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Bioengineering

इमेजिंग माइक्रोप्लेट में प्री-कास्ट पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल) (पीईजी) हाइड्रोगेल का उपयोग करके एक संवहनी ओस्टोजेनिक अस्थि मज्जा आला की सरल स्थापना

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65413
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Obstetrics, University Hospital Zurich, University of Zurich, 2Ectica Technologies AG

Summary

अस्थि मज्जा संवहनी आला का एक इन विट्रो मॉडल प्री-कास्ट 3 डी पीईजी हाइड्रोगेल पर मेसेनकाइमल और एंडोथेलियल कोशिकाओं को सीडिंग करके स्थापित किया गया है। एंडोथेलियल नेटवर्क, ईसीएम घटक, और आला की एएलपी गतिविधि उपयोग किए गए विकास कारक के आधार पर भिन्न होती है। मंच का उपयोग उन्नत कैंसर मॉडल के लिए किया जा सकता है।

Abstract

अस्थि और अस्थि मज्जा अत्यधिक संवहनी और संरचनात्मक रूप से जटिल अंग हैं, और कैंसर और मेटास्टेसिस गठन के लिए साइटें हैं। इन विट्रो मॉडल हड्डी और अस्थि मज्जा-विशिष्ट कार्यों को पुन: परिभाषित करते हैं, जिसमें वैस्कुलराइजेशन भी शामिल है, जो ड्रग स्क्रीनिंग के साथ संगत हैं, अत्यधिक वांछनीय हैं। इस तरह के मॉडल इन विट्रो मॉडल में सरलीकृत, संरचनात्मक रूप से अप्रासंगिक दो-आयामी (2 डी) और विवो मॉडल में अधिक महंगे, नैतिक रूप से चुनौतीपूर्ण के बीच की खाई को पाट सकते हैं। यह लेख संवहनी, ओस्टोजेनिक अस्थि-मज्जा आला की पीढ़ी के लिए इंजीनियर पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल) (पीईजी) मैट्रिसेस के आधार पर एक नियंत्रणीय त्रि-आयामी (3 डी) सह-संस्कृति परख का वर्णन करता है। पीईजी मैट्रिक्स डिजाइन एक सरल सेल सीडिंग चरण के माध्यम से 3 डी सेल संस्कृतियों के विकास की अनुमति देता है जिसमें कोई एनकैप्सुलेशन की आवश्यकता नहीं होती है, इस प्रकार जटिल सह-संस्कृति प्रणालियों के विकास को सक्षम किया जाता है। इसके अलावा, मैट्रिसेस पारदर्शी हैं और ग्लास-बॉटम 96-वेल इमेजिंग प्लेटों पर पूर्व-कास्ट हैं, जिससे सिस्टम माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त है। यहां वर्णित परख के लिए, मानव अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं (एचबीएम-एमएससी) को पहले सुसंस्कृत किया जाता है जब तक कि पर्याप्त रूप से विकसित 3 डी सेल नेटवर्क नहीं बनता है। इसके बाद, जीएफपी-व्यक्त मानव नाभि शिरा एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीईसी) को जोड़ा जाता है। संस्कृति विकास के बाद उज्ज्वल-क्षेत्र और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी होती है। एचबीएम-एमएससी नेटवर्क की उपस्थिति संवहनी जैसी संरचनाओं के गठन का समर्थन करती है जो अन्यथा नहीं बनती हैं और जो कम से कम 7 दिनों तक स्थिर रहती हैं। संवहनी जैसे नेटवर्क गठन की सीमा को आसानी से निर्धारित किया जा सकता है। इस मॉडल को अस्थि मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन 2 (बीएमपी -2) के साथ संस्कृति माध्यम को पूरक करके एक ओस्टोजेनिक अस्थि-मज्जा आला की ओर ट्यून किया जा सकता है, जो एचबीएम-एमएससी के ओस्टोजेनिक भेदभाव को बढ़ावा देता है, जैसा कि सह-संस्कृति के दिन 4 और दिन 7 में क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) गतिविधि में वृद्धि द्वारा मूल्यांकन किया गया है। इस सेलुलर मॉडल का उपयोग विभिन्न कैंसर कोशिकाओं के संवर्धन के लिए एक मंच के रूप में किया जा सकता है और अध्ययन किया जा सकता है कि वे अस्थि- और अस्थि मज्जा-विशिष्ट संवहनी niches के साथ कैसे बातचीत करते हैं। इसके अलावा, यह स्वचालन और उच्च-सामग्री विश्लेषण के लिए उपयुक्त है, जिसका अर्थ है कि यह अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संस्कृति स्थितियों के तहत कैंसर की दवा स्क्रीनिंग को सक्षम करेगा।

Introduction

अस्थि और अस्थि मज्जा संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप से जटिल अंग हैं जो मानव स्वास्थ्य के लिए केंद्रीय हैं। यह अलग-अलग niches के अस्तित्व से परिलक्षित होता है जो हेमटोपोइजिस और हड्डी के रखरखावको नियंत्रित करते हैं1. अब यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि स्वस्थ अस्थि मज्जा में, हेमटोपोइएटिक और कंकाल स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव और विस्तार, साथ ही साथ उनकी संतान, अलग-अलग niches द्वारा नियंत्रित होती है। इन niches में विभिन्न सेल प्रकार शामिल हैं, जिनमें ओस्टियोवंशावली कोशिकाएं, मेसेनकाइमल स्टेम सेल, एंडोथेलियल और पेरिवास्कुलर कोशिकाएं, न्यूरोनल और ग्लियल कोशिकाएं, एडिपोसाइट्स, ओस्टियोक्लास्ट, मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल2 शामिल हैं। आश्चर्य की बात नहीं, ये ज्यादातर वाहिका से जुड़े niches विभिन्न प्रकार के ल्यूकेमिया3 के विकास में भी शामिल हैं और विभिन्न कैंसर 4 के लिए मेटास्टेसिस की साइटहैं। हड्डी के गठन, रीमॉडेलिंग और अस्थि (मज्जा) रखरखाव में इसकी विशिष्ट भूमिकाओं के कारण, हड्डी से जुड़े वाहिका में शरीर में कहीं और पाए जाने वाले वाहिका 5,6,7 से अलग विशिष्ट संरचनाएं होती हैं। इस प्रकार, एंटी-एंजियोजेनिक या वास्कुलचर-मॉड्यूलेटिंग दवाओं को व्यवस्थित रूप से लागू किया जाता है, इन विशेष वातावरणोंके भीतर अलग-अलग प्रभाव हो सकते हैं। इसलिए, अस्थि और अस्थि मज्जा शारीरिक गुणों, हड्डी और अस्थि मज्जा पुनर्जनन, और चिकित्सीय उपचार के लिए प्रतिक्रियाओं को बनाए रखने में शामिल आणविक तंत्र की जांच करने के लिए मॉडल अत्यधिक वांछनीय हैं।

शास्त्रीय द्वि-आयामी (2 डी) ऊतक संस्कृतियों और पशु मॉडल का उपयोग करके विवो जांच में हड्डी और अस्थि मज्जा 9,10 के विकास में शामिल विभिन्न कोशिकाओं और आणविक खिलाड़ियों की भूमिकाओं में अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है। मॉडल जो प्रासंगिक मानव कोशिकाओं के साथ उच्च-थ्रूपुट प्रयोगों की अनुमति देते हैं, इन अत्यधिक जटिल प्रणालियों में चयनित मापदंडों को संशोधित करने के तरीके की हमारी समझ में सुधार कर सकते हैं।

पिछले दशक में, ऊतक इंजीनियरिंग से प्राप्त सिद्धांतों को 3 डी ऊतक मॉडल11,12 उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया गया है। ये ज्यादातर 3 डी मोनो- यासह-संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए बायोमैटेरियल्स में ऊतक-प्रासंगिक कोशिकाओं के एनकैप्सुलेशन पर निर्भर हैं। सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले बायोमैटेरियल्स में फाइब्रिन 14, कोलेजन 15, और मैट्रिगेल16,17 हैं, जिनमें से सभी अत्यधिक जैव-संगत हैं और कई सेल प्रकारों के विकास के लिए उपयुक्त स्थिति प्रदान करते हैं। इन बायोमटेरियल्स में इन विट्रो मॉडल उत्पन्न करने की क्षमता है जो विवो18 में पाए जाने वाले विभिन्न संवहनी niches के प्रमुख पहलुओं को पुन: उत्पन्न करते हैं। इसके अलावा, संक्रमित संवहनी हड्डी और अस्थि मज्जा मॉडल उत्पन्न करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के उपयोग ने उच्च जटिलता 19,20,21,22 के इन विट्रो मॉडल की पीढ़ी में योगदान दिया है।

स्वाभाविक रूप से होने वाले बायोमैटेरियल्स के गुणों की संरचना और इंजीनियरिंग को नियंत्रित करने में कठिनाई ने सिंथेटिक एनालॉग्स के विकास को प्रेरित किया है जिन्हें तर्कसंगत रूप से अनुमानित भौतिक, रासायनिक औरजैविक गुणों के साथ डिजाइन किया जा सकता है। हमने पूरी तरह से सिंथेटिक फैक्टर XIII (FXIII) क्रॉस-लिंक्ड पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल) (पीईजी) आधारित हाइड्रोगेल विकसित किए हैं, जो सेल अटैचमेंट और रीमॉडेलिंग25,26 की सुविधा के लिए आरजीडी पेप्टाइड्स और मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीज (एमएमपी) क्लीवेज साइटों के साथ कार्यात्मक हैं। इन बायोमैटेरियल्स के मॉड्यूलर डिजाइन का उपयोग सफलतापूर्वक 3 डी संवहनी हड्डी और अस्थि मज्जा मॉडल27,28 के गठन के लिए स्थितियों को अनुकूलित करने के लिए किया गया है।

विभिन्न संस्कृति स्थितियों और नए चिकित्सीय की बड़ी संख्या के परीक्षण के लिए, उच्च थ्रूपुट क्षमता वाले मॉडल की आवश्यकता होती है। हमने हाल ही में दिखाया है कि हमारे पीईजी हाइड्रोगेल के एफएक्सIII क्रॉस-लिंकिंग को एक इलेक्ट्रोकेमिकल प्रक्रिया के माध्यम से नियंत्रित किया जा सकता है जैसे कि एक गहन हाइड्रोगेल कठोरताढाल का गठन होता है। जब कोशिकाओं को ऐसे हाइड्रोगेल के शीर्ष पर जोड़ा जाता है, तो वे इंटीरियर की ओर पलायन करते हैं और धीरे-धीरे अत्यधिक परस्पर जुड़े 3 डी सेलुलर नेटवर्क30 में विकसित होते हैं। हाइड्रोगेल में कोशिकाओं को समाहित करने की आवश्यकता का उन्मूलन, जो आमतौर पर अन्य 3 डी मचानों के साथ मौजूद होता है, न केवल प्रयोगात्मक डिजाइन को सरल बनाता है, बल्कि जटिल सह-संस्कृति प्रणालियों को उत्पन्न करने के लिए अलग-अलग समय बिंदुओं पर विभिन्न सेल प्रकारों के अनुक्रमिक जोड़ की भी अनुमति देता है। ये हाइड्रोजेल ग्लास-बॉटम 96-वेल इमेजिंग प्लेटों पर प्री-कास्ट उपलब्ध हैं, इस प्रकार मैनुअल के साथ-साथ स्वचालित सेल सीडिंग प्रोटोकॉल द्वारा 3 डी संस्कृतियों की स्थापना प्राप्त की जा सकती है। पीईजी हाइड्रोगेल की ऑप्टिकल पारदर्शिता मंच को माइक्रोस्कोपी के साथ संगत बनाती है।

