Summary
Een in vitro model van de vasculaire niche van het beenmerg wordt vastgesteld door mesenchymale en endotheelcellen te zaaien op pre-cast 3D PEG-hydrogels. De endotheelnetwerken, ECM-componenten en ALP-activiteit van de niches variëren afhankelijk van de gebruikte groeifactor. Het platform kan worden gebruikt voor geavanceerde kankermodellen.
Abstract
Het bot en beenmerg zijn sterk gevasculariseerde en structureel complexe organen en zijn plaatsen voor de vorming van kanker en metastase. In vitro modellen die bot- en beenmergspecifieke functies samenvatten, waaronder vascularisatie, die compatibel zijn met geneesmiddelenscreening, zijn zeer wenselijk. Dergelijke modellen kunnen de kloof overbruggen tussen simplistische, structureel irrelevante tweedimensionale (2D) in vitro modellen en de duurdere, ethisch uitdagende in vivo modellen. Dit artikel beschrijft een controleerbare driedimensionale (3D) co-cultuur assay op basis van engineered poly(ethyleenglycol) (PEG) matrices voor het genereren van gevasculariseerde, osteogene beenmergniches. Het PEG-matrixontwerp maakt de ontwikkeling van 3D-celculturen mogelijk door middel van een eenvoudige celzaaistap die geen inkapseling vereist, waardoor de ontwikkeling van complexe co-cultuursystemen mogelijk wordt. Bovendien zijn de matrices transparant en voorgegoten op 96-well beeldvormingsplaten met glazen bodem, waardoor het systeem geschikt is voor microscopie. Voor de hier beschreven test worden menselijke mesenchymale stromale cellen (hBM-MSCs) van het beenmerg eerst gekweekt totdat een voldoende ontwikkeld 3D-celnetwerk is gevormd. Vervolgens worden GFP-tot expressie brengende menselijke navelstreng-endotheelcellen (HUVECs) toegevoegd. De cultuurontwikkeling wordt gevolgd door bright-field en fluorescentiemicroscopie. De aanwezigheid van het hBM-MSC-netwerk ondersteunt de vorming van vaatachtige structuren die zich anders niet zouden vormen en die minstens 7 dagen stabiel blijven. De mate van vaatachtige netwerkvorming kan eenvoudig worden gekwantificeerd. Dit model kan worden afgestemd op een osteogene beenmergniche door het kweekmedium aan te vullen met botmorfogenetisch eiwit 2 (BMP-2), dat de osteogene differentiatie van de hBM-MSC's bevordert, zoals beoordeeld door verhoogde alkalische fosfatase (ALP) activiteit op dag 4 en dag 7 van co-cultuur. Dit cellulaire model kan worden gebruikt als een platform voor het kweken van verschillende kankercellen en het bestuderen van hoe ze interageren met bot- en beenmergspecifieke vasculaire niches. Bovendien is het geschikt voor automatisering en analyses met een hoog gehalte, wat betekent dat het screening op kankergeneesmiddelen onder zeer reproduceerbare kweekomstandigheden mogelijk zou maken.
Introduction
Het bot en beenmerg zijn structureel en functioneel complexe organen die centraal staan in de menselijke gezondheid. Dit wordt weerspiegeld door het bestaan van verschillende niches die hematopoëse en botonderhoud reguleren1. Het is nu algemeen aanvaard dat in gezond beenmerg het onderhoud en de uitbreiding van hematopoëtische en skeletstamcellen, evenals hun nakomelingen, worden gecontroleerd door verschillende niches. Deze niches omvatten verschillende celtypen, waaronder osteolineagecellen, mesenchymale stamcellen, endotheel- en perivasculaire cellen, neuronale en gliacellen, adipocyten, osteoclasten, macrofagen en neutrofielen2. Het is niet verrassend dat deze meestal vasculatuur-geassocieerde niches ook betrokken zijn bij de ontwikkeling van verschillende soorten leukemie3 en de plaats zijn van metastase voor verschillende kankers4. Vanwege zijn specifieke rollen in botvorming, remodellering en bot(merg) onderhoud, heeft de bot-geassocieerde vasculatuur verschillende gespecialiseerde structuren die verschillen van de vasculatuur die elders in het lichaam wordt aangetroffen 5,6,7. Anti-angiogene of vasculatuurmodulerende geneesmiddelen die systemisch worden toegepast, kunnen dus verschillende effecten hebben binnen deze gespecialiseerde omgevingen8. Daarom zijn modellen om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die betrokken zijn bij het behoud van de fysiologische eigenschappen van bot en beenmerg, bot- en beenmergregeneratie en reacties op therapeutische behandelingen zeer wenselijk.
Klassieke tweedimensionale (2D) weefselculturen en in vivo onderzoeken met behulp van diermodellen hebben onschatbare inzichten opgeleverd in de rollen van verschillende cellen en moleculaire spelers die betrokken zijn bij de ontwikkeling van bot en beenmerg 9,10. Modellen die experimenten met hoge doorvoer met relevante menselijke cellen mogelijk maken, kunnen ons begrip van het moduleren van geselecteerde parameters in deze zeer complexe systemen verbeteren.
In het afgelopen decennium zijn principes afgeleid van tissue engineering gebruikt om 3D-weefselmodellen te genereren11,12. Deze zijn meestal gebaseerd op de inkapseling van weefselrelevante cellen in biomaterialen om 3D-mono- of coculturen te vormen13. Tot de meest gebruikte biomaterialen behoren fibrine 14, collageen15 en Matrigel16,17, die allemaal zeer biocompatibel zijn en geschikte omstandigheden bieden voor de groei van vele celtypen. Deze biomaterialen hebben het vermogen om in vitro modellen te genereren die de belangrijkste aspecten van de verschillende vasculaire niches in vivo18 samenvatten. Bovendien heeft het gebruik van microfluïdische apparaten om perfuseerde vasculaire bot- en beenmergmodellen te genereren bijgedragen aan het genereren van in vitro modellen met een hogere complexiteit 19,20,21,22.
De moeilijkheid om de samenstelling en engineering van de eigenschappen van natuurlijk voorkomende biomaterialen te beheersen, heeft de ontwikkeling van synthetische analogen geïnspireerd die rationeel kunnen worden ontworpen met voorspelbare fysische, chemische en biologische eigenschappen23,24. We hebben volledig synthetische factor XIII (FXIII) cross-linked poly (ethyleenglycol) (PEG) -gebaseerde hydrogels ontwikkeld, die zijn gefunctionaliseerd met RGD-peptiden en matrix metalloprotease (MMP) splitsingsplaatsen om celaanhechting en remodelleringte vergemakkelijken 25,26. Het modulaire ontwerp van deze biomaterialen is met succes gebruikt om de omstandigheden voor de vorming van 3D-gevasculariseerde bot- en beenmergmodellente optimaliseren 27,28.
Voor het testen van grotere aantallen verschillende kweekcondities en nieuwe therapieën zijn modellen met een hogere doorvoercapaciteit vereist. We hebben onlangs aangetoond dat de FXIII-crosslinking van onze PEG-hydrogel kan worden gecontroleerd door middel van een elektrochemisch proces, zodat een diepgaande hydrogelstijfheidsgradiënt wordt gevormd29. Wanneer cellen bovenop dergelijke hydrogels worden toegevoegd, migreren ze naar het binnenste en ontwikkelen ze zich geleidelijk tot sterk onderling verbonden 3D-cellulaire netwerken30. De eliminatie van de noodzaak om cellen in te kapselen in de hydrogel, die meestal aanwezig is bij andere 3D-steigers, vereenvoudigt niet alleen het experimentele ontwerp, maar maakt ook de sequentiële toevoeging van verschillende celtypen op verschillende tijdstippen mogelijk om complexe co-cultuursystemen te genereren. Deze hydrogels zijn beschikbaar voorgegoten op 96-well beeldvormingsplaten met glazen bodem, waardoor het opzetten van 3D-culturen haalbaar is door zowel handmatige als geautomatiseerde celzaaiprotocollen. De optische transparantie van de PEG hydrogels maakt het platform compatibel met microscopie.
Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het genereren en karakteriseren van gevasculariseerde osteogene niches binnen dit kant-en-klare, synthetische plug-and-play-platform. We laten zien dat de ontwikkeling van vasculaire netwerken kan worden gestimuleerd met een groeifactor die vaak wordt gebruikt voor het induceren van in vitro osteogenese, botmorfogenetisch eiwit-2 (BMP-2), terwijl osteogene differentiatie kan worden voorkomen door suppletie van fibroblastgroeifactor 2 (FGF-2)27,31. De gevormde netwerken zijn anders in vergelijking met FGF-2-gestimuleerde netwerken in termen van het algehele uiterlijk, evenals de cel- en ECM-distributie. Bovendien hebben we de osteogene inductie gemonitord met alkalische fosfatase als marker. We tonen de verhoogde expressie van deze marker in de loop van de tijd en vergelijken de expressie met die in FGF-2 gestimuleerde netwerken met behulp van kwalitatieve en kwantitatieve methoden. Ten slotte tonen we de geschiktheid van de gegenereerde niches van dit model voor twee potentiële toepassingen. Ten eerste voerden we een proof-of-concept medicijngevoeligheidstest uit door bevacizumab toe te voegen aan voorgevormde niches en de afbraak van de vasculaire netwerken in zijn aanwezigheid te volgen. Ten tweede hebben we MDA-MB-231 borstkanker en U2OS osteosarcoomcellen toegevoegd aan voorgevormde osteogene niches, waaruit blijkt dat de niches kunnen worden gebruikt om interacties tussen kankercellen en hun omgeving te bestuderen.
Protocol
Figuur 1 geeft een overzicht van de volgende protocolsecties.
1. Opzetten van de 3D stromale monocultuur
- Bereid de hBM-MSC-celsuspensie voor.
- Kweek hBM-MSCs tot een samenvloeiingsniveau van 70% -90% in MEMα aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine en 5 ng / ml FGF-2 in een couveuse bij 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde atmosfeer. De cellen kunnen worden gebruikt tot passage 6.
- Was de cellen met PBS en maak ze los met 0,05% Trypsine-EDTA gedurende 3-5 minuten bij 37 °C. Stop het loslatingsproces door te spoelen met basaal medium (MEMα aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine). Verzamel de gesuspendeerde cellen in een conische centrifugebuis van 50 ml.
- Tel de cellen met behulp van een hematocytometer of een geautomatiseerde celteller en bepaal het totale aantal cellen in de suspensie.
- Pellet de cellen door centrifugeren op 200 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant voorzichtig.
- Resuspendie van de cellen in een geschikt volume basaal medium om een concentratie van 1 x 107 cellen/ml stockoplossing te bereiken.
- Bereid conische centrifugebuizen van 50 ml met het vereiste volume basaal medium aangevuld met de respectieve groeifactoren (FGF-2 en BMP-2 bij gedefinieerde concentraties, bijvoorbeeld 0 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml, 100 ng / ml of 200 ng / ml). Per put is 200 μL nodig. Als het zaaien van cellen moet worden uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde vloeistofhandler, moet u ook rekening houden met het dode volume van het instrument. Voor handmatig celzaaien is een volumeoverschot van 10% voldoende.
- Voeg de hBM-MSCs uit de stamoplossing toe in een verdunning van 1:66,67 om een concentratie van 1,5 x 105 cellen/ml te bereiken.
- Bereid het bord voor op het zaaien.
- Verwijder de polypropyleen kleeffilm die de 96-well hydrogelplaat bedekt.
- Zuig voorzichtig de opslagbuffer op die de hydrogels bedekt. Gebruik voor deze taak een microplaatwasser; handmatige bediening is echter mogelijk.
- Wanneer u een handmatige aspirator of meerkanaalspipet gebruikt, plaatst u de punt tegen de wand van de put en beweegt u langzaam naar de rand van de binnenste put terwijl u de buffer aanzuigt. Dit voorkomt beschadiging van het hydrogeloppervlak.
- Bij gebruik van een geautomatiseerde platenwasser stelt u de aanzuigmondstukken in op ten minste 3,8 mm van de plaatdrager (dit komt overeen met 0,8 mm van de binnenring van de hydrogelplaat) en in de richting van de rand van de put. Raadpleeg de handleiding van de fabrikant voor meer gedetailleerde instructies en om de plaattekeningen van de 96-well hydrogelplaat te verkrijgen.
- Voeg na grondig mengen 200 μl/put van de in stap 1.1.7 bereide celsuspensie toe om ervoor te zorgen dat de cellen homogeen verdeeld zijn. Tijdens het zaaien, om ongelijke sedimentatie van de cellen in één gebied van het substraat te voorkomen, mag u de plaat niet kantelen. Voor handmatig zaaien, meng periodiek de celsuspensie (na het zaaien van drie putjes) om het mengsel homogeen te houden. Voor geautomatiseerd zaaien, meng met een serologische pipet onmiddellijk voor het doseren om volumes met gelijke aantallen cellen af te geven.
- Houd de culturen op 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde atmosfeer.
- Volg de ontwikkeling van de culturen door middel van bright-field microscopie met een 5x objectief naar wens. Verkrijg referentiebeelden ongeveer 30 minuten na het zaaien om het aantal toegevoegde cellen te evalueren.
2. Het opzetten van de 3D stromaal-endotheelcel co-cultuur
- Bereid de GFP-HUVEC celsuspensie voor.
- Bereid kolven voor de HUVEC-cultuur door gedurende 30 minuten bij 37 °C te bekleden met een oplossing bestaande uit 150 μg/ml rattenstaartcollageen I in 0,02 M azijnzuur. Spoel eenmaal af met PBS voor gebruik.
- Kweek de GFP-HUVECs tot een samenvloeiingsniveau van 80%-100% in EGM-2 aangevuld met 10% FBS in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde atmosfeer. De cellen mogen gebruikt worden tot passage 7.
- Was de cellen met PBS en maak ze los met 0,05% Trypsine-EDTA gedurende 2-3 minuten bij 37 °C. Stop het loslatingsproces door te spoelen met basaal medium (MEMα aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine). Verzamel de gesuspendeerde cellen in een conische centrifugebuis van 50 ml.
- Tel de cellen met behulp van een hematocytometer of een geautomatiseerde celteller en bepaal het totale aantal cellen dat in de suspensie aanwezig is.
- Pellet de cellen door centrifugeren op 200 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant voorzichtig.
- Resuspendie van de cellen in een geschikt volume basaal medium om een concentratie van 1 x 107 cellen/ml stockoplossing te bereiken.
- Bereid 50 ml conische centrifugebuizen met het vereiste volume basaal medium aangevuld met de respectieve groeifactoren (FGF-2 en BMP-2 bij gedefinieerde concentraties, bijvoorbeeld 0 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml, 100 ng / ml of 200 ng / ml) zoals beschreven voor de hBM-MSC's in stap 1.1.6.
- Voeg de GFP-HUVECs uit de stamoplossing toe in een verdunning van 1:66,67 om een concentratie van 1,5 x 105 cellen/ml te bereiken, zoals beschreven voor de hBM-MSCs in stap 1.1.7.
- Zuig het medium op van de plaat die de stromale monocultuur bevat, zoals beschreven voor de bufferverwijdering in stap 1.2.2.
- Voeg 200 μl/put van de GFP-HUVEC-celsuspensie toe die is voorbereid in stap 2.1.8, zoals beschreven voor de hBM-MSC-toevoeging in stap 1.3.
- Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde atmosfeer. Verander het medium elke 3-4 dagen.
- Volg de ontwikkeling van de cultuur door middel van bright-field en fluorescentiemicroscopie met behulp van een 5x objectief naar wens. Handhaaf de culturen tot dag 4 of dag 7 van de co-cultuur voor respectievelijk vroege of tussentijdse karakteriseringen, of naar wens.
3. Karakteriseringsprocedure 1: Kwantificering van de vorming van endotheelcelnetwerken
- Verkrijg op de gewenste tijdstippen het GFP-signaal van de GFP-HUVECs met fluorescentiemicroscopie met behulp van instellingen die geschikt zijn voor kwantificering (d.w.z. beste focus, hoog contrast en lage vergroting [bijv. 5x] voor grotere gezichtsvelden).
- Voorbewerk alle afbeeldingen die op dezelfde dag zijn verkregen (bijvoorbeeld met Fiji32) om het contrast verder te verbeteren. Merk op dat het GFP-signaal met de kweektijd zwakker kan worden; Daarom kunnen afbeeldingen die op verschillende dagen zijn verkregen, verschillende verwerking nodig hebben.
- Als u Fiji of ImageJ gebruikt, opent u alle GFP-kanaalafbeeldingen van hetzelfde tijdstip en opent u het menu Helderheid en contrast . Selecteer een afbeelding die een tussenliggende toestand vertegenwoordigt (niet het zwakste en niet het helderste signaal) en pas het contrast automatisch aan door Automatisch te selecteren. Selecteer Instellen en schakel Doorgeven naar alle andere geopende afbeeldingen in.
- Beoordeel visueel of het automatisch geselecteerde bereik geschikt is voor alle afbeeldingen van het huidige tijdstip en pas handmatig opnieuw aan en geef het indien nodig opnieuw door aan alle afbeeldingen.
