Summary
Um modelo in vitro do nicho vascular da medula óssea é estabelecido pela semeadura de células mesenquimais e endoteliais em hidrogéis pré-moldados de PEG 3D. As redes endoteliais, os componentes da MEC e a atividade da FA dos nichos variam dependendo do fator de crescimento utilizado. A plataforma pode ser usada para modelos avançados de câncer.
Abstract
O osso e a medula óssea são órgãos altamente vascularizados e estruturalmente complexos, sendo locais de formação de câncer e metástases. Modelos in vitro recapitulando funções específicas do osso e da medula óssea, incluindo vascularização, compatíveis com a triagem de drogas são altamente desejáveis. Tais modelos podem preencher a lacuna entre modelos in vitro bidimensionais (2D) simplistas, estruturalmente irrelevantes, e os modelos in vivo mais caros e eticamente desafiadores. Este artigo descreve um ensaio de co-cultura tridimensional (3D) controlável baseado em matrizes de poli(etilenoglicol) (PEG) projetadas para a geração de nichos osteogênicos vascularizados da medula óssea. O projeto da matriz PEG permite o desenvolvimento de culturas de células 3D através de uma etapa simples de semeadura de células que não requer encapsulamento, permitindo assim o desenvolvimento de sistemas complexos de co-cultura. Além disso, as matrizes são transparentes e pré-moldadas em placas de imagem de 96 poços com fundo de vidro, tornando o sistema adequado para microscopia. Para o ensaio aqui descrito, células estromais mesenquimais derivadas da medula óssea humana (hBM-MSCs) são cultivadas primeiro até que uma rede celular 3D suficientemente desenvolvida seja formada. Posteriormente, células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) que expressam GFP são adicionadas. O desenvolvimento da cultura é acompanhado por microscopia de campo claro e fluorescência. A presença da rede hBM-CTM suporta a formação de estruturas vasculares que, de outra forma, não se formariam e que permanecem estáveis por pelo menos 7 dias. A extensão da formação de redes vasculares pode ser facilmente quantificada. Esse modelo pode ser sintonizado em direção a um nicho osteogênico da medula óssea suplementando o meio de cultura com proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2), que promove a diferenciação osteogênica das hBM-CTMs, avaliada pelo aumento da atividade da fosfatase alcalina (FA) no 4º e 7º dias de cocultivo. Este modelo celular pode ser usado como uma plataforma para cultivar várias células cancerosas e estudar como elas interagem com nichos vasculares específicos do osso e da medula óssea. Além disso, é adequado para automação e análises de alto conteúdo, o que significa que permitiria o rastreamento de drogas contra o câncer em condições de cultura altamente reprodutíveis.
Introduction
O osso e a medula óssea são órgãos estrutural e funcionalmente complexos centrais para a saúde humana. Isso se reflete na existência de nichos distintos que regulam a hematopoese e a manutençãoóssea1. Atualmente, é amplamente aceito que, na medula óssea saudável, a manutenção e a expansão das células-tronco hematopoéticas e esqueléticas, bem como de sua progênie, são controladas por nichos distintos. Esses nichos compreendem vários tipos celulares, incluindo células osteolinhagens, células-tronco mesenquimais, células endoteliais e perivasculares, células neuronais e gliais, adipócitos, osteoclastos, macrófagos e neutrófilos2. Não surpreendentemente, esses nichos, principalmente associados à vasculatura, também estão envolvidos no desenvolvimento de vários tipos de leucemia3 e são o local de metástase para diferentes cânceres4. Devido às suas funções específicas na formação, remodelação e manutenção óssea (medula), a vasculatura associada ao osso possui estruturas especializadas distintas, diferentes da vasculatura encontrada em outras partes do corpo 5,6,7. Assim, drogas antiangiogênicas ou moduladoras da vasculatura aplicadas sistemicamente podem ter efeitos diferentes nesses ambientes especializados8. Portanto, modelos para investigar os mecanismos moleculares envolvidos na manutenção das propriedades fisiológicas do osso e da medula óssea, regeneração óssea e medular e respostas a tratamentos terapêuticos são altamente desejáveis.
Culturas clássicas de tecidos bidimensionais (2D) e investigações in vivo usando modelos animais têm fornecido informações inestimáveis sobre o papel de diferentes células e atores moleculares envolvidos no desenvolvimento do osso e da medulaóssea9,10. Modelos que permitem experimentos de alto rendimento com células humanas relevantes podem melhorar nossa compreensão de como modular parâmetros selecionados nesses sistemas altamente complexos.
Na última década, princípios derivados da engenharia tecidual têm sido empregados para gerar modelos teciduais3D 11,12. Estes têm dependido principalmente do encapsulamento de células relevantes para o tecido em biomateriais para estabelecer mono ou co-culturas 3D13. Entre os biomateriais mais utilizados estão a fibrina 14, o colágeno 15 e o Matrigel16,17, todos altamente biocompatíveis e condições adequadas para o crescimento de diversos tipos celulares. Esses biomateriais têm a capacidade de gerar modelos in vitro que recapitulam aspectos-chave dos diferentes nichos vasculares encontrados invivo18. Além disso, o uso de dispositivos microfluídicos para gerar modelos vasculares perfundidos de osso e medula óssea tem contribuído para a geração de modelos in vitro de maior complexidade 19,20,21,22.
A dificuldade em controlar a composição e projetar as propriedades de biomateriais naturais inspirou o desenvolvimento de análogos sintéticos que podem ser racionalmente projetados com propriedades físicas, químicas e biológicas previsíveis23,24. Desenvolvemos hidrogéis reticulados à base de poli(etilenoglicol) (PEG) reticulados totalmente sintéticos com fator XIII (FXIII), que são funcionalizados com peptídeos RGD e sítios de clivagem de metaloprotease de matriz (MMP) para facilitar a fixação e o remodelamento celular25,26. O desenho modular desses biomateriais tem sido utilizado com sucesso para otimizar as condições para a formação de modelos 3D vascularizados de osso e medulaóssea27,28.
Para o teste de um número maior de diferentes condições de cultura e novas terapêuticas, são necessários modelos com maior capacidade de produção. Recentemente, mostramos que a reticulação FXIII do nosso hidrogel de PEG pode ser controlada através de um processo eletroquímico tal que um gradiente de rigidez do hidrogel em profundidade é formado29. Quando as células são adicionadas sobre esses hidrogéis, elas migram em direção ao interior e gradualmente se desenvolvem em redes celulares 3D altamente interconectadas30. A eliminação da necessidade de encapsular células no hidrogel, que geralmente está presente com outros scaffolds 3D, não apenas simplifica o planejamento experimental, mas também permite a adição sequencial de diferentes tipos celulares em diferentes pontos de tempo para gerar sistemas complexos de co-cultura. Esses hidrogéis estão disponíveis pré-moldados em placas de imagem de 96 poços com fundo de vidro, tornando assim o estabelecimento de culturas 3D alcançável por protocolos manuais e automatizados de semeadura de células. A transparência óptica dos hidrogéis de PEG torna a plataforma compatível com microscopia.