यहां, हम इस तैयार-से-उपयोग, सिंथेटिक प्लग-एंड-प्ले प्लेटफॉर्म के भीतर संवहनी ओस्टोजेनिक niches की पीढ़ी और लक्षण वर्णन के लिए एक सीधी विधि प्रस्तुत करते हैं। हम दिखाते हैं कि संवहनी नेटवर्क के विकास को आमतौर पर इन विट्रो ओस्टियोजेनेसिस, बोन मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन -2 (बीएमपी -2) को प्रेरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विकास कारक के साथ उत्तेजित किया जा सकता है, जबकि ओस्टोजेनिक भेदभाव को फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक 2 (एफजीएफ -2) 27,31 के पूरक द्वारा रोका जा सकता है। समग्र उपस्थिति, साथ ही सेल और ईसीएम वितरण के संदर्भ में एफजीएफ -2-उत्तेजित नेटवर्क की तुलना में गठित नेटवर्क अलग हैं। इसके अलावा, हमने मार्कर के रूप में क्षारीय फॉस्फेट का उपयोग करके ओस्टोजेनिक प्रेरण की निगरानी की। हम समय के साथ इस मार्कर की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करते हैं और गुणात्मक और मात्रात्मक तरीकों का उपयोग करके एफजीएफ -2 उत्तेजित नेटवर्क में अभिव्यक्ति की तुलना करते हैं। अंत में, हम दो संभावित अनुप्रयोगों के लिए इस मॉडल के उत्पन्न niches की उपयुक्तता प्रदर्शित करते हैं। सबसे पहले, हमने पूर्व-गठित niches में Bevacizumab जोड़कर और इसकी उपस्थिति में संवहनी नेटवर्क के क्षरण की निगरानी करके एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट दवा संवेदनशीलता परख का प्रदर्शन किया। दूसरे, हमने एमडीए-एमबी -231 स्तन कैंसर और यू 2 ओएस ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं को पूर्व-गठित ओस्टोजेनिक niches में जोड़ा, यह दिखाते हुए कि niches का उपयोग कैंसर कोशिकाओं और उनके पर्यावरण के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Protocol

चित्रा 1 निम्न प्रोटोकॉल अनुभागों को सारांशित करता है।

1. 3 डी स्ट्रोमल मोनोकल्चर की स्थापना

  1. एचबीएम-एमएससी सेल सस्पेंशन तैयार करें।
    1. एचबीएम-एमएससी को एमईएमई में 70% -90% के संगम स्तर तक विकसित करें, जो 10% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 5 एनजी / एमएल एफजीएफ -2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक इनक्यूबेटर में एक ह्यूमिडिफाइड वातावरण में पूरक है। कोशिकाओं का उपयोग मार्ग 6 तक किया जा सकता है।
    2. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं, और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए का उपयोग करके अलग करें। बेसल माध्यम (एमईएमए 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) के साथ फ्लश करके अलगाव प्रक्रिया को रोकें। निलंबित कोशिकाओं को 50 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें।
    3. हेमटोसाइटोमीटर या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें, और निलंबन में कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करें।
    4. 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली दें। सुपरनैटेंट को सावधानी से हटा दें।
    5. स्टॉक समाधान के 1 x 107 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए बेसल माध्यम की उचित मात्रा में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    6. 50 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें जिसमें बेसल माध्यम की आवश्यक मात्रा संबंधित विकास कारकों (एफजीएफ -2 और बीएमपी -2 परिभाषित सांद्रता पर पूरक है, जैसे, 0 एनजी / एमएल, 25 एनजी / एमएल, 50 एनजी / एमएल, 100 एनजी / एमएल, या 200 एनजी / एमएल)। प्रति कुएं, 200 μL की आवश्यकता है। यदि सेल सीडिंग को स्वचालित तरल हैंडलर का उपयोग करके किया जाना है, तो उपकरण की मृत मात्रा पर भी विचार करें। मैनुअल सेल सीडिंग के लिए, 10% से अधिक मात्रा पर्याप्त है।
    7. 1.5 x 105 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए स्टॉक समाधान से 1: 66.67 के कमजोर पड़ने पर एचबीएम-एमएससी जोड़ें।
  2. बीज बोने के लिए प्लेट तैयार करें।
    1. 96-वेल हाइड्रोगेल प्लेट को कवर करने वाली पॉलीप्रोपाइलीन चिपकने वाली फिल्म को हटा दें।
    2. हाइड्रोगेल को कवर करने वाले भंडारण बफर को ध्यान से एस्पिरेट करें। इस कार्य के लिए, एक माइक्रोप्लेट वॉशर का उपयोग करें; हालांकि, मैनुअल हैंडलिंग संभव है।
      1. मैनुअल एस्पिरेटर या मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करते समय, नोक को कुएं की दीवार के खिलाफ रखें, और धीरे-धीरे बफर को घुमाते हुए आंतरिक कुएं के किनारे की ओर नीचे जाएं। यह हाइड्रोजेल की सतह को नुकसान पहुंचाने से बच जाएगा।
      2. स्वचालित प्लेट वॉशर का उपयोग करते समय, एस्पिरेशन नोजल को प्लेट वाहक से कम से कम 3.8 मिमी सेट करें (यह हाइड्रोगेल प्लेट की आंतरिक अंगूठी से 0.8 मिमी से मेल खाती है) और कुएं के किनारे की ओर। अधिक विस्तृत निर्देशों के लिए और 96-वेल हाइड्रोगेल प्लेट के प्लेट चित्र प्राप्त करने के लिए निर्माता के मैनुअल को देखें।
  3. कोशिकाओं को सजातीय रूप से वितरित करने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण करने के बाद चरण 1.1.7 में तैयार सेल सस्पेंशन के 200 μL / वेल जोड़ें। बीज बोने के दौरान, सब्सट्रेट के एक क्षेत्र में कोशिकाओं के असमान अवसादन से बचने के लिए, प्लेट को झुकाएं नहीं। मैनुअल सीडिंग के लिए, समय-समय पर मिश्रण को सजातीय रखने के लिए सेल सस्पेंशन (तीन कुओं को बोने के बाद) मिलाएं। स्वचालित बीज बोने के लिए, समान संख्या में कोशिकाओं वाले वॉल्यूम देने के लिए वितरण से तुरंत पहले एक सीरोलॉजिकल पाइप के साथ मिलाएं।
  4. संस्कृतियों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में बनाए रखें।
  5. इच्छानुसार 5x उद्देश्य के साथ उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा संस्कृतियों के विकास की निगरानी करें। जोड़े गए कोशिकाओं की संख्या का मूल्यांकन करने के लिए सीडिंग के लगभग 30 मिनट बाद संदर्भ चित्र प्राप्त करें।

2. 3 डी स्ट्रोमल-एंडोथेलियल सेल सह-संस्कृति की स्थापना

  1. जीएफपी-एचयूवीईसी सेल सस्पेंशन तैयार करें।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 0.02 एम एसिटिक एसिड में 150 μg / mL चूहा-पूंछ कोलेजन I से युक्त घोल के साथ कोटिंग करके HUVEC संस्कृति के लिए फ्लास्क तैयार करें। उपयोग करने से पहले पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला करें।
    2. जीएफपी-एचयूवीईसी को ईजीएम -2 में 80% -100% के संगम स्तर तक बढ़ाएं, 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में 10% एफबीएस के साथ पूरक और एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में 5% सीओ2 । कोशिकाओं का उपयोग मार्ग 7 तक किया जा सकता है।
    3. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 मिनट के लिए 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए का उपयोग करके उन्हें अलग करें। बेसल माध्यम (एमईएमए 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) के साथ फ्लश करके अलगाव प्रक्रिया को रोकें। निलंबित कोशिकाओं को 50 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें।
    4. हेमटोसाइटोमीटर या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें, और निलंबन में मौजूद कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करें।
    5. 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली दें। सुपरनैटेंट को सावधानी से हटा दें।
    6. स्टॉक समाधान के 1 x 107 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए बेसल माध्यम की उचित मात्रा में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    7. चरण 1.1.6 में एचबीएम-एमएससी के लिए वर्णित संबंधित विकास कारकों (जैसे, 0 एनजी/एमएल, 25 एनजी/एमएल, 50 एनजी/एमएल, 100 एनजी/एमएल, या 200 एनजी/एमएल) के साथ पूरक बेसल माध्यम की आवश्यक मात्रा वाले 50 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें।
    8. चरण 1.1.7 में hBM-MSCs के लिए वर्णित 1.5 x 105 कोशिकाओं/mL की सांद्रता प्राप्त करने के लिए स्टॉक समाधान से 1:66.67 के कमजोर पड़ने पर GFP-HUVECs जोड़ें।
  2. स्ट्रोमल मोनोकल्चर युक्त प्लेट से माध्यम को एस्पिरेट करें, जैसा कि चरण 1.2.2 में बफर हटाने के लिए वर्णित है।
  3. चरण 2.1.8 में तैयार जीएफपी-एचयूवीईसी सेल सस्पेंशन के 200 μL/वेल जोड़ें जैसा कि चरण 1.3 में hBM-MSC जोड़ के लिए वर्णित है।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में इनक्यूबेट करें। हर 3-4 दिनों में माध्यम बदलें।
  5. इच्छानुसार 5x उद्देश्य का उपयोग करके उज्ज्वल-क्षेत्र और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा संस्कृति के विकास की निगरानी करें। संस्कृतियों को क्रमशः प्रारंभिक या मध्यवर्ती लक्षण वर्णन के लिए सह-संस्कृति के दिन 4 या दिन 7 तक बनाए रखें, या इच्छानुसार।

