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Biology

Tests comportementaux à haut débit sur le vieillissement et la durée de vie à l’aide de la machine Lifespan

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65462
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2
1Centre for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2Universitat Pompeu Fabra (UPF)

Summary

La plateforme d’imagerie « The Lifespan Machine » automatise l’observation à vie de grandes populations. Nous montrons les étapes nécessaires pour effectuer des tests de durée de vie, de résistance au stress, de pathogenèse et de vieillissement comportemental. La qualité et l’étendue des données permettent aux chercheurs d’étudier les interventions dans le vieillissement malgré la présence de variations biologiques et environnementales.

Abstract

Les animaux génétiquement identiques maintenus dans un environnement constant présentent une large distribution de la durée de vie, reflétant un grand aspect stochastique non génétique du vieillissement conservé dans tous les organismes étudiés. Cette composante stochastique signifie que pour comprendre le vieillissement et identifier les interventions efficaces qui prolongent la durée de vie ou améliorent la santé, les chercheurs doivent surveiller simultanément de grandes populations d’animaux de laboratoire. L’évaluation manuelle traditionnelle de la mort limite le débit et l’échelle requis pour les tests d’hypothèses à grande échelle, ce qui a conduit au développement de méthodes automatisées pour les tests de durée de vie à haut débit. La Lifespan Machine (LSM) est une plate-forme d’imagerie à haut débit qui combine des scanners à plat modifiés avec un logiciel personnalisé de traitement d’images et de validation des données pour le suivi à vie des nématodes. La plateforme constitue une avancée technique majeure en générant des données de durée de vie hautement résolues temporellement à partir de grandes populations d’animaux à une échelle sans précédent et avec une précision statistique et une exactitude égales à des tests manuels effectués par des chercheurs expérimentés. Récemment, le LSM a été développé pour quantifier les changements comportementaux et morphologiques observés au cours du vieillissement et les relier à la durée de vie. Ici, nous décrivons comment planifier, exécuter et analyser une expérience automatisée de durée de vie à l’aide du LSM. Nous soulignons en outre les étapes critiques nécessaires à la collecte réussie de données comportementales et à des courbes de survie de haute qualité.

Introduction

Le vieillissement est un processus complexe et multidimensionnel caractérisé par un déclin de la fonction physiologique d’un organisme, ce qui entraîne une augmentation du risque de maladie et de décès au fil du temps1. La durée de vie, mesurée comme le temps écoulé entre la naissance ou le début de l’âge adulte jusqu’à la mort, fournit un résultat sans ambiguïté du vieillissement2 et une approximation indirecte mais rigoureusement quantitative pour mesurer le taux relatif de vieillissement entre les populations3. Les études sur le vieillissement dépendent souvent de mesures précises de la durée de vie, similaires aux essais cliniques, pour comparer les résultats entre une population exposée à une intervention et un groupe témoin non exposé. Malheureusement, les problèmes de reproductibilité imprègnent la recherche sur le vieillissement, parfois en raison d’expériences statistiquement sous-alimentées4 et souvent en raison de la sensibilité inhérente des tests de durée de vie aux variations subtiles de l’environnement5. Les expériences robustes nécessitent de multiples répétitions de grandes populations, et ce processus bénéficie particulièrement de l’évolutivité expérimentale offerte par l’automatisation6.

Les exigences rigoureuses des tests de durée de vie proviennent de l’imprévisibilité du processus de vieillissement lui-même. Les individus isogéniques hébergés dans des environnements identiques présentent des temps de mortalité et des taux de déclin physiologique différents7, ce qui suggère que la durée de vie implique un degré élevé de stochasticité 7,8. Par conséquent, de grandes populations sont nécessaires pour mesurer les changements quantitatifs dans le processus de vieillissement, tels que les changements dans la durée de vie moyenne ou maximale, et pour surmonter les biais découlant de la variabilité individuelle. De plus, une capacité de dosage de la durée de vie à haut débit est cruciale pour soutenir les études des formes des courbes de survie et des modèles de la dynamique du vieillissement9.

