Summary
تعمل منصة التصوير "The Lifespan Machine" على أتمتة المراقبة مدى الحياة لعدد كبير من السكان. نعرض الخطوات المطلوبة لأداء العمر الافتراضي ، ومقاومة الإجهاد ، والتسبب في المرض ، وفحوصات الشيخوخة السلوكية. تسمح جودة البيانات ونطاقها للباحثين بدراسة التدخلات في الشيخوخة على الرغم من وجود اختلاف بيولوجي وبيئي.
Abstract
تظهر المتطابقة وراثيا المحفوظة في بيئة ثابتة توزيعا واسعا للأعمار ، مما يعكس جانبا عشوائيا كبيرا غير وراثي للشيخوخة المحفوظة في جميع الكائنات الحية التي تمت دراستها. يعني هذا المكون العشوائي أنه من أجل فهم الشيخوخة وتحديد التدخلات الناجحة التي تطيل العمر أو تحسن الصحة ، يجب على الباحثين مراقبة أعداد كبيرة من التجارب في وقت واحد. يحد تسجيل الوفيات اليدوي التقليدي من الإنتاجية والحجم المطلوبين لاختبار الفرضيات على نطاق واسع ، مما يؤدي إلى تطوير طرق آلية لمقايسات العمر عالي الإنتاجية. آلة Lifespan (LSM) عبارة عن منصة تصوير عالية الإنتاجية تجمع بين الماسحات الضوئية المسطحة المعدلة ومعالجة الصور المخصصة وبرامج التحقق من صحة البيانات لتتبع الديدان الخيطية مدى الحياة. تشكل المنصة تقدما تقنيا كبيرا من خلال توليد بيانات عمر زمنية عالية من مجموعات كبيرة من على نطاق غير مسبوق وبدقة إحصائية ودقة مساوية للفحوصات اليدوية التي يقوم بها باحثون ذوو خبرة. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير LSM بشكل أكبر لتحديد التغيرات السلوكية والمورفولوجية التي لوحظت أثناء الشيخوخة وربطها بالعمر. هنا ، نصف كيفية تخطيط وتشغيل وتحليل تجربة العمر الآلي باستخدام LSM. نسلط الضوء كذلك على الخطوات الحاسمة المطلوبة للجمع الناجح للبيانات السلوكية ومنحنيات البقاء عالية الجودة.
Introduction
الشيخوخة هي عملية معقدة ومتعددة الأوجه تتميز بانخفاض في الوظيفة الفسيولوجية للكائن الحي ، مما يؤدي إلى زيادة خطر الإصابة بالأمراض والموت بمرور الوقت1. العمر ، الذي يقاس بالوقت من الولادة أو بداية مرحلة البلوغ حتى الموت ، يوفر نتيجة لا لبس فيها للشيخوخة2 ووكيل غير مباشر ولكنه كمي صارم لقياس المعدل النسبي للشيخوخة بين السكان3. غالبا ما تعتمد دراسات الشيخوخة على قياسات دقيقة للعمر ، على غرار التجارب السريرية ، لمقارنة النتائج بين مجموعة سكانية واحدة معرضة للتدخل ومجموعة تحكم غير مكشوفة. لسوء الحظ ، تسود مشكلات التكاثر أبحاث الشيخوخة ، ويرجع ذلك أحيانا إلى التجارب الضعيفة إحصائيا4 وغالبا بسبب الحساسية المتأصلة لمقايسات العمر للاختلافات الدقيقة في البيئة5. تتطلب التجارب القوية تكرارات متعددة لمجموعات سكانية كبيرة ، وتستفيد هذه العملية بشكل خاص من قابلية التوسع التجريبية التي توفرها الأتمتة6.
تنشأ المتطلبات الصارمة لفحوصات العمر من عدم القدرة على التنبؤ بعملية الشيخوخة نفسها. يظهر الأفراد المتساويون المجينيون الموجودون في بيئات متطابقة أوقات وفاة مختلفة ومعدلات تدهور فسيولوجي7 ، مما يشير إلى أن العمر ينطوي على درجة عالية من الاستواء 7,8. لذلك ، هناك حاجة إلى عدد كبير من السكان لقياس التغيرات الكمية في عملية الشيخوخة ، مثل التغيرات في متوسط أو الحد الأقصى للعمر ، والتغلب على التحيزات الناشئة عن التباين الفردي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن القدرة على مقايسات العمر عالي الإنتاجية أمر بالغ الأهمية لدعم دراسات أشكال منحنى البقاء على قيد الحياة ونماذج ديناميكيات الشيخوخة9.
تعد الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans نموذجا لا يقدر بثمن لأبحاث الشيخوخة نظرا لعمرها القصير ، وقابليتها للجذب الجيني ، ووقت التوليد السريع ، مما يؤكد ملاءمتها لفحوصات الشيخوخة عالية الإنتاجية والعمر. تقليديا ، عمر في C. تم قياس elegans من خلال تتبع مجموعة صغيرة متزامنة من حوالي 50-100 بمرور الوقت على وسائط صلبة وتدوين وقت الوفيات الفردية. مع تقدم في العمر وفقدان القدرة على الحركة ، يتطلب تسجيل أوقات الموت يدويا حث بشكل فردي والتحقق من الحركات الصغيرة للرأس أو الذيل. عادة ما تكون هذه عملية شاقة وشاقة ، على الرغم من الجهود المبذولة لتسريعها10،11،12. الأهم من ذلك ، أن خطوط الأنابيب التجريبية البطيئة تعيق التقدم في فهمنا للشيخوخة وفعالية التدخلات المختبرة.
لتلبية متطلبات أبحاث الشيخوخة للبيانات الكمية ، تم تطوير العديد من التقنيات لأتمتة جمع البيانات ، بما في ذلك مجموعة رائعة من الأساليب من غرف الموائع الدقيقة إلى الماسحات الضوئية المسطحة13،14،15،16،17،18. يختلف LSM عن الطرق الأخرى في تحسينه الشامل لجمع بيانات العمر عالية الدقة والدقة ، والتي يتم تحقيقها من خلال تطوير بروتوكولات معايرة المعدات الدقيقة جنبا إلى جنب مع مجموعة برامج واسعة النطاق تسمح للمستخدمين بالتحقق من صحة التحليلات الآلية وتصحيحها وتحسينها13. على الرغم من أنه يمكن تطبيق البرنامج ، من حيث المبدأ ، على طرق تصوير متنوعة ، في الممارسة العملية ، يستخدم معظم المستخدمين ماسحات ضوئية مسطحة معدلة للسماح بالتحكم الدقيق في درجة الحرارة والرطوبة البيئية - وهي عوامل ذات أهمية حاسمة بسبب تأثيرها الكبير على العمرالافتراضي 19. يلتقط LSM صورا للديدان الخيطية كل 20 دقيقة على فترات تتراوح من أيام إلى أشهر ، اعتمادا على الظروف البيئية والنمط الوراثي. البيانات الناتجة ذات دقة زمنية أعلى بكثير مقارنة بالبيانات من المقايسات اليدوية ، وتوفر الصور التي تم جمعها سجلا مرئيا دائما لموضع الديدان الخيطية عبر العمر. باستخدام أساليب التعلم الآلي ، يتم تعيين أوقات الوفاة تلقائيا لكل فرد. يمكن التحقق من صحة هذه النتائج يدويا بسرعة باستخدام برنامج عميل يسمى "متصفح الدودة". نتيجة لأجهزته وبرامجه ، يمكن ل LSM إنشاء منحنيات بقاء لا يمكن تمييزها إحصائيا عن تسجيل الموت اليدوي على أيدي الباحثين ذوي الخبرة ، مع ميزة إضافية تتمثل في تقليل عبء العمل وقابلية التوسعالعالية 13.
يسمح أحدث إصدار من LSM أيضا بدراسة الشيخوخة السلوكية من خلال جمع البيانات المورفولوجية والسلوكية طوال حياة الديدان الخيطية والإبلاغ عنها جنبا إلى جنب مع عمر كل فرد. على وجه الخصوص ، يلتقط LSM وقت توقف الحركة القوية لكل (VMC) ، وهو معلم يستخدم غالبا لتحديد "العمر الصحي" للفرد على أنه متميز عن عمره. من خلال جمع بيانات العمر والشيخوخة السلوكية في وقت واحد ، يدعم LSM دراسة التدخلات التي قد يكون لها تأثيرات تفاضلية على نتائج النمط الظاهري المختلفة للشيخوخة20. يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية التي يمكن ملاحظتها مجهريا لدراسة الشيخوخة السلوكية ، مثل حركة الجسم أو ضخ البلعوم21 ، وسلامة الأنسجة22 ، وسرعة الحركة أو الدوران الناجم عن التحفيز17. يمكن أن تدعم المقارنات بين الأنماط الظاهرية المختلفة للشيخوخة تحليلات البنية السببية لعمليات الشيخوخة. على سبيل المثال ، تم استخدام المقارنة بين VMC والعمر مؤخرا لتوصيف عمليتين متميزتين للشيخوخة في C. elegans23.
بينما تم تطويره في البداية لقياس العمر في C. elegans ، يدعم LSM جمع بيانات البقاء على قيد الحياة والسلوك من مجموعة من أنواع الديدان الخيطية ، بما في ذلك C. بريجزاي ، سي. تروبيكاليس ، سي. جابونيكا ، سي. برينيري، وب. المحيط الهادئ23. تسهل هذه التقنية دراسة تأثير التدخلات البيولوجية والبيئية على العمر ، ومقاومة الإجهاد ، ومقاومة مسببات الأمراض ويمكن أن تقترن بأدوات تجريبية مثل المقايسات المستهدفة لتداخل الحمض النووي الريبي أو أنظمة تحلل البروتين التي يسببها الأكسين. حتى الآن ، تم استخدامه في الأدبيات العلمية لمجموعة واسعة من التطبيقات6،24،25،26،27،28،29،30.
هنا ، نحدد بروتوكولا خطوة بخطوة لإجراء تجربة Lifespan Machine باستخدام ألواح أجار ، من المراحل الأولية للإعداد التجريبي إلى إخراج منحنيات البقاء الناتجة. من السمات المميزة ل LSM أن الجهد يتم تحميله مسبقا بشكل كبير ، مما يعني أن معظم وقت الباحث يقضي أثناء الإعداد التجريبي ، وبدرجة صغيرة ، أثناء التقاط الصور بعد ذلك. يتم جمع البيانات تلقائيا بالكامل طوال مدة التجربة ويسمح للباحث بالحصول على تجربة "بدون استخدام اليدين". تشترك الخطوات الموضحة هنا بين العديد من الأنواع المختلفة لفحوصات البقاء على قيد الحياة - يتم إجراء نفس الإعداد التجريبي لمقايسات العمر ، والتحمل الحراري ، والإجهاد التأكسدي ، ومقايسات الإمراض. في قسم النتائج التمثيلية ، نناقش مجموعة فرعية من البيانات من مخطوطة منشورة مؤخرا لتوضيح فعالية خط أنابيب التحليل وتسليط الضوء على أهم الخطوات أثناء تحليل الصور23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. متطلبات البرامج والأجهزة
- الماسحات الضوئية المسطحة: من حيث المبدأ ، يمكن تنفيذ LSM باستخدام مجموعة متنوعة من أجهزة التصوير. تتوفر تعليمات مفصلة لتعديلات الماسح الضوئي والتركيز البؤري في مكان آخر13. يظهر جهاز LSM في الشكل التكميلي 1.