- Sla de aangepaste afbeeldingen op als TIF-bestanden en herhaal stap 3.2.1 en stap 3.2.2 voor de andere verkregen tijdstippen.
- Pas een mediane vervagingsfilter (bijvoorbeeld straal 3 voor 2048x2048-afbeeldingen) toe op alle afbeeldingen om artefactherkenning stroomafwaarts te voorkomen en zo nauwkeurige netwerkidentificatie te vergemakkelijken. Verklein de grootte door te binnen (2x2) en sla alle voorbewerkte afbeeldingen op als grijswaarden RGB Color TIF-bestanden in een map voor kwantificering. Deze stappen kunnen handmatig of in batchmodus worden uitgevoerd met behulp van macro's die de auteurs op verzoek zullen delen.
- Analyseer alle afbeeldingen in de map die is gemaakt in stappen 3.1-3.3 met behulp van de batchprocesmodus in de Angiogenesis Analyzer voor ImageJ33. Houd er rekening mee dat, afhankelijk van de grootte van de afbeeldingen en het beschikbare werkgeheugen, dit enkele minuten per afbeelding kan duren.
- Valideer de kwantificeringsresultaten door de overlays van de herkende structuren en de originele afbeeldingen te onderzoeken. Als het algoritme kunstmatige structuren herkent, waarbij slechts enkele of geen cellen in de oorspronkelijke afbeelding te zien zijn, past u de voorbewerkingsparameters aan en analyseert u de oorspronkelijke afbeeldingen opnieuw, of sluit u dergelijke problematische gebieden uit en / of repliceert u afbeeldingen uit de analyse.
- Normaliseer de verkregen waarden tot een oppervlakte van 1 mm 2 door de waarden van elk monster te vermenigvuldigen met de verhouding van het geanalyseerde gebied tot 1 mm2. Deze stap is met name van belang als afbeeldingen van verschillende groottes worden gebruikt.
- Haal verschillende netwerkparameters, zoals de totale netwerklengte, het aantal knooppunten, het aantal segmenten, het aantal geïsoleerde segmenten, het vertakkingsinterval en de gemiddelde maaswijdte, uit de analyse en gebruik ze om het endotheelnetwerk op verschillende tijdstippen en onder verschillende cultuuromstandigheden te karakteriseren.
4. Karakteriseringsprocedure 2: Beoordeling van ECM-depositie
- Beoordeel op de gewenste eindtijdpunten de ECM-depositie met behulp van immunofluorescentie. Voeg primaire antilichamen tegen verschillende ECM-moleculen toe in 100 μL van het kweekmedium tijdens de laatste 6 uur van de kweek of na fixatie, zoals hieronder beschreven.
- Was de culturen eenmaal met 200 μL/put PBS gedurende 5 minuten bij RT en fixeer ze met 100 μL/put van 4% paraformaldehyde onder een chemische zuurkast gedurende 30 minuten bij RT. Merk op dat het wordt geadviseerd om alle putjes van een plaat tegelijkertijd te fixeren, omdat de omliggende culturen tijdens deze stap kunnen worden beschadigd. Was de vaste culturen met 200 μL/put PBS bij RT driemaal gedurende 5 minuten per keer, en bewaar bij 4 °C in 200 μL/putje PBS, of ga onmiddellijk verder met de volgende stap.
- Voordat u na fixatie met primaire antilichamen tegen ECM-moleculen incubeert, incubeert u de vaste culturen met 200 μL/put van 1% BSA in PBS als een blokkerende oplossing gedurende 30 minuten bij RT.
- Zuig de blokkerende oplossing aan en incubeer met 100 μL/put van de primaire antilichaamoplossing in 1% BSA in PBS gedurende een nacht bij 4 °C. Was met 200 μL/put PBS driemaal gedurende 5 min, ten minste 3 uur en 5 minuten, respectievelijk, bij RT.
OPMERKING: De lange wasstap is vereist voor de volledige diffusie van het ongebonden antilichaam uit de hydrogel.
- Zuig de blokkerende oplossing aan en incubeer met 100 μL/put van de primaire antilichaamoplossing in 1% BSA in PBS gedurende een nacht bij 4 °C. Was met 200 μL/put PBS driemaal gedurende 5 min, ten minste 3 uur en 5 minuten, respectievelijk, bij RT.
- Om de penetratie van de secundaire kleuringsoplossing, inclusief intracellulaire contrastains, te vergemakkelijken, permeabiliseert u de culturen met behulp van 0,3% Triton X-100 en 1% BSA in PBS gedurende 30-90 minuten bij RT, afhankelijk van de cellulaire dichtheid van de culturen.
OPMERKING: Voor de op antilichamen gebaseerde kleuring van intracellulaire moleculen moet deze stap worden uitgevoerd vóór de incubatie met het primaire antilichaam zoals beschreven in stap 4.1.2. - Bereid secundaire kleuringsoplossingen die de respectievelijke secundaire antilichamen en tegenstains naar wens bevatten (bijv. Een nucleaire kleuring zoals DAPI en een cytoskeletachtige kleuring zoals falloidine-rhodamine).
- Bereid een kleuringsbuffer voor bestaande uit 0,1% Triton X-100, 1% BSA in PBS en contrastains (bijv. 1 μg / ml DAPI en 1: 4.000 falloidine-rhodamine) en voeg de respectieve secundaire antilichamen toe bij de aanbevolen verdunningen.
- Voeg 100 μL/put secundaire kleuringsoplossing toe en incubeer een nacht bij 4 °C. Vergelijkbaar met de procedure na de primaire antilichaamincubatie, wassen met 200 μL / put van PBS driemaal gedurende 5 minuten, ten minste 3 uur en 5 minuten, respectievelijk, bij RT.
- Voor het 3D-oplossen van de structuren verkrijgt u confocale stapels vanaf de glazen bodem met een z-stap van 2,5 μm die een uiteindelijke hoogte van 500 μm bereikt, gebruikt u een objectief van 10x en een digitale zoom van 0,75x. Om een 3D-reconstructie van het GFP- en F-actinesignaal in Fiji te genereren, drempelt u elk kanaal afzonderlijk voordat u een composiet maakt en de reconstructie genereert met behulp van Fiji 3D Viewer.
- Voor de visualisatie van de gedeponeerde ECU van de immunostainings, verkrijg confocale stapels van een hoogte van 100 μm met een z-stap van 5 μm, een 10x objectief en een 1,5x digitale zoom. Genereer projecties met maximale intensiteit en pas de helderheid en het contrast voor elk kanaal afzonderlijk in Fiji aan voordat u een compositie maakt.
- Voer directe kleurkleuringen uit van de extracellulaire omgeving.
- Voeg 200 μL/put Picrosirius Red kleuringsoplossing toe aan de paraformaldehyde-gefixeerde putjes en incubeer gedurende 1 uur bij RT.
- Was vervolgens de bevlekte putten vijf keer met gedestilleerd water, gevolgd door twee keer per dag of elke tweede dag gedurende 3-4 dagen te wassen terwijl u de kleurzuivering van het monster controleert. Houd de platen op 4 °C tijdens de lange wasstappen (d.w.z. alles wat langer is dan 6 uur).
- Verkrijg beelden van de gekleurde monsters met behulp van een helderveldmicroscoop uitgerust met een kleurencamera en behoud een gelijke witbalans onder alle omstandigheden. Om overzichten van de monsters te krijgen, gebruikt u een lage vergroting (bijvoorbeeld 2,5x) om de hele put te scannen. Als de microscoop niet wordt geleverd met software die geautomatiseerd naaien ondersteunt, doe het dan handmatig (bijvoorbeeld met Pairwise Stitching in Fiji34).
OPMERKING: De putten die eerder voor immunofluorescentie werden gebruikt, kunnen hiervoor worden gebruikt, op voorwaarde dat de fluorescentiebeeldacquisitie is voltooid. - Volg dezelfde stappen die worden beschreven voor Picrosirius Red-kleuring in stappen 4.2.1-4.2.3 om Alizarin Red-kleuring, wassen en beeldvorming uit te voeren.
5. Karakteriseringsprocedure 3: Beoordeling van osteogene differentiatie door monitoring van ALP-activiteit
- Op verschillende eindtijdpunten van de cultuur (bijv. dag 4 en dag 7 van co-cultuur), kwantitatief de ALP-activiteit beoordelen met behulp van 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat (BCIP) / nitroblauw tetrazolium (NBT) kleuring.