Le nématode Caenorhabditis elegans est un modèle inestimable pour la recherche sur le vieillissement en raison de sa courte durée de vie, de sa tractabilité génétique et de sa durée de génération rapide, ce qui souligne sa pertinence pour les essais de vieillissement et de durée de vie à haut débit. Traditionnellement, la durée de vie en C. elegans a été mesuré en suivant une petite population synchronisée d’environ 50 à 100 animaux au fil du temps sur des supports solides et en notant l’heure des décès individuels. Au fur et à mesure que les animaux vieillissent et perdent de leur mobilité, le marquage manuel des heures de mort nécessite de pousser individuellement les animaux et de vérifier les petits mouvements de la tête ou de la queue. Il s’agit généralement d’un processus fastidieux et laborieux, bien que des efforts aient été faits pour l’accélérer 10,11,12. Il est important de noter que la lenteur des pipelines expérimentaux entrave les progrès dans notre compréhension du vieillissement et de l’efficacité des interventions testées.

Pour répondre aux exigences de la recherche sur le vieillissement en matière de données quantitatives, de nombreuses technologies ont été développées pour automatiser la collecte de données, y compris une gamme remarquable d’approches allant des chambres microfluidiques aux scanners à plat 13,14,15,16,17,18. Le LSM se distingue des autres méthodes par son optimisation poussée pour la collecte de données de durée de vie très précises et exactes, qui est obtenue grâce au développement de protocoles d’étalonnage minutieux des équipements combinés à une suite logicielle complète qui permet aux utilisateurs de valider, de corriger et d’affiner les analyses automatisées13. Bien que le logiciel puisse, en principe, être appliqué à diverses modalités d’imagerie, dans la pratique, la plupart des utilisateurs utilisent des scanners à plat modifiés pour permettre un contrôle précis de la température et de l’humidité ambiantes - des facteurs d’une importance critique en raison de leur effet majeur sur la durée de vie19. Le LSM prend des images de nématodes toutes les 20 minutes à des intervalles allant de quelques jours à plusieurs mois, selon les conditions environnementales et le génotype. Les données produites ont une résolution temporelle beaucoup plus élevée que les données des tests manuels, et les images recueillies fournissent un enregistrement visuel permanent de la position du nématode tout au long de sa vie. À l’aide de méthodes d’apprentissage automatique, les heures de décès sont automatiquement attribuées à chaque individu. Ces résultats peuvent être rapidement et manuellement validés à l’aide d’un logiciel client appelé « Worm Browser ». Grâce à son matériel et à ses logiciels, le LSM peut générer des courbes de survie qui sont statistiquement impossibles à distinguer de l’évaluation manuelle des décès par des chercheurs expérimentés, avec l’avantage supplémentaire d’une charge de travail réduite et d’une plus grande évolutivité13.

La dernière version du LSM permet également d’étudier le vieillissement comportemental en collectant des données morphologiques et comportementales tout au long de la vie du nématode et en les rapportant avec la durée de vie de chaque individu. En particulier, le LSM capture le temps de l’arrêt vigoureux des mouvements (VMC) de chaque animal, un point de repère souvent utilisé pour quantifier la « durée de vie » d’un individu par opposition à sa durée de vie. En recueillant simultanément des données sur la durée de vie et le vieillissement comportemental, le LSM soutient l’étude des interventions qui peuvent avoir des effets différentiels sur différents résultats phénotypiques du vieillissement20. Une variété de phénotypes macroscopiquement observables peuvent être utilisés pour étudier le vieillissement comportemental, tels que le mouvement du corps ou le pompage pharyngé21, l’intégrité des tissus22 et la vitesse de mouvement ou la rotation induite par le stimulus17. Les comparaisons entre différents phénotypes de vieillissement peuvent étayer les analyses de la structure causale des processus de vieillissement. Par exemple, la comparaison entre la VMC et la durée de vie a récemment été utilisée pour caractériser deux processus de vieillissement distincts chez C. elegans23.