3. लक्षण वर्णन प्रक्रिया 1: एंडोथेलियल सेल नेटवर्क गठन की मात्रा

  1. वांछित समय बिंदुओं पर, परिमाणीकरण के लिए उपयुक्त सेटिंग्स का उपयोग करके फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ जीएफपी-एचयूवीईसी से जीएफपी सिग्नल प्राप्त करें (यानी, सबसे अच्छा फोकस, उच्च कंट्रास्ट, और कम आवर्धन [जैसे, 5x] दृश्य के बड़े क्षेत्रों के लिए)।
  2. कंट्रास्ट को और बढ़ाने के लिए उसी दिन प्राप्त सभी छवियों को समान रूप से पूर्व-प्रक्रिया करें (उदाहरण के लिए, फिजी32 का उपयोग करके)। ध्यान दें कि जीएफपी सिग्नल संस्कृति समय के साथ मंद हो सकता है; इसलिए, अलग-अलग दिनों में प्राप्त छवियों को अलग-अलग प्रसंस्करण की आवश्यकता हो सकती है।
    1. यदि फिजी या इमेजजे का उपयोग कर रहे हैं, तो एक ही समय बिंदु के सभी जीएफपी चैनल छवियों को खोलें, और ब्राइटनेस एंड कंट्रास्ट मेनू खोलें। एक ऐसी छवि का चयन करें जो एक मध्यवर्ती स्थिति का प्रतिनिधित्व करती है (सबसे मंद और सबसे उज्ज्वल संकेत नहीं), और ऑटो का चयन करके कंट्रास्ट को स्वत: समायोजित करें। सेट का चयन करें, और अन्य सभी खुली छवियों के लिए प्रचार की जाँच करें।
    2. नेत्रहीन रूप से मूल्यांकन करें कि क्या चयनित श्रेणी स्वचालित रूप से वर्तमान समय बिंदु की सभी छवियों को फिट करती है, और आवश्यकतानुसार सभी छवियों को मैन्युअल रूप से पुन: समायोजित और पुन: प्रचारित करती है।
    3. समायोजित छवियों को TIF फ़ाइलों के रूप में सहेजें, और प्राप्त किए गए अन्य समय बिंदुओं के लिए चरण 3.2.1 और चरण 3.2.2 दोहराएं।
  3. डाउनस्ट्रीम आर्टिफैक्ट पहचान से बचने के लिए सभी छवियों पर एक मीडियन ब्लर फ़िल्टर (उदाहरण के लिए, 2048x2048 छवियों के लिए त्रिज्या 3) लागू करें और इस प्रकार, सटीक नेटवर्क पहचान की सुविधा प्रदान करें। बिनिंग (2x2) द्वारा आकार कम करें और सभी पूर्व-संसाधित छवियों को ग्रेस्केल आरजीबी कलर टीआईएफ फ़ाइलों के रूप में परिमाणीकरण के लिए एक फ़ोल्डर में सहेजें। इन चरणों को मैक्रोज़ का उपयोग करके मैन्युअल रूप से या बैच मोड में किया जा सकता है जिसे लेखक अनुरोध पर साझा करेंगे।
  4. ImageJ33 के लिए एंजियोजेनेसिस विश्लेषक में बैच प्रक्रिया मोड का उपयोग करके चरण 3.1-3.3 में बनाए गए फ़ोल्डर में सभी छवियों का विश्लेषण करें। ध्यान दें कि छवियों के आकार और उपलब्ध कार्यशील स्मृति के आधार पर, इसमें प्रति छवि कुछ मिनट लग सकते हैं।
  5. मान्यता प्राप्त संरचनाओं और मूल छवियों के ओवरले की जांच करके परिमाणीकरण परिणामों को मान्य करें। यदि एल्गोरिथ्म कृत्रिम संरचनाओं को पहचानता है, जहां मूल छवि में केवल कुछ या कोई कोशिकाएं नहीं देखी जा सकती हैं, तो पूर्व-प्रसंस्करण मापदंडों को समायोजित करें, और मूल छवियों का फिर से विश्लेषण करें, या ऐसे समस्याग्रस्त क्षेत्रों को बाहर करें और / या विश्लेषण से छवियों को दोहराएं।
  6. विश्लेषण किए गए क्षेत्र के अनुपात से प्रत्येक नमूने के मूल्यों को 1 मिमी 2 के अनुपात से गुणा करके प्राप्त मूल्यों को 1 मिमी2 के क्षेत्र में सामान्य करें। यदि विभिन्न आकारों की छवियों का उपयोग किया जाता है तो यह कदम विशेष महत्व का है।
  7. विश्लेषण से विभिन्न नेटवर्क मापदंडों, जैसे कुल नेटवर्क लंबाई, जंक्शनों की संख्या, खंडों की संख्या, पृथक खंडों की संख्या, शाखाओं के अंतराल, और औसत जाल आकार को निकालें, और विभिन्न समय बिंदुओं पर और विभिन्न संस्कृति स्थितियों के तहत एंडोथेलियल नेटवर्क को चिह्नित करने के लिए उनका उपयोग करें।

4. लक्षण वर्णन प्रक्रिया 2: ईसीएम जमाव का आकलन

  1. वांछित अंत समय बिंदुओं पर, इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके ईसीएम जमाव का आकलन करें। संस्कृति के अंतिम 6 घंटे के दौरान या निर्धारण के बाद संस्कृति माध्यम के 100 μL में विभिन्न ईसीएम अणुओं के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें, जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. RT पर 5 मिनट के लिए PBS के 200 μL/कुएं के साथ एक बार संस्कृतियों को धोएं, और उन्हें RT पर 30 मिनट के लिए रासायनिक फ्यूम हुड के तहत 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 100 μL/कुएं के साथ ठीक करें। ध्यान दें कि एक ही समय में एक प्लेट के सभी कुओं को ठीक करने की सलाह दी जाती है, क्योंकि इस चरण के दौरान आसपास की संस्कृतियां क्षतिग्रस्त हो सकती हैं। हर बार 5 मिनट के लिए आरटी पर पीबीएस के 200 μL / कुएं के साथ निश्चित संस्कृतियों को धोएं, और पीबीएस के 200 μL / कुएं में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, या तुरंत अगले चरण पर आगे बढ़ें।
    2. निर्धारण के बाद ईसीएम अणुओं के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इंक्यूबेट करने से पहले, आरटी पर 30 मिनट के लिए ब्लॉकिंग समाधान के रूप में पीबीएस में 1% बीएसए के 200 μL / वेल के साथ निश्चित संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें।
      1. ब्लॉकिंग समाधान को एस्पिरेट करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पीबीएस में 1% बीएसए में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 μL / अच्छी तरह से इनक्यूबेट करें। पीबीएस के 200 μL/ कुएं के साथ क्रमशः 5 मिनट, कम से कम 3 घंटे और 5 मिनट के लिए तीन बार आरटी पर धोएं।
        नोट: हाइड्रोजेल से अनबाउंड एंटीबॉडी के पूर्ण प्रसार के लिए लंबे समय तक धोने के चरण की आवश्यकता होती है।
    3. इंट्रासेल्युलर काउंटरदाग सहित द्वितीयक धुंधला समाधान के प्रवेश को सुविधाजनक बनाने के लिए, संस्कृतियों के सेलुलर घनत्व के आधार पर आरटी पर 30-90 मिनट के लिए पीबीएस में 0.3% ट्राइटन एक्स -100 और 1% बीएसए का उपयोग करके संस्कृतियों को स्थिर करें।
      नोट: इंट्रासेल्युलर अणुओं के एंटीबॉडी-आधारित धुंधलापन के लिए, यह चरण चरण 4.1.2 में वर्णित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन से पहले किया जाना चाहिए।
    4. वांछित रूप से संबंधित द्वितीयक एंटीबॉडी और काउंटरदाग युक्त द्वितीयक धुंधला समाधान तैयार करें (उदाहरण के लिए, डीएपीआई जैसे परमाणु दाग और एक साइटोस्केलेटल दाग जैसे कि फैलोइडिन-रोडामाइन)।
      1. पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स -100, 1% बीएसए और काउंटरदाग (जैसे, 1 μg / mL DAPI और 1: 4,000 फेलोइडिन-रोडामाइन) से युक्त एक धुंधला बफर तैयार करें, और अनुशंसित कमजोर पड़ने पर संबंधित द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें।
      2. द्वितीयक धुंधला घोल के 100 μL / कुएं जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद प्रक्रिया के समान, आरटी पर क्रमशः 5 मिनट, कम से कम 3 घंटे और 5 मिनट के लिए पीबीएस के 200 μL / कुएं के साथ तीन बार धोएं।
    5. संरचनाओं के 3 डी समाधान के लिए, 500 μm की अंतिम ऊंचाई तक पहुंचने वाले 2.5 μm के z-step के साथ ग्लास बॉटम से शुरू होने वाले कॉन्फोकल स्टैक प्राप्त करें, 10x उद्देश्य और 0.75x डिजिटल ज़ूम का उपयोग करें। फिजी में जीएफपी और एफ-एक्टिन सिग्नल का 3 डी पुनर्निर्माण उत्पन्न करने के लिए, एक समग्र बनाने और फिजी 3 डी व्यूअर का उपयोग करके पुनर्निर्माण उत्पन्न करने से पहले प्रत्येक चैनल को अलग से दहलीज करें।
    6. इम्यूनोस्टेनिंग्स से जमा ईसीएम के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, 5 μm के z-चरण, 10x उद्देश्य और 1.5x डिजिटल ज़ूम के साथ 100 μm की ऊंचाई के कॉन्फोकल स्टैक प्राप्त करें। अधिकतम तीव्रता अनुमान उत्पन्न करें, और एक समग्र बनाने से पहले फिजी में प्रत्येक चैनल के लिए चमक और कंट्रास्ट को अलग से समायोजित करें।
  2. बाह्य वातावरण के प्रत्यक्ष रंग धुंधलापन का प्रदर्शन करें।
    1. पैराफॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड कुओं में पिक्रोसिरियस रेड स्टेनिंग घोल के 200 μL/well जोड़ें, और RT पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. इसके बाद, सना हुआ कुओं को आसुत जल से पांच बार धोएं, इसके बाद नमूना रंग समाशोधन की निगरानी करते हुए 3-4 दिनों के लिए हर दिन या हर दूसरे दिन दो बार धोएं। लंबे समय तक धोने के चरणों के दौरान प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें (यानी, 6 घंटे से अधिक कुछ भी)।
    3. एक रंगीन कैमरे से लैस एक उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करके दाग वाले नमूनों की छवियां प्राप्त करें, और स्थितियों में एक समान सफेद संतुलन बनाए रखें। नमूने के अवलोकन प्राप्त करने के लिए, पूरे कुएं को स्कैन करने के लिए कम आवर्धन (जैसे, 2.5x) का उपयोग करें। यदि माइक्रोस्कोप स्वचालित सिलाई का समर्थन करने वाले सॉफ़्टवेयर के साथ नहीं आता है, तो इसे मैन्युअल रूप से करें (उदाहरण के लिए, फिजी34 में पेयरवाइज स्टिचिंग का उपयोग करना)।
      नोट: इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए पहले उपयोग किए जाने वाले कुओं का उपयोग इसके लिए किया जा सकता है, बशर्ते कि प्रतिदीप्ति छवि अधिग्रहण पूरा हो गया हो।
    4. एलिज़रीन रेड स्टेनिंग, वाशिंग और इमेजिंग करने के लिए चरण 4.2.1-4.2.3 में पिक्रोसिरियस रेड स्टेनिंग के लिए वर्णित समान चरणों का पालन करें।

5. लक्षण वर्णन प्रक्रिया 3: एएलपी गतिविधि की निगरानी करके ओस्टोजेनिक भेदभाव का आकलन करना।