Aqui, apresentamos um método simples para a geração e caracterização de nichos osteogênicos vascularizados dentro desta plataforma sintética plug-and-play pronta para uso. Mostramos que o desenvolvimento de redes vasculares pode ser estimulado com um fator de crescimento comumente utilizado para indução de osteogênese in vitro, a proteína morfogenética óssea-2 (BMP-2), enquanto a diferenciação osteogênica pode ser prevenida pela suplementação do fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF-2)27,31. As redes formadas são diferentes quando comparadas às redes estimuladas por FGF-2 em termos de aparência geral, bem como da distribuição celular e ECM. Além disso, monitoramos a indução osteogênica usando fosfatase alcalina como marcador. Demonstramos o aumento da expressão deste marcador ao longo do tempo e comparamos a expressão com a expressão em redes estimuladas pelo FGF-2 utilizando métodos qualitativos e quantitativos. Finalmente, demonstramos a adequação dos nichos gerados deste modelo para duas aplicações potenciais. Primeiramente, realizamos um ensaio de prova de conceito de sensibilidade a fármacos adicionando bevacizumabe a nichos pré-formados e monitorando a degradação das redes vasculares em sua presença. Em segundo lugar, adicionamos células de câncer de mama MDA-MB-231 e osteossarcoma U2OS a nichos osteogênicos pré-formados, mostrando que os nichos podem ser usados para estudar interações entre células cancerosas e seu ambiente.
Protocol
A Figura 1 resume as seções de protocolo a seguir.
1. Estabelecimento da monocultura estromal 3D
- Preparar a suspensão da célula hBM-MSC.
- Cultivar hBM-MSCs até um nível de confluência de 70%-90% em MEMα suplementado com 10% de SFB, 1% de penicilina-estreptomicina e 5 ng/mL de FGF-2 em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 em uma atmosfera umedecida. As células podem ser utilizadas até a passagem 6.
- Lavar as células com PBS e retirá-las com tripsina-EDTA a 0,05% por 3-5 min a 37 °C. Interromper o processo de descolamento lavando com meio basal (MEMα suplementado com 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina). Coletar as células suspensas em um tubo de centrífuga cônico de 50 mL.
- Conte as células usando um hematocitômetro ou um contador automático de células e determine o número total de células na suspensão.
- Pellet as células por centrifugação a 200 x g por 5 min. Retire cuidadosamente o sobrenadante.
- Ressuspender as células em um volume apropriado de meio basal para atingir uma concentração de 1 x 107 células/mL de solução reserva.
- Preparar tubos de centrífuga cônica de 50 mL contendo o volume necessário de meio basal suplementado com os respectivos fatores de crescimento (FGF-2 e BMP-2 em concentrações definidas, por exemplo, 0 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL ou 200 ng/mL). Por poço, são necessários 200 μL. Se a semeadura celular deve ser realizada usando um manipulador de líquidos automatizado, considere também o volume morto do instrumento. Para a semeadura manual de células, um excesso de volume de 10% é suficiente.
- Adicionar as CTMs-hBM da solução-mãe numa diluição de 1:66,67 para atingir uma concentração de 1,5 x 105 células/ml.
- Prepare o prato para semeadura.
- Remova a película adesiva de polipropileno que cobre a placa de hidrogel de 96 poços.
- Aspirar cuidadosamente o tampão de armazenamento que cobre os hidrogéis. Para esta tarefa, use uma lavadora de microplacas; no entanto, o manuseio manual é possível.
- Ao usar um aspirador manual ou pipeta multicanal, posicione a ponta contra a parede do poço e mova-se lentamente para baixo em direção à borda do poço interno enquanto aspira o tampão. Isso evitará danificar a superfície do hidrogel.
- Ao usar uma lavadora de placas automatizada, ajuste os bicos de aspiração a pelo menos 3,8 mm do suporte da placa (isso corresponde a 0,8 mm do anel interno da placa de hidrogel) e em direção à borda do poço. Consulte o manual do fabricante para obter instruções mais detalhadas e obter os desenhos da placa de hidrogel de 96 poços.
- Adicionar 200 μL/poço da suspensão celular preparada na etapa 1.1.7 após mistura completa para garantir que as células estão homogeneamente distribuídas. Durante a semeadura, para evitar a sedimentação irregular das células em uma região do substrato, não incline a placa. Para a semeadura manual, misture periodicamente a suspensão celular (após a semeadura de três poços) para manter a mistura homogênea. Para a semeadura automatizada, misturar com uma pipeta sorológica imediatamente antes da dispensação, a fim de dispensar volumes contendo igual número de células.
- Manter as culturas a 37 °C e 5% CO2 em atmosfera umedecida.
- Monitorar o desenvolvimento das culturas por microscopia de campo claro com objetiva de 5x conforme desejado. Adquirir imagens de referência aproximadamente 30 min após a semeadura para avaliar o número de células adicionadas.
2. Estabelecimento da co-cultura de células estromal-endotelial 3D
- Prepare a suspensão de células GFP-HUVEC.
- Preparar frascos para a cultura HUVEC revestindo-os com uma solução constituída por 150 μg/ml de colagénio I de cauda de rato em ácido acético 0,02 M durante 30 min a 37 °C. Enxágue uma vez com PBS antes de usar.
- Cultivar as GFP-HUVECs até um nível de confluência de 80%-100% em EGM-2 suplementado com 10% de SFB em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 em uma atmosfera umedecida. As células podem ser utilizadas até a passagem 7.
- Lavar as células com PBS e retirá-las com tripsina-EDTA a 0,05% durante 2-3 minutos a 37 °C. Interromper o processo de descolamento lavando com meio basal (MEMα suplementado com 10% FBS e 1% penicilina-estreptomicina). Coletar as células suspensas em um tubo de centrífuga cônico de 50 mL.
- Conte as células usando um hematocitômetro ou um contador automático de células e determine o número total de células presentes na suspensão.
- Pellet as células por centrifugação a 200 x g por 5 min. Retire cuidadosamente o sobrenadante.
- Ressuspender as células em um volume apropriado de meio basal para atingir uma concentração de 1 x 107 células/mL de solução reserva.
- Preparar tubos de centrífuga cônica de 50 mL contendo o volume necessário de meio basal suplementado com os respectivos fatores de crescimento (FGF-2 e BMP-2 em concentrações definidas, por exemplo, 0 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL ou 200 ng/mL), conforme descrito para as CTMs-hBM na etapa 1.1.6.
- Adicionar as GFP-HUVEC da solução-mãe numa diluição de 1:66,67 para atingir uma concentração de 1,5 x 105 células/ml, conforme descrito para as hBM-MSC no passo 1.1.7.
- Aspirar o meio da placa que contém a monocultura do estroma, conforme descrito para a remoção do tampão no passo 1.2.2.
- Adicionar 200 μL/poço da suspensão celular GFP-HUVEC preparada na etapa 2.1.8, conforme descrito para a adição de hBM-MSC na etapa 1.3.
- Incubar a 37 °C e 5% de CO2 numa atmosfera humidificada. Troque o meio a cada 3-4 dias.
- Monitorar o desenvolvimento da cultura por microscopia de campo claro e fluorescência usando uma objetiva de 5x como desejado. Manter as culturas até o dia 4 ou dia 7 de co-cultivo para caracterizações precoces ou intermediárias, respectivamente, ou conforme desejado.