- Was de culturen eenmaal met 200 μL/put PBS voordat u ze incubeert met de BCIP/NBT-substraatoplossing, die volgens de instructies van de fabrikant moet worden bereid. Incubeer bij 37 °C terwijl u periodiek de kleurontwikkeling controleert. Zodra de kleur zich begint te ontwikkelen in niet-osteogene omstandigheden, was u onmiddellijk eenmaal met 200 μL / put PBS voordat u fixeert met 4% paraformaldehyde, zoals beschreven in stap 4.1.1.
- Verkrijg kleurenafbeeldingen van de gekleurde monsters, zoals beschreven in stap 4.2.3 voor Picrosirius Red-kleuring.
- Kwantificeer op verschillende eindtijdpunten van de cultuur (bijv. dag 4 en dag 7 van co-cultuur) de ALP-activiteit in de cellysaten.
- Was de culturen driemaal met 200 μL/putje PBS voordat u incubeert met 200 μL/putje van 0,25% Trypsine-EDTA bij 37 °C. Roer de culturen elke 10 minuten door krachtig op en neer te pipetten om de spijsvertering te vergemakkelijken en controleer de kweekmorfologie met een standaard celkweekmicroscoop.
- Zodra een vloeibare, eencellige suspensie zonder langwerpige cellulaire structuren in de putten is verkregen (meestal na 20-30 minuten), breng de monsters over naar buizen van 2 ml, voeg 200 μL MSC basaal medium toe om de trypsine te remmen en centrifugeer gedurende 5 minuten op 500 x g om de opgehaalde cellen te pelleteren. Decanteer het supernatant en vries de pellets in bij −80 °C, of ga direct verder met stap 5.2.3.
- Ontdooi de celpellets verkregen in stap 5.2.2 en incubeer met 500 μL lysisbuffer bestaande uit 0,56 M 2-Amino-2-methyl-1-propanol, 0,2% Triton X-100, pH 10, gedurende 30 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 4 °C op 16.100 x g en bewaar de monsters op ijs. Na de in stap 5.2.7 beschreven metingen vriest u de monsters in bij −20 °C of −80 °C, of gaat u direct verder met de DNA-kwantificering, zoals beschreven in stap 5.2.8.
OPMERKING: De lysisbuffer kan van tevoren worden bereid, steriel worden gefilterd en bij 4 °C worden bewaard. - Bereid het ALP-reagens bestaande uit 20 mM 4-nitrofylfosfaat dinatriumzouthexahydraat en 4 mM MgCl2 in lysisbuffer.
OPMERKING: Het is het beste om deze oplossing vers te bereiden op de dag van kwantificering. - Doseer 50 μL van het in stap 5.2.3 bereide cellysaatsupernatant in duplicaat zonder gepelletiseerd puin te verstoren in de putjes van een standaard, transparante, weefselkweekplaat met 96 putten. Voeg lysisbuffer toe aan twee putten als lege besturingselementen.
- Voeg met een meerkanaalspipet 50 μl/put ALP-reagens toe aan de putjes die in stap 5.2.5 zijn gevuld. Schud de plaat kort en incubeer bij 37 °C gedurende 10 minuten beschermd tegen licht. Putten met een hogere ALP-activiteit worden geel weergegeven. Stop de reactie door 100 μL/put van 1 M NaOH toe te voegen met behulp van een meerkanaalspipet.
- Lees de optische dichtheid bij 410 nm af met behulp van een plaatlezer. Het gemiddelde van de technische duplicaten en trek het gemiddelde van de lege besturingselementen af.
- Voer DNA-kwantificering uit om de ALP-activiteit die in de vorige stappen is bepaald, te normaliseren ten opzichte van het totale celaantal. Hier wordt een methode op basis van fluorescentiemetingen beschreven, maar elke andere methode voor DNA-kwantificering in cellysaten is compatibel met de test. Bereid de reagentia en DNA-normen voor die nodig zijn voor DNA-kwantificering met behulp van in de handel verkrijgbare kits volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om lysisbuffer te gebruiken voor het voorbereiden van de DNA-standaarden. - Als de voor de ALP-kwantificering beschreven monsters als beschreven in stap 5.2.3 bevroren waren, ontdooi ze dan, centrifugeer ze gedurende 2 minuten bij 16.100 x g bij 4 °C en leg ze op ijs. Zonder gepelletiseerd puin te verstoren, doseer 50 μL van het cellysaatsupernatant in de putten van een zwarte 96-putplaat in duplicaten. Vries de monsters in bij −20 °C of −80 °C en herhaal zo nodig de ALP- en DNA-kwantificeringen. Voeg de DNA-standaarden in duplicaten toe.
- Voeg met een meerkanaalspipet 50 μL van het DNA-kleuringsmiddel toe, incubeer en lees de fluorescentie-intensiteit volgens de instructies van de fabrikant. Bepaal met behulp van de standaardcurvewaarden de conversie van de gemeten intensiteitswaarden naar de DNA-concentraties en pas deze toe.
- Normaliseer de in stap 5.2.7 verkregen ALP-waarden door ze te delen door de respectieve DNA-concentratie van elk monster.
6. Toepassing 1: Uitvoeren van geneesmiddelgevoeligheidstests
- Wanneer de endotheelnetwerken volledig zijn ontwikkeld (meestal op dag 4 van de stromale-endotheelcelcoculturen), voegt u anti-angiogene verbindingen, zoals bevacizumab, toe aan de culturen in vers kweekmedium en test hun activiteit in de loop van de tijd en onder verschillende omstandigheden (bijv. Verschillende concentraties FGF-2 of BMP-2).
- Bereid vers kweekmedium met dezelfde groeifactoren die tot dan toe voor de respectieve culturen zijn gebruikt.
- Bereid een controleoplossing bestaande uit het verdunningsmiddel van de betrokken verbinding (bijvoorbeeld voor bevacizumab: 60 mg / ml α-trehalosedihydraat, 0,4 mg / ml Tween20, 5,8 mg / ml natriumfosfaat, monobasisch en monohydraat en 1,2 mg / ml natriumfosfaat dibasisch, watervrij) en filter het.
- Voeg de relevante verbinding in de gewenste concentratie (bv. 10 μg/ml bevacizumab) en een gelijk volume van de controleoplossing toe aan het kweekmedium dat is aangewezen voor respectievelijk de test- en controleomstandigheden.
- Bereid vers kweekmedium met dezelfde groeifactoren die tot dan toe voor de respectieve culturen zijn gebruikt.
- Zuig het medium uit de kweek en voeg 200 μL/put van het medium toe, vers bereid in stap 6.1.1. Incubeer gedurende een tijd die geschikt is voor de te testen verbinding (bijv. voor bevacizumab: 2 dagen). Monitor de cultuurontwikkeling en karakteriseer de endotheelnetwerken zoals beschreven in hoofdstuk 3. Beoordeel de effectiviteit van de verbinding bij het remmen van angiogenese of het aborteren van de voorgevormde structuren met behulp van de GFP-beelden en de kwantitatieve netwerkparameters die zijn geëxtraheerd uit de analyse beschreven in stap 3.7.
7. Toepassing 2: Opzetten van geavanceerde co-cultuursystemen met verschillende soorten kankercellen
- Op dag 4 van co-cultuur, wanneer de endotheelnetwerken grotendeels zijn vastgesteld, voegt u andere celtypen, zoals MDA-MB-231 of U2OS-kankercellen, toe aan de culturen in vers kweekmedium.
- Label de kankercellen met behulp van een celcompatibele levende kleurstof volgens de instructies van de fabrikant om ze te kunnen onderscheiden van de GFP-gelabelde HUVECs en niet-gelabelde hBM-MSCs in de co-culturen.
- Bereid een suspensie van kankercellen in een concentratie van 1,5 x 104 cellen/ml in een vers kweekmedium dat dezelfde groeifactoren bevat die tot dan toe voor de respectieve culturen zijn gebruikt.
- Bewaak de kweekontwikkeling en de lokalisatie van kankercellen naar wens.
OPMERKING: Afhankelijk van het type kanker, de activiteit en de omgeving, kan het een paar dagen duren voordat ze de vasculaire structuren in de stromale-endotheelcelcoculturen bereiken (bijv. 2 dagen voor MDA-BM-231 en U2OS). Daarom moet de time-lapse beeldvorming om de interacties tussen kanker en vasculaire cellen te visualiseren dienovereenkomstig worden getimed.
Representative Results
Vasculaire nicheculturen werden vastgesteld door achtereenvolgens hBM-MSCs en GFP-HUVECs te zaaien op pre-cast PEG-gebaseerde hydrogels met een stijfheidsgradiënt binnen een 96-well imaging plate (figuur 1). De culturen werden longitudinaal gevolgd via live epifluorescentiemicroscopie en verder gekarakteriseerd op geselecteerde tijdstippen. Het extracellulaire compartiment werd beoordeeld via directe kleurkleuringen en op antilichamen gebaseerde kleuringen. ALP-activiteit werd gekwantificeerd na het ophalen en lyseren van de cellen uit de gegenereerde niches. Bovendien tonen we de geschiktheid van dit platform aan voor anti-angiogene medicijngevoeligheidstests en als basis voor co-cultuurmodellen voor kanker.
