 ImageJ를 사용하는 경우 동일한 시점의 모든 GFP 채널 이미지를 열고 밝기 및 대비 메뉴를 엽니다. 중간 조건(가장 어둡거나 가장 밝은 신호가 아님)을 나타내는 이미지를 선택하고 자동을 선택하여 대비를 자동 조정합니다. 설정(Set)을 선택하고 열려 있는 다른 모든 이미지로 전파(Propagate to all Open Images)를 선택합니다.
- 자동으로 선택된 범위가 현재 시점의 모든 이미지에 맞는지 시각적으로 평가하고 필요에 따라 수동으로 다시 조정하고 모든 이미지에 다시 전파합니다.
- 조정된 이미지를 TIF 파일로 저장하고 획득한 다른 시점에 대해 3.2.1단계와 3.2.2단계를 반복합니다.
- 모든 이미지에 중간 흐림 필터(예: 2048x2048 이미지의 경우 반경 3)를 적용하여 아티팩트 인식 다운스트림을 방지하여 정확한 네트워크 식별을 용이하게 합니다. 비닝(2x2)을 통해 크기를 줄이고 정량화를 위해 사전 처리된 모든 이미지를 그레이스케일 RGB 컬러 TIF 파일로 폴더에 저장합니다. 이러한 단계는 수동으로 수행하거나 작성자가 요청 시 공유할 매크로를 사용하여 배치 모드로 수행할 수 있습니다.
- 3.1-3.3단계에서 생성된 폴더의 모든 이미지를 ImageJ33용 혈관신생 분석기의 배치 프로세스 모드를 사용하여 분석합니다. 이미지 크기 및 사용 가능한 작업 메모리에 따라 이미지당 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
- 인식된 구조와 원본 이미지의 오버레이를 검사하여 정량화 결과를 검증합니다. 알고리즘이 원본 이미지에서 몇 개의 셀만 볼 수 있거나 전혀 볼 수 없는 인공 구조를 인식하는 경우 사전 처리 매개변수를 조정하고 원본 이미지를 다시 분석하거나 이러한 문제 영역을 제외하거나 분석에서 이미지를 복제합니다.
- 각 샘플의 값에 분석된 면적의 비율을 1mm2에 곱하여 얻은 값을1mm2의 면적으로 정규화합니다. 이 단계는 크기가 다른 이미지를 사용하는 경우 특히 중요합니다.
- 분석에서 총 네트워크 길이, 접합부 수, 세그먼트 수, 분리된 세그먼트 수, 분기 간격 및 평균 메쉬 크기와 같은 다양한 네트워크 파라미터를 추출하고 이를 사용하여 다양한 시점 및 다양한 배양 조건에서 내피 네트워크를 특성화합니다.
4. 특성화 절차 2 : ECM 증착 평가
- 원하는 종료 시점에서 면역형광을 사용하여 ECM 증착을 평가합니다. 아래에 설명된 바와 같이 배양의 마지막 6시간 동안 또는 고정 후 배양 배지 100μL에 다양한 ECM 분자에 대한 1차 항체를 추가합니다.
- RT에서 5분 동안 200μL/웰의 PBS로 배양물을 한 번 세척하고, RT에서 30분 동안 화학 흄 후드 아래에서 4% 파라포름알데히드의 100μL/웰로 고정합니다. 고정된 배양물을 RT에서 PBS 200μL/well로 매회 5분씩 3회 세척하고, PBS 200μL/well에 4°C에서 보관하거나 즉시 다음 단계로 진행한다.
- 고정 후 ECM 분자에 대한 1차 항체와 함께 배양하기 전에 RT에서 30분 동안 차단 용액으로 PBS에서 1% BSA의 200μL/well로 고정된 배양물을 배양합니다.
- 블로킹 용액을 흡인하고 4°C에서 밤새 PBS에서 1% BSA의 1차 항체 용액 100μL/웰과 함께 배양합니다. 200μL/웰의 PBS로 실온에서 각각 5분, 최소 3시간 및 5분 동안 3회 세척합니다.
참고: 결합되지 않은 항체가 하이드로겔 밖으로 완전히 확산되려면 긴 세척 단계가 필요합니다.
- 블로킹 용액을 흡인하고 4°C에서 밤새 PBS에서 1% BSA의 1차 항체 용액 100μL/웰과 함께 배양합니다. 200μL/웰의 PBS로 실온에서 각각 5분, 최소 3시간 및 5분 동안 3회 세척합니다.
- 세포내 카운터스테인을 포함한 2차 염색 용액의 침투를 용이하게 하기 위해, 배양물의 세포 밀도에 따라 RT에서 30-90분 동안 PBS 중 0.3% Triton X-100 및 1% BSA를 사용하여 배양물을 투과시킨다.
참고: 세포내 분자의 항체 기반 염색의 경우 이 단계는 4.1.2단계에 설명된 1차 항체로 배양하기 전에 수행해야 합니다. - 각각의 2차 항체 및 대조염색(예: DAPI와 같은 핵 염색 및 팔로이딘-로다민과 같은 세포골격 염색)을 포함하는 2차 염색 용액을 준비합니다.
- 0.1% Triton X-100, PBS 중 1% BSA 및 카운터스테인(예: 1μg/mL DAPI 및 1:4,000 팔로이딘-로다민)으로 구성된 염색 완충액을 준비하고 권장 희석액에 각각의 2차 항체를 추가합니다.
- 100 μL/well의 2차 염색 용액을 첨가하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 1차 항체 배양 후 절차와 유사하게 RT에서 각각 5분, 최소 3시간 및 5분 동안 PBS 200μL/well로 3회 세척합니다.