Bien qu’il ait été initialement développé pour mesurer la durée de vie de C. elegans, le LSM soutient la collecte de données sur la survie et le comportement d’une gamme d’espèces de nématodes, y compris C. briggsae, C. tropicalis, C. japonica, C. brenneri, et P. pacificus23. La technologie facilite l’étude de l’effet des interventions biologiques et environnementales sur la durée de vie, la résistance au stress et la résistance aux agents pathogènes et peut être couplée à des outils expérimentaux tels que des tests ciblés d’interférence de l’ARN ou des systèmes de dégradation des protéines inductibles par l’auxine. À ce jour, il a été utilisé dans la littérature scientifique pour un large éventail d’applications 6,24,25,26,27,28,29,30.

Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour la réalisation d’une expérience Lifespan Machine à l’aide de plaques de gélose, depuis les étapes initiales de la configuration expérimentale jusqu’à la sortie des courbes de survie résultantes. L’une des caractéristiques distinctives du LSM est que l’effort est fortement sollicité en amont, ce qui signifie que la majorité du temps du chercheur est consacrée à la mise en place de l’expérience et, dans une moindre mesure, à l’acquisition post-image. La collecte des données est entièrement automatisée pendant toute la durée de l’expérience et permet au chercheur d’avoir une expérience « mains libres ». Les étapes décrites ici sont communes à de nombreux types de tests de survie - la même configuration expérimentale est effectuée pour les tests de durée de vie, de thermotolérance, de stress oxydatif et de pathogenèse. Dans la section des résultats représentatifs, nous discutons d’un sous-ensemble de données tirées d’un manuscrit récemment publié afin d’illustrer l’efficacité du pipeline d’analyse et de mettre en évidence les étapes les plus importantes de l’analyse d’images23.

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Protocol

1. Configuration logicielle et matérielle requise

  1. Scanners à plat : En principe, le LSM peut être mis en œuvre à l’aide d’une variété d’appareils d’imagerie. Des instructions détaillées pour les modifications du scanner et la mise au point sont disponibles ailleurs13. Le matériel LSM est illustré à la figure supplémentaire 1.
  2. Outils d’analyse de données : le logiciel LSM comporte trois composants interactifs : un progiciel de contrôle de scanner basé sur Linux, un progiciel de gestion des métadonnées basé sur un navigateur Web et un progiciel d’analyse d’images client Windows et Linux. Reportez-vous aux instructions d’installation des outils logiciels publiés sur le référentiel GitHub (https://github.com/nstroustrup/lifespan).
  3. Logiciel de visualisation et de validation des données : utilisez le navigateur Worm, un programme client, pour planifier les expériences, valider l’analyse des images, effectuer une annotation manuelle du mouvement des nématodes et produire les données de survie. Des exécutables binaires sont fournis pour le navigateur Worm sous Windows 7, Windows 8 et Windows 10, et le navigateur Worm est compilé à partir du code source sous Linux ou Apple iOS. Un guide d’installation est disponible sur le dépôt GitHub mentionné ci-dessus.

Figure supplémentaire 1 : Durée de vie du matériel de la machine. Une unité de scanner à plat avec un couvercle ouvert pour montrer les plaques chargées, qui sont placées face vers le bas dans 16 ouvertures découpées sur un tapis en caoutchouc. Le tapis en caoutchouc est placé sur la surface d’un scanner en verre. Des étiquettes pour les conditions sont écrites sur les côtés des plaques pour éviter les problèmes lors de l’analyse de l’image. Le marquage du ruban avec le numéro (« 1 ») et/ou le nom de l’appareil (« Jabba ») facilite la vérification ultérieure de l’emplacement de l’échantillon lorsque vous travaillez avec plusieurs scanners. Vous trouverez plus de détails sur les composants matériels du LSM ailleurs13. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