Coculturen van hBM-MSCs en GFP-expressing HUVECs werden vastgesteld door 3 x 104 cellen / put te zaaien in afwezigheid van groeifactoren of in de aanwezigheid van FGF-2 of BMP-2 bij 50 ng / ml, zoals beschreven in het protocol. Vanaf een vroeg tijdstip konden verschillen tussen de culturen worden waargenomen, zowel van het heldere veld als van fluorescentiebeelden die alleen de GFP-HUVECs toonden (figuur 2A). Door dezelfde gebieden longitudinaal te observeren, konden verschillen in de ontwikkeling van de culturen worden opgemerkt, zoals een snellere ontwikkeling in de aanwezigheid van FGF-2. Over het algemeen leken de culturen minder ontwikkeld in afwezigheid van een groeifactor, met minder cellen van beide typen die zich verspreidden en de aanwezigheid van acellulaire gebieden. Daarentegen toonden de bright-field-beelden de meest dichte culturen in de aanwezigheid van BMP-2. Vaatachtige netwerken vormden zich echter in beide groeifactorbevattende omstandigheden en de meest uitgebreide en onderling verbonden netwerken werden gevormd met FGF-2. Deze waargenomen verschillen konden ook worden gekwantificeerd met behulp van Angiogenesis Analyzer voor ImageJ. De totale netwerklengte was inderdaad het hoogst in aanwezigheid van FGF-2 en het laagst in afwezigheid van groeifactoren (figuur 2B). Het aantal knooppunten dat vertakkingspunten in de netwerken aangeeft, volgde dezelfde trend als de totale lengte (figuur 2C). Omgekeerd vertoonden beide groeifactorbevattende omstandigheden significant minder geïsoleerde segmenten, wat wijst op een hogere interconnectiviteit, dan de aandoening zonder enige groeifactor (figuur 2D). Bovendien toonde 3D confocale beeldvorming een sterkere endotheelcelpenetratie in termen van diepte in de FGF-2-gestimuleerde toestand (figuur 2E).
hBM-MSC/GFP-HUVEC coculturen werden gedurende 7 dagen gehandhaafd in aanwezigheid van FGF-2 of BMP-2 voordat ze werden gefixeerd en gekleurd voor ECM-componenten. Immunocytochemische kleuringen gevolgd door confocale laserscanmicroscopie toonden opvallende verschillen in kweekmorfologie, afhankelijk van het type groeifactorsuppletie (figuur 3A). Met FGF-2 werd de cultuur georganiseerd in gecondenseerde microvasculaire structuren, die dicht waren in zowel endotheel- als mesenchymale cellen, terwijl in aanwezigheid van BMP-2 de hBM-MSC's een veel groter gebied besloegen, zoals blijkt uit de uitgebreidere F-actine-positieve en GFP-negatieve gebieden. De ECM-eiwitten fibronectine en collageen I waren op een vergelijkbare manier gelokaliseerd, terwijl laminine en collageen IV meer geconcentreerd waren rond de endotheelstructuren. Deze verhoogde concentratie rond de endotheelstructuren was echter veel meer uitgesproken in de aanwezigheid van FGF-2 dan in de aanwezigheid van BMP-2. Naast de op antilichamen gebaseerde kleuringen werden directe kleurkleuringen uitgevoerd om de algehele fibrotische toestand van de ECU te beoordelen (Picrosirius Red-kleuring; Figuur 3B), evenals de afzetting van Ca op de ECU (Alizarin Red staining; Figuur 3C) van de gevormde nissen. De Picrosirius Red-kleuring was sterker en uitgebreider in de nissen gekweekt met BMP-2, en de Alizarin Red-kleuring volgde dezelfde trend.
Vervolgens werden de culturen gekarakteriseerd in termen van hun osteogene potentieel door ALP-activiteit te beoordelen als een vroege osteogene marker. Op dag 4 en dag 7 van de co-cultuur werden cellen uit de niches gehaald door de hydrogels te verteren met Trypsine. Om de ALP-activiteit te kwantificeren, werden de opgehaalde cellen gelyseerd en werd een pNPP-test uitgevoerd. De verkregen waarden werden genormaliseerd tegen het totale DNA voor elk monster om rekening te houden met potentiële verschillen in de celnummers tussen de omstandigheden. Inderdaad, kleine verschillen tussen het DNA-gehalte van de aandoeningen konden worden waargenomen en de minste cellen werden uit de aandoening gehaald zonder enige groeifactor (niet getoond). De genormaliseerde ALP-activiteit varieerde echter sterk tussen omstandigheden, met een trend van toenemende activiteit met hogere concentraties BMP-2 en een plateau bij 100 ng / ml (figuur 4A, B). De laagste activiteitsniveaus werden geïdentificeerd voor de aandoening met 50 ng / ml FGF-2. Hoewel vergelijkbare trends konden worden waargenomen voor beide beoordeelde tijdstippen, namen alle waarden in de loop van de tijd aanzienlijk toe in de cultuur van dag 4 tot dag 7. Naast de kwantitatieve test kon de ALP-activiteit kwalitatief worden gevisualiseerd met behulp van directe kleurkleuring op basis van de BCIP / NBT-substraatconversie. Uitgebreidere en intensere paarse kleuring werd waargenomen in de aanwezigheid van BMP-2 in vergelijking met FGF-2 (figuur 4C).
Om twee mogelijke toepassingen van de gekarakteriseerde osteogene niches aan te tonen, werden een proof-of-concept medicijngevoeligheidsstudie en kankercoculturen uitgevoerd. Voor de geneesmiddelgevoeligheidstest werd bevacizumab of een controleoplossing bestaande uit het verdunningsmiddel van de bevacizumab-formulering toegevoegd aan het kweekmedium dat vers BMP-2 bevat. Op dag 4, toen gevestigde netwerken werden gevormd in de aanwezigheid van 50 ng / ml BMP-2, werd de controleoplossing of bevacizumab-bevattend medium toegevoegd tijdens de reguliere mediumwisseling en werden de culturen gecontroleerd met behulp van fluorescentiebeeldvorming. De toevoeging van 10 μg/ml bevacizumab leidde tot de terugtrekking of ablatie van het eerder gevormde netwerk, terwijl de controleconditie 2 dagen na de mediumverandering nog steeds uitgebreide netwerken bevatte (figuur 5A,B). Deze veranderingen kunnen ook worden gekwantificeerd door de totale lengte van de netwerken te volgen met behulp van Angiogenesis Analyzer voor ImageJ op fluorescentiebeelden die dagelijks worden verkregen (figuur 5C). Als alternatief kan bevacizumab of een andere verbinding ook vanaf het begin van de co-cultuur worden toegevoegd om hun invloed op de vorming van de netwerken te beoordelen. In het geval van bevacizumab remde dit de vorming van endotheelnetwerken volledig (niet getoond).
Voor de tweede toepassing werden MDA-MB-231 borstkanker of U2OS osteosarcoomcellen toegevoegd aan dag 4 co-culturen met een dichtheid van 1,5 x 103 cellen / put in vers kweekmedium met 50 ng / ml BMP-2. Om ze te onderscheiden van de GFP-gelabelde HUVECs en de niet-gelabelde hBM-MSCs, werden de kankercellen geïncubeerd met CellTrace FarRed vlak voor het zaaien op de osteogene niches. De culturen werden gemonitord door middel van fluorescentiemicroscopie; In het begin waren de meeste kankercellen gelokaliseerd in de buurt van het oppervlak van het substraat, maar na 2 dagen konden ze dichter bij de lagen met de vasculaire coculturen worden gevonden. Zo werd dag 2 geselecteerd als uitgangspunt voor time-lapse microscopie om de dynamiek van de interacties tussen de kankercellen en de cellen in de vasculaire niche te laten zien. Interessant is dat de MDA-MB-231-cellen zowel naderden als zich van endotheelstructuren verwijderden en dus mogelijk hun omgeving onderzochten of hermodelleerden (figuur 5D). Met behulp van CellTrace FarRed als een label voor de kankercellen, GFP als een label voor HUVECs en extra kleuring voor F-actine, konden alle celtypen worden onderscheiden met behulp van confocale laserscanmicroscopie (figuur 5E).