3. Procedimento de caracterização 1: Quantificação da formação da rede de células endoteliais
- Nos momentos desejados, adquira o sinal GFP dos GFP-HUVECs com microscopia de fluorescência usando configurações adequadas para quantificação (ou seja, melhor foco, alto contraste e baixa ampliação [por exemplo, 5x] para campos de visão maiores).
- Pré-processe igualmente todas as imagens adquiridas no mesmo dia (por exemplo, usando Fiji32) para melhorar ainda mais o contraste. Observe que o sinal de GFP pode tornar-se mais fraco com o tempo de cultura; portanto, imagens adquiridas em dias diferentes podem necessitar de processamento diferente.
- Se estiver usando Fiji ou ImageJ, abra todas as imagens do canal GFP do mesmo ponto de tempo e abra o menu Brilho e contraste . Selecione uma imagem que represente uma condição intermediária (não o sinal mais fraco e não o mais brilhante) e ajuste automaticamente o contraste selecionando Automático. Selecione Definir e marque Propagar para todas as outras imagens abertas.
- Avalie visualmente se o intervalo selecionado automaticamente se ajusta a todas as imagens do ponto de tempo atual e reajuste e repropague manualmente para todas as imagens, conforme necessário.
- Salve as imagens ajustadas como arquivos TIF e repita as etapas 3.2.1 e 3.2.2 para os outros pontos de tempo adquiridos.
- Aplique um filtro de desfoque mediano (por exemplo, raio 3 para imagens de 2048x2048) a todas as imagens para evitar o reconhecimento de artefatos a jusante e, assim, facilitar a identificação precisa da rede. Reduza o tamanho binning (2x2) e salve todas as imagens pré-processadas como arquivos TIF RGB Color em tons de cinza em uma pasta para quantificação. Essas etapas podem ser feitas manualmente ou em modo de lote usando macros que os autores compartilharão mediante solicitação.
- Analise todas as imagens na pasta criada nas etapas 3.1-3.3 usando o modo Processo em lote no Analisador de Angiogênese para ImageJ33. Observe que, dependendo do tamanho das imagens e da memória de trabalho disponível, isso pode levar alguns minutos por imagem.
- Validar os resultados da quantificação examinando as sobreposições das estruturas reconhecidas e as imagens originais. Se o algoritmo reconhecer estruturas artificiais, onde apenas algumas ou nenhuma célula pode ser vista na imagem original, ajuste os parâmetros de pré-processamento e reanalise as imagens originais, ou exclua essas áreas problemáticas e/ou replique as imagens da análise.
- Normalizar os valores obtidos para uma área de 1 mm 2 multiplicando os valores de cada amostra pela razão da área analisada para 1 mm2. Esta etapa é de particular importância se forem usadas imagens de diferentes tamanhos.
- Extrair vários parâmetros da rede, tais como comprimento total da rede, número de junções, número de segmentos, número de segmentos isolados, intervalo de ramificação e malha média, e usá-los para caracterizar a rede endotelial em diferentes momentos e sob diferentes condições de cultura.
4. Procedimento de caracterização 2: Avaliação da deposição de MEC
- Nos momentos finais desejados, avaliar a deposição de MEC por imunofluorescência. Adicionar anticorpos primários contra várias moléculas de MEC em 100 μL do meio de cultura durante as últimas 6 h de cultura ou após a fixação, conforme descrito abaixo.
- Lave as culturas uma vez com 200 μL/poço de PBS por 5 min no TR e fixe-as com 100 μL/poço de paraformaldeído a 4% sob um exaustor químico por 30 min no RT. Observe que é aconselhável fixar todos os poços de uma placa ao mesmo tempo, pois as culturas circundantes podem ser danificadas durante esta etapa. Lavar as culturas fixas com 200 μL/poço de PBS em TR três vezes por 5 min cada vez e armazenar a 4 °C em 200 μL/poço de PBS, ou prosseguir imediatamente para a próxima etapa.
- Antes de incubar com anticorpos primários contra moléculas de MEC após a fixação, incubar as culturas fixas com 200 μL/poço de BSA a 1% em PBS como solução de bloqueio por 30 min na RT.
- Aspirar a solução de bloqueio e incubar com 100 μL/poço da solução de anticorpos primários em BSA a 1% em PBS durante a noite a 4 °C. Lavar com 200 μL/poço de PBS três vezes por 5 min, pelo menos 3 h, e 5 min, respectivamente, em TR.
NOTA: A etapa de lavagem longa é necessária para a difusão completa do anticorpo não ligado para fora do hidrogel.
- Aspirar a solução de bloqueio e incubar com 100 μL/poço da solução de anticorpos primários em BSA a 1% em PBS durante a noite a 4 °C. Lavar com 200 μL/poço de PBS três vezes por 5 min, pelo menos 3 h, e 5 min, respectivamente, em TR.
- Para facilitar a penetração da solução de coloração secundária, incluindo contracolorações intracelulares, permeabilizar as culturas usando Triton X-100 0,3% e BSA 1% em PBS por 30-90 min em RT, dependendo da densidade celular das culturas.
NOTA: Para a coloração baseada em anticorpos de moléculas intracelulares, esta etapa deve ser realizada antes da incubação com o anticorpo primário descrito na etapa 4.1.2. - Preparar soluções de coloração secundárias contendo os respectivos anticorpos secundários e contracolorações conforme desejado (por exemplo, uma coloração nuclear como DAPI e uma coloração citoesquelética como faloidina-rodamina).
- Preparar um tampão de coloração composto por Triton X-100 a 0,1%, BSA a 1% em PBS e contracolorações (por exemplo, 1 μg/mL de DAPI e 1:4.000 faloidina-rodamina) e adicionar os respectivos anticorpos secundários nas diluições recomendadas.
- Adicionar 100 μL/poço de solução de coloração secundária e incubar durante a noite a 4 °C. Semelhante ao procedimento após a incubação do anticorpo primário, lavar com 200 μL/poço de PBS três vezes por 5 min, pelo menos 3 h e 5 min, respectivamente, em TR.
- Para a resolução 3D das estruturas, adquira pilhas confocais começando no fundo de vidro com um passo z de 2,5 μm atingindo uma altura final de 500 μm, use uma objetiva de 10x e um zoom digital de 0,75x. Para gerar uma reconstrução 3D do sinal GFP e F-actina em Fiji, limite cada canal separadamente antes de criar um composto e gerar a reconstrução usando o Fiji 3D Viewer.
- Para a visualização da MEC depositada a partir das imunomarcações, adquira pilhas confocais de 100 μm de altura com um passo z de 5 μm, uma objetiva de 10x e um zoom digital de 1,5x. Gere projeções de intensidade máxima e ajuste o brilho e o contraste para cada canal separadamente em Fiji antes de criar um composto.
- Realizar colorações diretas do ambiente extracelular.
- Adicionar 200 μL/poço de solução corante Picrosirius Red aos poços fixados com paraformaldeído e incubar por 1 h em TR.
- Em seguida, lave os poços corados cinco vezes com água destilada, seguido de lavar duas vezes por dia ou a cada dois dias por 3-4 dias enquanto monitora a limpeza da cor da amostra. Mantenha as placas a 4 °C durante as longas etapas de lavagem (ou seja, qualquer coisa que exceda 6 h).