- أدوات تحليل البيانات: يحتوي برنامج LSM على ثلاثة مكونات تفاعلية: حزمة برامج التحكم في الماسح الضوئي المستندة إلى Linux ، وحزمة إدارة البيانات الوصفية المستندة إلى متصفح الويب ، وحزمة برامج تحليل صور عميل Windows و Linux. راجع الإرشادات الخاصة بتثبيت أدوات البرامج المنشورة على مستودع GitHub (https://github.com/nstroustrup/lifespan).
- برنامج تصور البيانات والتحقق من صحتها: استخدم Worm Browser ، وهو برنامج عميل ، لجدولة التجارب ، والتحقق من صحة تحليل الصور ، وإجراء التعليق التوضيحي اليدوي لحركة الديدان الخيطية ، وإخراج بيانات البقاء على قيد الحياة. يتم توفير الملفات التنفيذية الثنائية لمتصفح الفيروس المتنقل على أنظمة التشغيل Windows 7 و Windows 8 و Windows 10 ، ويتم تجميع متصفح Worm من التعليمات البرمجية المصدر على Linux أو Apple iOS. يتوفر دليل التثبيت على مستودع GitHub المذكور أعلاه.
الشكل التكميلي 1: أجهزة آلة العمر الافتراضي. وحدة ماسح ضوئي مسطحة واحدة بغطاء مفتوح لإظهار الألواح المحملة ، والتي يتم وضعها متجهة لأسفل إلى 16 فتحة مقطوعة على حصيرة مطاطية. يتم وضع حصيرة المطاط على سطح الماسح الضوئي الزجاجي. تتم كتابة ملصقات الشروط على جوانب اللوحات لتجنب المشكلات أثناء تحليل الصور. يسهل وضع علامة على الشريط بالرقم ("1") و / أو اسم الجهاز ("Jabba") التحقق لاحقا من موقع العينة عند العمل مع أجهزة ماسحة ضوئية متعددة. تم العثور على مزيد من التفاصيل حول مكونات أجهزة LSM في مكان آخر13. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
2. الإعداد قبل يوم التجربة
- معايرة درجة حرارة الحاضنة: درجة الحرارة البيئية هي المحدد الرئيسي ل C. عمر ايليجانس 19. للحصول على نتائج دقيقة ، قم بإجراء التقاط الصور عند درجة حرارة معايرة بعناية ، مع الحفاظ على ثباتها طوال التجربة. لتحقيق ذلك ، قبل أيام قليلة من بدء التجربة ، قم بقياس ومعايرة درجة حرارة سطح كل ماسح ضوئي أثناء التشغيل. استخدم المزدوجات الحرارية عالية الدقة كما هو موضح في مكان آخر31 (انظر جدول المواد).
- تخطيط لوحة الماسح الضوئي: قبل بدء التجربة ، خطط للتخطيط الأمثل للوحات الاستزراع لكل ماسح ضوئي.
ملاحظة: الغرض من ذلك هو تجنب إدخال عوامل مربكة ناتجة عن اختلاف درجة الحرارة بين الماسحات الضوئية وعبر سطح كل ماسح ضوئي. تختلف الماسحات الضوئية بمهارة في متوسط درجة حرارة سطحها ، علاوة على ذلك ، تظهر تحيزات دقيقة في درجة الحرارة عبر سطحها31.- موضع لوحة الماسح الضوئي: للتحكم في هذه التأثيرات الحرارية في تحليل البيانات اللاحق ، قم بتوزيع أي متغيرات بيولوجية مشتركة بشكل عشوائي فيما يتعلق بموضع الماسح الضوئي ، وقم بتوحيد موقع اللوحة عبر جميع الماسحات الضوئية.
- عدد العينات عبر الماسحات الضوئية: عند استخدام تخطيط الحصيرة المطاطية ال 16 (انظر جدول المواد) ، ضع أربع لوحات لكل حالة في كل ماسح ضوئي ، بإجمالي أربعة ماسحات ضوئية على الأقل. يضمن ذلك توزيع كل حالة عبر ماسحات ضوئية متعددة ، بحيث يمكن تحديد التأثيرات المربكة لدرجة حرارة الماسح الضوئي وإزالتها أثناء تحليل البيانات13. لجعل هذا التحليل أكثر وضوحا ، قم بتضمين شرط مرجعي مشترك (على سبيل المثال ، عينات من النوع البري) على كل ماسح ضوئي.
ملاحظة: بشكل عام ، نظرا لوضع مراوح الماسح الضوئي ، تكون الألواح الموجودة في الزاوية العلوية اليمنى من الحصيرة المطاطية أكثر عرضة للجفاف. اترك هذا الموقع فارغا إذا لزم الأمر.
- لوحات وإعداد عينة
- صب ألواح الاستزراع: للحصول على التجفيف الأمثل لألواح زراعة الماسح الضوئي (انظر جدول المواد) ، صب وسط أجار قبل 4 أيام من تحميل الديدان الخيطية. على الرغم من أن تركيز الماسح الضوئي قابل للتعديل للسماح بإضافة أحجام مختلفة من الآجار إلى الألواح ، إلا أن حجم اللوحة القياسي هو 8 مل.
ملاحظة: قد يكون من المفيد صب الألواح بمضخة تمعجية ، خاصة للتجارب الكبيرة. - بذر الألواح: بذر الألواح بالثقافة البكتيرية المرغوبة قبل 2 أيام على الأقل من بدء التجربة للسماح بالتجفيف السليم ونمو العشب البكتيري. عادة ، 200 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية كافية لتشكيل العشب الذي سيغذي 40 الديدان الخيطية لعدة أسابيع.
ملاحظة: اللوحات المستخدمة عادة للتصوير محكمة الغلق أكثر من أطباق بتري الاستزراع القياسية. لذلك ، ينصح بزرع وتجفيف الألواح داخل غطاء المختبر ، عادة لمدة 1 ساعة تقريبا أو حتى تجف بشكل صحيح.
- صب ألواح الاستزراع: للحصول على التجفيف الأمثل لألواح زراعة الماسح الضوئي (انظر جدول المواد) ، صب وسط أجار قبل 4 أيام من تحميل الديدان الخيطية. على الرغم من أن تركيز الماسح الضوئي قابل للتعديل للسماح بإضافة أحجام مختلفة من الآجار إلى الألواح ، إلا أن حجم اللوحة القياسي هو 8 مل.
- التعامل مع الديدان الخيطية
- حجم السكان: يعتمد عدد الديدان الخيطية التي يمكن تصويرها بشكل موثوق على طبق واحد على النمط الوراثي ، والعمر الذي يتم فيه طلاء الديدان الخيطية ، وكمية الطعام المضافة إلى كل طبق. بالنسبة لتجارب العمر التي تبدأ في مرحلة البلوغ المبكرة ، قم بتحميل ما يقرب من 40 لكل طبق. يضمن هذا العدد طعاما كافيا ويتجنب الازدحام.
- تزايد عدد السكان الكبير: للتحضير للتوسع السكاني والتزامن ، ابدأ بمجموعة من الديدان الخيطية المناسبة لطريقة التزامن المختارة (انظر أدناه). تهدف إلى إجراء التزامن على في سن الحد الأقصى لإنتاج البيض ، والذي بالنسبة للحيوانات البرية N2 هو اليوم الثاني من مرحلة البلوغ32.
ملاحظة: سبب آخر لمزامنة المجموعات باستخدام في اليوم الثاني من مرحلة البلوغ هو إزالة عمر الأم كعامل مساهم في عدم تجانس السكان. عمر الأم في C. لقد ثبت أن elegans يؤثر على سمات اللياقة البدنية المتعددة في النسل ، حيث تنتج البرية من النوع 2 ذرية "عالية الجودة"33. - إجراء مزامنة العمر: للحصول على نتائج دقيقة ، قم بمزامنة عمر بأكبر قدر ممكن من الدقة. في هذا البروتوكول ، يتم إجراء تزامن العمر باستخدام علاج هيبوكلوريت معدل34. قد تشمل الطرق الأخرى التزامن عن طريق تسريح البيض ، أو عن طريق إيقاف اليرقات L1 ، أو عن طريق قطف يرقات L4 يدويا.
ملاحظة: لتزامن العمر عن طريق علاج هيبوكلوريت ، توقع الحصول على ثلاث إلى أربع بيضات من كل خنثى بالغ. - الحفاظ على مجموعات خالية من النسل: الحفاظ على السكان الخاليين من النسل عن طريق تعريض الديدان الخيطية خلال مرحلة L4 المتأخرة إلى 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) 35.
ملاحظة: عند الجرعات المنخفضة ، يكون FuDR قاتلا للأجنة النامية دون إحداث تغييرات مرئية مجهرية على الخط الجرثومي أو تغيير معدل إنتاج البويضات. تشمل الطرق الأخرى استخدام طفرات معقمة بدرجة الحرارة ، أو استخدام تركيبات RNAi للتعقيم ، أو ببساطة الانتظار حتى الشيخوخة بعد الإنجاب لنقل الديدان الخيطية إلى لوحات للتصوير. - نقل السكان: عند نقل آلاف بين الألواح ، يصبح البروتوكول القياسي الذي يتضمن سلك البلاتين / الإيريديوم شاقا. الطرق التي تنطوي على التعليق السائل للديدان الخيطية تسهل عمليات النقل وتجعلها أكثر كفاءة. اجمع الديدان الخيطية باستخدام المخزن المؤقت M9 + Mg (Na2HPO4 42.27 mM ، KH2PO4 22.05 mM ، NaCl 85.56 mM ، MgSO4 1 mM) ، قلل الحجم الكلي بمجرد استقرار الديدان الخيطية عن طريق الجاذبية ، ثم انقل الديدان الخيطية بسرعة إلى الألواح المستخدمة في التصوير.
ملاحظة: قد يؤدي نقل الديدان الخيطية عن طريق التعليق السائل إلى اختلاف في عدد المنقولة إلى كل لوحة. حاول أن تكون متسقا مع عدد الديدان الخيطية على كل لوحة لتجنب التباين التجريبي. - تطبيق التدخلات: يؤدي إيقاف الحصول على الصور وإعادة تشغيلها أثناء التجربة إلى تعقيد تحليل الصور (انظر المناقشة). لذلك ، ابدأ تجارب LSM فقط بعد الانتهاء من معالجة الديدان الخيطية اللازمة.
- تعقيم الحصائر المطاطية: الأوتوكلاف عدد كبير من الحصائر في وقت واحد ، عن طريق لفها بشكل فردي في رقائق الألومنيوم.
ملاحظة: يجب تعقيم الحصائر المطاطية بين الاستخدامات لتجنب تراكم الملوثات الفطرية أو البكتيرية. تتحلل معظم أنواع المطاط المستخدمة عادة عن طريق معالجة الإيثانول العدوانية.
3. الإعداد في يوم التجربة
- دعامة اللوحة وإعداد زجاج الماسحة الضوئية: لتبسيط التعامل مع اللوحة ، لا تقم بتحميل أطباق Petri مباشرة على سطح الماسح الضوئي ، ولكن بدلا من ذلك ثبتها في مكانها باستخدام حصائر مطاطية مدعومة بألواح زجاجية (انظر جدول المواد). يتم تصوير السكان من خلال هذا الزجاج ، لذا حافظ على نظافة الزجاج ومعالجته بطبقة مضادة للضباب وكارهة للماء ومعقمة (انظر جدول المواد).