- 구조물의 3D 분해를 위해 2.5 μm의 z 스텝으로 유리 바닥에서 시작하여 최종 높이 500 μm에 도달하는 컨포칼 스택을 획득하고, 10x 대물렌즈와 0.75x 디지털 줌을 사용합니다. 피지에서 GFP 및 F-액틴 신호의 3D 재구성을 생성하려면 합성물을 생성하고 Fiji 3D 뷰어를 사용하여 재구성을 생성하기 전에 각 채널을 개별적으로 임계값화합니다.
- 면역염색에서 증착된 ECM을 시각화하기 위해 5μm의 z-스텝, 10x 대물렌즈 및 1.5x 디지털 줌으로 100μm 높이의 컨포칼 스택을 획득합니다. 컴포지트를 만들기 전에 최대 강도 프로젝션을 생성하고 피지에서 각 채널의 밝기와 대비를 개별적으로 조정합니다.
- 세포 외 환경의 직접적인 색상 염색을 수행합니다.
- 200μL/웰의 피크로시리우스 레드 염색 용액을 파라포름알데히드 고정 웰에 추가하고 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
- 다음에, 염색된 웰을 증류수로 5회 세척하고, 샘플 색 투명화를 모니터링하면서 3-4일 동안 매일 또는 2일마다 2회 세척하였다. 긴 세척 단계(즉, 6시간을 초과하는 모든 것) 동안 플레이트를 4°C로 유지하십시오.
- 컬러 카메라가 장착된 명시야 현미경을 사용하여 염색된 샘플의 이미지를 획득하고 조건 전반에 걸쳐 동일한 화이트 밸런스를 유지합니다. 샘플의 개요를 얻으려면 저배율(예: 2.5x)을 사용하여 전체 웰을 스캔합니다. 현미경에 자동 스티칭을 지원하는 소프트웨어가 함께 제공되지 않는 경우 수동으로 수행하십시오(예: 피지34에서 페어와이즈 스티칭 사용).
참고: 형광 이미지 획득이 완료된 경우 이전에 면역형광에 사용된 웰을 사용할 수 있습니다. - 4.2.1-4.2.3 단계에서 Picrosirius Red 염색에 대해 설명한 것과 동일한 단계에 따라 Alizarin Red 염색, 세척 및 이미징을 수행합니다.
5. 특성화 절차 3: ALP 활성을 모니터링하여 골형성 분화 평가
- 서로 다른 배양 종료 시점(예: 공동 배양 4일 및 7일)에서 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP)/니트로 블루 테트라졸리움(NBT) 염색을 사용하여 ALP 활성을 정량적으로 평가합니다.
- BCIP/NBT 기질 용액으로 배양하기 전에 200μL/well의 PBS로 배양물을 한 번 세척하고 제조업체의 지침에 따라 준비해야 합니다. 37°C에서 배양하면서 주기적으로 발색을 모니터링합니다. 비골형성 조건에서 색이 발달하기 시작하면 4.1.1단계에서 설명한 대로 즉시 200% 파라포름알데히드로 고정하기 전에 PBS 4μL/well로 한 번 세척합니다.
- Picrosirius Red 염색을 위해 4.2.3 단계에 설명된 대로 염색된 샘플의 색상 이미지를 획득합니다.
- 상이한 배양 종료 시점 (예를 들어, 공동 배양의 4일째 및 7일째)에서, 세포 용해물에서 ALP 활성을 정량화한다.
- 37°C에서 0.25% 트립신-EDTA의 200μL/웰로 배양하기 전에 200μL/웰의 PBS로 배양물을 3회 세척합니다. 10분마다 소화를 촉진하기 위해 위아래로 세게 피펫팅하여 배양물을 교반하고 표준 세포 배양 현미경으로 배양 형태를 모니터링합니다.
- 웰에서 길쭉한 세포 구조가 없는 액체 단일 세포 현탁액을 얻으면(일반적으로 20-30분 후) 샘플을 2mL 튜브로 옮기고 200μL의 MSC 기본 배지를 추가하여 트립신을 억제하고 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 회수된 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 경사 제거하고, 펠릿을 -80°C에서 동결시키거나, 단계 5.2.3으로 직접 진행한다.
- 5.2.2 단계에서 얻은 세포 펠렛을 해동하고 0.56 M 2-Amino-2-methyl-1-propanol, 0.2% Triton X-100, pH 10으로 구성된 용해 완충액 500μL와 함께 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 다음에, 4°C에서 10분 동안 16,100 x g 로 원심분리하고, 샘플을 얼음 위에 보관한다. 단계 5.2.7에 기술된 측정 후, -20°C 또는 -80°C에서 샘플을 동결시키거나, 단계 5.2.8에 기술된 바와 같이, DNA 정량화를 직접 계속한다.
참고: 용해 완충액은 미리 준비하고, 멸균 여과하고, 4°C에서 보관할 수 있습니다. - 용해 완충액에서 20 mM 4-니트로페닐포스페이트 디소듐 염 육수화물 및 4 mMMgCl2 로 구성된 ALP 시약을 준비한다.
참고: 이 용액은 정량화 당일에 신선하게 준비하는 것이 가장 좋습니다. - 펠렛 파편을 방해하지 않고 5.2.3 단계에서 준비한 세포 용해물 상청액 50μL를 표준의 투명한 조직 배양 96웰 플레이트의 웰에 이중으로 분주합니다. 용해 버퍼를 두 개의 웰에 빈 컨트롤로 추가합니다.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 5.2.5단계에서 충진된 웰에 50μL/웰의 ALP 시약을 추가합니다. 플레이트를 짧게 흔들고, 빛으로부터 보호하면서 37°C에서 10분 동안 인큐베이션한다. ALP 활성이 높은 웰은 노란색으로 나타납니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 1M NaOH 100μL/웰을 추가하여 반응을 중지합니다.
- 플레이트 리더를 사용하여 410nm에서 광학 밀도를 읽습니다. 기술 중복의 평균을 구하고 빈 컨트롤의 평균을 뺍니다.