- Adquira imagens das amostras coradas usando um microscópio de campo brilhante equipado com uma câmera colorida e mantenha um equilíbrio de branco igual em todas as condições. Para obter visões gerais das amostras, use uma ampliação baixa (por exemplo, 2,5x) para examinar todo o poço. Se o microscópio não vier com software que suporte costura automatizada, faça-o manualmente (por exemplo, usando Matchwise Stitching em Fiji34).
NOTA: Os poços anteriormente utilizados para imunofluorescência podem ser utilizados para isso, desde que a aquisição da imagem de fluorescência seja concluída. - Siga os mesmos passos descritos para a coloração Picrosirius Red nas etapas 4.2.1-4.2.3 para realizar a coloração, lavagem e imagem do vermelho de alizarina.
5. Procedimento de caracterização 3: Avaliação da diferenciação osteogênica monitorando a atividade da FA
- Em diferentes momentos finais de cultura (por exemplo, dia 4 e dia 7 de cocultivo), avalie quantitativamente a atividade da ALP usando a coloração 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP)/nitro azul de tetrazólio (NBT).
- Lavar as culturas uma vez com 200 μL/poço de PBS antes de incubar com a solução de substrato BCIP/NBT, que deve ser preparada seguindo as instruções do fabricante. Incubar a 37 °C enquanto monitoriza periodicamente o desenvolvimento da cor. Uma vez que a cor começa a se desenvolver em condições não osteogênicas, lavar imediatamente uma vez com 200 μL/poço de PBS antes de fixar com paraformaldeído a 4%, conforme descrito no passo 4.1.1.
- Adquirir imagens coloridas das amostras coradas, conforme descrito na etapa 4.2.3 para coloração Picrosirius Red.
- Em diferentes momentos finais de cultura (por exemplo, dia 4 e dia 7 de co-cultivo), quantificar a atividade da FA nos lisados celulares.
- Lavar as culturas três vezes com 200 μL/poço de PBS antes de incubar com 200 μL/poço de Tripsina-EDTA a 0,25% a 37 °C. A cada 10 min, agite as culturas pipetando vigorosamente para cima e para baixo para facilitar a digestão e monitore a morfologia da cultura com um microscópio de cultura celular padrão.
- Uma vez obtida uma suspensão líquida de célula única sem estruturas celulares alongadas nos poços (tipicamente após 20-30 min), transferir as amostras para tubos de 2 mL, adicionar 200 μL de meio basal de CTM para inibir a tripsina e centrifugar a 500 x g por 5 min para peletizar as células recuperadas. Decantar o sobrenadante e congelar os pellets a -80 °C ou seguir directamente para o ponto 5.2.3.
- Descongelar os pellets celulares obtidos na etapa 5.2.2 e incubar com 500 μL de tampão de lise constituído de 0,56 M 2-Amino-2-metil-1-propanol, 0,2% Triton X-100, pH 10, por 30 min sobre gelo. Em seguida, centrifugar a 16.100 x g por 10 min a 4 °C e manter as amostras no gelo. Após as medições descritas na etapa 5.2.7, congelar as amostras a −20 °C ou −80 °C, ou continuar diretamente com a quantificação de DNA, conforme descrito na etapa 5.2.8.
NOTA: O tampão de lise pode ser preparado com antecedência, filtrado estéril e armazenado a 4 °C. - Preparar o reagente ALP constituído por 20 mM de sal dissódico de 4-nitrofenil fosfato hexahidratado e 4 mM de MgCl2 em tampão de lise.
NOTA: É melhor preparar esta solução fresca no dia da quantificação. - Sem perturbar quaisquer detritos peletizados, distribua 50 μL do sobrenadante de lisado celular preparado na etapa 5.2.3 nos poços de uma placa padrão, transparente, de cultura de tecidos de 96 poços em duplicatas. Adicione buffer de lise a dois poços como controles em branco.
- Com uma pipeta multicanal, adicionar 50 μL/poço de reagente ALP aos poços preenchidos na etapa 5.2.5. Agitar brevemente a placa e incubar a 37 °C durante 10 minutos protegido da luz. Poços com maior atividade de ALP aparecerão amarelos. Pare a reação adicionando 100 μL/poço de NaOH 1 M usando uma pipeta multicanal.
- Leia a densidade óptica a 410 nm usando um leitor de placas. Faça a média das duplicatas técnicas e subtraia a média dos controles em branco.
- Realizar a quantificação do DNA para normalizar a atividade da ALP determinada nas etapas anteriores em relação ao número total de células. Aqui, um método baseado em medidas de fluorescência é descrito, mas qualquer outro método para quantificação de DNA em lisados celulares é compatível com o ensaio. Preparar os reagentes e padrões de DNA necessários para a quantificação de DNA usando kits disponíveis comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
NOTA: Recomenda-se o uso de tampão de lise para preparar os padrões de DNA. - Se as amostras utilizadas para a quantificação da FA descritas no passo 5.2.3 forem congeladas, descongelá-las, centrifugar a 16.100 x g durante 2 min a 4 °C e colocá-las no gelo. Sem perturbar nenhum detrito peletizado, distribua 50 μL do sobrenadante lisado celular nos poços de uma placa preta de 96 poços em duplicatas. Congelar as amostras a −20 °C ou −80 °C e repetir as quantificações de ALP e ADN, se necessário. Adicione os padrões de DNA em duplicatas.
- Com uma pipeta multicanal, adicione 50 μL do agente de coloração de DNA, incube e leia a intensidade da fluorescência de acordo com as instruções do fabricante. Usando os valores da curva padrão, determine e aplique a conversão dos valores de intensidade medidos às concentrações de DNA.
- Normalizar os valores de FA obtidos no passo 5.2.7 dividindo-os pela respectiva concentração de ADN de cada amostra.
6. Aplicação 1: Realização de ensaios de sensibilidade a drogas
- Quando as redes endoteliais estiverem completamente desenvolvidas (tipicamente no 4º dia das coculturas de células estromais-endoteliais), adicionar compostos antiangiogênicos, como o bevacizumabe, às culturas em meio de cultura fresco e testar sua atividade ao longo do tempo e sob diferentes condições (por exemplo, diferentes concentrações de FGF-2 ou BMP-2).
- Preparar meio de cultura fresco contendo os mesmos fatores de crescimento utilizados para as respectivas culturas até aquele momento.
- Preparar uma solução de controlo que consista no diluente do composto de interesse (por exemplo, para o bevacizumab: 60 mg/ml de α-trealose di-hidratada, 0,4 mg/ml de Tween20, 5,8 mg/ml de fosfato de sódio, monobásico e monohidratado, e 1,2 mg/ml de fosfato de sódio dibásico, anidro) e filtrá-la estéril.
- Adicionar o composto de interesse na concentração desejada (por exemplo, 10 μg/mL de bevacizumabe) e um volume igual da solução controle ao meio de cultura designado para as condições de teste e controle, respectivamente.
- Preparar meio de cultura fresco contendo os mesmos fatores de crescimento utilizados para as respectivas culturas até aquele momento.