  1. विभिन्न संस्कृति अंत समय बिंदुओं (जैसे, सह-संस्कृति के दिन 4 और दिन 7) पर, मात्रात्मक रूप से 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल फॉस्फेट (बीसीआईपी)/नाइट्रो ब्लू टेट्राज़ोलियम (एनबीटी) धुंधला का उपयोग करके एएलपी गतिविधि का आकलन करें।
    1. बीसीआईपी / एनबीटी सब्सट्रेट समाधान के साथ इनक्यूबेट करने से पहले पीबीएस के 200 μL / कुएं के साथ संस्कृतियों को एक बार धोएं, जिसे निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए तैयार किया जाना चाहिए। समय-समय पर रंग विकास की निगरानी करते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक बार जब रंग गैर-ओस्टोजेनिक स्थितियों में विकसित होना शुरू हो जाता है, तो चरण 4.1.1 में वर्णित 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ ठीक करने से पहले पीबीएस के 200 μL / अच्छी तरह से एक बार तुरंत धो लें।
    2. दाग वाले नमूनों की रंगीन छवियां प्राप्त करें, जैसा कि पिक्रोसिरियस रेड स्टेनिंग के लिए चरण 4.2.3 में वर्णित है।
  2. विभिन्न संस्कृति अंत समय बिंदुओं (जैसे, सह-संस्कृति के दिन 4 और दिन 7) पर, सेल लाइसेट में एएलपी गतिविधि की मात्रा निर्धारित करें।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 200 μL/कुएं के साथ इनक्यूबेट करने से पहले पीबीएस के 200 μL/कुएं के साथ संस्कृतियों को तीन बार धोएं। हर 10 मिनट में, पाचन को सुविधाजनक बनाने के लिए सख्ती से ऊपर और नीचे पाइप करके संस्कृतियों को उत्तेजित करें, और एक मानक सेल कल्चर माइक्रोस्कोप के साथ संस्कृति आकृति विज्ञान की निगरानी करें।
    2. एक बार जब कुओं में कोई लम्बी सेलुलर संरचना नहीं होती है तो एक तरल, एकल-कोशिका निलंबन प्राप्त होता है (आमतौर पर 20-30 मिनट के बाद), नमूनों को 2 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें, ट्रिप्सिन को रोकने के लिए एमएससी बेसल माध्यम के 200 μL जोड़ें, और पुनर्प्राप्त कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें, या सीधे चरण 5.2.3 पर आगे बढ़ें।
    3. चरण 5.2.2 में प्राप्त सेल छर्रों को पिघलाएं, और बर्फ पर 30 मिनट के लिए 0.56 एम 2-एमिनो-2-मिथाइल-1-प्रोपेनोल, 0.2% ट्राइटन एक्स -100, पीएच 10 से युक्त 500 μL लाइसिस बफर के साथ इनक्यूबेट करें। इसके बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,100 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और नमूने बर्फ पर रखें। चरण 5.2.7 में वर्णित माप के बाद, नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें, या सीधे डीएनए परिमाणीकरण के साथ जारी रखें, जैसा कि चरण 5.2.8 में वर्णित है।
      नोट: लाइसिस बफर को पहले से तैयार किया जा सकता है, बाँझ-फ़िल्टर किया जा सकता है, और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. लाइसिस बफर में 20 एमएम 4-नाइट्रोफेनिल फॉस्फेट डिसोडियम नमक हेक्साहाइड्रेट और 4 एमएम एमजीसीएल2 से युक्त एएलपी अभिकर्मक तैयार करें।
      नोट: परिमाणीकरण के दिन इस समाधान को ताजा तैयार करना सबसे अच्छा है।
    5. किसी भी पेलेट मलबे को परेशान किए बिना, चरण 5.2.3 में तैयार सेल लाइसेट सुपरनैटेंट के 50 μL को डुप्लिकेट में एक मानक, पारदर्शी, ऊतक-संस्कृति 96-वेल प्लेट के कुओं में वितरित करें। रिक्त नियंत्रण के रूप में दो कुओं में लाइसिस बफर जोड़ें।
    6. मल्टीचैनल पिपेट के साथ, चरण 5.2.5 में भरे गए कुओं में एएलपी अभिकर्मक के 50 μL / कुएं जोड़ें। प्लेट को संक्षेप में हिलाएं, और प्रकाश से सुरक्षित 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। उच्च एएलपी गतिविधि वाले कुएं पीले दिखाई देंगे। मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके 1 M NaOH के 100 μL/well को जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें।
    7. प्लेट रीडर का उपयोग करके 410 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व पढ़ें। तकनीकी डुप्लिकेट को औसत करें, और रिक्त नियंत्रणों के औसत को घटाएं।
    8. कुल सेल संख्या के खिलाफ पिछले चरणों में निर्धारित एएलपी गतिविधि को सामान्य करने के लिए डीएनए परिमाणीकरण करें। यहां, प्रतिदीप्ति माप पर आधारित एक विधि का वर्णन किया गया है, लेकिन सेल लाइसेट में डीएनए परिमाणीकरण के लिए कोई अन्य विधि परख के साथ संगत है। निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके डीएनए परिमाणीकरण के लिए आवश्यक अभिकर्मकों और डीएनए मानकों को तैयार करें।
      नोट: डीएनए मानकों को तैयार करने के लिए लाइसिस बफर का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    9. यदि चरण 5.2.3 में वर्णित एएलपी परिमाणीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूने जमे हुए थे, तो उन्हें पिघलाएं, 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 16,100 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और उन्हें बर्फ पर रखें। किसी भी पेलेट मलबे को परेशान किए बिना, सेल लाइसेट सुपरनैटेंट के 50 μL को डुप्लिकेट में एक काले 96-वेल प्लेट के कुओं में फेंक दें। -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने फ्रीज करें, और यदि आवश्यक हो तो एएलपी और डीएनए परिमाणीकरण दोहराएं। डुप्लिकेट में डीएनए मानकों को जोड़ें।
    10. एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ, डीएनए धुंधला एजेंट के 50 μL जोड़ें, इनक्यूबेट करें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रतिदीप्ति तीव्रता पढ़ें। मानक वक्र मूल्यों का उपयोग करके, डीएनए सांद्रता में मापा तीव्रता मानों के रूपांतरण को निर्धारित और लागू करें।
    11. चरण 5.2.7 में प्राप्त एएलपी मानों को प्रत्येक नमूने की संबंधित डीएनए एकाग्रता से विभाजित करके सामान्य करें।

6. आवेदन 1: दवा संवेदनशीलता परख का प्रदर्शन

  1. जब एंडोथेलियल नेटवर्क पूरी तरह से विकसित हो जाते हैं (आमतौर पर स्ट्रोमल-एंडोथेलियल सेल सह-संस्कृतियों के दिन 4 पर), ताजा संस्कृति माध्यम में संस्कृतियों में एंटी-एंजियोजेनिक यौगिकों, जैसे कि बेवासिज़ुमाब को जोड़ें, और समय के साथ और विभिन्न परिस्थितियों में उनकी गतिविधि का परीक्षण करें (उदाहरण के लिए, एफजीएफ -2 या बीएमपी -2 की विभिन्न सांद्रता)।
    1. उस बिंदु तक संबंधित संस्कृतियों के लिए उपयोग किए जाने वाले समान विकास कारकों वाले ताजा संस्कृति माध्यम तैयार करें।
      1. एक नियंत्रण समाधान तैयार करें जिसमें ब्याज के यौगिक का डिल्यूएंट शामिल हो (उदाहरण के लिए, बेवासिजुमैब के लिए: 60 मिलीग्राम / एमएल α-ट्रेहलोस डाइहाइड्रेट, 0.4 मिलीग्राम / एमएल ट्वीन 20, 5.8 मिलीग्राम / एमएल सोडियम फॉस्फेट, मोनोबैसिक और मोनोहाइड्रेट, और 1.2 मिलीग्राम / एमएल सोडियम फॉस्फेट डिबेसिक, निर्जल), और बाँझ-फ़िल्टर करें।
      2. वांछित एकाग्रता पर ब्याज का यौगिक जोड़ें (उदाहरण के लिए, 10 μg / mL bevacizumab) और नियंत्रण समाधान की एक समान मात्रा क्रमशः परीक्षण और नियंत्रण स्थितियों के लिए निर्दिष्ट संस्कृति माध्यम में।
  2. संस्कृति से माध्यम को अलग करें, और चरण 6.1.1 में ताजा तैयार किए गए माध्यम के 200 μL / कुएं जोड़ें। यौगिक के परीक्षण के लिए उपयुक्त समय के लिए इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, बेवासिज़ुमैब के लिए: 2 दिन)। संस्कृति के विकास की निगरानी करें, और एंडोथेलियल नेटवर्क को चिह्नित करें जैसा कि खंड 3 में वर्णित है। जीएफपी छवियों और चरण 3.7 में वर्णित विश्लेषण से निकाले गए मात्रात्मक नेटवर्क मापदंडों का उपयोग करके एंजियोजेनेसिस को बाधित करने या पूर्व-गठित संरचनाओं को हटाने में यौगिक की प्रभावशीलता का आकलन करें।

7. आवेदन 2: विभिन्न कैंसर सेल प्रकारों के साथ उन्नत सह-संस्कृति प्रणालियों की स्थापना

  1. सह-संस्कृति के दिन 4 पर, जब एंडोथेलियल नेटवर्क ज्यादातर स्थापित होते हैं, तो ताजा संस्कृति माध्यम में संस्कृतियों में एमडीए-एमबी -231 या यू 2 ओएस कैंसर कोशिकाओं जैसे अन्य सेल प्रकारों को जोड़ें।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेल-संगत लाइव डाई का उपयोग करके कैंसर कोशिकाओं को लेबल करें ताकि उन्हें सह-संस्कृतियों में जीएफपी-लेबल एचयूवीईसी और गैर-लेबल एचबीएम-एमएससी से अलग करने में सक्षम हो सकें।
    2. ताजा संस्कृति माध्यम में 1.5 x 104 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर कैंसर कोशिकाओं का निलंबन तैयार करें, जिसमें उस बिंदु तक संबंधित संस्कृतियों के लिए उपयोग किए जाने वाले समान विकास कारक हों।
  2. वांछित के रूप में संस्कृति विकास और कैंसर सेल स्थानीयकरण की निगरानी करें।
    नोट: कैंसर के प्रकार, गतिविधि और पर्यावरण के आधार पर, स्ट्रोमल-एंडोथेलियल सेल सह-संस्कृतियों में संवहनी संरचनाओं तक पहुंचने में उन्हें कुछ दिन लग सकते हैं (उदाहरण के लिए, एमडीए-बीएम -231 और यू 2 ओएस के लिए 2 दिन)। इसलिए, कैंसर-संवहनी सेल इंटरैक्शन की कल्पना करने के लिए टाइम-लैप्स इमेजिंग को तदनुसार समय दिया जाना चाहिए।

Representative Results

संवहनी आला संस्कृतियों को 96-वेल इमेजिंग प्लेट (चित्रा 1) के भीतर कठोरता ढाल के साथ प्री-कास्ट पीईजी-आधारित हाइड्रोगेल पर क्रमिक रूप से एचबीएम-एमएससी और जीएफपी-एचयूवीईसी को जोड़कर स्थापित किया गया था। लाइव एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के माध्यम से संस्कृतियों की अनुदैर्ध्य निगरानी की गई और आगे चयनित समय बिंदुओं पर विशेषता दी गई। बाह्य डिब्बे का मूल्यांकन प्रत्यक्ष रंग धुंधला और एंटीबॉडी-आधारित धुंधलापन के माध्यम से किया गया था। उत्पन्न niches से कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करने और लाइज़ करने के बाद ALP गतिविधि की मात्रा निर्धारित की गई थी। इसके अलावा, हम एंटी-एंजियोजेनिक दवा संवेदनशीलता परख के लिए और कैंसर सह-संस्कृति मॉडल के आधार के रूप में इस मंच की उपयुक्तता का प्रदर्शन करते हैं।

