La piattaforma di imaging "The Lifespan Machine" automatizza l'osservazione permanente di grandi popolazioni. Mostriamo i passaggi necessari per eseguire saggi sulla durata della vita, sulla resistenza allo stress, sulla patogenesi e sull'invecchiamento comportamentale. La qualità e la portata dei dati consentono ai ricercatori di studiare gli interventi sull'invecchiamento nonostante la presenza di variazioni biologiche e ambientali.
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Articolo metodologico
Saggi sull'invecchiamento comportamentale e sulla durata della vita ad alto rendimento utilizzando la macchina per la durata della vita
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli animali geneticamente identici tenuti in un ambiente costante mostrano un'ampia distribuzione della durata della vita, riflettendo un grande aspetto stocastico non genetico dell'invecchiamento conservato in tutti gli organismi studiati. Questa componente stocastica significa che per comprendere l'invecchiamento e identificare interventi di successo che prolungano la durata della vita o migliorano la salute, i ricercatori devono monitorare contemporaneamente grandi popolazioni di animali da esperimento. Il tradizionale punteggio manuale dei decessi limita la produttività e la scala necessarie per i test di ipotesi su larga scala, portando allo sviluppo di metodi automatizzati per i saggi ad alta produttività. Lifespan Machine (LSM) è una piattaforma di imaging ad alto rendimento che combina scanner piani modificati con software di elaborazione delle immagini e convalida dei dati personalizzati per il monitoraggio dei nematodi per tutta la vita. La piattaforma costituisce un importante progresso tecnico in quanto genera dati sulla durata della vita altamente risolti temporalmente da grandi popolazioni di animali su una scala senza precedenti e con una precisione statistica e un'accuratezza pari ai saggi manuali eseguiti da ricercatori esperti. Recentemente, l'LSM è stato ulteriormente sviluppato per quantificare i cambiamenti comportamentali e morfologici osservati durante l'invecchiamento e metterli in relazione con la durata della vita. In questo articolo viene descritto come pianificare, eseguire e analizzare un esperimento automatizzato sulla durata della vita utilizzando LSM. Evidenziamo inoltre i passaggi critici necessari per il successo della raccolta di dati comportamentali e curve di sopravvivenza di alta qualità.
Introduzione
L'invecchiamento è un processo complesso e sfaccettato, caratterizzato da un declino della funzione fisiologica di un organismo, che porta ad un aumento del rischio di malattia e morte nel tempo1. La durata della vita, misurata come il tempo che intercorre tra la nascita o l'inizio dell'età adulta fino alla morte, fornisce un risultato inequivocabile dell'invecchiamento2 e un indicatore indiretto ma rigorosamente quantitativo per misurare il tasso relativo di invecchiamento tra le popolazioni3. Gli studi sull'invecchiamento spesso dipendono da misurazioni accurate della durata della vita, simili a....
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Protocollo
1. Requisiti software e hardware
- Scanner piani: in linea di principio, l'LSM può essere implementato utilizzando una varietà di dispositivi di imaging. Istruzioni dettagliate per le modifiche e la messa a fuoco dello scanner sono disponibili altrove13. L'hardware LSM è mostrato nella Figura 1 supplementare.
- Strumenti di analisi dei dati: il software LSM ha tre componenti interagenti: un pacchetto software di controllo dello scanner basato su Linux, un pacchetto di gestione dei metadati basato su browser Web e un pacchetto software di analisi delle immagini client Windows e Linux. Fare riferi....
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Risultati
La riproducibilità sperimentale nei saggi di durata della vita è impegnativa e richiede sia condizioni sperimentali strettamente controllate che grandi popolazioni per ottenere una risoluzione statistica sufficiente 4,36. L'LSM è particolarmente adatto per il rilevamento di grandi popolazioni di animali in un ambiente costante con un'elevata risoluzione temporale. Per dimostrare la capacità dell'LSM, evidenziare le fasi cruciali dell'analisi e aiutare i ricercato.......
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Discussione
Qui forniamo un protocollo dettagliato e accessibile per l'esecuzione di un esperimento utilizzando l'ultima versione di Lifespan Machine. Abbiamo dimostrato che il passaggio critico per ottenere curve di sopravvivenza ben risolte è l'esclusione manuale di oggetti non vermi durante l'acquisizione post-immagine. L'annotazione manuale del tempo di morte ha un piccolo effetto sulla forma complessiva delle curve di sopravvivenza, dimostrando che la stima del tempo di morte completamente automatizzata è efficiente anche senza.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo Julian Ceron e Jeremy Vicencio (IDIBELL Barcelona) per aver prodotto l'allele rpb-2 (cer135). Questo progetto è stato finanziato dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea (accordo di sovvenzione n. 852201), dal Ministero spagnolo dell'Economia, dell'Industria e della Competitività (MEIC) al partenariato EMBL, dal Centro de Excelencia Severo Ochoa (CEX2020-001049-S, MCIN/AEI /10.13039/501100011033), dal Programma CERCA/Generalitat de Catalunya, dal premio MEIC Excelencia BFU2017-88615-P, e un premio della Glenn Foundation for Medical Research.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| acido 1-naftaleneacetico (auxina) | Sigma | N0640 | Solubilizzare l'auxina in idrossido di potassio 1M e aggiungere nell'agar fuso |
| 5-fluoro-2-deossiuridina (FUDR) | Sigma | F0503 | 27.5 μ g/mL di FUDR è stato utilizzato per eliminare la progenie da popolazioni su batteri inattivati dai raggi UV |
| Detergente per vetri | Kristal-M | QB-KRISTAL-M125ml | |
| Trattamento idrofobico antiappannamento per vetri | Rain-X Scheibenreiniger | C. 059140 | |
| Gomma opaca | Crafstman | Taglio su un foglio di gomma EPDM ad alta resistenza | |
| Vetro per scanner | Fornitore | Lastra di vetro da 9" x 11,5" pollici | |
| Piastre per scanner | Scienze | della vita 351006 | 50 mm x 9 mm, piastra di Petri in polistirene |
| Termometro di riferimento USB | Brando | ULIFE055500 | Per la calibrazione della temperatura degli scanner |
Riferimenti
- Harman, D. The aging process: Major risk factor for disease and death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5360-5363 (1991).
- Vaupel, J. W. Biodemography of human ageing. Nature. 464 (....
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Ristampe e permessi