- Aspirar o meio da cultura e adicionar 200 μL/poço do meio acabado de preparar na etapa 6.1.1. Incubar por um tempo apropriado para o composto a ser testado (por exemplo, para bevacizumab: 2 dias). Monitorar o desenvolvimento da cultura e caracterizar as redes endoteliais conforme descrito na seção 3. Avaliar a eficácia do composto em inibir a angiogênese ou ablar as estruturas pré-formadas utilizando as imagens de GFP e os parâmetros quantitativos da rede extraídos da análise descrita na etapa 3.7.
7. Aplicação 2: Estabelecimento de sistemas avançados de co-cultura com vários tipos de células cancerosas
- No 4º dia de co-cultivo, quando as redes endoteliais estão mais estabelecidas, adicionar outros tipos celulares, como células cancerosas MDA-MB-231 ou U2OS, às culturas em meio de cultura fresco.
- Rotular as células cancerosas usando um corante vivo compatível com células, de acordo com as instruções do fabricante, a fim de ser capaz de distingui-las das HUVECs marcadas com GFP e hBM-MSCs não marcadas nas co-culturas.
- Preparar uma suspensão de células cancerosas na concentração de 1,5 x 104 células/mL em meio de cultura fresco contendo os mesmos fatores de crescimento utilizados para as respectivas culturas até aquele momento.
- Monitorar o desenvolvimento da cultura e a localização das células cancerígenas conforme desejado.
NOTA: Dependendo do tipo de câncer, atividade e ambiente, pode levar alguns dias para que eles atinjam as estruturas vasculares nas coculturas de células estromais-endoteliais (por exemplo, 2 dias para MDA-BM-231 e U2OS). Portanto, a imagem de lapso de tempo para visualizar as interações células cancerígenas-vasculares deve ser cronometrada de acordo.
Representative Results
Culturas de nicho vascular foram estabelecidas pela semeadura sequencial de hBM-MSCs e GFP-HUVECs em hidrogéis pré-moldados à base de PEG com um gradiente de rigidez dentro de uma placa de imagem de 96 poços (Figura 1). As culturas foram monitoradas longitudinalmente por microscopia de epifluorescência viva e posteriormente caracterizadas em momentos selecionados. O compartimento extracelular foi avaliado por meio de colorações diretas e baseadas em anticorpos. A atividade da ALP foi quantificada após a recuperação e lise das células dos nichos gerados. Além disso, demonstramos a adequação dessa plataforma para ensaios de sensibilidade a drogas antiangiogênicas e como base para modelos de co-cultura de câncer.
Co-culturas de hBM-MSCs e HUVECs que expressam GFP foram estabelecidas pela semeadura 3 x 104 células/poço na ausência de fatores de crescimento ou na presença de FGF-2 ou BMP-2 a 50 ng/mL, conforme descrito no protocolo. Desde cedo, diferenças entre as culturas puderam ser observadas tanto nas imagens de campo claro quanto nas imagens de fluorescência, mostrando apenas as GFP-HUVECs (Figura 2A). Observando-se longitudinalmente as mesmas áreas, observaram-se diferenças no desenvolvimento das culturas, como um desenvolvimento mais rápido na presença do FGF-2. Geralmente, as culturas mostraram-se menos desenvolvidas na ausência de qualquer fator de crescimento, com menos células de ambos os tipos se espalhando e a presença de áreas acelulares. Em contraste, as imagens de campo claro mostraram as culturas mais densas na presença de BMP-2. No entanto, redes vasculares formaram-se em ambas as condições contendo fator de crescimento, e as redes mais extensas e interconectadas foram formadas com FGF-2. Essas diferenças observadas também puderam ser quantificadas usando o Angiogenesis Analyzer for ImageJ. De fato, o comprimento total da rede foi maior na presença de FGF-2 e menor na ausência de fatores de crescimento (Figura 2B). O número de junções indicadoras de pontos de ramificação nas redes seguiu a mesma tendência do comprimento total (Figura 2C). Por outro lado, ambas as condições contendo fator de crescimento apresentaram significativamente menos segmentos isolados, indicando maior interconectividade, do que a condição sem qualquer fator de crescimento (Figura 2D). Além disso, imagens confocais 3D revelaram maior penetração de células endoteliais em termos de profundidade na condição estimulada pelo FGF-2 (Figura 2E).
As coculturas hBM-MSC/GFP-HUVEC foram mantidas por 7 dias na presença de FGF-2 ou BMP-2 antes de serem fixadas e coradas para componentes da MEC. As colorações imunocitoquímicas seguidas de microscopia confocal de varredura a laser mostraram diferenças marcantes na morfologia das culturas dependendo do tipo de suplementação do fator de crescimento (Figura 3A). Com o FGF-2, a cultura foi organizada em estruturas microvasculares condensadas, que eram densas em células endoteliais e mesenquimais, enquanto na presença de BMP-2, as hBM-MSCs abrangeram uma área muito maior, como evidenciado nas áreas mais extensas positivas e negativas para F. As proteínas da MEC fibronectina e colágeno I localizaram-se de maneira semelhante, enquanto a laminina e o colágeno IV estavam mais concentrados ao redor das estruturas endoteliais. No entanto, esse aumento da concentração ao redor das estruturas endoteliais foi muito mais pronunciado na presença de FGF-2 do que na presença de BMP-2. Além das colorações baseadas em anticorpos, colorações diretas foram realizadas para avaliar o estado fibrótico geral da MEC (coloração Picrosirius Red; Figura 3B), bem como a deposição de Ca na MEC (coloração em vermelho de alizarina; Figura 3C) dos nichos formados. A coloração Picrosirius Red foi mais forte e extensa nos nichos cultivados com BMP-2, e a coloração Alizarin Red seguiu a mesma tendência.
Em seguida, as culturas foram caracterizadas quanto ao seu potencial osteogênico, avaliando-se a atividade da FA como um marcador osteogênico precoce. No 4º e 7º dia de co-cultivo, as células foram recuperadas dos nichos digerindo-se os hidrogéis com tripsina. Para quantificar a atividade da ALP, as células recuperadas foram lisadas e um ensaio de pNPP foi realizado. Os valores obtidos foram normalizados contra o DNA total de cada amostra para explicar possíveis diferenças no número de células entre as condições. De fato, pequenas diferenças entre o conteúdo de DNA das condições puderam ser observadas, e o menor número de células foi recuperado da condição sem qualquer fator de crescimento (não mostrado). A atividade normalizada da ALP, no entanto, variou muito entre as condições, com uma tendência de aumento da atividade com maiores concentrações de BMP-2 e um platô em 100 ng/mL (Figura 4A,B). Os menores níveis de atividade foram identificados para a condição contendo 50 ng/mL de FGF-2. Embora tendências semelhantes possam ser observadas para ambos os momentos avaliados, todos os valores aumentaram significativamente ao longo do tempo em cultura do dia 4 ao dia 7. Além do ensaio quantitativo, a atividade da FA pôde ser visualizada qualitativamente usando coloração direta de cor baseada na conversão do substrato BCIP/NBT. Coloração roxa mais extensa e mais intensa foi observada na presença de BMP-2 em relação ao FGF-2 (Figura 4C).