एचबीएम-एमएससी और जीएफपी-व्यक्त करने वाले एचयूवीईसी की सह-संस्कृतियों को विकास कारकों की अनुपस्थिति में या 50 एनजी / एमएल पर एफजीएफ -2 या बीएमपी -2 की उपस्थिति में 3 x 104 कोशिकाओं / वेल को सीडिंग करके स्थापित किया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है। प्रारंभिक समय से, संस्कृतियों के बीच अंतर को उज्ज्वल-क्षेत्र और प्रतिदीप्ति छवियों दोनों से देखा जा सकता है जो केवल जीएफपी-एचयूवीईसी (चित्रा 2 ए) दिखाते हैं। एक ही क्षेत्र को अनुदैर्ध्य रूप से देखकर, संस्कृतियों के विकास में अंतर को नोट किया जा सकता है, जैसे कि एफजीएफ -2 की उपस्थिति में तेजी से विकास। आम तौर पर, संस्कृतियां किसी भी विकास कारक की अनुपस्थिति में कम विकसित दिखाई देती हैं, जिसमें किसी भी प्रकार की कम कोशिकाएं फैलती हैं और एककोशिकीय क्षेत्रों की उपस्थिति होती है। इसके विपरीत, उज्ज्वल-क्षेत्र छवियों ने बीएमपी -2 की उपस्थिति में सबसे घनी संस्कृतियों को दिखाया। हालांकि, विकास कारक-युक्त दोनों स्थितियों में संवहनी जैसे नेटवर्क का गठन किया गया, और एफजीएफ -2 के साथ सबसे व्यापक और परस्पर जुड़े नेटवर्क का गठन किया गया। इमेजजे के लिए एंजियोजेनेसिस विश्लेषक का उपयोग करके इन देखे गए अंतरों को भी निर्धारित किया जा सकता है। दरअसल, एफजीएफ -2 की उपस्थिति में कुल नेटवर्क की लंबाई सबसे अधिक थी और विकास कारकों की अनुपस्थिति में सबसे कम थी (चित्रा 2 बी)। नेटवर्क में ब्रांचिंग पॉइंट को इंगित करने वाले जंक्शनों की संख्या ने कुल लंबाई (चित्रा 2 सी) के समान प्रवृत्ति का पालन किया। इसके विपरीत, दोनों विकास कारक युक्त स्थितियों में काफी कम अलग-थलग खंड थे, जो किसी भी विकास कारक के बिना स्थिति की तुलना में उच्च इंटरकनेक्टिविटी का संकेत देते हैं (चित्रा 2 डी)। इसके अतिरिक्त, 3 डी कॉन्फोकल इमेजिंग ने एफजीएफ -2-उत्तेजित स्थिति (चित्रा 2 ई) में गहराई के संदर्भ में मजबूत एंडोथेलियल सेल प्रवेश का खुलासा किया।

एचबीएम-एमएससी/जीएफपी-एचयूवीईसी सह-संस्कृतियों को ईसीएम घटकों के लिए तय और दाग लगाने से पहले एफजीएफ -2 या बीएमपी -2 की उपस्थिति में 7 दिनों तक बनाए रखा गया था। कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के बाद इम्यूनोसाइटोकेमिकल स्टेनिंग ने विकास कारक पूरकता के प्रकार के आधार पर संस्कृति आकृति विज्ञान में हड़ताली अंतर दिखाया (चित्रा 3 ए)। एफजीएफ -2 के साथ, संस्कृति को संघनित माइक्रोवास्कुलर जैसी संरचनाओं में व्यवस्थित किया गया था, जो एंडोथेलियल और मेसेनकाइमल कोशिकाओं दोनों में घने थे, जबकि बीएमपी -2 की उपस्थिति में, एचबीएम-एमएससी ने बहुत बड़े क्षेत्र को फैलाया, जैसा कि अधिक व्यापक एफ-एक्टिन-पॉजिटिव और जीएफपी-नकारात्मक क्षेत्रों से स्पष्ट है। ईसीएम प्रोटीन फाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन I को एक समान तरीके से स्थानीयकृत किया गया था, जबकि लैमिनिन और कोलेजन IV एंडोथेलियल संरचनाओं के आसपास अधिक केंद्रित थे। हालांकि, एंडोथेलियल संरचनाओं के आसपास यह बढ़ी हुई एकाग्रता बीएमपी -2 की उपस्थिति की तुलना में एफजीएफ -2 की उपस्थिति में बहुत अधिक स्पष्ट थी। एंटीबॉडी-आधारित धुंधलापन के अलावा, ईसीएम की समग्र फाइब्रोटिक स्थिति का आकलन करने के लिए प्रत्यक्ष रंग धुंधला पन किया गया था (पिक्रोसिरियस रेड स्टेनिंग; चित्रा 3 बी), साथ ही ईसीएम पर सीए का जमाव (अलीज़रीन रेड स्टेनिंग; चित्र 3C) गठित स्थानों में से। बीएमपी -2 के साथ सुसंस्कृत आला में पिक्रोसिरियस रेड स्टेनिंग मजबूत और अधिक व्यापक था, और अलीज़रीन रेड स्टेनिंग ने उसी प्रवृत्ति का पालन किया।

इसके बाद, संस्कृतियों को प्रारंभिक ओस्टोजेनिक मार्कर के रूप में एएलपी गतिविधि का आकलन करके उनकी ओस्टोजेनिक क्षमता के संदर्भ में विशेषता दी गई थी। सह-संस्कृति के दिन 4 और दिन 7 पर, ट्रिप्सिन के साथ हाइड्रोगेल को पचाकर कोशिकाओं को niches से पुनर्प्राप्त किया गया था। एएलपी गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए, पुनर्प्राप्त कोशिकाओं को लाइसिस किया गया था, और एक पीएनपीपी परख का प्रदर्शन किया गया था। प्राप्त मूल्यों को प्रत्येक नमूने के लिए कुल डीएनए के खिलाफ सामान्यीकृत किया गया था ताकि स्थितियों में सेल संख्या में संभावित अंतर को ध्यान में रखा जा सके। दरअसल, स्थितियों की डीएनए सामग्री के बीच छोटे अंतर देखे जा सकते हैं, और सबसे कम कोशिकाओं को बिना किसी विकास कारक (दिखाया नहीं गया) के बिना स्थिति से पुनर्प्राप्त किया गया था। सामान्यीकृत एएलपी गतिविधि, हालांकि, स्थितियों में बहुत भिन्न होती है, जिसमें बीएमपी -2 की उच्च सांद्रता और 100 एनजी / एमएल (चित्रा 4 ए, बी) पर पठार के साथ बढ़ती गतिविधि की प्रवृत्ति होती है। 50 एनजी/एमएल एफजीएफ-2 युक्त स्थिति के लिए सबसे कम गतिविधि स्तरों की पहचान की गई थी। जबकि मूल्यांकन किए गए दोनों समय बिंदुओं के लिए समान रुझान देखे जा सकते हैं, सभी मूल्यों में संस्कृति में दिन 4 से दिन 7 तक समय के साथ काफी वृद्धि हुई है। मात्रात्मक परख के अलावा, एएलपी गतिविधि को बीसीआईपी / एनबीटी सब्सट्रेट रूपांतरण के आधार पर प्रत्यक्ष रंग धुंधला का उपयोग करके गुणात्मक रूप से कल्पना की जा सकती है। एफजीएफ -2 (चित्रा 4 सी) की तुलना में बीएमपी -2 की उपस्थिति में अधिक व्यापक और अधिक तीव्र बैंगनी धुंधलापन देखा गया था।

विशेषता वाले ओस्टोजेनिक niches के दो संभावित अनुप्रयोगों को प्रदर्शित करने के लिए, एक सबूत-अवधारणा दवा संवेदनशीलता अध्ययन और कैंसर सह-संस्कृतियों का प्रदर्शन किया गया था। दवा संवेदनशीलता परख के लिए, बेवासिजुमैब या एक नियंत्रण समाधान जिसमें बेवासिजुमैब फॉर्मूलेशन का डिल्यूनेट शामिल था, को ताजा बीएमपी -2 युक्त संस्कृति माध्यम में जोड़ा गया था। दिन 4 पर, जब 50 एनजी / एमएल बीएमपी -2 की उपस्थिति में स्थापित नेटवर्क का गठन किया गया था, तो नियमित माध्यम परिवर्तन के दौरान या तो नियंत्रण समाधान या बेवासिजुमैब युक्त माध्यम जोड़ा गया था, और प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करके संस्कृतियों की निगरानी की गई थी। 10 μg / mL bevacizumab के अतिरिक्त पहले से गठित नेटवर्क की वापसी या पृथक्करण हुआ, जबकि नियंत्रण की स्थिति में अभी भी मध्यम परिवर्तन के 2 दिन बाद व्यापक नेटवर्क थे (चित्रा 5 ए, बी)। इन परिवर्तनों को दैनिक रूप से प्राप्त प्रतिदीप्ति छवियों पर इमेजजे के लिए एंजियोजेनेसिस विश्लेषक का उपयोग करके नेटवर्क की कुल लंबाई को ट्रैक करके भी निर्धारित किया जा सकता है (चित्रा 5 सी)। वैकल्पिक रूप से, नेटवर्क के गठन पर उनके प्रभाव का आकलन करने के लिए सह-संस्कृति की शुरुआत से बेवासिजुमैब या किसी अन्य यौगिक को भी जोड़ा जा सकता है। Bevacizumab के मामले में, इसने एंडोथेलियल नेटवर्क के गठन को पूरी तरह से रोक दिया (दिखाया नहीं गया)।