Figuur 1: Een eenvoudige aanpak voor de betrouwbare generatie van gevasculariseerde, osteogene niches. Pre-cast synthetische hydrogels met een diepgaande stijfheidsgradiënt maken het mogelijk om 3D-culturen te genereren via sequentiële celzaaiing zonder de noodzaak van directe inkapseling. hBM-MSC's worden gedurende 3 dagen voorgekweekt voordat GFP-tot expressie brengende HUVECs worden toegevoegd. De culturen worden gemonitord door het verkrijgen van bright-field en GFP signalen longitudinaal. Op bepaalde tijdstippen worden de niches verder geëvalueerd op hun ECM-depositie en osteogene toestand. Alkalische fosfatase-activiteit wordt beoordeeld via directe kleurkleuring en door cellen uit de niches te halen en een pNPP-test uit te voeren op de cellysaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stimulatie van vaatachtige netwerken met FGF-2 of BMP-2. (A) Bright-field and fluorescence (GFP) beelden werden verkregen op dag 2, dag 4 en dag 6 van de co-cultuur van cellen gekweekt in afwezigheid van groeifactoren of in de aanwezigheid van FGF-2 of BMP-2, beide bij 50 ng / ml. Schaalbalk: 400 μm. (B-D) Gekwantificeerde parameters van de GFP-HUVEC-netwerken afgebeeld op dag 4 van co-cultuur, geanalyseerd met behulp van Angiogenesis Analyzer voor ImageJ. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. De statistische analyse werd uitgevoerd met GraphPad Prism 9.5.1. Een gewone eenrichtings-ANOVA met Dunnett's meervoudige vergelijkingstest werd uitgevoerd met n ≥ 4; * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. (E) Driedimensionale reconstructies gegenereerd uit confocale stapels (totale hoogte: 547,5 μm; z-stap: 2,5 μm) van de GFP- en F-actinesignalen voor de FGF-2- (bovenste rij) en BMP-2- (onderste rij) gestimuleerde omstandigheden. Schaalbalk: 300 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Inductie van gedelokaliseerde hBM-MSC-verspreiding en ECM-depositie door BMP-2. (A-C) De 7-daagse coculturen gekweekt in de aanwezigheid van FGF-2 of BMP-2 werden onderworpen aan (A) immunofluorescentie of (B,C) directe kleurkleuring. (A) De culturen waren gekleurd voor F-actine en de ECM-eiwitten fibronectine, laminine, collageen I en collageen IV. De beelden tonen de maximale intensiteitsprojecties van de confocale stapels (totale hoogte: 100 μm; z-stap: 5 μm). Schaalbalk: 200 μm. (B,C) De culturen werden gekleurd met (B) Picrosirius Red en (C) Alizarin Red. De bovenste rij toont gestikte, goed-goed-overzichten van de afbeeldingen die zijn verkregen met 2,5x vergroting (schaalbalk: 1.000 μm), terwijl de onderste rij één gezichtsveld weergeeft dat is verkregen bij 5x vergroting (schaalbalk: 400 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Biochemische beoordeling van BMP-2-geïnduceerde ALP-activiteit door directe kleurkleuring. (A,B) De ALP-activiteit werd bepaald in de cellysaten van culturen gekweekt in afwezigheid van groeifactoren of in aanwezigheid van BMP-2 bij verschillende concentraties of FGF-2 bij 50 ng/ml gedurende (A) 4 dagen of (B) 7 dagen co-cultuur. De ALP-activiteit wordt genormaliseerd weergegeven naar het DNA-gehalte van elk lysaatmonster. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. De statistische analyse werd uitgevoerd met GraphPad Prism 9.5.1. Een gewone eenrichtings-ANOVA met dunnett's meervoudige vergelijkingstest werd uitgevoerd met n = 5; P < 0,0001. (C) Directe kleurkleuring van de ALP-activiteit in nissen gekweekt in de aanwezigheid van 50 ng / ml FGF-2 of BMP-2 gedurende 7 dagen co-cultuur. De afbeeldingen aan de linkerkant tonen gestikte overzichten van beelden die zijn verkregen met een vergroting van 2,5x (schaalbalk: 1.000 μm), terwijl de afbeeldingen aan de rechterkant één gezichtsveld weergeven dat is verkregen bij 5x vergroting (schaalbalk: 400 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Gebruik van osteogene, gevasculariseerde niches in geavanceerde kankermodellen. (A) De GFP-signalen van culturen gekweekt in aanwezigheid van BMP-2 werden op dag 4 van de co-cultuur in beeld gebracht voordat een controleoplossing (links) of bevacizumab bij 10 μg/ml (rechts) gedurende 2 dagen werden toegevoegd, waarna de culturen opnieuw in beeld werden gebracht (dag 6 van de cocultuur). Schaalbalk: 600 μm. (B) Hogere vergrotingsbeelden van de met bevacizumab behandelde culturen worden weergegeven in A. Schaalbalk: 250 μm. (C) De totale lengte van de endotheelnetwerken zoals weergegeven in A werden gekwantificeerd met behulp van Angiogenesis Analyzer voor ImageJ uit beelden die dagelijks werden verkregen; n ≥ 3. (D) CellTrace FarRed-gelabelde MDA-MB-231 borstkankercellen werden toegevoegd aan de 4-daagse co-culturen gekweekt in de aanwezigheid van BMP-2, en time-lapse-beelden werden verkregen vanaf 2 dagen na de toevoeging van de kankercel. Schaalbalk: 100 μm. (E) Maximale intensiteitsprojecties van confocale stapels (totale hoogte: 70 μm; z-stap: 2,4 μm) van drievoudige coculturen gegenereerd zoals beschreven in D en gefixeerd en gekleurd voor F-actine. Links: niches met MDA-MB-231 borstkankercellen; rechts: niches met U2OS osteosarcoomcellen. Schaalbalken voor afbeeldingen aan de linkerkant: 200 μm; schaalbalken voor afbeeldingen aan de rechterkant: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Hier beschrijven we een protocol voor het opzetten van een in vitro model van sterk gevasculariseerde bot- en beenmergniches in een volledig synthetische en controleerbare 3D PEG-gebaseerde matrix, die een verscheidenheid aan toepassingen heeft in bot- en beenmergbiologisch onderzoek, weefselmanipulatie en kankeronderzoek. Dit model bouwt voort op een synthetische peg-gebaseerde hydrogel die is gefunctionaliseerd met RGD-peptiden en MMP-splitsingsplaatsen en is gegoten met een diepgaande dichtheidsgradiënt op 96-well imaging-platen met glazen bodem30. Dit plug-and-play-platform bleek de oprichting van sterk onderling verbonden 3D-cellulaire netwerken mogelijk te maken zonder de noodzaak om cellen in de hydrogel in te kapselen. Vergelijkbaar met het eerder beschreven celinkapselingsprotocol, tonen we in dit werk de remodellering van het substraat door een cel-inherente ECM28 om een celtype-specifieke micro-omgeving te creëren. Met deze methode kunnen geneesmiddelenscreeningtests en analyses met een hoog gehalte eenvoudig worden uitgevoerd onder zeer reproduceerbare, organotypische 3D-kweekomstandigheden. De 96-putplaten met glazen bodem en de optisch transparante hydrogels maken het platform compatibel met automatisering van vloeistofverwerking en microscopie met hoge doorvoer.
De eerste stap in het genereren van een osteogene vasculaire beenmergniche is de voorkweek van hBM-MSCs op de PEG-hydrogel gedurende ten minste 3 dagen. Gedurende deze tijd hechten ze zich aan de hydrogel, dringen deze binnen en beginnen celcelcontacten en ECM-afzetting tot stand te brengen. Voordat de hBM-MSC's worden gezaaid, moet de opslagbuffer worden verwijderd. Omdat de hydrogel zich in een binnenput binnen de standaardput van de 96-well imaging plate bevindt, is het veilig om de aspiratietip langs de zijkant van de put te plaatsen totdat deze de binnenste putring raakt. Een vacuümpomp kan worden gebruikt voor afzuiging als deze is ingesteld op de laagst mogelijke zuigkracht. Als alternatief kan een geautomatiseerde platenwasser met de spuitmondhoogte ingesteld op ten minste 0,8 mm boven de binnenste putring worden gebruikt om de buffer van de hydrogelplaat op te zuigen. Het gebruik van automatisering voor vloeistofbehandeling kan schade aan het hydrogeloppervlak minimaliseren en leiden tot een hogere reproduceerbaarheid van de resulterende culturen. Kleine defecten op het hydrogeloppervlak worden zichtbaar zodra de cellen zich op de hydrogel nestelen en verschijnen op een lager focusvlak in defecte hydrogelgebieden. Daarom dient het verkrijgen van referentiebeelden op dag 0 als een goede kwaliteitscontrole voor de homogeniteit van de celzaaiing en de integriteit van het hydrogeloppervlak. Hoewel kleine hydrogel-oppervlaktedefecten het verdere gebruik van de put niet uitsluiten, hebben de cellen de neiging zich te clusteren op de defecte gebieden en kunnen ze uitgroeien tot niet-representatieve patronen of sneller het onderste glas bereiken, waar ze uitgroeien tot een monolaag. Deze artefacten moeten worden opgemerkt bij het gebruik / evalueren van deze putten. Soortgelijke overwegingen zijn van toepassing op eventuele mediumveranderingen die gedurende de gehele duur van de test worden uitgevoerd.