- قبل تحميل الألواح في الحاضنة ، قم بتنظيف سطح زجاج دعم اللوحة على كلا الجانبين باستخدام منظف زجاج مضاد للضباب.
- قبل تحميل الألواح على زجاج الدعم الخاص بها ، قم بتطبيق معالجة زجاجية واقية كارهة للماء (انظر جدول المواد) لتقليل الضباب على جانب الزجاج الذي سيكون ملامسا للحصيرة المطاطية. انشر هذا العلاج جيدا واتركه على الزجاج لمدة 5-10 دقائق قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. نظف بقوة بعد التطبيق لإزالة أي بقايا.
- ضع 70٪ إيثانول لتطهير سطح الزجاج الذي سيكون ملامسا للمطاط غير اللامع. اتركيه لمدة 1 دقيقة أو 2 دقيقة ، ثم أخرجه بقطعة قماش أو منشفة ورقية.
- تحميل اللوحات على الماسحات الضوئية
- أولا ، ضع الحصائر المطاطية المعقمة أعلى زجاج دعم اللوحة المعالج.
- قم بإزالة الغطاء من الألواح المستخدمة للتصوير باستخدام الديدان الخيطية المحملة ، وضعها على مواقع حصيرة مطاطية تواجه السطح الزجاجي. تأكد من أن السجادة المطاطية محكمة الغلق حول جميع الألواح ، على سبيل المثال ، عن طريق إضافة لوح زجاجي آخر في الأعلى والتأكد من أنها مسطحة أو عن طريق النقر على الجزء العلوي من كل لوحة (ستتحرك الألواح السائبة قليلا وتضرب الزجاج ، مما يصدر صوتا ، بينما لن تتحرك الألواح المؤمنة بإحكام عند النقر عليها).
ملاحظة: من المفيد تسمية كل ورقة من زجاج دعم اللوحة بشكل فردي بشريط وسم بمعلومات حول محتويات اللوحة والماسح الضوئي المقصود. يمكن استخدام هذه البيانات بعد التجربة لحل أي غموض محتمل فيما يتعلق بمواقع اللوحة. - قبل تحميل اللوحات في الماسحات الضوئية ، افصل مراوح الماسح الضوئي لحماية أصابع المجرب أثناء تحميل اللوحة.
- حرك الألواح والصفيحة الزجاجية التي تدعمها برفق على سطح الماسحة الضوئية.
ملاحظة: تجنب الضغط مباشرة على الحصيرة المطاطية ، لأن هذا يتسبب في انزلاق الحصيرة عبر زجاج دعم اللوحة. عندما تنزلق الحصائر ، غالبا ما يتم التخلص من الألواح من السجادة. - أعد تنشيط مراوح الماسحة الضوئية ، وتأكد بصريا من تشغيل المراوح الأمامية والجانبية. إذا تم إيقاف تشغيل الماسحات الضوئية ، فقم بتشغيلها في هذه المرحلة.
4. الحصول على ما قبل الصورة
ملاحظة: يوضح الشكل 1 مخططا انسيابيا شاملا يلخص جميع الخطوات المستندة إلى البرامج أثناء الحصول على الصور.
الشكل 1: نظرة عامة رسومية على خط أنابيب تحليل صورة Lifespan Machine. يتم تنفيذ خطوات الحصول على الصور قبل وأثناء وبعد الحصول على الصورة إلى حد كبير على واجهة الويب (WI ، باللون الأحمر) وعلى متصفح الفيروس المتنقل (WB ، باللون الأخضر). يتم تنفيذ بعض الخطوات في الأنظمة الأساسية الأخرى (O ، باللون الأزرق) ، مثل مستندات TXT في الخطوة 3a ، Photoshop أو ما يعادلها في الخطوة 4b ، و JMP أو ما يعادلها في الخطوة 13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- إعداد الحصول على الصور: أنشئ ملفا يحدد جدول التجربة وموقع اللوحات على كل ماسح ضوئي لتكوين الحصول على الصورة.
ملاحظة: يتضمن هذا الملف بيانات تعريف مهمة مثل عنوان التجربة وتكرار التقاط الصور والمدة الإجمالية للتجربة. عادة، لا يتم إنشاء هذا الملف de novo لكل تجربة، ولكن بدلا من ذلك، يتم إعادة استخدام ملفات التجربة من التجارب السابقة كنماذج. بالنسبة للتجربة الأولى للمستخدم، يتم توفير ملف قالب (الملف التكميلي 1).- طلب لقطات المعاينة: قم بتوفير موقع جميع اللوحات على كل ماسح ضوئي. يتم توفير العديد من الأدوات لتسريع هذه العملية. أولا ، استخدم الماسح الضوئي للحصول على صورة لسطح الماسح الضوئي بالكامل ، تسمى "معاينة الالتقاط". تأكد من أن صور التقاط المعاينة تظهر بوضوح السطح الكامل لكل لوحة ليتم تصويرها (الشكل 2 أ) بدون خطوط أو اقتصاص حواف اللوحة.
- باستخدام واجهة الويب ، ابحث عن قسم الحصول على الصور في الصفحة الرئيسية ، واتبع الرابط المسمى أجهزة الالتقاط وخوادم الصور. في تلك الصفحة ، انقر فوق الزر الذي يحمل علامة البحث عن أجهزة جديدة (أي الماسحات الضوئية) في مربع التقاط الصور وخوادم المعالجة . راقب تقدم الخادم في اكتشاف الماسحات الضوئية من خلال النقر على رابط [log] بجوار الخادم.
ملاحظة: تأكد من تشغيل الماسحات الضوئية المطلوبة وتوصيلها بالخادم قبل تنفيذ هذه الخطوة. - في نفس الصفحة من واجهة الويب، تأكد من ظهور كل ماسح ضوئي متصل بالخادم في المربع أجهزة التقاط الصور . لم يعد يتم عرض تصنيف "مفقود" ضمن "الحالة الحالية" إذا تم اكتشاف الجهاز بنجاح. حدد خانة الاختيار المقابلة لكل ماسحة ضوئية تحتوي على لوحات محملة حديثا.
- في الجزء السفلي من قسم أجهزة التقاط الصور ، انقر فوق الزر طلب التقاط معاينة . في غضون 1 دقيقة أو 2 دقيقة ، يجب أن تضيء الماسحات الضوئية وتبدأ في المسح.
ملاحظة: يجب غالبا ضبط الموضع الأولي لألواح الدعم الزجاجية لوضع جميع اللوحات في النطاق القابل للعرض. يمكن تصحيح المواضع عن طريق فحص صور التقاط المعاينة وإجراء تعديلات على موضع اللوحة واستعادة صور التقاط المعاينة الجديدة. إذا استمرت عمليات المسح ببطء شديد (عدة دقائق لمسح التقاط واحد) أو إذا كانت صور التقاط المعاينة تحتوي على خطوط بيضاء طويلة، فهذه علامة على أن اللوحة أو الحصيرة المطاطية أو أي كائن آخر يحجب الضوء داخل منطقة معايرة الماسح الضوئي (يشار إليها بأسهم بيضاء على سطح الماسحة الضوئية). يجب إعادة وضع جميع الكائنات بحيث يشغل زجاج الدعم الزجاجي فقط هذه المنطقة.
- باستخدام واجهة الويب ، ابحث عن قسم الحصول على الصور في الصفحة الرئيسية ، واتبع الرابط المسمى أجهزة الالتقاط وخوادم الصور. في تلك الصفحة ، انقر فوق الزر الذي يحمل علامة البحث عن أجهزة جديدة (أي الماسحات الضوئية) في مربع التقاط الصور وخوادم المعالجة . راقب تقدم الخادم في اكتشاف الماسحات الضوئية من خلال النقر على رابط [log] بجوار الخادم.
- تحديد مناطق المسح: اتبع الخطوات التالية على Worm Browser لتحليل معاينة التقاط الصور، وتجميعها في صورة مركبة واحدة، والتي تستخدم لتحديد موقع كل لوحة لتحليل البيانات. تأكد من أن الصورة الناتجة تبدو مشابهة للشكل 2B.
- أولا ، باستخدام متصفح الفيروس المتنقل ، افتح كل صورة التقاط معاينة عن طريق تحديد خيار القائمة ملف > فتح الصورة، واختر الصورة المطلوبة.
- في كل صورة ، انقر لتحديد الأعمدة للمناطق ذات الألواح (إذا كانت الحصيرة المطاطية تحتوي على 16 موقعا للوحة ، فحدد 4 أعمدة).
ملاحظة: يجب تحديد مناطق المسح الضوئي كأعمدة طويلة (وليس صفوفا عريضة) حيث يكون التقاط الماسحة الضوئية أبطأ للمناطق الأوسع، مما ينتج عنه صور ضبابية بسبب حركة الديدان الخيطية. - بمجرد تحديد جميع الصور ، قم بتصدير مواصفات المنطقة إلى القرص عن طريق تحديد عنصر القائمة الحصول على الصور > تحديد مناطق المسح الضوئي > حفظ مناطق المسح المحددة على القرص واختيار الموقع المطلوب.
- إنشاء جدول التجربة:
- باتباع تنسيق الملف التكميلي 1، قم بتجميع ملف يحتوي على اسم التجربة، والمواقع الفعلية لكل عمود على الماسحات الضوئية (المنسوخة من ملف مناطق المسح الضوئي الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.1.2.3)، والمدة الإجمالية للتجربة، وتكرار التقاط الصورة، واحفظه كملف TXT وكملف XML.
- ثم ، في متصفح الفيروس المتنقل ، انقر فوق الحصول على الصور > إرسال جدول التجربة ، واختر ملف XML الذي تم إنشاؤه. سيسألك متصفح الفيروس المتنقل عما إذا كان سيتم إخراج ملخص للجدول أو تشغيل التجربة. انقر فوق إنشاء ملف ملخص.
- التحقق من صحة ملف الملخص: بعد إرسال الجدول الزمني للتجربة، سيخرج متصفح الفيروسات المتنقلة ملخصا للجدول. يظهر هذا الملخص على الشاشة ويكتب على القرص. اقرأها ، وتحقق من تواريخ اللقطات المجدولة ، بالإضافة إلى موقع الماسحات الضوئية واسمها وعددها.
- إرسال جدول التجربة: عند الرضا عن ملف الملخص، حمل ملف XML لجدول التجربة مرة أخرى إلى متصفح الفيروسات المتنقلة عن طريق تحديد خيار القائمة الحصول على الصورة > إرسال جدول التجربة. سيطالبك متصفح الفيروس المتنقل مرة ثانية بما إذا كان سيتم إخراج ملخص للجدول أو تشغيل التجربة. هذه المرة انقر فوق تشغيل! .
ملاحظة: بعد بضع دقائق من إرسال التجربة ، من الحكمة استخدام واجهة الويب للتأكد من إرسال التجربة بنجاح ويتم جمع عمليات المسح بواسطة جميع الماسحات الضوئية. من المعتاد تفويت عمليات الفحص القليلة الأولى ، خاصة في التجارب الكبيرة. - تنظيم التجارب على واجهة الويب: يمكن لمجموعة الماسح الضوئي المزدحمة إنتاج مئات مجموعات البيانات التجريبية التي جمعها العديد من المستخدمين المختلفين. لتنظيم هذه القائمة، يمكنك إسناد التجارب إلى مجموعات منفصلة، على سبيل المثال تقابل اسم المستخدم المسؤول عن التجربة.