दूसरे आवेदन के लिए, एमडीए-एमबी -231 स्तन कैंसर या यू 2 ओएस ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं को 50 एनजी / एमएल बीएमपी -2 युक्त ताजा संस्कृति माध्यम में 1.5 x 103 कोशिकाओं / अच्छी तरह से घनत्व पर दिन 4 सह-संस्कृतियों में जोड़ा गया था। उन्हें जीएफपी-लेबल वाले एचयूवीईसी और गैर-लेबल एचबीएम-एमएससी से अलग करने के लिए, कैंसर कोशिकाओं को ओस्टोजेनिक niches पर सीडिंग से ठीक पहले सेलट्रेस फाररेड के साथ इनक्यूबेट किया गया था। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा संस्कृतियों की निगरानी की गई; शुरुआत में, अधिकांश कैंसर कोशिकाएं सब्सट्रेट की सतह के पास स्थानीयकृत होती हैं, लेकिन 2 दिनों के बाद, वे संवहनी सह-संस्कृतियों वाली परतों के करीब निकटता में पाई जा सकती हैं। इस प्रकार, दिन 2 को कैंसर कोशिकाओं और संवहनी आला के भीतर कोशिकाओं के बीच बातचीत की गतिशीलता दिखाने के लिए टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी के लिए शुरुआती बिंदु के रूप में चुना गया था। दिलचस्प बात यह है कि एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं को एंडोथेलियल संरचनाओं के करीब आने और दूर जाने दोनों को देखा जा सकता है और इस प्रकार, संभवतः उनके पर्यावरण की जांच या रीमॉडेलिंग कर रहे थे (चित्रा 5 डी)। कैंसर कोशिकाओं के लिए एक लेबल के रूप में सेलट्रेस फाररेड का उपयोग करते हुए, एचयूवीईसी के लिए एक लेबल के रूप में जीएफपी, और एफ-एक्टिन के लिए अतिरिक्त धुंधलापन, सभी सेल प्रकारों को कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (चित्रा 5 ई) का उपयोग करके अलग किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: संवहनी, ओस्टोजेनिक niches की विश्वसनीय पीढ़ी के लिए एक सरल दृष्टिकोण। गहराई से कठोरता ढाल के साथ प्री-कास्ट सिंथेटिक हाइड्रोगेल प्रत्यक्ष एनकैप्सुलेशन की आवश्यकता के बिना अनुक्रमिक सेल सीडिंग के माध्यम से 3 डी संस्कृतियों की पीढ़ी की अनुमति देते हैं। जीएफपी-व्यक्त करने वाले एचयूवीईसी को जोड़ने से पहले एचबीएम-एमएससी को 3 दिनों के लिए पूर्व-सुसंस्कृत किया जाता है। संस्कृतियों की निगरानी उज्ज्वल क्षेत्र और जीएफपी संकेतों को अनुदैर्ध्य रूप से प्राप्त करके की जाती है। चुनिंदा समय बिंदुओं पर, आला को उनके ईसीएम जमाव और ओस्टोजेनिक स्थिति के लिए आगे मूल्यांकन किया जाता है। क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि का मूल्यांकन सीधे रंग धुंधला होने के माध्यम से और आला से कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करके और सेल लाइसेट पर पीएनपीपी परख करके किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एफजीएफ -2 या बीएमपी -2 के साथ संवहनी जैसे नेटवर्क की उत्तेजना। (ए) विकास कारकों की अनुपस्थिति में या एफजीएफ -2 या बीएमपी -2 की उपस्थिति में उगाई गई कोशिकाओं की सह-संस्कृति के दिन 2, दिन 4 और दिन 6 पर ब्राइट-फील्ड और फ्लोरेसेंस (जीएफपी) छवियां प्राप्त की गईं, दोनों 50 एनजी / एमएल पर। स्केल बार: 400 μm. (B-D) सह-संस्कृति के दिन 4 पर चित्रित जीएफपी-एचयूवीईसी-नेटवर्क के परिमाणित पैरामीटर, इमेजजे के लिए एंजियोजेनेसिस विश्लेषक का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। डेटा को मानक विचलन ± माध्य के रूप में दर्शाया जाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म 9.5.1 का उपयोग करके किया गया था। डुनेट के कई तुलना परीक्षण के साथ एक साधारण एक-तरफ़ा एनोवा एन ≥ 4 के साथ किया गया था; * पी < 0.05; ** पी < 0.01; P < 0.001. (ई) एफजीएफ -2- (शीर्ष पंक्ति) और बीएमपी -2- (नीचे पंक्ति) उत्तेजित स्थितियों के लिए जीएफपी और एफ-एक्टिन संकेतों के कॉन्फोकल ढेर (कुल ऊंचाई: 547.5 μm; z-step: 2.5 μm) से उत्पन्न त्रि-आयामी पुनर्निर्माण। स्केल बार: 300 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: बीएमपी -2 द्वारा डी-स्थानीयकृत एचबीएम-एमएससी प्रसार और ईसीएम जमाव का प्रेरण। (ए-सी) एफजीएफ -2 या बीएमपी -2 की उपस्थिति में उगाए गए 7 दिवसीय सह-संस्कृतियों को (ए) इम्यूनोफ्लोरेसेंस या (बी, सी) प्रत्यक्ष रंग धुंधला करने के अधीन किया गया था। (ए) संस्कृतियों को एफ-एक्टिन और ईसीएम प्रोटीन फाइब्रोनेक्टिन, लैमिनिन, कोलेजन I और कोलेजन IV के लिए दाग दिया गया था। छवियां कॉन्फोकल ढेर के अधिकतम तीव्रता अनुमानों को दर्शाती हैं (कुल ऊंचाई: 100 μm; z-step: 5 μm)। स्केल बार: 200 μm. (B, C) संस्कृतियों को (B) Picrosirius Red और (C) Alizarin Red का उपयोग करके दाग दिया गया था। शीर्ष पंक्ति 2.5x आवर्धन (स्केल बार: 1,000 μm) पर प्राप्त छवियों के सिले हुए, पूरे-अच्छी तरह से अवलोकन को दर्शाती है, जबकि नीचे की पंक्ति 5x आवर्धन (स्केल बार: 400 μm) पर प्राप्त दृश्य के एक क्षेत्र को दर्शाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रत्यक्ष रंग धुंधलापन के माध्यम से बीएमपी -2-प्रेरित एएलपी गतिविधि का जैव रासायनिक मूल्यांकन। (ए, बी) एएलपी गतिविधि को विकास कारकों की अनुपस्थिति में उगाई गई संस्कृतियों के सेल लाइसेट में या विभिन्न सांद्रता में बीएमपी -2 या (ए) 4 दिनों या (बी) के लिए 50 एनजी / एमएल पर एफजीएफ -2 की उपस्थिति में निर्धारित किया गया था।) सह-संस्कृति के 7 दिन। एएलपी गतिविधि को प्रत्येक लाइसेट नमूने की डीएनए सामग्री के लिए सामान्यीकृत दिखाया गया है। डेटा को मानक विचलन ± माध्य के रूप में दर्शाया जाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म 9.5.1 का उपयोग करके किया गया था। डुनेट के कई तुलना परीक्षण के साथ एक साधारण एक-तरफ़ा एनोवा एन = 5 के साथ किया गया था; P < 0.0001. (ग) 7 दिनों के सह-संवर्धन के लिए 50 एनजी/एमएल एफजीएफ-2 या बीएमपी-2 की उपस्थिति में उगाए गए स्थानों में एएलपी गतिविधि का सीधा रंग धुंधला होना। बाईं ओर की छवियां 2.5x आवर्धन (स्केल बार: 1,000 μm) पर प्राप्त छवियों के पूरे-अच्छी तरह से अवलोकन को दर्शाती हैं, जबकि दाईं ओर की छवियां 5x आवर्धन (स्केल बार: 400 μm) पर प्राप्त दृश्य के एक क्षेत्र को दर्शाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: उन्नत कैंसर मॉडल में ओस्टोजेनिक, संवहनी niches का रोजगार। (ए) बीएमपी -2 की उपस्थिति में उगाई गई संस्कृतियों के जीएफपी संकेतों को सह-संस्कृति के दिन 4 पर चित्रित किया गया था, इससे पहले कि नियंत्रण समाधान (बाएं) या 10 μg / mL (दाएं) पर Bevacizumab को 2 दिनों के लिए जोड़ा गया था, जिसके बाद संस्कृतियों को फिर से चित्रित किया गया था (सह-संस्कृति का दिन 6)। स्केल बार: 600 μm. (B) Bevacizumab-उपचारित संस्कृतियों की उच्च आवर्धन छवियां A में दिखाई जाती हैं। स्केल बार: 250 μm. (C) ए में दिखाए गए एंडोथेलियल नेटवर्क की कुल लंबाई को दैनिक रूप से प्राप्त छवियों से इमेजजे के लिए एंजियोजेनेसिस विश्लेषक का उपयोग करके परिमाणित किया गया था; n ≥ 3. (डी) सेलट्रेस फाररेड-लेबल एमडीए-एमबी -231 स्तन कैंसर कोशिकाओं को बीएमपी -2 की उपस्थिति में उगाए गए 4 दिवसीय सह-संस्कृतियों में जोड़ा गया था, और कैंसर सेल जोड़ने के 2 दिन बाद समय-चूक छवियां प्राप्त की गई थीं। स्केल बार: 100 μm. (E) D में वर्णित और F-Actin के लिए स्थिर और दागदार ट्रिपल सह-संस्कृतियों के कॉन्फोकल ढेर (कुल ऊंचाई: 70 μm; z-step: 2.4 μm) की अधिकतम तीव्रता अनुमान। बाएं: एमडीए-एमबी -231 स्तन कैंसर कोशिकाओं की विशेषता वाले आला; दाएं: यू 2 ओएस ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं की विशेषता वाले niches। बाईं ओर छवियों के लिए स्केल सलाखों: 200 μm; दाईं ओर छवियों के लिए स्केल सलाखों: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहां, हम पूरी तरह से सिंथेटिक और नियंत्रणीय 3 डी पीईजी-आधारित मैट्रिक्स में अत्यधिक संवहनी हड्डी और अस्थि मज्जा आला के इन विट्रो मॉडल की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें अस्थि और अस्थि मज्जा जीव विज्ञान अनुसंधान, ऊतक इंजीनियरिंग और कैंसर अनुसंधान में विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोग हैं। यह मॉडल एक सिंथेटिक पीईजी-आधारित हाइड्रोगेल पर बनाता है जो आरजीडी पेप्टाइड्स और एमएमपी क्लीवेज साइटों के साथ कार्यात्मक है और ग्लास-बॉटम 96-वेल इमेजिंग प्लेटों30 पर गहराई से घनत्व ढाल के साथ डाला गया है। इस प्लग-एंड-प्ले प्लेटफॉर्म को हाइड्रोगेल में कोशिकाओं को समाहित करने की आवश्यकता के बिना अत्यधिक परस्पर जुड़े 3 डी सेलुलर नेटवर्क की स्थापना की अनुमति देने के लिए दिखाया गया था। पहले वर्णित सेल एनकैप्सुलेशन प्रोटोकॉल के समान, इस काम में, हम सेल प्रकार-विशिष्ट माइक्रोएन्वायरमेंट बनाने के लिए सेल-अंतर्निहित ईसीएम28 द्वारा सब्सट्रेट के रीमॉडेलिंग को दिखाते हैं। इस प्रकार, इस विधि के साथ, दवा स्क्रीनिंग परख और उच्च-सामग्री विश्लेषण आसानी से अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, ऑर्गेनोटाइपिक 3 डी संस्कृति स्थितियों के तहत किया जा सकता है। ग्लास-बॉटम 96-वेल प्लेट्स और ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी हाइड्रोगेल प्लेटफॉर्म को तरल हैंडलिंग स्वचालन और उच्च-थ्रूपुट माइक्रोस्कोपी के साथ संगत करते हैं।

ओस्टोजेनिक संवहनी अस्थि मज्जा आला उत्पन्न करने में पहला कदम कम से कम 3 दिनों के लिए पीईजी हाइड्रोगेल पर एचबीएम-एमएससी की पूर्व-संस्कृति है। इस समय के दौरान, वे हाइड्रोजेल से जुड़ते हैं, इसे भेदते हैं, और सेल-सेल संपर्क और ईसीएम जमाव स्थापित करना शुरू करते हैं। एचबीएम-एमएससी को सीडिंग करने से पहले, स्टोरेज बफर को हटा दिया जाना चाहिए। चूंकि हाइड्रोगेल 96-वेल इमेजिंग प्लेट के मानक कुएं के भीतर एक आंतरिक कुएं के अंदर स्थित है, इसलिए कुएं के किनारे आकांक्षा टिप डालना सुरक्षित है जब तक कि यह आंतरिक कुएं की अंगूठी को नहीं छूता है। एक वैक्यूम पंप का उपयोग आकांक्षा के लिए किया जा सकता है यदि इसे सबसे कम संभव चूषण बल पर सेट किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, आंतरिक वेल रिंग से कम से कम 0.8 मिमी ऊपर समायोजित नोजल ऊंचाई के साथ एक स्वचालित प्लेट वॉशर का उपयोग हाइड्रोगेल प्लेट से बफर को एस्पिरेट करने के लिए किया जा सकता है। तरल हैंडलिंग के लिए स्वचालन का उपयोग हाइड्रोगेल सतह को नुकसान को कम कर सकता है और परिणामस्वरूप संस्कृतियों की उच्च प्रजनन क्षमता का कारण बन सकता है। हाइड्रोजेल की सतह पर छोटे दोष दिखाई देते हैं जब कोशिकाएं हाइड्रोजेल पर बस जाती हैं और दोषपूर्ण हाइड्रोगेल क्षेत्रों में कम फोकस प्लेन पर दिखाई देती हैं। इसलिए, दिन 0 पर संदर्भ छवियों को प्राप्त करना सेल सीडिंग समरूपता और हाइड्रोगेल सतह अखंडता के लिए एक अच्छी गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। जबकि छोटे हाइड्रोगेल सतह दोष कुएं के आगे के उपयोग को नहीं रोकते हैं, कोशिकाएं दोषपूर्ण क्षेत्रों पर क्लस्टर करती हैं और गैर-प्रतिनिधि पैटर्न में बढ़ सकती हैं या अधिक तेज़ी से नीचे के ग्लास तक पहुंच सकती हैं, जहां वे एक मोनोलेयर में विकसित होती हैं। इन कुओं का उपयोग / मूल्यांकन करते समय इन कलाकृतियों पर ध्यान दिया जाना चाहिए। परख की पूरी अवधि के दौरान किए गए किसी भी माध्यम परिवर्तन के लिए समान विचार लागू होते हैं।