2. Mise en place avant le jour de l’expérience

  1. Étalonnage de la température de l’incubateur : La température ambiante est un déterminant majeur du C. Durée de vie d’Elegans 19. Pour produire des résultats précis, effectuez l’acquisition d’images à une température soigneusement calibrée, maintenue constante tout au long de l’expérience. Pour ce faire, quelques jours avant le début de l’expérience, mesurez et étalonnez la température de la surface de chaque scanner pendant le fonctionnement. Utilisez des thermocouples de haute précision comme décrit ailleurs31 (voir le tableau des matériaux).
  2. Disposition des plaques du scanner : Avant le début de l’expérience, planifiez la disposition optimale des plaques de culture pour chaque scanner.
    REMARQUE : L’objectif est d’éviter l’introduction de facteurs de confusion résultant de la variation de température entre les scanners et sur la surface de chaque scanner. Les scanners diffèrent subtilement par leur température moyenne de surface et, en outre, présentent de subtils biais de température sur leur surface31.
    1. Position de la plaque du scanner : Pour contrôler ces effets thermiques dans l’analyse ultérieure des données, randomisez toutes les covariables biologiques concernant la position du scanner et standardisez l’emplacement de la plaque sur tous les scanners.
    2. Nombre d’échantillons sur les scanners : Lorsque vous utilisez la disposition à 16 tapis en caoutchouc (voir le tableau des matériaux), placez quatre plaques par condition dans chaque scanner, avec un total d’au moins quatre scanners. Cela permet de s’assurer que chaque condition est répartie sur plusieurs scanners, de sorte que les effets confondants de la température du scanner peuvent être identifiés et éliminés lors de l’analyse des données13. Pour simplifier cette analyse, incluez une condition de référence partagée (par exemple, des échantillons de type sauvage) sur chaque scanner.
      REMARQUE : En général, en raison de l’emplacement des ventilateurs du scanner, les plaques dans le coin supérieur droit du tapis en caoutchouc sont plus sujettes à la dessiccation. Laissez cet emplacement vide si nécessaire.
  3. Préparation des plaques et des échantillons
    1. Coulage des plaques de culture : Pour un séchage optimal des plaques de culture du scanner (voir le tableau des matériaux), verser un milieu gélosé 4 jours avant de charger les nématodes. Bien que la mise au point du scanner soit réglable pour permettre l’ajout de différents volumes d’agar-agar aux plaques, le volume standard de la plaque est de 8 ml.
      REMARQUE : Il peut être utile de verser les plaques avec une pompe péristaltique, en particulier pour les grandes expériences.
    2. Ensemencement des plaques : Ensemencez les plaques avec la culture bactérienne souhaitée au moins 2 jours avant le début de l’expérience pour permettre le bon séchage et la croissance de la pelouse bactérienne. En règle générale, 200 μL de culture bactérienne suffisent pour former une pelouse qui nourrira 40 nématodes pendant plusieurs semaines.
      REMARQUE : Les plaques généralement utilisées pour l’imagerie sont plus hermétiquement scellées que les boîtes de Pétri de culture standard ; Par conséquent, il est conseillé d’ensemencer et de sécher les plaques à l’intérieur d’une hotte de laboratoire, généralement pendant environ 1 h ou jusqu’à ce qu’elles soient correctement séchées.
  4. Manipulation des nématodes
    1. Taille de la population : Le nombre de nématodes qui peuvent être photographiés de manière fiable sur une seule assiette dépend du génotype, de l’âge auquel les nématodes sont mis en plaque et de la quantité de nourriture ajoutée à chaque assiette. Pour les expériences sur la durée de vie qui commencent au début de l’âge adulte, chargez environ 40 animaux par plaque. Ce nombre permet d’assurer une nourriture suffisante et d’éviter les attroupements.