- إنشاء مجموعة جديدة أو تعديل مجموعة موجودة: يمكنك إنشاء مجموعات جديدة على واجهة الويب بالنقر فوق إدارة مجموعات التجارب أسفل المربع المسمى Image Acquisition. في الصفحة الجديدة التي ستظهر ، أضف الاسم المطلوب في إنشاء مجموعة جديدة وانقر فوق إنشاء. لتعديل اسم مجموعة موجودة، في المربع نفسه، اختر المجموعة المطلوبة إلى جانب تعديل المجموعة الموجودة، ثم حدد تعديل.
- إسناد تجارب إلى مجموعة: لتعيين تجارب جديدة لمجموعة معينة، انتقل إلى واجهة الويب، وابحث عن التجربة المطلوبة، والتي سيتم تعيينها افتراضيا إلى مجموعة "لا مجموعة " في أسفل قائمة التجارب. انقر على الرابط إلى الجانب الأيمن من قسم التجربة حيث يقول تعديل ، واستخدم القائمة المنسدلة لتحديد اسم المجموعة المراد استخدامها. ثم حدد حفظ.
- إلغاء تجربة:
ملاحظة: سيستمر LSM في العمل بشكل مستقل حتى يتم تحديد عمليات الفحص النهائية في جدول التجربة. بعد اكتمال الجدول التجريبي ، سيستمر LSM ، افتراضيا ، في جمع عمليات المسح ولكن على الفور يتجاهل بيانات الصورة في عملية تسمى المسح التلقائي. يتم إجراء عمليات المسح التلقائي هذه لمنع الماسحات الضوئية من إيقاف التشغيل والتبريد ، والحفاظ على ملف تعريف درجة حرارة قياسي بحيث لا تتأثر أي تجارب أخرى تعمل في نفس المساحة (ولكن من تجربة مختلفة) بإغلاق الماسحات الضوئية الأخرى.- إيقاف عمليات المسح التلقائي: لإيقاف عمليات المسح التلقائي من تجربة جارية على واجهة الويب ، انقر فوق تحرير بجوار التجربة المطلوبة ، ثم إلغاء عمليات الفحص المعلقة ، وحدد إلغاء اللقطات المجدولة.
- طلب لقطات المعاينة: قم بتوفير موقع جميع اللوحات على كل ماسح ضوئي. يتم توفير العديد من الأدوات لتسريع هذه العملية. أولا ، استخدم الماسح الضوئي للحصول على صورة لسطح الماسح الضوئي بالكامل ، تسمى "معاينة الالتقاط". تأكد من أن صور التقاط المعاينة تظهر بوضوح السطح الكامل لكل لوحة ليتم تصويرها (الشكل 2 أ) بدون خطوط أو اقتصاص حواف اللوحة.
الشكل 2: معاينة صورة الالتقاط وتحديد منطقة المسح الضوئي. (أ) لكل ماسح ضوئي في التجربة، يتم إنشاء صورة التقاط معاينة. (B) اختيار صف واحد من اللوحات في كل مرة (المربعات الحمراء) ، مما يزيد من سرعة المسح ويمنع ضبابية حركة الدودة نتيجة مسح المناطق الواسعة جدا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
5. الحصول على الصور
ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوات التالية أثناء تشغيل التجربة أو بعد انتهائها.
- إخراج ملف قناع التجربة: تحتوي بيانات الصورة الأولية من الماسحات الضوئية على العديد من المناطق التي لا تحتاج إلى معالجة (مناطق خارج اللوحات). لتركيز التحليل على كل لوحة على حدة ، يتم إنشاء "قناع" يحدد المساحة التي تشغلها كل لوحة على كل ماسح ضوئي. قم بإنشاء هذا القناع عن طريق رسم موضع كل لوحة كتراكب على الصور التي تم جمعها بواسطة الماسحات الضوئية.
- باستخدام متصفح الفيروس المتنقل ، اختر التجربة المطلوبة عن طريق تحديد ملف > تحديد التجربة الحالية ، ثم انقر فوق اسم التجربة.
- مرة أخرى في متصفح الفيروس المتنقل، حدد الحصول على صورة > تعريف أقنعة نموذجية > إنشاء مركب قناع التجربة، واحفظ القناع في الموقع المطلوب. تأكد من أن الملف الناتج يشبه الشكل 3A.
الشكل 3: مواصفات مواقع اللوحات لكل ماسح ضوئي باستخدام أقنعة العينة. لضمان التحليل المستقل للوحات داخل تحديدات الأعمدة الموضحة في الشكل 1 ، يجب تحديد الألواح الفردية عن طريق إنشاء مركب قناع الصورة. (A) يتم فتح التقاط عمليات المسح الضوئي للماسحات الضوئية باستخدام برنامج معالجة الصور (لاحظ اسم الماسح الضوئي "han" فوق التحديد الممسوح ضوئيا ، و "a-d" يشير إلى كل عمود من الأعمدة). (ب) تتطلب الخطوات الفردية لتوليد القناع لتحديد موقع كل لوحة في مركب القناع ضبط الخلفية على اللون الأسود ، (ج) إزالة الحواف الخشنة وحواف الألواح غير المحددة عن طريق توسيع الخلفية ثم تقليصها ، و (د) تحديد اللوحات الأمامية وملء المناطق بالكامل بالبكسل الأبيض. (ه) لكي يتعرف LSM على اللوحات الفردية في الصفوف الممسوحة ضوئيا ، تمتلئ كل منطقة بيضاء متتالية بظل مختلف من الرمادي ، عادة في سطوع متزايد. (F) في هذه المرحلة، يتم حفظ القناع (ضغط LZW بدون تحديد طبقات إذا تم إنشاؤه في Photoshop). ثم يتم فحص القناع بواسطة متصفح الفيروس المتنقل ، ويتم إنشاء تصور للقناع بواسطة البرنامج. يجب أن يعرض تصور القناع الصحيح مربعا محددا واحدا لكل لوحة مع تقاطع صغير في المنتصف ولون مختلف لكل صف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- إضافة تعليق توضيحي إلى قناع التجربة: افتح الملف الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة باستخدام برنامج معالجة الصور (مثل Photoshop أو GIMP) لتحديد موقع كل لوحة في الصورة. فيما يلي نظرة عامة على جميع خطوات تحرير القناع باستخدام Photoshop.
- في Photoshop، حدد أداة التعبئة مع ضبط التفاوت على صفر، والخيار المجاور محدد، والصقل غير محدد. انقر على الخلفية الرمادية لتعيينها بالكامل على اللون الأسود. تأكد من أن الصورة الناتجة تشبه الشكل 3B.
- استخدم أداة العصا السحرية لتحديد الخلفية السوداء، مع ضبط التعرج على إيقاف التشغيل، وضبط التفاوت على الصفر، وتحديد الخيار المجاور. لتنعيم الحواف ، قم بتوسيع الخلفية المحددة بمقدار 30 بكسل بالنقر فوق تحديد > تعديل > توسيع. ثم قم بتقليص التحديد بمقدار 20 بكسل على تحديد > تعديل > العقد. تأكد من أن الصورة الناتجة تبدو مشابهة للشكل 3C.
- قم بتعبئة الخلفية الناعمة بالكامل بالبيكسلات السوداء، على سبيل المثال، بضبط تفاوت أداة التعبئة إلى 255 وتعبئة المنطقة المحددة. ثم ، انقر فوق تحديد > معكوس لعكس التحديد ، وحدد المقدمة. املأ المنطقة الجديدة بالكامل بالبيكسلات البيضاء، على سبيل المثال، عن طريق ضبط تفاوت أداة التعبئة على 255 وتعبئة المنطقة باللون الأبيض. تأكد من أن الصورة الناتجة تبدو مشابهة للشكل 3D.
- لفصل كل لوحة داخل منطقة واحدة ، املأ كل صف بتدرج مختلف من الرمادي في زيادة السطوع. يمكن القيام بذلك باستخدام أداة التعبئة ثم عن طريق تحديد اللون المطلوب ، مع ضبط التسامح على 0. تأكد من أن الصورة الناتجة تشبه الشكل 3E. احفظه في ضغط LZW بدون تحديد "طبقات".
ملاحظة: يتم ضبط ترتيب اللوحات حسب لون المناطق المحددة. لتسمية اللوحات من 1 إلى 4 بترتيب من أعلى إلى أسفل، حدد الألوان في زيادة السطوع لكل صف. - في متصفح الفيروس المتنقل، حدد الحصول على الصور > تعريف أقنعة العينة > تحليل مواقع الألواح المرسومة على مركب قناع التجربة، وحدد الملف الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة. سيستغرق البرنامج الآن بضع لحظات لتحليل القناع المقدم.
- سيعرض متصفح الفيروس المتنقل مرئيا للقناع. افحص القناع بحثا عن أخطاء محتملة في الملف. تأكد من أن كل صف من الألواح مملوء بلون مختلف ومحدد بمستطيل ملون. تأكد من أن الصورة الناتجة تبدو مشابهة للشكل 3F.
ملاحظة: إذا أظهرت لوحة واحدة دائرتين أو أكثر، أو إذا كانت دائرتان تشتركان في نفس اللون، فارجع إلى الخطوة 5.2 لتصحيح ملف القناع، وقم بتحميله مرة أخرى في مستعرض الفيروس المتنقل. - بعد التحقق من صحة مرئيات القناع، في متصفح الفيروس المتنقل، حدد الحصول على صورة > تعريف أقنعة العينة > إرسال مركب قناع التجربة الذي تم تحليله إلى نظام المجموعة. سيقوم خادم تحليل الصور الآن بتحليل موقع جميع اللوحات في التجربة.
- تطبيق القناع: يستخدم LSM أقنعة لتقسيم بيانات الصورة الأولية إلى لوحات فردية. لبدء هذه العملية، قم بجدولة مهمة تطبيق قناع باستخدام واجهة الويب.
- قبل إرسال المهمة ، تحقق من أن جميع الماسحات الضوئية قد حددت مناطق في القناع. انتقل إلى الصفحة الرئيسية لواجهة الويب ، وحدد موقع اسم التجربة والعمود المسمى تحليل الصور ، وانقر فوق تشغيل التحليل. تحقق من أن جميع الأجهزة ضمن عينات التجربة لها مناطق محددة.
- لتطبيق القناع ، على نفس الواجهة ، انقر فوق وظيفة جديدة لجميع العينات. في المربع المسمى جدولة مهمة للصور الفردية، حدد المربع تطبيق قناع، ثم حفظ الوظيفة.
ملاحظة: سيتم تطبيق القناع على جميع الصور التي تم التقاطها بالفعل ، وكذلك على أي صور تم التقاطها في المستقبل.
- أداء مراقبة جودة اللوحة:
ملاحظة: تخضع اللوحات التي تعاني من التلوث أو الجفاف أو الضباب للرقابة في هذه المرحلة من تحليل الصور. يوضح الشكل 4 مثالا على الألواح الملوثة والمجففة والضبابية والمحسنة. تشمل الأسباب الأخرى للرقابة الجوع أو الأطباق الفارغة أو اليرقات في المجموعات العقيمة. غالبا ما تحتوي اللوحات غير الصالحة على أشكال معقدة تهدف الآلة إلى تفسيرها على أنها ديدان خيطية. من المهم استبعاد اللوحات غير الصالحة في هذه الخطوة لمنع أوقات المعالجة الطويلة في الخطوات اللاحقة لتحليل الصورة.- باستخدام واجهة الويب ، استبعد اللوحات المراد مراقبتها من خلال العثور على التجربة المطلوبة والعمود المسمى تعليق معلومات اللوحة وتحديد حسب الصورة.