प्रोटोकॉल के दूसरे चरण में जीएफपी-एचयूवीईसी को पूर्व-गठित एचबीएम-एमएससी मोनोकल्चर (सह-संस्कृति का दिन 0) में जोड़ना शामिल है। एचबीएम-एमएससी द्वारा जमा ईसीएम एंडोथेलियल कोशिकाओं के विकास के लिए एक महान मचान प्रदान करता है, जो इस काम में, एचबीएम-एमएससी-वातानुकूलित माध्यम की उपस्थिति में भी, केवल हाइड्रोगेल पर गोल सेल क्लस्टर बना सकता है (दिखाया नहीं गया है)। एचबीएम-एमएससी संस्कृतियों पर बीज बोने पर, एचयूवीईसी माइक्रोवाइल जैसी संरचनाओं को एकीकृत करते हैं और सेल एनकैप्सुलेशन27,28 द्वारा उत्पन्न सह-संस्कृतियों में देखे गए संरचनाओं की तुलना में बनाते हैं। आमतौर पर, अच्छी तरह से विकसित 3 डी माइक्रोवस्कुलर-जैसे नेटवर्क सह-संस्कृति के 4 दिनों के भीतर बनते हैं, और इसे जीएफपी-लेबल एचयूवीईसी के उपयोग से अनुदैर्ध्य रूप से निगरानी की जा सकती है। इन संरचनाओं को संस्कृति में कम से कम 7 दिनों तक बनाए रखा जा सकता है, जिसका अर्थ है कि उपचार के जवाब में संवहनी नेटवर्क संगठन में परिवर्तन का पालन करने के लिए पर्याप्त समय है, जैसे कि एंटी-एंजियोजेनिक दवाओं की स्क्रीनिंग के लिए। एंडोथेलियल नेटवर्क के रूपात्मक तत्वों को अच्छी तरह से स्थापित उपकरणों का उपयोग करके जीएफपी छवियों को विभाजित करके बैच मोड में परिमाणित किया जा सकता है, जैसे कि इमेजजे33 के एंजियोजेनेसिस विश्लेषक प्लगइन, और उनके मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, दवा प्रभावकारिता और फार्माकोडायनामिक्स।

कई संभावित अनुप्रयोगों के लिए वर्णित सेलुलर मॉडल का एक महत्वपूर्ण लाभ इसकी प्लास्टिसिटी है। बस विभिन्न विकास कारकों के साथ संस्कृति माध्यम को पूरक करना सह-संस्कृति की उपस्थिति को बदल सकता है। उदाहरण के लिए, मोनो- और सह-संस्कृति अवधि में बीएमपी -2 की उपस्थिति एक ओस्टोजेनिक संवहनी आला बनाती है, जो एएलपी गतिविधि, बाह्य कैल्शियम जमाव, साथ ही ईसीएम असेंबली और जमाव में वृद्धि दिखाती है। इसके विपरीत, एफजीएफ -2 की उपस्थिति में, ओस्टोजेनिक मार्कर अनुपस्थित हैं, और सह-संस्कृति कम पार्श्व सेल एसोसिएशन बनाती है लेकिन अधिक स्पष्ट 3 डी सेल वृद्धि दिखाती है। तथ्य यह है कि एफजीएफ -2 एएलपी गतिविधि को दबा देता है जबकि बीएमपी -2 बिना किसी विकास कारक उपचार की तुलना में मजबूत एएलपी गतिविधि प्राप्त करताहै। फिर भी, एचबीएम-एमएससी स्ट्रोमल घटक में इन बड़े अंतरों के बावजूद, इस काम में दो विकास कारक-उपचारित स्थितियों के लिए माइक्रोवस्कुलर नेटवर्क की सीमा बहुत समान थी। नियंत्रण संस्कृतियों में, केवल कुछ छोटे संवहनी नेटवर्क का गठन किया गया, जो शायद एक खराब संवहनी अस्थि मज्जा आला का प्रतिनिधित्व करता है। इससे पता चलता है कि संस्कृति माध्यम में जोड़े गए विकास कारकों के प्रकार, एकाग्रता और समय को बदलकर, तुलनात्मक अध्ययन के लिए आवश्यक अच्छी तरह से परिभाषित संवहनी अस्थि मज्जा niches की एक श्रृंखला का उत्पादन किया जा सकता है। हालांकि, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि संस्कृति की प्रगति और आकृति विज्ञान उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं के इतिहास के आधार पर भिन्न हो सकती है (उदाहरण के लिए, नियमित संस्कृति रखरखाव के दौरान उपयोग की जाने वाली मार्ग संख्या और अलगाव विधि), और परख डिजाइन के दौरान ऐसे कारकों को नियंत्रित करना उचित है।

यहां, इस मॉडल के पहले आवेदन के रूप में, हम 10 μg / mL Bevacizumab के साथ उपचार के लिए इंजीनियर माइक्रोवस्कुलर नेटवर्क की संवेदनशीलता का प्रदर्शन करते हैं। विशेष रूप से, यह पुष्टि करना महत्वपूर्ण है कि उपयोग किया जाने वाला एल्गोरिदम एंडोथेलियल नेटवर्क को सटीक रूप से पहचान सकता है, क्योंकि कलाकृतियों को अक्सर खराब विकसित नेटवर्क वाली छवियों में उत्पन्न किया जाता है। यदि यह मामला है, तो छवि प्रसंस्करण (विभाजन से पहले और दौरान) के लिए उपयोग किए जाने वाले मापदंडों को अक्सर परीक्षण-और-त्रुटि के आधार पर ठीक करने की आवश्यकता होती है।

दूसरे आवेदन के रूप में, हम मेसेनकाइमल, एंडोथेलियल और कैंसर कोशिकाओं के अनुक्रमिक सीडिंग द्वारा गठित एक उन्नत सह-संस्कृति मॉडल प्रस्तुत करते हैं। यह मॉडल कैंसर कोशिकाओं, स्ट्रोमा और अस्थि मज्जा के वाहिका के बीच बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति देता है, जो मेटास्टेसिस के दौरान महत्वपूर्ण कारक हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, इस मॉडल का उपयोग दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों और एंजियोजेनेसिस से परे लक्ष्यों के साथ यौगिकों के परीक्षण के लिए किया जा सकता है।

2 डी संस्कृतियों में, कोशिकाओं को फिजियोलॉजिकल माइक्रोएनवायरनमेंटल सिग्नल प्राप्त नहीं होते हैं, स्वाभाविक रूप से होने वाली सेल आकृति विज्ञान प्राप्त नहीं करते हैं, और परिणामस्वरूप, देशी 3 डी वातावरण में कोशिकाओं की तुलना में अलग-अलग अंतर करतेहैं। जब इंजीनियर 3 डी हाइड्रोगेल में उगाया जाता है, तो कोशिकाएं एक अंतर्निहित ईसीएम जमा करती हैं, जो आसंजन साइट प्रदान करती है और सक्रिय रूप से 28,36 को फिर से तैयार किया जा सकता है। यहां, स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए एक सरलीकृत 3 डी मॉडल स्थापित करने के लिए, पोत बनाने वाली कोशिकाओं को इंजीनियर हाइड्रोगेल की सतह पर बीज दिया गया था और छिड़काव की अनुपस्थिति में संवहनी नेटवर्क स्थापित करने की अनुमति दी गई थी। संवहनी संरचनाओं में योगदान देने वाले एंडोथेलियल कोशिकाओं के 2 डी अनुमानों पर इमेजिंग-आधारित मूल्यांकन आयोजित किए गए थे। हालांकि, केवल कॉन्फोकल छवियों ने एफजीएफ -2-उत्तेजित नमूनों की तुलना में बीएमपी -2-उत्तेजित नमूनों में 3 डी संवहनी नेटवर्क की कम स्पष्ट वृद्धि का खुलासा किया। इससे पता चलता है कि गठित संवहनी संरचनाओं की लंबाई को कम करके आंका गया था, जबकि उनकी कनेक्टिविटी को कम करके आंका गया था। इसके अतिरिक्त, पेरिवास्कुलर और एंडोथेलियल कोशिकाओं और संवहनी लुमेन गठन के बीच बातचीत की जांच नहीं की गई है। इन पहलुओं, विशेष रूप से दवा उपचार प्रतिक्रियाओं के संदर्भ में, आगे ध्यान देने की आवश्यकता होगी। अंत में, पहले व्यापक 3 डी संवहनी नेटवर्क स्थापित करने के लिए परिष्कृत प्रोटोकॉल और उसके बाद ही उनके ओस्टोजेनिक भेदभाव को प्रेरित करना अधिक शारीरिक अस्थि और अस्थि मज्जा मॉडल उत्पन्न करने के लिए वांछनीय होगा।

कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत मॉडल अत्यधिक बहुमुखी है और इसे आसानी से विशिष्ट अनुप्रयोगों की ओर तैयार किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, विभिन्न स्रोतों से मेसेनकाइमल और एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है। यह ज्ञात है कि वसा ऊतक एमएससी और गर्भनाल एमएससी बीएम-एमएससी की तुलना में विभिन्न एंजियोजेनिक कारकों को व्यक्त करते हैं, और उन्हें आसानी से वैकल्पिक स्ट्रोमल घटक37 के रूप में प्रतिस्थापित किया जा सकता है। पहले से ही परिभाषित अस्थि मज्जा आला से अलग एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग एचयूवीईसी के बजाय भी किया जा सकता है। कोई व्यक्तिगत चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए रोगी-व्युत्पन्न, अस्थि मज्जा मेसेनकाइमल और एंडोथेलियल कोशिकाओं से मेल खाने वाले सह-संस्कृति के साथ सह-संस्कृति भी स्थापित कर सकता है, जैसा कि हाल ही में संवहनी मांसपेशी सह-संस्कृतियोंके लिए सुझाया गया है। इसके अतिरिक्त, हाइड्रोगेल प्लेट का डिज़ाइन उज्ज्वल-क्षेत्र और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी दोनों के साथ संस्कृति की अनुदैर्ध्य निगरानी की अनुमति देता है, इस प्रकार उपयोगकर्ता को आवेदन के आधार पर संस्कृति समय को छोटा या विस्तारित करने की संभावना प्रदान करता है। वैकल्पिक रूप से, सीडिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले सेल घनत्व को तदनुसार समायोजित किया जा सकता है ताकि सेल नेटवर्क के गठन में तेजी या देरी हो यदि इस प्रोटोकॉल की तुलना में कम या लंबे अवलोकन समय की आवश्यकता होती है। किसी भी मामले में, शीट जैसी संरचनाओं में सेल अतिवृद्धि से बचने के लिए सावधानी की आवश्यकता होती है, जिससे हाइड्रोगेल का संकुचन और अंततः सेल डिटेचमेंट हो सकता है।