    2. Croissance de grandes populations : Pour vous préparer à l’expansion et à la synchronisation des populations, commencez par une population de nématodes adaptée à la méthode de synchronisation choisie (voir ci-dessous). Visez à effectuer la synchronisation sur les animaux à leur âge de production maximale d’œufs, qui pour les animaux de type sauvage N2 est le jour 2 de l’âge adulte32.
      REMARQUE : Une autre raison de synchroniser les populations en utilisant des animaux le deuxième jour de l’âge adulte est d’éliminer l’âge maternel comme facteur contribuant à l’hétérogénéité de la population. L’âge de la mère en C. Il a été démontré qu’elegans affecte plusieurs traits de fitness chez la progéniture, les animaux de type sauvage du jour 2 produisant la progéniture33 de la « plus haute qualité ».
    3. Synchronisation de l’âge : Pour obtenir des résultats précis, synchronisez l’âge des animaux aussi précisément que possible. Dans ce protocole, la synchronisation de l’âge est effectuée à l’aide d’un traitement à l’hypochlorite modifié34. D’autres méthodes peuvent inclure la synchronisation par ponte des œufs, par l’arrêt larvaire L1 ou par prélèvement manuel des larves L4.
      REMARQUE : Pour la synchronisation de l’âge par traitement à l’hypochlorite, attendez-vous à obtenir trois à quatre œufs de chaque hermaphrodite adulte.
    4. Maintien de populations exemptes de descendance : Maintenir des populations exemptes de descendance en exposant les nématodes à la fin de leur stade L4 à la 5-fluoro-2'-désoxyuridine (FUdR)35.
      REMARQUE : À faible dose, le FuDR est mortel pour les embryons en développement sans produire de changements macroscopiques visibles sur la lignée germinale ni modifier le taux de production d’ovocytes. D’autres méthodes incluent l’utilisation de mutants stériles à température, l’utilisation de constructions d’ARNi stérilisantes ou simplement l’attente de la sénescence post-reproductive pour transférer les nématodes sur des plaques pour l’imagerie.
    5. Transfert de populations : Lors du transfert de milliers d’animaux entre les plaques, le protocole standard impliquant un fil de platine/iridium devient laborieux. Les méthodes impliquant la suspension liquide de nématodes facilitent les transferts et les rendent plus efficaces. Recueillir les nématodes avec le tampon M9 + Mg (Na2HPO4 42,27 mM, KH2PO4 22,05 mM, NaCl 85,56 mM, MgSO4 1 mM), réduire le volume total une fois que les nématodes se sont installés par gravité, puis transférer rapidement les nématodes sur les plaques utilisées pour l’imagerie.
      REMARQUE : Le transfert des nématodes par suspension liquide peut entraîner une variation du nombre d’animaux transférés dans chaque plaque. Essayez d’être cohérent avec le nombre de nématodes sur chaque plaque pour éviter la variabilité expérimentale.
    6. Application d’interventions : L’arrêt et le redémarrage de l’acquisition d’images au cours d’une expérience compliquent l’analyse d’images (voir discussion). Par conséquent, ne commencez les expériences LSM qu’une fois que toutes les manipulations nécessaires des nématodes ont été effectuées.
  5. Stérilisation des tapis en caoutchouc : Autoclaver un grand nombre de tapis simultanément, en les enveloppant individuellement dans du papier d’aluminium.
    REMARQUE : Les tapis en caoutchouc doivent être stérilisés entre les utilisations pour éviter l’accumulation de contaminants fongiques ou bactériens. La plupart des types de caoutchouc généralement utilisés sont dégradés par un traitement agressif à l’éthanol.