De tweede stap van het protocol omvat de toevoeging van GFP-HUVECs aan de voorgevormde hBM-MSC monocultuur (dag 0 van co-cultuur). De ECM afgezet door de hBM-MSC biedt een geweldige steiger voor de groei van endotheelcellen, die in dit werk, zelfs in de aanwezigheid van hBM-MSC-geconditioneerd medium, alleen ronde celclusters op de hydrogels konden vormen (niet getoond). Bij het zaaien op de hBM-MSC-culturen integreren de HUVEC's en vormen ze microvesselachtige structuren die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in coculturen die worden gegenereerd door celinkapseling27,28. Typisch, goed ontwikkelde 3D microvasculaire-achtige netwerken vormen zich binnen 4 dagen na co-cultuur, en dit kan longitudinaal worden gecontroleerd door het gebruik van GFP-gelabelde HUVECs. Deze structuren kunnen gedurende ten minste 7 dagen in cultuur worden gehouden, wat betekent dat er voldoende tijd is om veranderingen in de vasculaire netwerkorganisatie te volgen als reactie op behandelingen, zoals voor de screening van anti-angiogene geneesmiddelen. De morfologische elementen van het endotheelnetwerk kunnen in batchmodus worden gekwantificeerd door de GFP-beelden te segmenteren met behulp van gevestigde hulpmiddelen, zoals de Angiogenesis Analyzer-plug-in van ImageJ33, en hun parameters kunnen worden gebruikt om bijvoorbeeld de werkzaamheid van geneesmiddelen en farmacodynamiek te evalueren.
Een belangrijk voordeel van het beschreven cellulaire model voor veel potentiële toepassingen is de plasticiteit. Het simpelweg aanvullen van het kweekmedium met verschillende groeifactoren kan het uiterlijk van de co-cultuur veranderen. De aanwezigheid van BMP-2 gedurende de mono- en co-cultuurperiode creëert bijvoorbeeld een osteogene vasculaire niche, die verhoogde ALP-activiteit, extracellulaire calciumafzetting en ECM-assemblage en -afzetting vertoont. Integendeel, in aanwezigheid van FGF-2 zijn de osteogene markers afwezig en vormt de co-cultuur minder laterale celassociaties, maar vertoont meer uitgesproken 3D-celgroei. Het feit dat FGF-2 de ALP-activiteit onderdrukt, terwijl BMP-2 een sterkere ALP-activiteit opwekt in vergelijking met geen behandeling met groeifactoren, is in overeenstemming met eerderewaarnemingen 27. Maar ondanks deze grote verschillen in de hBM-MSC stromale component, was de omvang van het microvasculaire netwerk zeer vergelijkbaar voor de twee met groeifactoren behandelde aandoeningen in dit werk. In de controleculturen vormden zich slechts enkele korte vasculaire netwerken, die misschien een slecht gevasculariseerde beenmergniche vertegenwoordigen. Dit suggereert dat door simpelweg het type, de concentratie en de timing van de groeifactoren die aan het kweekmedium worden toegevoegd, een reeks goed gedefinieerde gevasculariseerde beenmergniches te veranderen, zoals vereist zou zijn voor vergelijkende studies, zou kunnen worden geproduceerd. Om reproduceerbare resultaten te garanderen, is het echter belangrijk op te merken dat de kweekprogressie en morfologie kunnen variëren afhankelijk van de geschiedenis van de gebruikte cellen (bijvoorbeeld het passagenummer en de loslatingsmethode die wordt gebruikt tijdens routinematig kweekonderhoud), en het is raadzaam om tijdens het testontwerp op dergelijke factoren te controleren.
Hier, als eerste toepassing van dit model, tonen we de gevoeligheid van de gemanipuleerde microvasculaire netwerken voor behandeling met 10 μg / ml bevacizumab. Het is met name belangrijk om te bevestigen dat het gebruikte algoritme het endotheelnetwerk nauwkeurig kan herkennen, omdat artefacten vaak worden gegenereerd in afbeeldingen met slecht ontwikkelde netwerken. Als dit het geval is, moeten de parameters die worden gebruikt voor beeldverwerking (voor en tijdens segmentatie) worden verfijnd, vaak op een trial-and-error-basis.
Als tweede toepassing presenteren we een geavanceerd co-cultuurmodel gevormd door het sequentieel zaaien van mesenchymale, endotheel- en kankercellen. Dit model maakt het mogelijk om de interacties tussen kankercellen, het stroma en de vasculatuur van het beenmerg te bestuderen, wat belangrijke factoren kunnen zijn tijdens metastase. Bovendien kan dit model worden gebruikt voor toepassingen voor het screenen van geneesmiddelen en het testen van verbindingen met doelen die verder gaan dan angiogenese.
In 2D-culturen ontvangen cellen geen fysiologische micro-omgevingssignalen, verwerven ze geen natuurlijk voorkomende celmorfologieën en differentiëren ze bijgevolg anders in vergelijking met cellen in inheemse 3D-omgevingen35. Wanneer ze worden gekweekt in technische 3D-hydrogels, zetten de cellen al vroeg een inherente ECM af, die adhesieplaatsen biedt en actief kan worden gehermodelleerd28,36. Hier, om een vereenvoudigd 3D-model voor screeningstoepassingen vast te stellen, werden vatvormende cellen op het oppervlak van gemanipuleerde hydrogels gezaaid en in staat gesteld om vasculaire netwerken op te zetten in afwezigheid van perfusie. De op beeldvorming gebaseerde evaluaties werden uitgevoerd op 2D-projecties van de endotheelcellen die bijdragen aan vasculaire structuren. Alleen confocale beelden onthulden echter de minder uitgesproken ingroei van de 3D-vasculaire netwerken in de BMP-2-gestimuleerde monsters in vergelijking met de FGF-2-gestimuleerde monsters. Dit suggereert dat de lengte van de gevormde vasculaire structuren werd onderschat, terwijl hun connectiviteit werd overschat. Bovendien zijn interacties tussen perivasculaire en endotheelcellen en vasculaire lumenvorming niet onderzocht. Deze aspecten, met name in termen van reacties op medicamenteuze behandeling, zullen verdere aandacht vereisen. Ten slotte zouden verfijnde protocollen om eerst uitgebreide 3D-vasculaire netwerken tot stand te brengen en pas daarna hun osteogene differentiatie te induceren, wenselijk zijn om meer fysiologische bot- en beenmergmodellen te genereren.
Over het algemeen is het hier gepresenteerde model zeer veelzijdig en kan het gemakkelijk worden aangepast aan specifieke toepassingen. Mesenchymale en endotheelcellen uit verschillende bronnen kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt. Het is bekend dat vetweefsel MSC's en navelstreng MSC's verschillende angiogene factoren tot expressie brengen in vergelijking met BM-MSCs, en ze kunnen gemakkelijk worden vervangen als een alternatieve stromale component37. Endotheelcellen geïsoleerd uit reeds gedefinieerde beenmergniches kunnen ook worden gebruikt in plaats van HUVECs. Men zou ook de co-cultuur kunnen opzetten met patiënt-afgeleide, overeenkomende beenmerg mesenchymale en endotheelcellen voor gepersonaliseerde geneeskundetoepassingen, zoals onlangs is gesuggereerd voor gevasculariseerde spiercoculturen38. Bovendien maakt het ontwerp van de hydrogelplaat de longitudinale monitoring van de cultuur mogelijk met zowel bright-field als fluorescentiemicroscopie, waardoor de gebruiker de mogelijkheid heeft om de kweektijd te verkorten of te verlengen, afhankelijk van de toepassing. Als alternatief kunnen de celdichtheden die worden gebruikt voor het zaaien dienovereenkomstig worden aangepast om de vorming van het celnetwerk te versnellen of te vertragen als kortere of langere observatietijden nodig zijn dan die in dit protocol. In ieder geval is voorzichtigheid geboden om celovergroei in plaatachtige structuren te voorkomen, wat kan leiden tot de samentrekking van de hydrogel en uiteindelijk celloslating.