- DNA 정량화를 수행하여 전체 세포 수에 대해 이전 단계에서 결정된 ALP 활성을 정상화합니다. 여기서는 형광 측정에 기초한 방법이 설명되지만 세포 용해물에서 DNA 정량화를 위한 다른 방법은 분석과 호환됩니다. 제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매되는 키트를 사용하여 DNA 정량에 필요한 시약 및 DNA 표준물질을 준비합니다.
참고: DNA 표준물질을 준비하기 위해 용해 완충액을 사용하는 것이 좋습니다. - 단계 5.2.3에 기술된 ALP 정량화에 사용된 샘플을 동결시킨 경우, 이들을 해동시키고, 4°C에서 2분 동안 16,100 x g 에서 원심분리하고, 얼음 위에 놓았다. 펠릿화된 파편을 방해하지 않고 50μL의 세포 용해물 상청액을 검은색 96웰 플레이트의 웰에 이중으로 분주합니다. -20°C 또는 -80°C에서 샘플을 동결하고 필요한 경우 ALP 및 DNA 정량화를 반복합니다. DNA 표준물질을 중복으로 추가합니다.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 50μL의 DNA 염색제를 첨가하고 배양한 후 제조업체의 지침에 따라 형광 강도를 판독합니다. 표준 곡선 값을 사용하여 측정된 강도 값의 변환을 결정하고 DNA 농도에 적용합니다.
- 5.2.7 단계에서 얻은 ALP 값을 각 샘플의 각 DNA 농도로 나누어 정규화합니다.
6. 적용 1 : 약물 감수성 분석 수행
- 내피 네트워크가 완전히 발달하면(일반적으로 간질-내피 세포 공동 배양의 4일째에) 베바시주맙과 같은 항혈관신생 화합물을 신선한 배양 배지의 배양물에 첨가하고 시간 경과에 따른 활성을 다른 조건(예: 다른 농도의 FGF-2 또는 BMP-2)에서 테스트합니다.
- 그 시점까지 각 배양에 사용된 것과 동일한 성장 인자를 함유하는 신선한 배양 배지를 준비한다.
- 관심 화합물의 희석제(예: 베바시주맙의 경우: 60mg/mL α-트레할로스 이수화물, 0.4mg/mL Tween20, 5.8mg/mL 인산나트륨, 일염기성 및 일수화물, 1.2mg/mL 인산나트륨 이염기성, 무수물)로 구성된 대조 용액을 준비하고 멸균 여과합니다.
- 관심 화합물을 원하는 농도(예: 10μg/mL 베바시주맙)로 추가하고 동일한 부피의 대조 용액을 각각 테스트 및 컨트롤 조건에 대해 지정된 배양 배지에 추가합니다.
- 그 시점까지 각 배양에 사용된 것과 동일한 성장 인자를 함유하는 신선한 배양 배지를 준비한다.
- 배양물에서 배지를 흡인하고 6.1.1단계에서 새로 준비한 배지 200μL/웰을 추가합니다. 테스트할 화합물에 적합한 시간 동안 배양합니다(예: 베바시주맙의 경우: 2일). 배양 발달을 모니터링하고 섹션 3에 설명된 대로 내피 네트워크를 특성화합니다. 단계 3.7에 기술된 분석으로부터 추출된 GFP 이미지 및 정량적 네트워크 파라미터를 사용하여 혈관신생을 억제하거나 예비형성된 구조를 절제하는 데 있어서의 화합물의 효과를 평가한다.
7. 적용2 : 다양한 암세포 유형을 이용한 선진 공배양 시스템 구축
- 공동 배양 4일째에 내피 네트워크가 대부분 확립되면 MDA-MB-231 또는 U2OS 암 세포와 같은 다른 세포 유형을 신선한 배양 배지의 배양에 추가합니다.
- 공동 배양에서 GFP 표지 HUVEC 및 표지되지 않은 hBM-MSC와 구별할 수 있도록 제조업체의 지침에 따라 세포 적합성 살아있는 염료를 사용하여 암세포에 라벨을 붙입니다.
- 그 시점까지 각 배양에 사용된 것과 동일한 성장 인자를 포함하는 신선한 배양 배지에서 1.5 x 104 cells/mL의 농도로 암세포 현탁액을 준비합니다.
- 원하는 대로 배양 발달 및 암세포 국소화를 모니터링합니다.
참고: 암 유형, 활동 및 환경에 따라 간질-내피 세포 공동 배양에서 혈관 구조에 도달하는 데 며칠이 걸릴 수 있습니다(예: MDA-BM-231 및 U2OS의 경우 2일). 따라서 암-혈관 세포 상호작용을 시각화하기 위한 타임랩스 영상은 그에 따라 시간을 맞춰야 합니다.
Representative Results
혈관 틈새 배양은 hBM-MSC 및 GFP-HUVEC를 96웰 이미징 플레이트 내에서 강성 구배가 있는 프리캐스트 PEG 기반 하이드로겔에 순차적으로 파종하여 확립되었습니다(그림 1). 배양은 살아있는 epifluorescence 현미경을 통해 종단으로 모니터링되었으며 선택된 시점에서 추가로 특성화되었습니다. 세포외 구획은 직접 색상 염색 및 항체 기반 염색을 통해 평가되었습니다. ALP 활성은 생성된 틈새로부터 세포를 회수하고 용해시킨 후에 정량화하였다. 또한, 우리는 항혈관신생 약물 감수성 분석 및 암 공동 배양 모델의 기초로서 이 플랫폼의 적합성을 입증합니다.