3. Mise en place le jour de l’expérience

  1. Support de la plaque et préparation de la vitre du scanner : Pour simplifier la manipulation des plaques, ne chargez pas les boîtes de Pétri directement sur la surface du scanner, mais maintenez-les en place à l’aide de tapis en caoutchouc soutenus par des vitres (voir le tableau des matériaux). Les populations sont photographiées à travers ce verre, alors gardez le verre propre et traité avec un revêtement antibuée, hydrophobe et stérilisant (voir le tableau des matériaux).
    1. Avant de charger les plaques dans l’incubateur, nettoyez la surface du verre de support de plaque des deux côtés avec un nettoyant pour vitres antibuée.
    2. Avant de charger les plaques sur leur verre de support, appliquez un traitement protecteur hydrophobe pour le verre (voir le tableau des matériaux) afin de minimiser la formation de buée sur le côté du verre qui sera en contact avec le tapis en caoutchouc. Étalez bien ce traitement et laissez-le sur le verre pendant 5 à 10 minutes avant de passer à l’étape suivante. Nettoyez vigoureusement après l’application pour éliminer tout résidu.
    3. Appliquez de l’éthanol à 70% pour désinfecter la surface du verre qui sera en contact avec le mat en caoutchouc. Laisser agir 1 min ou 2 min, puis retirer avec un chiffon ou une serviette en papier.
  2. Chargement des plaques sur les scanners
    1. Tout d’abord, placez les tapis en caoutchouc autoclavés sur le verre de support de la plaque traitée.
    2. Retirez le couvercle des plaques utilisées pour l’imagerie avec des nématodes chargés et placez-les sur des emplacements de tapis en caoutchouc face à la surface du verre. Assurez-vous que le tapis en caoutchouc est hermétiquement scellé autour de toutes les plaques, par exemple, en ajoutant une autre feuille de verre sur le dessus et en vous assurant qu’elle repose à plat ou en tapotant sur le dessus de chaque assiette (les plaques lâches bougeront légèrement et frapperont le verre, faisant un bruit, tandis que les plaques bien fixées ne bougeront pas lorsqu’elles seront tapotées).
      REMARQUE : Il est utile d’étiqueter individuellement chaque feuille de verre de support de plaque avec du ruban de marquage avec des informations sur le contenu de la plaque et le scanner prévu. Ces données peuvent être utilisées après l’expérience pour résoudre toute ambiguïté potentielle concernant l’emplacement des plaques.
    3. Avant de charger les plaques dans les scanners, débranchez les ventilateurs du scanner pour protéger les doigts de l’expérimentateur pendant le chargement des plaques.
    4. Faites glisser délicatement les plaques et la feuille de verre qui les soutient sur la surface du scanner.
      REMARQUE : Évitez d’appliquer une pression directement sur le tapis en caoutchouc, car cela fait glisser le tapis sur le verre de support de la plaque. Lorsque les tapis glissent, les plaques se détachent souvent du tapis.
    5. Réactivez les ventilateurs du scanner et vérifiez visuellement que les ventilateurs avant et latéraux sont alimentés. Si les scanners sont hors tension, allumez-les à ce stade.