Para demonstrar duas potenciais aplicações dos nichos osteogênicos caracterizados, um estudo de sensibilidade a drogas de prova de conceito e co-culturas de câncer foram realizados. Para o ensaio de sensibilidade ao fármaco, bevacizumabe ou uma solução controle consistindo do diluente da formulação de bevacizumabe foi adicionada ao meio de cultura contendo BMP-2 fresco. No dia 4, quando redes estabelecidas foram formadas na presença de 50 ng/mL de BMP-2, a solução controle ou o meio contendo bevacizumabe foram adicionados durante a troca regular do meio, e as culturas foram monitoradas usando imagens de fluorescência. A adição de 10 μg/mL de bevacizumabe levou à retração ou ablação da rede previamente formada, enquanto a condição de controle ainda apresentava extensas redes 2 dias após a troca do meio (Figura 5A,B). Essas alterações também puderam ser quantificadas rastreando-se o comprimento total das redes utilizando o Angiogenesis Analyzer for ImageJ em imagens de fluorescência adquiridas diariamente (Figura 5C). Alternativamente, bevacizumabe ou qualquer outro composto também poderia ser adicionado desde o início da co-cultura para avaliar sua influência na formação das redes. No caso do bevacizumabe, isso inibiu completamente a formação de redes endoteliais (não mostrado).
Para a segunda aplicação, células de câncer de mama MDA-MB-231 ou osteossarcoma U2OS foram adicionadas a co-culturas do dia 4 a uma densidade de 1,5 x 103 células/poço em meio de cultura fresco contendo 50 ng/mL de BMP-2. Para distingui-los dos HUVECs marcados com GFP e dos hBM-MSCs não marcados, as células cancerosas foram incubadas com CellTrace FarRed pouco antes da semeadura nos nichos osteogênicos. As culturas foram monitoradas por microscopia de fluorescência; No início, a maioria das células cancerosas localizava-se perto da superfície do substrato, mas após 2 dias, elas podiam ser encontradas mais próximas das camadas contendo as co-culturas vasculares. Assim, o dia 2 foi selecionado como ponto de partida para a microscopia de lapso de tempo para mostrar a dinâmica das interações entre as células cancerosas e as células dentro do nicho vascular. Curiosamente, as células MDA-MB-231 puderam ser vistas tanto se aproximando quanto se afastando das estruturas endoteliais e, portanto, possivelmente estavam sondando ou remodelando seu ambiente (Figura 5D). Usando CellTrace FarRed como um rótulo para as células cancerosas, GFP como um rótulo para HUVECs, e coloração adicional para F-actina, todos os tipos de células puderam ser distinguidos usando microscopia confocal de varredura a laser (Figura 5E).
Figura 1: Uma abordagem simples para a geração confiável de nichos vascularizados e osteogênicos. Hidrogéis sintéticos pré-moldados com gradiente de rigidez em profundidade permitem a geração de culturas 3D via semeadura sequencial de células sem a necessidade de encapsulamento direto. As CTMs-hBM são pré-cultivadas por 3 dias antes da adição de HUVECs que expressam GFP. As culturas são monitoradas adquirindo sinais de campo claro e GFP longitudinalmente. Em momentos selecionados, os nichos são avaliados quanto à deposição de MEC e estado osteogênico. A atividade da fosfatase alcalina é avaliada através da coloração direta da cor e pela recuperação de células dos nichos e realização de um ensaio de pNPP nos lisados celulares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estimulação de redes vasculares com FGF-2 ou BMP-2. (A) Imagens de campo claro e fluorescência (GFP) foram adquiridas nos dias 2, 4 e 6 da co-cultura de células cultivadas na ausência de fatores de crescimento ou na presença de FGF-2 ou BMP-2, ambas a 50 ng/mL. Barra de escala: 400 μm. (B-D) Parâmetros quantificados das redes GFP-HUVEC imageadas no dia 4 de co-cultura, analisadas usando o Angiogenesis Analyzer for ImageJ. Os dados são representados como média ± desvio padrão. A análise estatística foi realizada com o programa GraphPad Prism 9.5.1. Uma ANOVA unidirecional comum com o teste de comparações múltiplas de Dunnett foi realizada com n ≥ 4; * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. (E) Reconstruções tridimensionais geradas a partir de pilhas confocais (altura total: 547,5 μm; passo z: 2,5 μm) dos sinais GFP e F-actina para as condições estimuladas por FGF-2- (fileira superior) e BMP-2- (fileira inferior). Barra de escala: 300 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Indução de disseminação deslocalizada de hBM-MSC e deposição de MEC por BMP-2. (A-C) As co-culturas de 7 dias cultivadas na presença de FGF-2 ou BMP-2 foram submetidas à (A) imunofluorescência ou (B,C) coloração direta de cor. (A) As culturas foram coradas para F-actina e para as proteínas fibronectina, laminina, colágeno I e colágeno IV. As imagens mostram as projeções de intensidade máxima das pilhas confocais (altura total: 100 μm; passo z: 5 μm). Barra de escala: 200 μm. (B,C) As culturas foram coradas utilizando-se (B) Picrosirius Red e (C) Alizarin Red. A linha superior mostra uma visão geral costurada e completa das imagens adquiridas com aumento de 2,5x (barra de escala: 1.000 μm), enquanto a linha inferior mostra um campo de visão adquirido com aumento de 5x (barra de escala: 400 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Avaliação bioquímica da atividade da ALP induzida por BMP-2 através da coloração direta de cor. (A,B) A atividade da FA foi determinada nos lisados celulares de culturas cultivadas na ausência de fatores de crescimento ou na presença de BMP-2 em diferentes concentrações ou FGF-2 a 50 ng/mL por (A) 4 dias ou (B) 7 dias de co-cultura. A atividade da ALP mostra-se normalizada para o conteúdo de DNA de cada amostra de lisado. Os dados são representados como média ± desvio padrão. A análise estatística foi realizada com o programa GraphPad Prism 9.5.1. Uma ANOVA unidirecional comum com o teste de comparações múltiplas de Dunnett foi realizada com n = 5; P < 0,0001. (C) Coloração direta da atividade da FA em nichos cultivados na presença de 50 ng/mL de FGF-2 ou BMP-2 por 7 dias de cocultivo. As imagens do lado esquerdo retratam uma visão geral costurada de imagens adquiridas com aumento de 2,5x (barra de escala: 1.000 μm), enquanto as imagens do lado direito retratam um campo de visão adquirido com aumento de 5x (barra de escala: 400 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Emprego de nichos vascularizados osteogênicos em modelos avançados de câncer. (A) Os sinais de GFP das culturas cultivadas na presença de BMP-2 foram imageados no dia 4 da co-cultura antes que uma solução controle (esquerda) ou bevacizumab a 10 μg/mL (direita) fossem adicionados por 2 dias, após os quais as culturas foram fotografadas novamente (dia 6 da co-cultura). Barra de escala: 600 μm. (B) Imagens de maior aumento das culturas tratadas com bevacizumabe são mostradas em A. Barra de escala: 250 μm. (C) O comprimento total das redes endoteliais mostrado em A foi quantificado usando o Angiogenesis Analyzer for ImageJ a partir de imagens adquiridas diariamente; n ≥ 3. (D) Células de câncer de mama MDA-MB-231 marcadas com CellTrace FarRed foram adicionadas às co-culturas de 4 dias cultivadas na presença de BMP-2, e imagens de lapso de tempo foram adquiridas a partir de 2 dias após a adição de células cancerosas. Barra de escala: 100 μm. (E) Projeções de intensidade máxima de pilhas confocais (altura total: 70 μm; passo z: 2,4 μm) de coculturas triplas geradas conforme descrito em D e fixadas e coradas para F-actina. Esquerda: nichos com células de câncer de mama MDA-MB-231; direita: nichos com células de osteossarcoma U2OS. Barras de escala para imagens à esquerda: 200 μm; barras de escala para imagens à direita: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo para o estabelecimento de um modelo in vitro de nichos ósseos e medulares altamente vascularizados em uma matriz baseada em PEG 3D totalmente sintética e controlável, que tem uma variedade de aplicações em pesquisa de biologia óssea e medular, engenharia de tecidos e pesquisa de câncer. Este modelo baseia-se em um hidrogel sintético à base de PEG que é funcionalizado com peptídeos RGD e sítios de clivagem MMP e é fundido com um gradiente de densidade em profundidade em placas de imagem de 96 poços com fundo de vidro30. Esta plataforma plug-and-play foi mostrada para permitir o estabelecimento de redes celulares 3D altamente interconectadas sem a necessidade de encapsular células no hidrogel. Semelhante ao protocolo de encapsulamento celular descrito anteriormente, neste trabalho, mostramos a remodelação do substrato por uma ECM28 inerente à célula para criar um microambiente específico do tipo celular. Assim, com esse método, ensaios de triagem de fármacos e análises de alto conteúdo podem ser facilmente realizados em condições de cultura 3D organotípicas e altamente reprodutíveis. As placas de 96 poços com fundo de vidro e os hidrogéis opticamente transparentes tornam a plataforma compatível com automação de manuseio de líquidos e microscopia de alto rendimento.