hBM-MSC와 GFP-발현 HUVEC의 공동 배양은 프로토콜에 설명된 대로 성장 인자가 없거나 FGF-2 또는 BMP-2가 있는 상태에서 50ng/mL의 3 x 104 세포/웰을 파종하여 확립되었습니다. 초기 시점에서, GFP-HUVECs만을 보여주는 명시야 및 형광 이미지 모두에서 배양 간의 차이를 관찰할 수 있었습니다(그림 2A). 동일한 영역을 종단적으로 관찰함으로써, FGF-2의 존재 하에서 더 빠른 발달과 같은 배양 발달의 차이가 주목 될 수 있었다. 일반적으로 배양은 성장 인자가 없을 때 덜 발달된 것으로 나타났으며, 두 유형의 세포가 더 적게 퍼지고 무세포 영역이 존재했습니다. 대조적으로, 명시야 이미지는 BMP-2가 존재할 때 가장 조밀한 배양을 보여주었습니다. 그러나, 성장 인자 함유 조건 모두에서 형성된 혈관 유사 네트워크와 FGF-2로 가장 광범위하고 상호 연결된 네트워크가 형성되었습니다. 이러한 관찰된 차이는 ImageJ용 혈관신생 분석기 를 사용하여 정량화할 수도 있습니다. 실제로, 총 네트워크 길이는 FGF-2의 존재 하에서 가장 높았고 성장 인자의 부재 하에서 가장 낮았다 (도 2B). 네트워크에서 분기점을 나타내는 접합부의 수는 전체 길이와 동일한 추세를 따랐습니다(그림 2C). 반대로, 두 성장 인자 함유 조건 모두 성장 인자가없는 조건보다 훨씬 적은 수의 분리 된 세그먼트를 나타 냈으며, 이는 더 높은 상호 연결성을 나타냅니다 (그림 2D). 또한, 3D 컨포칼 이미징은 FGF-2 자극 조건에서 깊이 측면에서 더 강력한 내피 세포 침투를 보여주었습니다(그림 2E).
hBM-MSC/GFP-HUVEC 공동 배양물을 FGF-2 또는 BMP-2의 존재 하에 7일 동안 유지한 후 ECM 성분에 대해 고정 및 염색했습니다. 면역세포화학적 염색 후 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경은 성장 인자 보충 유형에 따라 배양 형태에 현저한 차이를 보였습니다(그림 3A). FGF-2의 경우, 배양은 내피 세포와 중간엽 세포 모두에서 조밀한 응축된 미세혈관 유사 구조로 조직화된 반면, BMP-2의 존재 하에서, hBM-MSC는 훨씬 더 넓은 영역에 걸쳐 있었고, 이는 보다 광범위한 F-액틴-양성 및 GFP-음성 영역에서 명백히 나타났다. ECM 단백질 피브로넥틴과 콜라겐 I은 유사한 방식으로 국소화된 반면, 라미닌과 콜라겐 IV는 내피 구조 주위에 더 집중되어 있었습니다. 그러나, 내피 구조 주위의 이러한 증가된 농도는 BMP-2의 존재 하에서보다 FGF-2의 존재 하에서 훨씬 더 두드러졌다. 항체 기반 염색 외에도 ECM의 전반적인 섬유화 상태를 평가하기 위해 직접 발색 염색을 수행하였다(Picrosirius Red staining; 도 3B), 뿐만 아니라 ECM 상의 Ca의 증착(Alizarin Red staining; 그림 3C) 형성된 틈새의. Picrosirius Red 염색은 BMP-2로 배양 된 틈새에서 더 강력하고 광범위했으며 Alizarin Red 염색은 동일한 경향을 따랐습니다.
다음으로, 배양은 초기 골형성 마커로서 ALP 활성을 평가함으로써 골형성 잠재력 측면에서 특성화되었습니다. 공동 배양 4일째와 7일째에 히드로겔을 트립신으로 분해하여 틈새에서 세포를 회수했습니다. ALP 활성을 정량화하기 위해, 회수된 세포를 용해시키고, pNPP 분석을 수행하였다. 얻어진 값은 조건에 따른 세포 수의 잠재적 차이를 설명하기 위해 각 샘플의 총 DNA에 대해 정규화되었습니다. 실제로, 조건의 DNA 함량 사이의 작은 차이가 관찰될 수 있었고, 성장 인자 없이 조건으로부터 가장 적은 수의 세포가 회수되었다 (나타내지 않음). 그러나 정규화된 ALP 활성은 BMP-2 농도가 높을수록 활성이 증가하는 경향이 있고 100ng/mL에서 정체되는 경향과 함께 조건에 따라 크게 달랐습니다(그림 4A, B). 가장 낮은 활성 수준은 50ng/mL FGF-2를 함유하는 조건에서 확인되었습니다. 평가된 두 시점 모두에서 유사한 경향이 관찰될 수 있었지만, 모든 값은 4일차부터 7일차까지 배양에서 시간이 지남에 따라 유의하게 증가했습니다. 정량적 분석 외에도 ALP 활성은 BCIP/NBT 기질 전환을 기반으로 하는 직접 색상 염색을 사용하여 정성적으로 시각화할 수 있습니다. FGF-2와 비교하여 BMP-2의 존재 하에서 더 광범위하고 더 강렬한 보라색 염색이 관찰되었다(도 4C).
특성화된 골형성 틈새의 두 가지 잠재적 적용을 입증하기 위해 개념 증명 약물 감수성 연구와 암 공동 배양이 수행되었습니다. 약물 감수성 분석을 위해, 베바시주맙 또는 베바시주맙 제형의 희석제로 이루어진 대조 용액을 신선한 BMP-2를 함유하는 배양액에 첨가하였다. 4일째에 50ng/mL BMP-2의 존재 하에 확립된 네트워크가 형성되었을 때, 규칙적인 배지 교체 중에 대조 용액 또는 베바시주맙 함유 배지를 추가하고 형광 이미징을 사용하여 배양을 모니터링했습니다. 10μg/mL 베바시주맙의 추가는 이전에 형성된 네트워크의 후퇴 또는 절제로 이어졌지만, 대조군 조건은 배지 변경 후 2일 후에도 여전히 광범위한 네트워크를 특징으로 했습니다(그림 5A, B). 이러한 변화는 매일 획득하는 형광 이미지에서 ImageJ용 혈관신생 분석기 를 사용하여 네트워크의 전체 길이를 추적하여 정량화할 수도 있습니다(그림 5C). 대안적으로, 베바시주맙 또는 다른 화합물은 또한 네트워크 형성에 대한 그들의 영향을 평가하기 위해 공동 배양의 시작부터 추가될 수 있다. 베바시주맙의 경우, 이것은 내피 네트워크의 형성을 완전히 억제하였다 (나타내지 않음).