अंत में, इस मॉडल का उपयोग करके परख की एक विस्तृत श्रृंखला का प्रदर्शन किया जा सकता है। जीवित या निश्चित संस्कृतियों में किए गए इम्यूनोफ्लोरेसेंस और माइक्रोस्कोपी के अलावा, 3 डी संस्कृतियों को एंजाइमेटिक रूप से पचाया जा सकता है, और कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त किया जा सकता है और किसी भी प्रकार के जैव रासायनिक परख के अधीन किया जा सकता है। फ्लोरोमेट्रिक परख का उपयोग करके सेल लाइसेट में एएलपी गतिविधि और डीएनए सामग्री परिमाणीकरण के निर्धारण का प्रदर्शन करते हैं, लेकिन सिस्टम पीसीआर, आरएनएसेक और प्रोटिओमिक्स सहित कई अन्य तकनीकों के साथ संगत है। यदि वांछित परख की संवेदनशीलता बहुत अधिक नहीं है, तो परख के लिए उपलब्ध नमूने की मात्रा बढ़ाने के लिए एक से अधिक कुएं से नमूने पूल कर सकते हैं। यदि वांछित अनुप्रयोग को तेजी से जेल विघटन की आवश्यकता होती है, तो प्लेट के कक्षीय झटकों को कुओं में भंवर गठन सुनिश्चित करने के लिए पाचन समाधान की छोटी मात्रा के साथ संयोजन में लागू किया जा सकता है, यह मानते हुए कि प्लेट पर सभी कुओं का उपयोग इस तरह से किया जाएगा (जीवित संस्कृतियां इस तरह के कठोर हैंडलिंग के प्रति संवेदनशील हैं)। सारांश में, हम यहां एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो यदि वर्णित के रूप में उपयोग किया जाता है, तो एक इन विट्रो मॉडल की पीढ़ी की गारंटी देता है जो ओस्टोजेनिक संवहनी niches के प्रमुख पहलुओं को पुन: प्रस्तुत करता है लेकिन दर्जी किए गए अनुप्रयोगों के लिए संशोधित होने के लिए पर्याप्त बहुमुखी भी है।

Disclosures

एक्टिका टेक्नोलॉजीज एजी 3डीप्रोसीड हाइड्रोगेल वेल प्लेट का निर्माता है और इसके वाणिज्यिक हित हैं। बेंजामिन आर सिमोना और मार्टिन एहरबार एक्टिका टेक्नोलॉजीज एजी के शेयरधारक हैं।

Acknowledgments

लेखक तरल हैंडलिंग उपकरणों के साथ तकनीकी सहायता के लिए रिकार्डो अर्बनेट और एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ समर्थन के लिए रोडी ओडाबासी को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 310030E_202429 और 205321_204318) और एक्टिका टेक्नोलॉजीज एजी द्वारा वित्तपोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-072
2 mL microtubes Eppendorf 30120094
2-Amino-2-methyl-1-propanol Sigma A9199
3DProSeed hydrogel well plate Ectica Technologies ECT.PS1.001.096
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate Sigma 71768
Alizarin Red S Sigma A5533
Anti-Collagen IV antibody Abcam ab6311
Anti-Laminin 1+2 antibody Abcam ab7463
Automated plate washer Agilent Biotek ELχ50
Automated washer/dispenser Agilent Biotek MULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette
Bevacizumab Evidentic ID PS-E07-2019-00119 A009
BMP-2 Peprotech 120-02C
BSA AppliChem A1391
Centrifuge Eppendorf 5415 R To centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis
Confocal laser scanning microscope Leica Stellaris 5
Conical 50 mL centrifuge tubes TPP 91050
DAPI Sigma D9542
DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) Antibody Biolegend 406406
DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody Biolegend 405312
EGM-2 Lonza CC-3162
Epifluorescence microscope Leica DMI6000B
FBS Gibco 10500-064
FGF-2 Peprotech 100-18B
Fibronectin (IST-9) Santa Cruz sc-59826
GFP-HUVECs PELOBiotech PB-CAP-0001GFP
hBM-MSCs - - Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359
Inverted microscope Zeiss 200M
Magnesium chloride Sigma M8266
MDA-MB-231 breast cancer cell line - Kindly obtained from J Massagué at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center
MEMα Gibco 22571-038
Multimode imaging reader Agilent Biotek Cytation 1 For automated imaging
Multimode imaging reader - fluorescence and absorbance Agilent Biotek Cytation 5 For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis
Paraformaldehyde Artechemis US 040
PBS Gibco 10010-015
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Phalloidin-rhodamine Invitrogen R415
Picro-Sirius Red Solution Abcam ab246832
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit ThermoFisher Scientific P7589
Recombinant Anti-Collagen I antibody Abcam ab260043
SIGMAFAST BCIP/NBT Sigma B5655-25TAB
Sodium hydroxide Sigma 1064981000
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Sigma S-0876
Sodium phosphate monobasic, monohydrate Merck 1.06346
Triton X-100 Sigma T8787
Tween20 AppliChem A4974
U2OS osteosarcoma cell line - Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich 
α-trehalose dihydrate Sigma 90208

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References

  1. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
  2. Calvi, L. M., Link, D. C. Cellular complexity of the bone marrow hematopoietic stem cell niche. Calcified Tissue International. 94 (1), 112-124 (2014).
  3. Behrmann, L., Wellbrock, J., Fiedler, W. Acute myeloid leukemia and the bone marrow niche-take a closer look. Frontiers in Oncology. 8, 444 (2018).
  4. Yip, R. K. H., et al. Mammary tumour cells remodel the bone marrow vascular microenvironment to support metastasis. Nature Communications. 12 (1), 6920 (2021).
  5. Potente, M., Makinen, T. Vascular heterogeneity and specialization in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 477-494 (2017).
  6. Augustin, H. G., Koh, G. Y. Organotypic vasculature: From descriptive heterogeneity to functional pathophysiology. Science. 357 (6353), (2017).
  7. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  8. Barillari, G. The anti-angiogenic effects of anti-human immunodeficiency virus drugs. Frontiers in Oncology. 10, 806 (2020).
  9. Owen, M., Friedenstein, A. J. Stromal stem-cells - Marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Foundation Symposia. 136, 42-60 (1988).
  10. Sacchetti, B., et al. Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment. Cell. 131 (2), 324-336 (2007).
  11. Traore, M. A., George, S. C. Tissue engineering the vascular tree. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 23 (6), 505-514 (2017).
  12. Bessy, T., Itkin, T., Passaro, D. Bioengineering the bone marrow vascular niche. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 645496 (2021).
  13. Bray, L. J., et al. A three-dimensional ex vivo tri-culture model mimics cell-cell interactions between acute myeloid leukemia and the vascular niche. Haematologica. 102 (7), 1215-1226 (2017).
  14. Montano, I., et al. Formation of human capillaries in vitro: The engineering of prevascularized matrices. Tissue Engineering Part A. 16 (1), 269-282 (2010).
  15. Sun, Z. Y., Kemp, S. S., Lin, P. K., Aguera, K. N., Davis, G. E. Endothelial k-RasV12 expression induces capillary deficiency attributable to marked tube network expansion coupled to reduced pericytes and basement membranes. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 42 (2), 205-222 (2022).
  16. Kleinman, H. K., et al. Basement-membrane complexes with biological-activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).
  17. Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement-membrane in the morphological-differentiation of human-endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
  18. Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods in Molecular Biology. 1066, 17-28 (2013).
  19. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).
  20. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  21. Wang, X. L., et al. Engineering anastomosis between living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Lab on a Chip. 16 (2), 282-290 (2016).
  22. Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
  23. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature Biotechnology. 23 (1), 47-55 (2005).
  24. Kyburz, K. A., Anseth, K. S. Synthetic mimics of the extracellular matrix: How simple is complex enough. Annals of Biomedical Engineering. 43 (3), 489-500 (2015).
  25. Ehrbar, M., et al. Enzymatic formation of modular cell-instructive fibrin analogs for tissue engineering. Biomaterials. 28 (26), 3856-3866 (2007).
  26. Ehrbar, M., et al. Biomolecular hydrogels formed and degraded via site-specific enzymatic reactions. Biomacromolecules. 8 (10), 3000-3007 (2007).
  27. Blache, U., et al. Dual role of mesenchymal stem cells allows for microvascularized bone tissue-like environments in PEG hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 5 (4), 489-498 (2016).
  28. Blache, U., et al. Notch-inducing hydrogels reveal a perivascular switch of mesenchymal stem cell fate. Embo Reports. 19 (8), e45964 (2018).
  29. Simona, B. R., et al. Density gradients at hydrogel interfaces for enhanced cell penetration. Biomaterials Science. 3 (4), 586-591 (2015).
  30. Zhang, N., et al. Soft hydrogels featuring in-depth surface density gradients for the simple establishment of 3d tissue models for screening applications. SLAS Discovery. 22 (5), 635-644 (2017).
  31. Martin, I., Muraglia, A., Campanile, G., Cancedda, R., Quarto, R. Fibroblast growth factor-2 supports ex vivo expansion and maintenance of osteogenic precursors from human bone marrow. Endocrinology. 138 (10), 4456-4462 (1997).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Carpentier, G., Martinelli, M., Courty, J., Cascone, I. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. 4th ImageJ User and Developer Conference. , Mondorf-les-Bains, Luxembourg. 198-201 (2012).
  34. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  35. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  36. Loebel, C., Mauck, R. L., Burdick, J. A. Local nascent protein deposition and remodelling guide mesenchymal stromal cell mechanosensing and fate in three-dimensional hydrogels. Nature Materials. 18 (8), 883-891 (2019).
  37. Curtis, M. B., Kelly, N., Hughes, C. C. W., George, S. C. Organotypic stromal cells impact endothelial cell transcriptome in 3D microvessel networks. Scientific Reports. 12 (1), 20434 (2022).
  38. Wust, R., Terrie, L., Muntefering, T., Ruck, T., Thorrez, L. Efficient co-isolation of microvascular endothelial cells and satellite cell-derived myoblasts from human skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 964705 (2022).

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बायोइंजीनियरिंग अंक 195 हाइड्रोगेल अस्थि मज्जा संवहनी आला एंजियोजेनेसिस ओस्टियोजेनेसिस इन विट्रो माइक्रोएन्वायरमेंट फेनोटाइपिक ड्रग स्क्रीनिंग ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट।
इमेजिंग माइक्रोप्लेट में प्री-कास्ट पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल) (पीईजी) हाइड्रोगेल का उपयोग करके एक संवहनी ओस्टोजेनिक अस्थि मज्जा आला की सरल स्थापना
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Krattiger, L. A., Mitsi, M., Simona, B. R., Ehrbar, M. Simple Establishment of a Vascularized Osteogenic Bone Marrow Niche Using Pre-Cast Poly(ethylene Glycol) (PEG) Hydrogels in an Imaging Microplate. J. Vis. Exp. (195), e65413, doi:10.3791/65413 (2023).

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