Ten slotte kan een breed scala aan assays worden uitgevoerd met behulp van dit model. Naast immunofluorescentie en microscopie uitgevoerd in levende of vaste culturen, kunnen de 3D-culturen enzymatisch worden verteerd en kunnen de cellen worden opgehaald en onderworpen aan elk type biochemische test. Hier demonstreren we de bepaling van ALP-activiteit en DNA-gehaltekwantificering in cellysaten met behulp van colorimetrische / fluorometrische assays, maar het systeem is compatibel met vele andere technieken, waaronder PCR, RNAseq en proteomics. Als de gevoeligheid van de gewenste test niet erg hoog is, kan men monsters uit meer dan één put poolen om de hoeveelheid monster die beschikbaar is voor de test te vergroten. Als de gewenste toepassing een snellere geloplossing vereist, kan orbitaal schudden van de plaat worden toegepast in combinatie met kleinere volumes van de spijsverteringsoplossing om vortexvorming in de putten te garanderen, ervan uitgaande dat alle putten op de plaat op deze manier zullen worden gebruikt (levende culturen zijn gevoelig voor een dergelijke harde behandeling). Samenvattend presenteren we hier een protocol dat, indien gebruikt zoals beschreven, de generatie van een in vitro model garandeert dat de belangrijkste aspecten van osteogene vasculaire niches samenvat, maar ook veelzijdig genoeg is om te worden aangepast voor op maat gemaakte toepassingen.
Disclosures
Ectica Technologies AG is de fabrikant van de 3DProSeed hydrogel putplaat en heeft commerciële belangen. Benjamin R. Simona en Martin Ehrbar zijn aandeelhouders van Ectica Technologies AG.
Acknowledgments
De auteurs willen Riccardo Urbanet bedanken voor de technische assistentie met de vloeistofbehandelingsapparatuur en Rodi Odabasi voor de ondersteuning bij de epifluorescentiemicroscopie. Dit werk werd gefinancierd door de Swiss National Science Foundation (subsidienummers 310030E_202429 en 205321_204318) en Ectica Technologies AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 2 mL microtubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 2-Amino-2-methyl-1-propanol | Sigma | A9199 | |
| 3DProSeed hydrogel well plate | Ectica Technologies | ECT.PS1.001.096 | |
| 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma | 71768 | |
| Alizarin Red S | Sigma | A5533 | |
| Anti-Collagen IV antibody | Abcam | ab6311 | |
| Anti-Laminin 1+2 antibody | Abcam | ab7463 | |
| Automated plate washer | Agilent Biotek | ELχ50 | |
| Automated washer/dispenser | Agilent Biotek | MULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette | |
| Bevacizumab | Evidentic | ID PS-E07-2019-00119 A009 | |
| BMP-2 | Peprotech | 120-02C | |
| BSA | AppliChem | A1391 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | To centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Stellaris 5 | |
| Conical 50 mL centrifuge tubes | TPP | 91050 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 406406 | |
| DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 405312 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Epifluorescence microscope | Leica | DMI6000B | |
| FBS | Gibco | 10500-064 | |
| FGF-2 | Peprotech | 100-18B | |
| Fibronectin (IST-9) | Santa Cruz | sc-59826 | |
| GFP-HUVECs | PELOBiotech | PB-CAP-0001GFP | |
| hBM-MSCs | - | - | Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359 |
| Inverted microscope | Zeiss | 200M | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cell line | - | Kindly obtained from J Massagué at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | |
| MEMα | Gibco | 22571-038 | |
| Multimode imaging reader | Agilent Biotek | Cytation 1 | For automated imaging |
| Multimode imaging reader - fluorescence and absorbance | Agilent Biotek | Cytation 5 | For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis |
| Paraformaldehyde | Artechemis | US 040 | |
| PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phalloidin-rhodamine | Invitrogen | R415 | |
| Picro-Sirius Red Solution | Abcam | ab246832 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | ThermoFisher Scientific | P7589 | |
| Recombinant Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab260043 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Sigma | B5655-25TAB | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1064981000 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Sigma | S-0876 | |
| Sodium phosphate monobasic, monohydrate | Merck | 1.06346 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween20 | AppliChem | A4974 | |
| U2OS osteosarcoma cell line | - | Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich | |
| α-trehalose dihydrate | Sigma | 90208 |
References
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Calvi, L. M., Link, D. C. Cellular complexity of the bone marrow hematopoietic stem cell niche. Calcified Tissue International. 94 (1), 112-124 (2014).
- Behrmann, L., Wellbrock, J., Fiedler, W. Acute myeloid leukemia and the bone marrow niche-take a closer look. Frontiers in Oncology. 8, 444 (2018).
- Yip, R. K. H., et al. Mammary tumour cells remodel the bone marrow vascular microenvironment to support metastasis. Nature Communications. 12 (1), 6920 (2021).
- Potente, M., Makinen, T. Vascular heterogeneity and specialization in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 477-494 (2017).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y. Organotypic vasculature: From descriptive heterogeneity to functional pathophysiology. Science. 357 (6353), (2017).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Barillari, G. The anti-angiogenic effects of anti-human immunodeficiency virus drugs. Frontiers in Oncology. 10, 806 (2020).
- Owen, M., Friedenstein, A. J. Stromal stem-cells - Marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Foundation Symposia. 136, 42-60 (1988).
- Sacchetti, B., et al. Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment. Cell. 131 (2), 324-336 (2007).
- Traore, M. A., George, S. C.
- Bessy, T., Itkin, T., Passaro, D. Bioengineering the bone marrow vascular niche. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 645496 (2021).
- Bray, L. J., et al. A three-dimensional ex vivo tri-culture model mimics cell-cell interactions between acute myeloid leukemia and the vascular niche. Haematologica. 102 (7), 1215-1226 (2017).
- Montano, I., et al. Formation of human capillaries in vitro: The engineering of prevascularized matrices. Tissue Engineering Part A. 16 (1), 269-282 (2010).
- Sun, Z. Y., Kemp, S. S., Lin, P. K., Aguera, K. N., Davis, G. E. Endothelial k-RasV12 expression induces capillary deficiency attributable to marked tube network expansion coupled to reduced pericytes and basement membranes. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 42 (2), 205-222 (2022).
- Kleinman, H. K., et al.
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement-membrane in the morphological-differentiation of human-endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
- Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods in Molecular Biology. 1066, 17-28 (2013).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
- Wang, X. L., et al. Engineering anastomosis between living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Lab on a Chip. 16 (2), 282-290 (2016).
- Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature Biotechnology. 23 (1), 47-55 (2005).
- Kyburz, K. A., Anseth, K. S. Synthetic mimics of the extracellular matrix: How simple is complex enough. Annals of Biomedical Engineering. 43 (3), 489-500 (2015).
- Ehrbar, M., et al. Enzymatic formation of modular cell-instructive fibrin analogs for tissue engineering. Biomaterials. 28 (26), 3856-3866 (2007).
- Ehrbar, M., et al. Biomolecular hydrogels formed and degraded via site-specific enzymatic reactions. Biomacromolecules. 8 (10), 3000-3007 (2007).
- Blache, U., et al. Dual role of mesenchymal stem cells allows for microvascularized bone tissue-like environments in PEG hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 5 (4), 489-498 (2016).
- Blache, U., et al. Notch-inducing hydrogels reveal a perivascular switch of mesenchymal stem cell fate. Embo Reports. 19 (8), e45964 (2018).
- Simona, B. R., et al. Density gradients at hydrogel interfaces for enhanced cell penetration. Biomaterials Science. 3 (4), 586-591 (2015).
- Zhang, N., et al. Soft hydrogels featuring in-depth surface density gradients for the simple establishment of 3d tissue models for screening applications. SLAS Discovery. 22 (5), 635-644 (2017).
- Martin, I., Muraglia, A., Campanile, G., Cancedda, R., Quarto, R. Fibroblast growth factor-2 supports ex vivo expansion and maintenance of osteogenic precursors from human bone marrow. Endocrinology. 138 (10), 4456-4462 (1997).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpentier, G., Martinelli, M., Courty, J., Cascone, I.
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Loebel, C., Mauck, R. L., Burdick, J. A. Local nascent protein deposition and remodelling guide mesenchymal stromal cell mechanosensing and fate in three-dimensional hydrogels. Nature Materials. 18 (8), 883-891 (2019).
- Curtis, M. B., Kelly, N., Hughes, C. C. W., George, S. C. Organotypic stromal cells impact endothelial cell transcriptome in 3D microvessel networks. Scientific Reports. 12 (1), 20434 (2022).
- Wust, R., Terrie, L., Muntefering, T., Ruck, T., Thorrez, L. Efficient co-isolation of microvascular endothelial cells and satellite cell-derived myoblasts from human skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 964705 (2022).