O primeiro passo para gerar um nicho osteogênico vascular da medula óssea é o pré-cultivo de hBM-MSCs no hidrogel de PEG por pelo menos 3 dias. Durante esse tempo, eles se ligam ao hidrogel, penetram nele e começam a estabelecer contatos célula-célula e deposição de MEC. Antes de semear os hBM-MSCs, o buffer de armazenamento deve ser removido. Como o hidrogel está situado dentro de um poço interno dentro do poço padrão da placa de imagem de 96 poços, é seguro inserir a ponta de aspiração ao longo do lado do poço até que ele toque o anel interno do poço. Uma bomba de vácuo pode ser usada para aspiração se for ajustada com a menor força de sucção possível. Alternativamente, uma lavadora de placas automatizada com a altura do bocal ajustada para pelo menos 0,8 mm acima do anel interno do poço pode ser usada para aspirar o tampão da placa de hidrogel. O uso de automação para manuseio de líquidos pode minimizar danos à superfície do hidrogel e levar a uma maior reprodutibilidade das culturas resultantes. Pequenos defeitos na superfície do hidrogel tornam-se visíveis quando as células se instalam no hidrogel e aparecem em um plano de foco inferior em áreas de hidrogel defeituosas. Portanto, a aquisição de imagens de referência no dia 0 serve como um bom controle de qualidade para a homogeneidade da semeadura celular e integridade da superfície do hidrogel. Embora pequenos defeitos superficiais de hidrogel não impeçam o uso posterior do poço, as células tendem a se agrupar nas áreas defeituosas e podem crescer em padrões não representativos ou chegar mais rapidamente ao vidro inferior, onde crescem em uma monocamada. Esses artefatos devem ser observados ao usar/avaliar esses poços. Considerações semelhantes se aplicam a quaisquer alterações de meio realizadas durante toda a duração do ensaio.
A segunda etapa do protocolo envolve a adição de GFP-HUVECs à monocultura pré-formada de hBM-MSC (dia 0 de co-cultivo). A MEC depositada pelas CTM-hBM fornece um ótimo arcabouço para o crescimento de células endoteliais, que neste trabalho, mesmo na presença de meio condicionado por hBM-MSC, só puderam formar aglomerados redondos de células nos hidrogéis (não mostrados). Ao semeadura nas culturas de hBM-MSC, as HUVECs integram-se e formam estruturas semelhantes a microvasos comparáveis àquelas observadas em co-culturas geradas pelo encapsulamento celular27,28. Normalmente, redes microvasculares 3D bem desenvolvidas se formam dentro de 4 dias após a co-cultura, e isso pode ser monitorado longitudinalmente pelo uso de HUVECs marcadas com GFP. Essas estruturas podem ser mantidas por pelo menos 7 dias em cultura, ou seja, há tempo suficiente para acompanhar mudanças na organização da rede vascular em resposta a tratamentos, como para a triagem de drogas antiangiogênicas. Os elementos morfológicos da rede endotelial podem ser quantificados em modo batch segmentando as imagens de GFP usando ferramentas bem estabelecidas, como o plugin Angiogenesis Analyzer do ImageJ33, e seus parâmetros podem ser usados para avaliar, por exemplo, a eficácia e a farmacodinâmica de drogas.
Uma vantagem significativa do modelo celular descrito para muitas aplicações potenciais é a sua plasticidade. A simples suplementação do meio de cultura com diferentes fatores de crescimento pode alterar a aparência da co-cultura. Por exemplo, a presença de BMP-2 durante todo o período de monocultura e co-cultura cria um nicho vascular osteogênico, mostrando aumento da atividade da FAL, deposição de cálcio extracelular, bem como montagem e deposição de MEC. Ao contrário, na presença de FGF-2, os marcadores osteogênicos estão ausentes, e a co-cultura forma menos associações de células laterais, mas mostra crescimento de células 3D mais pronunciado. O fato de que o FGF-2 suprime a atividade da FA enquanto a BMP-2 provoca maior atividade da FA em comparação com nenhum tratamento com fator de crescimento está de acordo com observações anteriores27. No entanto, apesar dessas grandes diferenças no componente estromal hBM-CTM, a extensão da rede microvascular foi muito semelhante para as duas condições tratadas com fator de crescimento neste trabalho. Nas culturas controle, apenas algumas redes vasculares curtas se formaram, representando talvez um nicho de medula óssea pouco vascularizado. Isso sugere que, simplesmente alterando o tipo, a concentração e o tempo dos fatores de crescimento adicionados ao meio de cultura, uma variedade de nichos de medula óssea vascularizados bem definidos, como seria necessário para estudos comparativos, poderia ser produzida. No entanto, para garantir resultados reprodutíveis, é importante notar que a progressão e a morfologia da cultura podem variar dependendo da história das células usadas (por exemplo, o número de passagem e o método de descolamento usado durante a manutenção rotineira da cultura), e é aconselhável controlar esses fatores durante o desenho do ensaio.
Aqui, como primeira aplicação deste modelo, demonstramos a sensibilidade das redes microvasculares projetadas ao tratamento com 10 μg/mL de bevacizumabe. Notadamente, é importante confirmar que o algoritmo utilizado é capaz de reconhecer com precisão a rede endotelial, uma vez que artefatos são frequentemente gerados em imagens com redes pouco desenvolvidas. Se esse for o caso, os parâmetros usados para o processamento de imagens (antes e durante a segmentação) precisam ser ajustados, muitas vezes em uma base de tentativa e erro.