두 번째 적용을 위해 MDA-MB-231 유방암 또는 U2OS 골육종 세포를 50ng/mL BMP-2를 포함하는 신선한 배양 배지에서 1.5 x 103 세포/웰의 밀도로 4일차 공동 배양에 추가했습니다. GFP 표지 HUVEC 및 표지되지 않은 hBM-MSC와 구별하기 위해 암세포를 골형성 틈새에 파종하기 직전에 CellTrace FarRed와 함께 배양했습니다. 배양물을 형광 현미경으로 모니터링했습니다. 처음에, 대부분의 암세포는 기질의 표면 근처에 국한되었지만, 2일 후에, 이들은 혈관 공배양물을 포함하는 층에 더 근접하여 발견될 수 있었다. 따라서 2일차는 암세포와 혈관 틈새 내 세포 간의 상호 작용의 역학을 보여주기 위해 타임랩스 현미경의 시작점으로 선택되었습니다. 흥미롭게도 MDA-MB-231 세포는 내피 구조에 접근하거나 멀어지는 것을 볼 수 있으므로 환경을 탐색하거나 리모델링할 수 있습니다(그림 5D). 암세포의 표지로 CellTrace FarRed, HUVEC의 표지로 GFP, F-액틴의 추가 염색을 사용하여 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 모든 세포 유형을 구별할 수 있었습니다(그림 5E).
그림 1: 혈관화된 골형성 틈새의 신뢰할 수 있는 생성을 위한 간단한 접근 방식. 심층적인 강성 구배를 가진 프리캐스트 합성 하이드로겔을 사용하면 직접 캡슐화할 필요 없이 순차적 세포 파종을 통해 3D 배양을 생성할 수 있습니다. hBM-MSC는 GFP 발현 HUVEC을 첨가하기 전에 3일 동안 사전 배양됩니다. 배양은 명시야 및 GFP 신호를 세로로 획득하여 모니터링됩니다. 선택된 시점에서, 틈새는 ECM 침착 및 골형성 상태에 대해 추가로 평가됩니다. 알칼리성 포스파타제 활성은 직접 색상 염색을 통해 그리고 틈새에서 세포를 회수하고 세포 용해물에 대해 pNPP 분석을 수행하여 평가됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: FGF-2 또는 BMP-2를 사용한 혈관 유사 네트워크의 자극. (A) 성장 인자가 없거나 FGF-2 또는 BMP-2가 있는 상태에서 성장한 세포의 공동 배양 2일, 4일 및 6일에 50ng/mL에서 명시야 및 형광(GFP) 이미지를 획득했습니다. 스케일 바: 400μm. (B-D) 공동 배양 4일째에 이미지화된 GFP-HUVEC 네트워크의 정량화된 매개변수, ImageJ용 혈관신생 분석기를 사용하여 분석. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. 통계 분석은 GraphPad Prism 9.5.1을 사용하여 수행되었습니다. Dunnett의 다중 비교 검정을 사용한 일반적인 일원 분산 분석은 n ≥ 4로 수행되었습니다. * P < 0.05; ** P < 0.01; P < 0.001입니다. (E) FGF-2-(상단 행) 및 BMP-2-(하단 행) 자극 조건에 대한 GFP 및 F-액틴 신호의 공초점 스택(총 높이: 547.5μm; z-스텝: 2.5μm)에서 생성된 3차원 재구성. 스케일 바: 300μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: BMP-2에 의한 비국소화된 hBM-MSC 확산 및 ECM 침착 유도. (A-C) FGF-2 또는 BMP-2의 존재 하에서 성장한 7일간의 공동 배양을 (A) 면역형광 또는 (B,C) 직접 색상 염색을 실시했습니다. (A) 배양물을 F-액틴 및 ECM 단백질 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐 I 및 콜라겐 IV에 대해 염색하였다. 이미지는 컨포칼 스택의 최대 강도 투영을 나타냅니다(총 높이: 100 μm, z-스텝: 5 μm). 스케일 바: 200 μm. (B,C) 배양물을 (B) 피크로시리우스 레드 및 (C) 알리자린 레드를 사용하여 염색하였다. 맨 윗줄은 2.5x 배율(스케일 바: 1,000 μm)로 획득한 이미지의 스티칭된 전체 웰 오버뷰를 나타내고, 맨 아래 행은 5x 배율(스케일 바: 400 μm)에서 획득한 하나의 시야를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 직접 색상 염색을 통한 BMP-2 유도 ALP 활성의 생화학적 평가. (A,B) ALP 활성은 성장 인자가 없거나 다른 농도의 BMP-2 또는 FGF-2가 50ng/mL로 존재할 때 성장한 배양물의 세포 용해물에서 (A) 4일 또는 (B) 7 일간의 공동 배양. ALP 활성은 각 용해물 샘플의 DNA 함량으로 정규화되어 나타난다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. 