- لفحص اللوحات ، انقر فوق عرض الصور.
ملاحظة: إذا كانت خطوة عرض الصور لا تعمل بشكل صحيح، فقد لا يتم تكوين خادم Linux بشكل صحيح. تتوفر إرشادات حول كيفية القيام بذلك في دليل تثبيت البرنامج في مستودع GitHub المذكور أعلاه. - لاستبعاد اللوحات ، حدد علامة المربع الرقيب ، وحدد خيارا في المربع المنسدل المسمى Reason Censored ، ثم انقر فوق حفظ لكل صفحة.
- إضافة معلومات البيانات الوصفية: تصف البيانات الوصفية محتويات كل لوحة في التجربة. ثم تدرج هذه المعلومات في جميع ملفات البيانات الإحصائية التي يتم إنشاؤها لاحقا.
- لإضافة معلومات البيانات الوصفية المتعلقة بالسلالة ، والنمط الجيني ، ودرجة الحرارة ، والطعام ، وما إلى ذلك ، انتقل إلى الصفحة الرئيسية لواجهة الويب ، وابحث عن التجربة المطلوبة والعمود المسمى معلومات لوحة التعليق التوضيحي ، وحدد حسب الموضع.
- أدخل التسميات ، وحدد الماسحات الضوئية التي تريد حفظ البيانات الوصفية لها بالنقر فوق حفظ إلى الأجهزة في الزاوية اليسرى السفلية.
- لإعادة استخدام البيانات الوصفية بين الماسحات الضوئية المختلفة دون الحاجة إلى إعادة إدخال جميع التسميات مرة أخرى ، انتقل إلى تحميل من الجهاز في الزاوية العلوية اليمنى ، وحدد الماسح الضوئي الذي تريد إعادة استخدام البيانات الوصفية منه ، وانقر فوق تحميل من الجهاز.
- حدد وقت "العمر الصفري": بشكل افتراضي ، يقيس LSM الوقت بالنسبة لبداية حقبة UNIX. نادرا ما يكون هذا مناسبا ، لذلك يلزم تحديد وقت مرجعي (على سبيل المثال ، التاريخ الذي يفقس فيه جميع الأفراد أو يصلون إلى مرحلة البلوغ).
- لتحديد معلومات وقت العمر الصفري، انتقل إلى الصفحة الرئيسية لواجهة الويب، وابحث عن التجربة المطلوبة والعمود المسمى تحليل الصور، وحدد تشغيل التحليل.
- في الصفحة الجديدة التي تظهر، حدد وظيفة جديدة لجميع المناطق. في المربع المسمى تحديث معلومات المنطقة ، حدد الوقت الذي كان فيه عمر 0 ، وأضف المعلومات ، ثم انقر فوق تحديث الحقول المحددة.
ملاحظة: إذا كانت جميع لا تشترك في نفس وقت العمر الصفري، فحدد بدلا من ذلك وظيفة جديدة لأنواع معينة من، وكرر الخطوات المذكورة أعلاه لكل مجموعة.
- جدولة اكتشاف الدودة: يمكن ل LSM أتمتة اكتشاف كل نيماتودا بناء على موضعها على اللوحة.
- لبدء الكشف التلقائي عن الديدان الخيطية لكل صورة ، انتقل إلى الصفحة الرئيسية لواجهة الويب ، وابحث عن التجربة المطلوبة والعمود المسمى تحليل الصورة ، وحدد تشغيل التحليل.
- في الصفحة الجديدة التي ستظهر ، انقر فوق وظيفة جديدة لجميع المناطق ، ثم في المربع المسمى جدولة مهمة للصور الفردية ، وحدد المربعات مرشح الوسيط > عتبة > اكتشاف الفيروس المتنقل > حفظ الوظيفة. سيتم تطبيق هذه الوظائف على جميع الصور السابقة والمستقبلية التي تم التقاطها.
ملاحظة: لجدولة وظيفة فقط لسلالة أو حالة معينة ، انقر بدلا من ذلك على وظائف لأنواع معينة من الحيوانات. يتم تنفيذ تصنيف الكائن باستخدام نماذج SVM المحددة كملفات مخزنة في المجلد الفرعي Models من دليل التخزين طويل الأجل الخاص ب LSM. يمكن تنزيل مجموعات معلمات الكشف عن الديدان الخيطية V2.0 ل LSM من مستودع GitHub.
الشكل 4: مراقبة جودة اللوحة باستخدام واجهة الويب. تعد الرقابة على اللوحات دون المستوى الأمثل على واجهة الويب قبل تحليل حركة الدودة أمرا بالغ الأهمية لتسريع خط أنابيب معالجة الصور. تتضمن أمثلة الصفائح المعرضة للإزالة شروط (أ) الجفاف أو (ب) التلوث أو (ج) الضباب ، على عكس ذلك. (د) اللوحات المثلى التي يجب تضمينها في مزيد من التحليل. يتم تثبيت شريط مقياس 10 مم على صورة التقاط المعاينة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
6. الحصول على ما بعد الصورة
ملاحظة: بعد اكتمال اكتشاف الفيروس المتنقل ، يجب تجميع جميع البيانات التي تم جمعها من التجربة بمرور الوقت لتتبع كل فرد عبر عمره وتحديد أوقات وفاة جميع الأفراد. انتظر حتى تموت جميع في التجربة وحتى يتم الانتهاء من جميع مهام الكشف عن الديدان ، ثم قم بتنفيذ الخطوات التالية:
- جدولة تحليل الحركة:
- يدمج تحليل الحركة جميع البيانات التجريبية بمرور الوقت لتقدير أوقات الوفاة. لبدء هذه المهمة ، انتقل إلى الصفحة الرئيسية لواجهة الويب ، وابحث عن التجربة المطلوبة في العمود المسمى تحليل الصور. حدد الارتباط تشغيل التحليل.
- في الصفحة الجديدة التي تظهر ، انقر فوق الارتباط وظيفة جديدة لجميع المناطق ، ومن القائمة المنسدلة ، جدولة وظيفة لمنطقة بأكملها ، حدد تحليل حركة الفيروس المتنقل ، وانقر فوق الزر حفظ الوظيفة.
- سيبدأ خادم الحصول على الصور LSM تلقائيا في تحليل الحركة عبر جميع اللوحات.
ملاحظة: تحليل الحركة هو أكبر وظيفة منفردة. على معالج حديث متعدد النواة ، يمكن أن يستغرق تحليل كل لوحة من تجربة عمر 1 شهر 20 دقيقة أو أكثر.
- إنشاء لوحة العمل: بعد اكتمال تحليل الحركة ، تسمح لوحة العمل LSM للمستخدمين بالتحقق يدويا من صحة النتائج الآلية والتأكد من أن البرنامج يقوم بافتراضات صحيحة حول مورفولوجيا وسلوك الديدان الخيطية.
- في الصفحة الرئيسية لواجهة الويب، حدد موقع التجربة المطلوبة والعمود المسمى تحليل الصور، وحدد تشغيل التحليل. في الصفحة الجديدة التي تظهر ، انقر فوق مهمة تجربة جديدة. ثم ، في قسم جدولة وظيفة لمنطقة بأكملها ، حدد إنشاء لوحة عمل حيوانية ، وانقر فوق حفظ الوظيفة.
- بعد انتهاء LSM من إنشاء لوحة العمل ، انتقل إلى متصفح الفيروس المتنقل ، وحدد التجربة المطلوبة. بالعودة إلى القائمة الرئيسية، حدد التحقق من الصحة > استعراض التجربة بأكملها > فور وفاة كل دودة.
- التعليق على القصص المصورة على متصفح الفيروس المتنقل: يجب أن تبدو لوحة العمل النموذجية على مستعرض الفيروس المتنقل كما الشكل 5.
- إضافة تعليقات توضيحية إلى كائنات "غير دودية"
ملاحظة: يتم عرض كل كائن تم اكتشافه أثناء الحركة على لوحة العمل ، مرتبة حسب وقت الوفاة المقدر. ما لم يحدد المستخدم خلاف ذلك ، سيتم تضمين كل كائن في منحنيات البقاء الناتجة. تمت معايرة تصنيف كائن LSM عن قصد للحصول على معدل إيجابي كاذب مرتفع ، كمقايضة لتقليل عدد الديدان الخيطية غير المكتشفة. يعد استبعاد الكائنات غير الدودية أمرا مهما للحصول على منحنيات بقاء عالية الجودة (انظر النتائج التمثيلية). عادة ما يتم العثور على عدد كبير من الكائنات غير المتنقلة في الصفحتين الأولى والأخيرة من لوحة العمل ، والتي يمكن استبعادها يدويا بسرعة بكميات كبيرة.- لاستبعاد كائنات غير متنقلة على لوحة العمل، انقر بزر الماوس الأيمن مرة واحدة على صورة الكائن. سيتم الآن تحديد الكائن المستبعد بواسطة مربع أبيض. لاستبعاد العديد من الكائنات في وقت واحد ، اضغط مع الاستمرار على مفتاح التحكم ، وانقر بزر الماوس الأيمن مرة واحدة على أي كائن ، وسيتم استبعاد جميع الكائنات الموجودة على صفحة لوحة العمل.
- بعد استبعاد كائن من التحليل ، يمكن إعادة تضمين هذا الكائن بالنقر بزر الماوس الأيمن مرتين مرة أخرى.
- لحفظ التعليقات التوضيحية التي تم إجراؤها أثناء التعليق التوضيحي للوحة العمل ، انقر فوق الزر حفظ . يوصى بحفظ التقدم بشكل متكرر أثناء التعليق التوضيحي.
- التعليق على أوقات الوفاة:
ملاحظة: بدون تدخل المستخدم ، يقدر LSM بدقة أوقات الوفاة لمعظم السكان. ومع ذلك ، يوصى بتأكيد دقة النتائج الآلية بشكل روتيني عن طريق التحقق يدويا من صحة مجموعة فرعية عشوائية من الأفراد من كل تجربة. يجب إيلاء اهتمام إضافي للأفراد الأقصر والأطول عمرا ، حيث تميل أي أخطاء في التحليل الآلي إلى التجمع في هذه المجموعات.- انقر بزر الماوس الأيسر مرة واحدة على أي كائن من لوحة العمل لفتح نافذة جديدة تعرض معلومات مفصلة عن السلاسل الزمنية حول هذا الكائن. تسمح هذه النافذة بفحص جميع الصور التي تم جمعها للكائن طوال التجربة ، بالإضافة إلى القياس الكمي لديناميكيات حركة الكائن ومورفولوجيته. باستخدام نفس الواجهة ، قم بالتعليق يدويا على أوقات الوفاة. تظهر واجهة التعليق التوضيحي لوقت الموت في الشكل 6.
- لإضافة تعليق توضيحي يدويا على أوقات الوفاة ، انقر بزر الماوس الأيسر على الشريط السفلي عند النقطة المقابلة لوقت الوفاة. استخدم شريط المسافة والأسهم اليمنى أو اليسرى للوحة المفاتيح للتنقل عبر الأطر الزمنية ، أو انقر مباشرة على الشريط في الإطار الزمني المطلوب.