Como segunda aplicação, apresentamos um modelo avançado de co-cultura formado pela semeadura sequencial de células mesenquimais, endoteliais e cancerosas. Esse modelo permite estudar as interações entre as células cancerosas, o estroma e a vasculatura da medula óssea, que podem ser fatores importantes durante a metástase. Além disso, este modelo pode ser usado para aplicações de triagem de drogas e testes de compostos com alvos além da angiogênese.
Em culturas 2D, as células não recebem sinais microambientais fisiológicos, não adquirem morfologias celulares naturais e, consequentemente, diferenciam-se diferentemente das células em ambientes 3D nativos35. Quando cultivadas em hidrogéis 3D projetados, as células depositam precocemente uma MEC inerente, que fornece sítios de adesão e pode ser ativamente remodelada28,36. Aqui, para estabelecer um modelo 3D simplificado para aplicações de triagem, células formadoras de vasos foram semeadas na superfície de hidrogéis projetados e permitiram estabelecer redes vasculares na ausência de perfusão. As avaliações por imagem foram realizadas em projeções 2D das células endoteliais que contribuem para as estruturas vasculares. No entanto, apenas imagens confocais revelaram o crescimento menos pronunciado das redes vasculares 3D nas amostras estimuladas por BMP-2 quando comparadas às amostras estimuladas por FGF-2. Isso sugere que o comprimento das estruturas vasculares formadas foi subestimado, enquanto sua conectividade foi superestimada. Além disso, as interações entre células perivasculares e endoteliais e a formação do lúmen vascular não foram investigadas. Estes aspectos, especialmente em termos de respostas ao tratamento medicamentoso, exigirão maior atenção. Finalmente, protocolos refinados para estabelecer primeiramente extensas redes vasculares 3D e só então induzir sua diferenciação osteogênica seriam desejáveis para gerar modelos mais fisiológicos de osso e medula óssea.
No geral, o modelo apresentado aqui é altamente versátil e pode ser facilmente adaptado para aplicações específicas. Por exemplo, células mesenquimais e endoteliais de diferentes fontes poderiam ser usadas. Sabe-se que as CTMs de tecido adiposo e de cordão umbilical expressam fatores angiogênicos diferentes em relação às CTMs de MO, podendo ser facilmente substituídas como componente estromal alternativo37. Células endoteliais isoladas de nichos medulares já definidos também poderiam ser usadas em vez de HUVECs. Pode-se também estabelecer a co-cultura com células mesenquimais e endoteliais da medula óssea derivadas do paciente, pareadas para aplicações em medicina personalizada, como recentemente foi sugerido para coculturas musculares vascularizadas38. Além disso, o design da placa de hidrogel permite o monitoramento longitudinal da cultura com microscopia de campo claro e fluorescência, oferecendo ao usuário a possibilidade de encurtar ou estender o tempo de cultura dependendo da aplicação. Alternativamente, as densidades celulares usadas para semeadura podem ser ajustadas de acordo para acelerar ou retardar a formação da rede celular se forem necessários tempos de observação mais curtos ou mais longos do que os deste protocolo. Em qualquer caso, é necessário cuidado para evitar o crescimento excessivo de células em estruturas semelhantes a folhas, o que pode levar à contração do hidrogel e eventual descolamento celular.
Finalmente, uma ampla gama de ensaios pode ser realizada usando este modelo. Além da imunofluorescência e microscopia realizadas em culturas vivas ou fixas, as culturas 3D podem ser digeridas enzimaticamente, e as células podem ser recuperadas e submetidas a qualquer tipo de ensaio bioquímico. Aqui, demonstramos a determinação da atividade de ALP e quantificação do conteúdo de DNA em lisados celulares usando ensaios colorimétricos/fluorométricos, mas o sistema é compatível com muitas outras técnicas, incluindo PCR, RNAseq e proteômica. Se a sensibilidade do ensaio desejado não for muito alta, pode-se reunir amostras de mais de um poço para aumentar a quantidade de amostra disponível para o ensaio. Se a aplicação desejada requer dissolução mais rápida do gel, a agitação orbital da placa pode ser aplicada em combinação com volumes menores da solução digestiva para garantir a formação de vórtices nos poços, supondo que todos os poços da placa serão usados dessa maneira (culturas vivas são sensíveis a esse manuseio severo). Em resumo, apresentamos aqui um protocolo que, se usado como descrito, garante a geração de um modelo in vitro que recapitula os principais aspectos dos nichos vasculares osteogênicos, mas também é versátil o suficiente para ser modificado para aplicações sob medida.
Disclosures
A Ectica Technologies AG é a fabricante da placa de poço hidrogel 3DProSeed e tem interesses comerciais. Benjamin R. Simona e Martin Ehrbar são acionistas da Ectica Technologies AG.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Riccardo Urbanet pela assistência técnica com os dispositivos de manuseio de líquidos e a Rodi Odabasi pelo suporte com a microscopia de epifluorescência. Este trabalho foi financiado pela Swiss National Science Foundation (números de concessão 310030E_202429 e 205321_204318) e pela Ectica Technologies AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 2 mL microtubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 2-Amino-2-methyl-1-propanol | Sigma | A9199 | |
| 3DProSeed hydrogel well plate | Ectica Technologies | ECT.PS1.001.096 | |
| 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma | 71768 | |
| Alizarin Red S | Sigma | A5533 | |
| Anti-Collagen IV antibody | Abcam | ab6311 | |
| Anti-Laminin 1+2 antibody | Abcam | ab7463 | |
| Automated plate washer | Agilent Biotek | ELχ50 | |
| Automated washer/dispenser | Agilent Biotek | MULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette | |
| Bevacizumab | Evidentic | ID PS-E07-2019-00119 A009 | |
| BMP-2 | Peprotech | 120-02C | |
| BSA | AppliChem | A1391 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | To centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Stellaris 5 | |
| Conical 50 mL centrifuge tubes | TPP | 91050 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 406406 | |
| DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 405312 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Epifluorescence microscope | Leica | DMI6000B | |
| FBS | Gibco | 10500-064 | |
| FGF-2 | Peprotech | 100-18B | |
| Fibronectin (IST-9) | Santa Cruz | sc-59826 | |
| GFP-HUVECs | PELOBiotech | PB-CAP-0001GFP | |
| hBM-MSCs | - | - | Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359 |
| Inverted microscope | Zeiss | 200M | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cell line | - | Kindly obtained from J Massagué at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | |
| MEMα | Gibco | 22571-038 | |
| Multimode imaging reader | Agilent Biotek | Cytation 1 | For automated imaging |
| Multimode imaging reader - fluorescence and absorbance | Agilent Biotek | Cytation 5 | For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis |
| Paraformaldehyde | Artechemis | US 040 | |
| PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phalloidin-rhodamine | Invitrogen | R415 | |
| Picro-Sirius Red Solution | Abcam | ab246832 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | ThermoFisher Scientific | P7589 | |
| Recombinant Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab260043 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Sigma | B5655-25TAB | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1064981000 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Sigma | S-0876 | |
| Sodium phosphate monobasic, monohydrate | Merck | 1.06346 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween20 | AppliChem | A4974 | |
| U2OS osteosarcoma cell line | - | Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich | |
| α-trehalose dihydrate | Sigma | 90208 |
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