통계 분석은 GraphPad Prism 9.5.1을 사용하여 수행되었습니다. Dunnett의 다중 비교 검정을 사용한 일반적인 일원 분산 분석은 n = 5로 수행되었습니다. P < 0.0001입니다. (C) 7일간의 공동 배양 동안 50ng/mL FGF-2 또는 BMP-2의 존재 하에서 성장한 틈새에서 ALP 활성의 직접적인 색상 염색. 왼쪽의 이미지는 2.5x 배율(스케일 바: 1,000μm)에서 획득한 이미지의 스티칭된 전체 웰 오버뷰를 나타내고 오른쪽의 이미지는 5배 배율(스케일 바: 400μm)에서 획득한 하나의 시야를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 진행된 암 모델에서 골형성, 혈관화된 틈새의 사용. (A) BMP-2의 존재 하에서 성장한 배양의 GFP 신호는 대조군 용액(왼쪽) 또는 10μg/mL(오른쪽)의 베바시주맙을 2일 동안 첨가하기 전에 공동 배양 4일째에 이미지화한 후 배양물을 다시 이미지화했습니다(공동 배양 6일). 스케일 바: 600 μm. (B) 베바시주맙 처리된 배양물의 고배율 이미지가 A에 표시됩니다. 스케일 바: 250 μm. (C) A에 나타낸 바와 같이 내피 네트워크의 전체 길이는 매일 획득된 이미지로부터 ImageJ용 혈관신생 분석기 를 사용하여 정량화되었습니다. n ≥ 3. (D) BMP-2의 존재 하에서 성장한 4일간의 공동 배양에 CellTrace FarRed-labeled MDA-MB-231 유방암 세포를 첨가하고, 암세포 첨가 후 2일부터 타임랩스 이미지를 획득하였다. 스케일 바: 100μm. (E) D 에 기재된 바와 같이 생성된 삼중 공동 배양의 공초점 스택(총 높이: 70μm; z-단계: 2.4μm)의 최대 강도 투영을 F-액틴에 대해 고정 및 염색했습니다. 왼쪽: MDA-MB-231 유방암 세포를 특징으로 하는 틈새; 오른쪽: U2OS 골육종 세포를 특징으로 하는 틈새. 왼쪽 이미지의 축척 막대: 200μm; 오른쪽 이미지의 축척 막대: 50μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에서는 뼈 및 골수 생물학 연구, 조직 공학 및 암 연구에서 다양한 응용 분야를 가지고 있는 완전히 합성되고 제어 가능한 3D PEG 기반 매트릭스에서 고도로 혈관화된 뼈 및 골수 틈새의 체외 모델을 구축하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 RGD 펩티드 및 MMP 절단 부위로 기능화되고 유리 바닥 96웰 이미징 플레이트(30)에 심층적인 밀도 구배로 주조된 합성 PEG 기반 하이드로겔을 기반으로 합니다. 이 플러그 앤 플레이 플랫폼은 세포를 하이드로겔에 캡슐화할 필요 없이 고도로 상호 연결된 3D 셀룰러 네트워크를 구축할 수 있는 것으로 나타났습니다. 앞서 설명한 세포 캡슐화 프로토콜과 유사하게, 이 작업에서, 우리는 세포 유형별 미세 환경을 생성하기 위해 세포 고유 ECM28 에 의한 기질의 리모델링을 보여줍니다. 따라서 이 방법을 사용하면 재현성이 높은 유기형 3D 배양 조건에서 약물 스크리닝 분석 및 고함량 분석을 쉽게 수행할 수 있습니다. 유리 바닥 96웰 플레이트와 광학적으로 투명한 하이드로겔은 액체 처리 자동화 및 고처리량 현미경 검사와 호환되는 플랫폼을 제공합니다.
골형성 혈관 골수 틈새를 생성하는 첫 번째 단계는 적어도 3일 동안 PEG 하이드로겔 상에서 hBM-MSCs를 사전 배양하는 것이다. 이 시간 동안 그들은 하이드로겔에 부착되어 침투하여 세포-세포 접촉 및 ECM 증착을 설정하기 시작합니다. hBM-MSC를 시드하기 전에 스토리지 버퍼를 제거해야 합니다. 하이드로겔은 96웰 이미징 플레이트의 표준 웰 내 내부 웰 내부에 위치하므로 내부 웰 링에 닿을 때까지 웰 측면을 따라 흡인 팁을 삽입하는 것이 안전합니다. 진공 펌프는 가능한 가장 낮은 흡입력으로 설정된 경우 흡기에 사용할 수 있습니다. 대안적으로, 노즐 높이가 내부 웰 링에서 최소 0.8mm 위로 조정된 자동 플레이트 와셔를 사용하여 하이드로겔 플레이트에서 버퍼를 흡인할 수 있습니다. 액체 취급에 자동화를 사용하면 하이드로겔 표면의 손상을 최소화하고 배양 결과의 재현성을 높일 수 있습니다. 하이드로겔 표면의 작은 결함은 세포가 하이드로겔에 안착되면 가시화되고 결함이 있는 하이드로겔 영역의 낮은 초점 평면에 나타납니다. 따라서 0일째에 참조 이미지를 획득하면 세포 파종 균질성 및 하이드로겔 표면 무결성에 대한 우수한 품질 관리 역할을 합니다. 작은 하이드로겔 표면 결함은 웰의 추가 사용을 배제하지 않지만, 세포는 결함 부위에 군집하는 경향이 있으며 비대표적 패턴으로 성장하거나 더 빨리 바닥 유리에 도달하여 단층으로 성장할 수 있습니다. 이러한 유물은 이러한 우물을 사용/평가할 때 기록해야 합니다. 전체 분석 기간 동안 수행된 모든 배지 변경에 대해서도 유사한 고려 사항이 적용됩니다.