ملاحظة: يمثل التصور حالة حركة بمرور الوقت ، مثل الرسم البياني الشريطي الأفقي مع وقت تحديد المحور السيني . يشير القسم الوردي / الأرجواني إلى الفترة الزمنية التي يتحرك فيها الجسم بقوة ، ويشير اللون الأصفر إلى ضعف الحركة ، ويشير الأحمر إلى غير المتحركة ، ويشير اللون الأخضر إلى فترة التمدد المرتبط بالموت. تظهر الديدان الخيطية أحداثا مورفولوجية مميزة مرتبطة بالموت: تقلص تدريجي للجسم يحدث عادة قبل الموت ، يليه توسع سريع للجسم أثناء الوفاة أو بعدها مباشرة (الشكل 6 ب). لا تظهر الأجسام غير الدودية مثل الغبار أو الظلال هذه الديناميكيات في حجم الجسم ، وبدلا من ذلك ، عادة ما تتبع تغيرا خطيا وتدريجيا في الحجم والشدة بمرور الوقت. توفر ديناميكيات حجم الجسم المختلفة هذه طريقة سريعة ومباشرة للتصنيف السريع والاستبعاد اليدوي. - اعتمادا على نهج التحليل ، يمكن اعتبار وقت الموت إما وقت توقف الحركة (بداية الشريط الأحمر في تصور الحركة) أو وقت التوسع المرتبط بالموت (الشريط الأخضر في تصور الحركة). لإضافة تعليق توضيحي يدويا إلى أحداث الانكماش والتوسع ، انقر بزر الماوس الأيمن على الشريط السفلي في الإطار الزمني المطلوب.
- يتم توفير بعض تصورات بيانات الوفيات البدائية أصلا داخل عميل Worm Browser. يتم عرض منحنيات البقاء على قيد الحياة وتشخيصات وقت الوفاة لكل مجموعة موجودة في لوحة العمل (الشكل 7). شاهد منحنيات البقاء على قيد الحياة على الجانب الأيسر ومخطط التشتت الذي يقارن وقت توقف الحركة القوية (VMC) بوقت الوفاة لكل فرد على الجانب الأيمن من لوحة العمل.
ملاحظة: من الممكن تجميع هذه النتائج وفقا لمعلمات تجريبية مختلفة عن طريق الإعداد الفرعي على الشريط السفلي لظروف مثل سلالات معينة أو ماسحات ضوئية أو لوحات. يمكن اختيار الديدان الفردية بناء على أوقات وفاتها عن طريق النقر بزر الماوس الأيسر على النقاط الفردية في مخطط VMC مقابل وقت الموت.
- إضافة تعليقات توضيحية إلى كائنات "غير دودية"
- كتابة بيانات الوفيات على القرص: ينتج LSM بيانات الوفيات في شكل ملفات CSV. ارسم منحنيات البقاء الناتجة ، وقم بتحليلها على أي برنامج إحصائي مثل R أو SAS أو STATA أو JMP.
- لإنشاء هذه الملفات ، اختر التجربة على متصفح الفيروس المتنقل ، وفي القائمة ، حدد ملفات البيانات ، أوقات الوفاة ، ثم انقر فوق إنشاء أوقات الوفاة للتجربة الحالية. سيقوم LSM بإنشاء ملف إخراج مع بيانات بقاء التجربة ، والتي سيتم حفظها في دليل النتائج.
- إذا تم تنفيذ التعليقات التوضيحية باليد على لوحة العمل ، فستظهر مطالبة على متصفح الفيروس المتنقل تسألك عن كيفية التعامل مع التعليقات التوضيحية اليدوية. انقر فوق "فورا" لتضمين التعليقات التوضيحية اليدوية في ملف أوقات الوفاة المخرج.
ملاحظة: تتم كتابة ملفات بيانات الوفيات إلى دليل النتائج المحدد في ملف imageserver.ini. تتم كتابة مجموعة متنوعة من الملفات ، ولكن الإصدار الأكثر استخداما هو "survival_simple / البقاء على قيد الحياة = machine_hand" ، والذي يتضمن جميع التعليقات التوضيحية اليدوية التي تم إجراؤها باستخدام لوحة العمل. - تحليل بيانات الوفيات في البرنامج الإحصائي المختار.
الشكل 5: القصة المصورة الحيوانية على متصفح الدودة. (أ) جميع الديدان الثابتة موضحة بترتيب زمني لوقت الوفاة المشروح آليا. للتنقل في لوحة العمل ، اضغط على الأزرار الموجودة في الزاوية السفلية اليمنى (B) ، و (C) احفظ التعليقات التوضيحية كثيرا. (د) تصور الصور ذات الخلفية غير الرمادية حدثين لموت الدودة (الموت المبكر باللون الأخضر ، والموت اللاحق باللون الأحمر) ، والذي يمكن أن يحدث إما عندما تموت دودتان بالقرب من بعضهما البعض ، أو عندما تتحرك الديدان الميتة بواسطة دودة عابرة ، وبالتالي يتم اكتشافها على أنها ميتة مرتين. (ه) علامة حمراء في الزاوية السفلية من الصورة تحدد الديدان ذات وقت الوفاة المكتشف ؛ (و) تشير العلامة الخضراء إلى المكان الذي لم يبق فيه الجسم لفترة كافية لتسجيل وقت الوفاة. (G) يمكن وضع علامة على العديد من الفيروسات المتنقلة في نفس الإطار بالضغط على shift والنقر بزر الماوس الأيسر. (H) يتم استبعاد الكائنات غير المتنقلة من التحليل بالنقر بزر الماوس الأيمن. (I) يتم فرض رقابة على الديدان المنفجرة من التحليل بالنقر فوق الصورة المقابلة (تفتح نافذة تعليق توضيحي باليد) والضغط على shift والنقر بزر الماوس الأيمن حتى تظهر رسالة "انفجر". يتم تثبيت شريط مقياس 0.5 مم والتسميات على لقطة شاشة نافذة Worm Browser. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: فحص الكائنات والتعليق التوضيحي لأوقات الوفاة على متصفح الدودة. يؤدي النقر بزر الماوس الأيسر على أي كائن على لوحة عمل Worm Browser إلى فتح واجهة جديدة ويسمح للمستخدم بفحص ديناميكيات حركة الكائن. على الجانب الأيمن ، يتم عرض درجة الحركة (A) ، والتي تحدد حركة الكائن ؛ ويقدر ذلك من خلال التغير في شدة البكسل بين الملاحظات المتتالية. بالإضافة إلى ذلك، في الجانب الأيمن، (ب) يتم عرض التغير في كثافة الجسم الكلية، وهو ما يحدد كمية التغيرات في حجم الجسم. على الجانب الأيسر ، يظهر الشريط العلوي تقدير الآلة (C) لوقت الوفاة ، بينما الشريط السفلي هو التعليق التوضيحي (D) البشري. يتيح النقر فوق أي نقطة من الأشرطة والضغط على مفتاح المسافة للمستخدم التنقل عبر الأطر الزمنية التي تم فيها تصوير الدودة. على هذه الأشرطة ، يمثل اللون الوردي الوقت الذي يقضيه في حركة قوية ، ويمثل اللون الأحمر الوقت الذي يقضيه في الموت ، والأصفر هو كل شيء بينهما. يظهر الوقت المستغرق في التمدد والانكماش بعد وقت الوفاة باللون الأخضر. يتم تثبيت التسميات على لقطة شاشة نافذة متصفح الدودة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: إحصائيات ملخص السكان على متصفح الفيروس المتنقل. الإحصاءات السكانية لجهاز الماسح الضوئي "obiwan" ، مع مخطط البقاء على قيد الحياة (اللوحة اليسرى) ومخطط مبعثر لوقت توقف الحركة القوية (VMC) مقابل وقت الوفاة (اللوحة اليمنى). المرسومة هي تفاصيل (أ) شرط واحد ، تم الحصول عليه من (ب) ماسح ضوئي واحد تم تحقيقه عن طريق الاختيار الأول (ج) تجميع البقاء على قيد الحياة حسب السلالة. (د) الأشكال المربعة في مخطط التشتت تصور الأحداث المشروحة يدويا، بينما (ه) الأشكال الدائرية تصور الأحداث المشروحة آليا. (و) غالبا ما يكون التعليق التوضيحي اليدوي مطلوبا لأحداث الوفاة التي تحدث مبكرا أو (ز) تلك التي يتزامن فيها وقت توقف الحركة القوية مع وقت الوفاة. يتم تثبيت التسميات على لقطة شاشة نافذة متصفح الدودة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تمثل قابلية التكاثر التجريبي في مقايسات العمر تحديا وتتطلب ظروفا تجريبية خاضعة لرقابة مشددة وأعدادا كبيرة من السكان لتحقيق دقة إحصائية كافية 4,36. LSM مناسب بشكل فريد لمسح أعداد كبيرة من في بيئة ثابتة ذات دقة زمنية عالية. لإثبات قدرة LSM ، وتسليط الضوء على الخطوات الحاسمة للتحليل ، ومساعدة الباحثين على تحديد أولويات جهودهم العمالية ، نقدم مجموعة فرعية من البيانات من تجربة23 المثلى المنشورة مسبقا. نظرا لطبيعة هذه التجربة كاختبار للجرعة والاستجابة ، كان هناك حاجة إلى عدد كبير من للكشف بشكل موثوق عن تغيرات العمر. باليد ، ستتطلب هذه التجربة التزاما زمنيا مكثفا من العديد من الباحثين أو ، إذا تم تقليصها ، فإنها تؤدي إلى نتائج ضعيفة. قامت مجموعة البيانات بقياس التغيرات الكمية في العمر بعد إزالة جين الوحدة الفرعية RNA polymerase II (b) (RPB-2) ، المطلوب لنسخ الحمض النووي الريبي المرسال. باستخدام النظام المستحث للأوكسين37 في C. elegans ، تم تمييز الموضع الداخلي ل RPB-2 بتسلسل degron إلى الوجود المشروط في كل مكان وتحلل RPB-2 باستخدام تركيزات مختلفة من الأوكسين (حمض α-naphtaleneacetic acid). أجريت التجربة على AMP100 [rpb-2 (cer135) ؛ eft-3p::TIR-1] مع cer135 المقابل لعلامة AID المدرجة في CRISPR rpb-2::GFPΔpiRNA::AID::3xFLAG23. كانت الظروف التجريبية عند درجة حرارة 20 درجة مئوية وباستخدام NEC937 المعطل بالأشعة فوق البنفسجية (OP50 ΔuvrA; KanR)38E. القولونيه. تم تعقيم الخنثى عن طريق نقل الديدان الخيطية خلال مرحلة L4 المتأخرة إلى ألواح تحتوي على 5-فلورو-2-ديوكيوريدين (FUdR). تم نقل الديدان الخيطية خلال اليوم 2 من مرحلة البلوغ إلى لوحات تحتوي على تركيزات مختلفة من الأوكسين. في الدراسة الأصلية ، أظهر المؤلفون أنه في وجود الأوكسين ، أدى تحلل RPB-2 إلى تقصير العمر بطريقة تعتمد على الجرعة23.