프로토콜의 두 번째 단계는 사전 형성된 hBM-MSC 단일 배양(공동 배양 0일)에 GFP-HUVEC를 추가하는 것을 포함합니다. hBM-MSC에 의해 침착된 ECM은 내피 세포의 성장을 위한 훌륭한 스캐폴드를 제공하며, 이 작업에서, hBM-MSC-조건화된 배지의 존재 하에서도, 히드로겔 상에 단지 둥근 세포 클러스터를 형성할 수 있었다 (도시되지 않음). hBM-MSC 배양물에 파종할 때, HUVEC는 세포 캡슐화에 의해 생성된 공동 배양에서 관찰된 것과 유사한 미세혈관 유사 구조를 통합하고 형성합니다27,28. 일반적으로 잘 발달된 3D 미세혈관 유사 네트워크는 공동 배양 후 4일 이내에 형성되며, 이는 GFP 표지 HUVEC를 사용하여 종단적으로 모니터링할 수 있습니다. 이러한 구조는 배양에서 적어도 7일 동안 유지될 수 있으며, 이는 항혈관형성 약물의 스크리닝과 같은 치료에 반응하여 혈관 네트워크 조직의 변화를 따르기에 충분한 시간이 있음을 의미한다. 내피 네트워크의 형태학적 요소는 ImageJ(33)의 혈관신생 분석기 플러그인과 같은 잘 확립된 도구를 사용하여 GFP 이미지를 분할함으로써 배치 모드에서 정량화할 수 있으며, 이들의 파라미터는 예를 들어 약물 효능 및 약력학을 평가하는 데 사용될 수 있습니다.
많은 잠재적 응용에 대해 기술된 세포 모델의 한 가지 중요한 이점은 가소성이다. 단순히 배양 배지에 다른 성장 인자를 보충하는 것만으로도 공동 배양의 모양을 바꿀 수 있습니다. 예를 들어, 단일 및 공동 배양 기간 동안 BMP-2의 존재는 골형성 혈관 틈새를 생성하여 증가된 ALP 활성, 세포외 칼슘 침착, ECM 조립 및 침착을 보여줍니다. 반대로, FGF-2의 존재 하에서, 골형성 마커는 부재하고, 공동 배양은 더 적은 측방 세포 연관성을 형성하지만, 더 뚜렷한 3D 세포 성장을 나타낸다. FGF-2가 ALP 활성을 억제하는 반면, BMP-2는 성장인자 처리를 하지 않은 경우에 비해 더 강한 ALP 활성을 유도한다는 사실은 이전의 관찰과 일치한다27. 그러나 hBM-MSC 기질 성분의 이러한 큰 차이에도 불구하고 미세혈관 네트워크의 범위는 이 연구에서 두 가지 성장 인자 처리 조건에 대해 매우 유사했습니다. 대조 배양에서는 단지 몇 개의 짧은 혈관 네트워크가 형성되었으며, 이는 아마도 혈관이 잘 형성되지 않은 골수 틈새를 나타냅니다. 이는 배양 배지에 첨가된 성장 인자의 유형, 농도 및 시기를 단순히 변경함으로써 비교 연구에 필요한 바와 같이 잘 정의된 다양한 혈관화된 골수 틈새를 생성할 수 있음을 시사합니다. 그러나 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 배양 진행 및 형태는 사용된 세포의 이력(예: 일상적인 배양 유지 관리 중에 사용되는 통과 수 및 분리 방법)에 따라 달라질 수 있으며 분석 설계 중에 이러한 요인을 제어하는 것이 좋습니다.
여기에서 이 모델의 첫 번째 적용으로 10μg/mL 베바시주맙 치료에 대한 조작된 미세혈관 네트워크의 민감도를 보여줍니다. 특히, 아티팩트는 종종 잘 발달되지 않은 네트워크를 가진 이미지에서 생성되기 때문에 사용된 알고리즘이 내피 네트워크를 정확하게 인식할 수 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 경우 이미지 처리에 사용되는 매개변수(분할 전과 분할 중)를 미세 조정해야 하며, 종종 시행착오를 거쳐야 합니다.
두 번째 응용 프로그램으로, 우리는 중간엽, 내피 및 암세포의 순차적 파종에 의해 형성된 고급 공동 배양 모델을 제시합니다. 이 모델을 사용하면 전이 중에 중요한 요소가 될 수 있는 암세포, 기질 및 골수 혈관 구조 간의 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 또한 이 모델은 약물 스크리닝 응용 분야 및 혈관신생 이외의 표적을 가진 화합물 테스트에 사용할 수 있습니다.
2D 배양에서, 세포는 생리학적 미세환경 신호를 받지 못하고, 자연적으로 발생하는 세포 형태를 획득하지 못하며, 결과적으로 네이티브3D 환경(35)의 세포와 다르게 분화한다. 조작된 3D 하이드로겔에서 성장할 때, 세포는 초기에 고유한 ECM을 증착하여 접착 부위를 제공하고 능동적으로 리모델링할 수 있습니다28,36. 여기에서 스크리닝 응용 분야를 위한 단순화된 3D 모델을 구축하기 위해 혈관 형성 세포를 조작된 하이드로겔의 표면에 파종하고 관류가 없는 상태에서 혈관 네트워크를 구축할 수 있었습니다. 이미징 기반 평가는 혈관 구조에 기여하는 내피 세포의 2D 투영에 대해 수행되었습니다. 그러나, 단지 공초점 이미지만이 FGF-2-자극된 샘플과 비교했을 때, BMP-2-자극된 샘플에서 3D 혈관 네트워크의 덜 뚜렷한 성장을 나타내었다. 이것은 형성된 혈관 구조의 길이가 과소 평가되었지만 연결성이 과대 평가되었음을 시사합니다. 또한, 혈관주위 세포와 내피 세포 사이의 상호 작용과 혈관 내강 형성은 조사되지 않았습니다. 이러한 측면, 특히 약물 치료 반응 측면에서 더 많은 주의가 필요합니다. 마지막으로, 먼저 광범위한 3D 혈관 네트워크를 구축한 다음에야 골형성 분화를 유도하는 정제된 프로토콜이 보다 생리적인 뼈 및 골수 모델을 생성하는 데 바람직할 것입니다.
전반적으로 여기에 제시된 모델은 매우 다재다능하며 특정 응용 분야에 쉽게 맞출 수 있습니다. 예를 들어, 상이한 공급원으로부터의 중간엽 및 내피 세포가 사용될 수 있다. 지방 조직 중간엽 줄기세포와 탯줄 중간엽 줄기세포는 BM-중간엽 줄기세포에 비해 상이한 혈관신생 인자를 발현하는 것으로 알려져 있으며, 이들은 대안적인 기질 성분으로서 용이하게 치환될 수 있다37. 이미 정의된 골수 틈새에서 분리된 내피 세포도 HUVEC 대신 사용할 수 있습니다. 또한 최근 혈관화된 근육 공동 배양에 대해 제안된 바와 같이 개인화된 의학 적용을 위해 환자 유래의 일치하는 골수 중간엽 및 내피 세포와의 공동 배양을 확립할 수 있습니다38. 또한 하이드로겔 플레이트의 설계는 명시야 현미경과 형광 현미경 모두를 사용하여 배양의 종단 모니터링을 가능하게 하여 사용자가 응용 분야에 따라 배양 시간을 단축하거나 연장할 수 있는 가능성을 제공합니다. 대안적으로, 파종에 사용되는 세포 밀도는 이 프로토콜의 관찰 시간보다 더 짧거나 더 긴 관찰 시간이 필요한 경우 세포 네트워크의 형성을 가속화하거나 지연시키기 위해 그에 따라 조정될 수 있습니다. 어쨌든, 하이드로겔의 수축과 궁극적인 세포 분리로 이어질 수 있는 시트와 같은 구조로의 세포 과증식을 피하기 위해 주의가 필요합니다.
마지막으로, 이 모델을 사용하여 광범위한 분석을 수행할 수 있습니다. 살아있는 배양 또는 고정 배양에서 수행되는 면역 형광 및 현미경 검사 외에도 3D 배양은 효소로 분해 될 수 있으며 세포를 회수하여 모든 유형의 생화학 적 분석을 수행 할 수 있습니다. 여기에서는 비색/형광 분석을 사용하여 세포 용해물에서 ALP 활성 및 DNA 함량 정량을 측정하는 방법을 보여주지만 이 시스템은 PCR, RNAseq 및 단백질체학을 포함한 다른 많은 기술과 호환됩니다. 원하는 분석의 민감도가 그리 높지 않은 경우 둘 이상의 웰에서 샘플을 풀링하여 분석에 사용할 수 있는 샘플의 양을 늘릴 수 있습니다. 원하는 적용이 더 빠른 겔 용해를 필요로 하는 경우, 플레이트 상의 모든 웰이 이러한 방식으로 사용될 것이라고 가정할 때, 플레이트의 오비탈 쉐이킹은 웰에서 소용돌이 형성을 보장하기 위해 더 작은 부피의 소화 용액과 함께 적용될 수 있다(살아있는 배양은 이러한 가혹한 취급에 민감하다). 요약하면, 우리는 설명된 대로 사용할 경우 골형성 혈관 틈새의 주요 측면을 요약하는 시험관 내 모델의 생성을 보장하지만 맞춤형 응용 프로그램을 위해 수정할 수 있을 만큼 충분히 다재다능한 프로토콜을 여기에 제시합니다.
Disclosures
Ectica Technologies AG는 3DProSeed 하이드로겔 웰 플레이트 제조업체이며 상업적 이해관계를 가지고 있습니다. 벤자민 R. 시모나(Benjamin R. Simona)와 마틴 에르바(Martin Ehrbar)는 엑티카 테크놀로지스(Ectica Technologies AG)의 주주입니다.
Acknowledgments
저자는 액체 처리 장치에 대한 기술 지원을 제공한 Riccardo Urbanet과 에피형광 현미경을 지원한 Rodi Odabasi에게 감사를 표합니다. 이 연구는 스위스 국립 과학 재단 (보조금 번호 310030E_202429 및 205321_204318)과 Ectica Technologies AG의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 2 mL microtubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 2-Amino-2-methyl-1-propanol | Sigma | A9199 | |
| 3DProSeed hydrogel well plate | Ectica Technologies | ECT.PS1.001.096 | |
| 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma | 71768 | |
| Alizarin Red S | Sigma | A5533 | |
| Anti-Collagen IV antibody | Abcam | ab6311 | |
| Anti-Laminin 1+2 antibody | Abcam | ab7463 | |
| Automated plate washer | Agilent Biotek | ELχ50 | |
| Automated washer/dispenser | Agilent Biotek | MULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette | |
| Bevacizumab | Evidentic | ID PS-E07-2019-00119 A009 | |
| BMP-2 | Peprotech | 120-02C | |
| BSA | AppliChem | A1391 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | To centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Stellaris 5 | |
| Conical 50 mL centrifuge tubes | TPP | 91050 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 406406 | |
| DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 405312 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Epifluorescence microscope | Leica | DMI6000B | |
| FBS | Gibco | 10500-064 | |
| FGF-2 | Peprotech | 100-18B | |
| Fibronectin (IST-9) | Santa Cruz | sc-59826 | |
| GFP-HUVECs | PELOBiotech | PB-CAP-0001GFP | |
| hBM-MSCs | - | - | Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359 |
| Inverted microscope | Zeiss | 200M | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cell line | - | Kindly obtained from J Massagué at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | |
| MEMα | Gibco | 22571-038 | |
| Multimode imaging reader | Agilent Biotek | Cytation 1 | For automated imaging |
| Multimode imaging reader - fluorescence and absorbance | Agilent Biotek | Cytation 5 | For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis |
| Paraformaldehyde | Artechemis | US 040 | |
| PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phalloidin-rhodamine | Invitrogen | R415 | |
| Picro-Sirius Red Solution | Abcam | ab246832 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | ThermoFisher Scientific | P7589 | |
| Recombinant Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab260043 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Sigma | B5655-25TAB | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1064981000 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Sigma | S-0876 | |
| Sodium phosphate monobasic, monohydrate | Merck | 1.06346 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween20 | AppliChem | A4974 | |
| U2OS osteosarcoma cell line | - | Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich | |
| α-trehalose dihydrate | Sigma | 90208 |
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