هنا ، نوضح المساهمة التي يقدمها التحقق من صحة البيانات بعد التجربة والتعليق التوضيحي في ناتج منحنى البقاء النهائي (الشكل 8). في الخطوات الأخيرة لتحليل الصور داخل لوحة عمل Worm Browser ، قارنا منحنيات البقاء الخام التي تم إنتاجها قبل التعليق التوضيحي للوحة العمل بمنحنيات البقاء التي تم إنتاجها بعد الاستبعاد اليدوي للكائنات غير الدودية وأيضا بمنحنيات البقاء التي تم إنتاجها بعد التعليق التوضيحي لكل من الكائنات غير الدودية وأوقات الموت الفردية (الشكل 8A-C). وجدنا أن منحنيات البقاء الأولية التي تم إنتاجها قبل التعليق التوضيحي للوحة العمل (الشكل 8 أ) قد تم تشويهها من خلال التضمين غير الصحيح للكائنات غير الدودية ، والذي كان أكثر وضوحا في ذيول منحنيات البقاء على قيد الحياة. قبل التعليق التوضيحي اليدوي ، تضمنت منحنيات البقاء جميع الكائنات التي اكتشفها الجهاز ككائنات دودة محتملة ، نصفها تقريبا ، بسبب المعدل الإيجابي الخاطئ المرتفع عمدا ، كانت كائنات غير دودة وكان لا بد من استبعادها يدويا (الشكل 8D). هذا حسب التصميم ، حيث تتم معايرة الخوارزميات للحصول على معدل إيجابي كاذب مرتفع نسبيا من أجل تجنب السلبيات الخاطئة ، حيث أنه من الأسهل بكثير استبعاد الكائنات المضمنة بشكل غير صحيح بدلا من البحث عن الكائنات المستبعدة بشكل غير صحيح واستعادتها. بعد استبعاد الكائنات غير الدودية أثناء التعليق التوضيحي اليدوي للوحة العمل ، كانت منحنيات البقاء الناتجة ذات دقة أعلى بكثير (الشكل 8B ، E) ، وأنتجت التعليقات التوضيحية اليدوية الإضافية لأوقات الوفاة على لوحة العمل تغييرات لا تزيد عن ~ 4٪ في متوسط العمر المقدر. لذلك ، نوضح أن إزالة الكائنات غير الدودية أثناء خط أنابيب تحليل الصور ل LSM هي الخطوة الحاسمة للحصول على منحنيات بقاء جيدة الحل.
الشكل 8: تأثير التحقق اليدوي من صحة البيانات على منحنيات البقاء على قيد الحياة. يؤدي تدهور RPB-2 إلى تقصير C. عمر ايليجانس في وجود الأوكسين (K-NAA: α-حمض النفثالين أسيتيك) بطريقة تعتمد على الجرعة. (أ) منحنيات البقاء على قيد الحياة المرسومة من الإخراج الخام LSM بعد مراقبة جودة اللوحات وبدون تعليق توضيحي يدوي لكائنات الدودة على لوحة عمل Worm Browser. (ب) منحنيات البقاء على قيد الحياة مرسومة بعد التعليق التوضيحي اليدوي لكائنات الدودة على لوحة العمل. (ج) منحنيات البقاء على قيد الحياة المرسومة بعد التعليق اليدوي لكائنات الدودة وأوقات الموت على لوحة العمل. (د) ملخص لجميع الأجسام المكتشفة بواسطة LSM. تضمنت كائنات الفيروس المتنقل الخاضعة للرقابة كائنات مستبعدة تلقائيا (على سبيل المثال ، بسبب تحرك الديدان خارج المنطقة الممسوحة ضوئيا) أو يدويا بواسطة المجرب (على سبيل المثال ، بسبب انفجار الديدان). (ه) تمثيل جدولي لمتوسط العمر المقدر بعد التعليق التوضيحي لكائن الدودة باليد (يسار) والتعليق التوضيحي الإضافي لوقت الوفاة باليد (يمين). النسبة المئوية للفرق في متوسط العمر بين المجموعات المتجاورة ذات تركيزات الأوكسين المختلفة والقوة الإحصائية للكشف. تم رسم جميع الرسوم البيانية على البرنامج الإحصائي JMP. تم تكييف بيانات هذا الرقم بإذن من Oswal et al.23. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بالانتقال إلى ما بعد العمر كنقطة نهاية واحدة لدراسة الشيخوخة ، نظرنا بعد ذلك في الشيخوخة السلوكية وحققنا في خطوات تحليل الصور بعد التجربة الأكثر أهمية لقياسها. مع التركيز على العلاقة بين توقف الحركة القوية (VMC) والعمر الافتراضي ، قمنا بمقارنة ناتج LSM في مراحل مختلفة من تحليل الصورة والتحقق من صحتها (الشكل 9A-D). وجدنا أن الأجسام غير الدودية أظهرت علاقة فريدة بين VMC الظاهر والعمر الافتراضي ، مع تعليق الاثنين على أنهما يحدثان في وقت واحد تقريبا في كل كائن (الشكل 9 أ). في المقابل ، عادة ما تتوقف الديدان الخيطية الحقيقية عن الحركة بقوة قبل عدة أيام من وقت وفاتها (الشكل 9 أ). يوفر هذا الاختلاف في العلاقة بين VMC والعمر الافتراضي وسيلة إضافية لتحديد الكائنات غير المتنقلة واستبعادها بسرعة.
الشكل 9: تأثير التحقق اليدوي من صحة البيانات على تحليل توقف الحركة القوي (VMC). (أ) بيانات الشيخوخة السلوكية بدون تعليق توضيحي يدوي لكائنات الفيروس المتنقل على لوحة عمل Worm Browser ، وعرض العلاقة بين أوقات الوفاة وأوقات VMC في الكائنات غير المتنقلة (باللون الأسود) مقابل كائنات الدودة (باللون الأحمر). (ب) بيانات الشيخوخة السلوكية المرسومة بعد التعليق اليدوي لكائنات الدودة على لوحة العمل. (ج) بيانات الشيخوخة السلوكية المرسومة بعد التعليق اليدوي لكائنات الدودة وأوقات الوفاة على لوحة العمل. (د) تمثيل جدولي لمتوسط العمر المتبقي (ARL ؛ تم الحصول عليه من الاعتراض بين عمر الوفاة وعمر VMC) عبر خطوات مختلفة من خط أنابيب تحليل الصورة والنسبة المئوية للفرق في ARL بين التعليق التوضيحي لكائن الدودة والتعليق التوضيحي الإضافي لوقت الوفاة. (ه) التمثيل البياني ل ARLs المقدرة عبر خطوات مختلفة من تحليل اكتساب ما بعد الصورة ، وعلاقتها بعمر الدودة (الذي يعتمد على تركيز الأوكسين: حمض α-napthaleneacetic acid). تم تنفيذ ملاءمة الشريحة باستخدام طريقة الشريحة المكعبة. تم رسم جميع الرسوم البيانية على البرنامج الإحصائي JMP. تم تكييف بيانات هذا الرقم بإذن من Oswal et al.23. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وجدنا أن التعليق التوضيحي واستبعاد الكائنات غير المتنقلة باستخدام متصفح الفيروس المتنقل كان كافيا لتقديم تقدير تقريبي للعلاقة بين VMC وأوقات الوفاة (الشكل 9A-C) ، مع تلخيص الديناميات المتوقعة للانخفاض الفسيولوجي في الديدان الخيطية23. لمزيد من استكشاف هذا ، نظرنا في نفس مجموعة بيانات RNA polymerase II وقدرنا متوسط العمر المتبقي (ARL) بعد VMC لكل مجموعة فرعية كتقاطع لنموذج الانحدار الخطي الذي يربط العمر الافتراضي ب VMC. لفهم تأثير التعليق التوضيحي للبيانات على ARL ، أعدنا حساب ARL بعد كل خطوة من خطوات التعليق التوضيحي للبيانات (الشكل 9E). وجدنا أن التعليق اليدوي لأوقات الوفاة في تحليل الشيخوخة السلوكية كان مهما بشكل خاص في الديدان طويلة العمر ، في هذه الحالة ، أولئك الذين تعرضوا لأقل تركيزات من الأوكسين (الشكل 9D ، E). وعلى النقيض من تأثيره الضئيل على منحنيات البقاء على قيد الحياة، كان للشرح اليدوي لأوقات الوفاة تأثير كبير على العلاقة الكمية بين VMC والعمر الافتراضي، مما أدى إلى زيادة ARL المقدر، على سبيل المثال عند 0 ميكرومتر من الأوكسين، من 8.09 أيام إلى 10.42 يوما بعد شرح وقت الوفاة؛ يمثل هذا فرقا في ARL بنسبة 29٪. لذلك ، وجدنا أن العلاقة بين VMC وأوقات الوفاة التي أوضحتها ARL كانت أكثر حساسية للتعليق اليدوي لأوقات الوفاة مقارنة بقياسات أوقات الوفاة لعمر العمر وحده. يمكن تفسير هذه الحساسية من خلال الفترات النسبية ل ARL والعمر الافتراضي ؛ عادة ما تكون نفس التعديلات على وقت الوفاة صغيرة بالنسبة إلى العمر ولكنها كبيرة بالنسبة إلى ARL. وبالتالي ، فإن التعديلات على أوقات الوفاة سيكون لها تأثير نسبي أكبر على ARL مقارنة بالعمر.
الملف التكميلي 1: هيكل ملف جدول تجربة آلة Lifespan. يتكون جدول التجربة من ثلاثة أجزاء. أولا ، يتم تضمين المعلومات الأساسية حول التجربة ، مثل الاسم ومواصفات الالتقاط. من هذا الجزء ، بشكل عام ، يجب تغيير اسم التجربة فقط لكل تجربة جديدة. يتم إنشاء الجزء الثاني من المستند عن طريق تصدير مناطق المسح الضوئي من مستعرض الفيروس المتنقل ويحدد الموقع الفعلي لمناطق المسح الضوئي لكل ماسح ضوئي ("asuna" و "bulma" و "moscow" و "rio" و "yuno" و "yuki" في هذا المثال). يتم استبدالها لكل تجربة جديدة ويتم نسخها من ملفات TXT التي تم إنشاؤها لكل ماسح ضوئي على حدة خلال الخطوة 4.1.2.3. يوفر الجزء الثالث من المستند معلومات حول مدة التجربة ، والتي يجب تعديلها أيضا لكل تجربة جديدة ، وتكرار الالتقاط. سيقوم الجهاز بمسح كل منطقة محددة واحدة تلو الأخرى على فترات زمنية محددة طوال مدة التجربة بأكملها. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا يمكن الوصول إليه لإجراء تجربة باستخدام أحدث إصدار من Lifespan Machine. لقد أظهرنا أن الخطوة الحاسمة لتحقيق منحنيات البقاء التي تم حلها جيدا هي الاستبعاد اليدوي للكائنات غير الدودية أثناء الحصول على ما بعد الصورة. التعليق التوضيحي اليدوي لوقت الوفاة له تأثير صغير على الشكل العام لمنحنيات البقاء على قيد الحياة ، مما يدل على أن تقدير وقت الوفاة المؤتمت بالكامل فعال حتى بدون التعليق التوضيحي اليدوي (الشكل 8). على العكس من ذلك ، يتطلب الحصول على بيانات الشيخوخة السلوكية عالية الجودة شرحا أكثر دقة لأوقات الوفاة ، خاصة في الأفراد الذين عاشوا طويلا (الشكل 9). لذلك ، فإن مقدار الوقت اللازم للتعليق التوضيحي للوحة العمل باليد سيعتمد في النهاية على النتيجة المحددة التي يتم قياسها. بشكل عام ، نجد أنه عند العمل مع LSM ، تكون جهود الباحث أكثر أهمية أثناء الإعداد التجريبي ، وبدرجة أقل ، أثناء تحليل ما بعد التقاط الصورة. أخيرا ، نسلط الضوء على قيمة المقايسات الآلية عالية الإنتاجية في إنتاج بيانات البقاء على قيد الحياة والشيخوخة السلوكية عالية الحل مع زيادة إنتاجية الباحثين ودعم قابلية التكرار التجريبي.
يحتوي LSM على الديدان الخيطية على ألواح أجار ، مما يعيد إنشاء مقايسة العمر اليدوي الكلاسيكية في سياق آلي. تم تطوير أدوات أخرى لأتمتة قياس العمر في C. elegans باستخدام طرق مختلفة لحبس الديدان الخيطية. وتشمل هذه الأساليب التي يتم فيها وضع الديدان الخيطية المفردة في وسائط صلبة (WorMotel15) أو داخل جهاز الموائع الدقيقة (Lifespan-on-a-chip11) أو تلك التي تتعقب عددا أكبر من باستخدام الموائع الدقيقة (WormFarm14). تشمل مزايا منصات الموائع الدقيقة إمكانية التحكم البيئي الدقيق في الوقت الفعلي والإزالة الآلية للذرية عن طريق استبعاد الحجم. ومع ذلك ، لم تثبت الأجهزة المذكورة أعلاه حتى الآن أنها قابلة للتطوير بسهولة ، لأنها تتطلب معالجة يدوية مكثفة وغالبا ما تعتمد على التقاط الصور أو الفيديو اليومي الذي يشغله أحد التجريبيين. تستخدم المنصات الأخرى ، مثل Stress-Chip39 ، الماسحات الضوئية المسطحة المعدلة المصممة ل LSM لتصوير أجهزة الموائع الدقيقة المخصصة.
على عكس الطرق الأخرى ، يحتوي LSM على مرافق واسعة النطاق للتعليقات التوضيحية والتحقق من صحة البيانات ، مما يسمح للمستخدمين بإجراء مراقبة الجودة المطلوبة بشكل منهجي لجمع بيانات عمر عالية الدقة ودقيقة ودقيقة في سياق عالي الإنتاجية13. هذه التقنية متعددة الاستخدامات نظرا لاستخدامها للبروتوكولات المختبرية الحالية القائمة على ألواح الأجار وتوفر ميزة فريدة لقابلية التوسع التجريبي نظرا للسهولة النسبية لتجميع مجموعات كبيرة من الماسحات الضوئية المسطحة. على الرغم من أن LSM يتطلب استثمارا أوليا للوقت للبناء والتشغيل وتدريب المستخدمين على البرامج المتخصصة ، إلا أن هذه التكاليف متوازنة من خلال الإنتاج القوي وعالي الإنتاجية لبيانات العمر. تم نشر مجموعات Lifespan Machine المكونة من 50 ماسحا ضوئيا أو أكثر في العديد من المختبرات ، وتعمل بشكل مستمر لأكثر منعقد من الزمان 40.
LSM لديها قيود. يتم إيواء في الماسحات الضوئية أثناء الجمع الآلي لبيانات البقاء على قيد الحياة ، مما يحد من قدرة الباحثين على إجراء تدخلات تجريبية متزامنة مع الملاحظة وتتطلب إما تعقيم أو بدء التجارب بعد مرحلة تكاثر الديدان الخيطية. التغيرات في درجة الحرارة هي استثناء نادر للحد من التدخلات ، حيث يمكن تعديل درجة الحرارة البيئية دون الحاجة إلى فتح الماسحات الضوئية والوصول إلى. في الحالات التي يجب فيها تطبيق التدخلات العملية على الديدان الخيطية في منتصف العمر ، فإن الحل الشائع هو تأخير بدء المراقبة الآلية إلى ما بعد إجراء المعالجة اللازمة للحيوانات. بالإضافة إلى ذلك ، هناك اختلاف متأصل في موقع اللوحات داخل وعبر الماسحات الضوئية. يمكن أن تخضع هذه الاختلافات المحلية الدقيقة في الظروف البيئية (مثل درجة الحرارة والضوء والتهوية وما إلى ذلك) ، والتي قد تؤثر على C. عمر ايليجانس 19. يمكن قياس هذا التأثير البيئي ودراسته بشكل أكبر باستخدام نماذج الانحدار الزمني المتسارعللفشل 41. تتمثل إحدى طرق التخفيف من هذا التأثير ببساطة في زيادة عدد اللوحات والماسحات الضوئية لتحقيق قياس صارم مستقل عن التقلبات البيئية. بشكل عام ، يتم توزيع اللوحات من نفس الحالة بشكل عشوائي داخل كل ماسح ضوئي ، وقد أظهرت أحجام السكان الأكبر من 500 فرد لكل حالة وعبر الماسحات الضوئية تقديرات بقاء قوية إحصائيا31.
إجمالا ، يسمح LSM بجمع بيانات البقاء على قيد الحياة والشيخوخة السلوكية بدقة عالية وكبيرة ، ويمكن أن يتيح إجراء الشاشات التي لم تكن مجدية من قبل بطريقة كمية. وبهذه الطريقة ، يساهم LSM في تقدم تقني كبير للمجموعة الموحدة لمنحنيات البقاء على قيد الحياة ويوفر إطارا جديدا للدراسة المزدوجة للعمر والشيخوخة السلوكية في الديدان الخيطية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.
Acknowledgments
نشكر جوليان سيرون وجيريمي فيسينسيو (IDIBELL Barcelona) على إنتاج أليل rpb-2 (cer135 ). تم تمويل هذا المشروع من قبل مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي (اتفاقية المنحة رقم 852201) ، ووزارة الاقتصاد والصناعة والقدرة التنافسية الإسبانية (MEIC) لشراكة EMBL ، ومركز التميز Severo Ochoa (CEX2020-001049-S ، MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033) ، وبرنامج CERCA / Generalitat de Catalunya ، وجائزة MEIC Excelencia BFU2017-88615-P ، وجائزة من مؤسسة جلين للأبحاث الطبية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Naphtaleneacetic acid (Auxin) | Sigma | N0640 | Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | 27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria |
| Glass cleaner | Kristal-M | QB-KRISTAL-M125ml | |
| Hydrophobic anti-fog glass treatment | Rain-X Scheibenreiniger | C. 059140 | |
| Rubber matt | Local crafstman | Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock | |
| Scanner glass | Local hardware supplier | 9" x 11.5" inch glass sheet | |
| Scanner plates | Life Sciences | 351006 | 50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish |
| USB Reference Thermometer | USB Brando | ULIFE055500 | For calibrating temperature of scanners |
References
- Harman, D. The aging process: Major risk factor for disease and death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5360-5363 (1991).
- Vaupel, J. W.
- Mair, W., Goymer, P., Pletcher, S. D., Partridge, L. Demography of dietary restriction and death in Drosophila. Science. 301 (5640), 1731-1733 (2003).
- Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational analysis of lifespan experiment reproducibility. Frontiers in Genetics. 8, 92 (2017).
- Lucanic, M., et al. Impact of genetic background and experimental reproducibility on identifying chemical compounds with robust longevity effects. Nature Communications. 8 (1), 14256 (2017).
- Banse, S. A., et al. Automated lifespan determination across Caenorhabditis strains and species reveals assay-specific effects of chemical interventions. Geroscience. 41 (6), 945-960 (2019).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Kirkwood, T. B., et al. What accounts for the wide variation in life span of genetically identical organisms reared in a constant environment. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (3), 439-443 (2005).
- Stroustrup, N., et al. The temporal scaling of Caenorhabditis elegans ageing. Nature. 530 (7588), 103-107 (2016).
- Hamilton, B., et al. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes & Development. 19 (13), 1544-1555 (2005).
- Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nature Genetics. 33 (1), 40-48 (2003).
- Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The replica set method: A high-throughput approach to quantitatively measure Caenorhabditis elegans lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819 (2018).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. Elife. 6, 26652 (2017).
- Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Kerr, R. A., Roux, A. E., Goudeau, J. F., Kenyon, C. The C. elegans observatory: High-throughput exploration of behavioral aging. Frontiers in Aging. 3, 932696 (2022).
- Javer, A., Ripoll-Sánchez, L., Brown, A. E. Powerful and interpretable behavioural features for quantitative phenotyping of Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1758), 20170375 (2018).
- Miller, H., et al. Genetic interaction with temperature is an important determinant of nematode longevity. Aging Cell. 16 (6), 1425-1429 (2017).
- Bansal, A., Zhu, L. J., Yen, K., Tissenbaum, H. A. Uncoupling lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans longevity mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E277-E286 (2015).
- Huang, C., Xiong, C., Kornfeld, K. Measurements of age-related changes of physiological processes that predict lifespan of Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (21), 8084-8089 (2004).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Oswal, N., Martin, O. M., Stroustrup, S., Bruckner, M. A. M., Stroustrup, N. A hierarchical process model links behavioral aging and lifespan in C. elegans. PLoS Computational Biology. 18 (9), 1010415 (2022).
- Sen, I., et al. DAF-16/FOXO requires protein phosphatase 4 to initiate transcription of stress resistance and longevity promoting genes. Nature Communications. 11 (1), 138 (2020).
- Schiffer, J. A., et al. et al.Caenorhabditis elegans processes sensory information to choose between freeloading and self-defense strategies. Elife. 9, 56186 (2020).
- Bazopoulou, D., et al. Developmental ROS individualizes organismal stress resistance and lifespan. Nature. 576 (7786), 301-305 (2019).
- Guerrero-Rubio, M. A., Hernández-García, S., García-Carmona, F., Gandía-Herrero, F. Extension of life-span using a RNAi model and in vivo antioxidant effect of Opuntia fruit extracts and pure betalains in Caenorhabditis elegans. Food Chemistry. 274, 840-847 (2019).
- Janssens, G. E., et al. Transcriptomics-based screening identifies pharmacological inhibition of Hsp90 as a means to defer aging. Cell Reports. 27 (2), 467-480 (2019).
- Kasimatis, K. R., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Phillips, P. C. Auxin-mediated sterility induction system for longevity and mating studies in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (8), 2655-2662 (2018).
- Lin, X. -X., et al. DAF-16/FOXO and HLH-30/TFEB function as combinatorial transcription factors to promote stress resistance and longevity. Nature Communications. 9 (1), 4400 (2018).
- Stroustrup, N., et al. The temporal scaling of Caenorhabditis elegans ageing. Nature. 530 (7588), 103-107 (2016).
- Byerly, L., Cassada, R., Russell, R. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
- Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
- Wilkinson, D. S., Taylor, R. C., Dillin, A.
- Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental Gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
- Lithgow, G. J., Driscoll, M., Phillips, P. A long journey to reproducible results. Nature. 548 (7668), 387-388 (2017).
- Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
- Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2010).
- Banse, S. A., Blue, B. W., Robinson, K. J., Jarrett, C. M., Phillips, P. C. The Stress-Chip: A microfluidic platform for stress analysis in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 14 (5), e0216283 (2019).
- Banse, S. A., et al. Automated lifespan determination across Caenorhabditis strains and species reveals assay-specific effects of chemical interventions. Geroscience. 41 (6), 945-960 (2019).
- Swindell, W. R. Accelerated failure time models provide a useful statistical framework for aging research. Experimental Gerontology. 44 (3), 190-200 (2009).