4. Acquisition de pré-image

REMARQUE : La figure 1 présente un organigramme complet résumant toutes les étapes logicielles de l’acquisition d’images.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble graphique du pipeline d’analyse d’images de Lifespan Machine. Les étapes de pré-, pendant et post-acquisition de l’image sont en grande partie effectuées sur l’interface Web (WI, en rouge) et sur le navigateur de vers (WB, en vert). Certaines étapes sont effectuées sur d’autres plates-formes (O, en bleu), telles que les documents TXT à l’étape 3a, Photoshop ou l’équivalent à l’étape 4b, et JMP ou l’équivalent à l’étape 13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Configuration de l’acquisition d’images : générez un fichier qui spécifie le calendrier de l’expérience et l’emplacement des plaques sur chaque scanner pour configurer l’acquisition d’images.
    REMARQUE : Ce fichier contient des métadonnées importantes telles que le titre de l’expérience, la fréquence des captures d’images et la durée totale de l’expérience. En règle générale, ce fichier n’est pas généré de novo pour chaque expérience, mais à la place, les fichiers de test des expériences précédentes sont réutilisés en tant que modèles. Pour la première expérience d’un utilisateur, un fichier modèle est fourni (Fichier supplémentaire 1).
    1. Demander des captures d’aperçu : indiquez l’emplacement de toutes les plaques sur chaque scanner. Plusieurs outils sont prévus pour accélérer ce processus. Tout d’abord, utilisez le scanner pour obtenir une image de toute la surface du scanner, appelée « Capture d’aperçu ». Assurez-vous que les images de capture d’aperçu montrent clairement toute la surface de chaque plaque à imager (Figure 2A) sans stries ni recadrage des bords de la plaque.
      1. À l’aide de l’interface Web, recherchez la section Acquisition d’images de la page principale et suivez le lien intitulé Périphériques de capture et serveurs d’images. Sur cette page, cliquez sur le bouton Rechercher de nouveaux périphériques (c’est-à-dire des scanners) dans la zone Serveurs de capture et de traitement d’images . Surveillez la progression du serveur dans la détection des scanners en cliquant sur le lien [log] à côté du serveur.
        REMARQUE : Assurez-vous que les scanners souhaités sont sous tension et branchés sur le serveur avant d’effectuer cette étape.
      2. Sur la même page de l’interface Web, assurez-vous que chaque scanneur connecté au serveur apparaît dans la zone Périphériques de capture d’image . L’étiquette « Manquant » sous « État actuel » ne s’affiche plus si l’appareil est détecté avec succès. Cochez la case correspondant à chaque scanner contenant des plaques nouvellement chargées.
      3. En bas de la section Périphériques de capture d’image , cliquez sur le bouton Demander une capture d’aperçu . Au bout de 1 ou 2 minutes, les scanners devraient s’allumer et commencer à numériser.
        REMARQUE : La position initiale des feuilles de support en verre doit souvent être ajustée pour amener toutes les plaques dans la plage visible. Les positions peuvent être corrigées en inspectant les images de capture d’aperçu, en ajustant la position de la plaque et en reprenant de nouvelles images de capture d’aperçu. Si les numérisations se déroulent extrêmement lentement (plusieurs minutes pour une numérisation de capture) ou si les images de capture d’aperçu contiennent de longues traînées blanches, cela indique qu’une plaque, le tapis en caoutchouc ou un autre objet bloque la lumière dans la zone d’étalonnage du scanner (indiquée par des flèches blanches sur la surface du scanner). Tous les objets doivent être repositionnés de manière à ce que seul le verre de support en verre occupe cette région.
    2. Définir les zones de numérisation : suivez les étapes suivantes dans le navigateur de vers pour analyser les images de capture d’aperçu et les assembler en une seule image composite, qui est utilisée pour spécifier l’emplacement de chaque plaque pour l’analyse des données. Assurez-vous que l’image résultante ressemble à la figure 2B.
      1. Tout d’abord, à l’aide du navigateur de vers, ouvrez chaque image de capture d’aperçu en sélectionnant l’option de menu Fichier > Ouvrir l’image, puis choisissez l’image souhaitée.
      2. Sur chaque image, cliquez pour sélectionner les colonnes des régions avec des plaques (si le tapis en caoutchouc a 16 emplacements de plaques, sélectionnez 4 colonnes).
        REMARQUE : Les zones de numérisation doivent être spécifiées sous forme de colonnes hautes (et non de lignes larges) car la capture du scanner est plus lente pour les régions plus larges, ce qui entraîne des images floues en raison du mouvement des nématodes.
      3. Une fois toutes les images définies, exportez les spécifications de la région sur le disque en sélectionnant l’élément de menu Acquisition d’images > Définir les zones de numérisation > Enregistrer les zones de numérisation sélectionnées sur le disque et en choisissant l’emplacement souhaité.
    3. Générez la planification de l’expérience :
      1. En suivant le format du fichier supplémentaire 1, assemblez un fichier contenant le nom de l’expérience, les emplacements physiques de chaque colonne sur les scanners (copiés à partir du fichier des zones de numérisation généré à l’étape 4.1.2.3), la durée totale de l’expérience et la fréquence de capture d’image, puis enregistrez-le à la fois sous forme de fichier TXT et de fichier XML.
      2. Ensuite, dans Worm Browser, cliquez sur Image Acquisition > Submit Experiment Schedule, puis choisissez le fichier XML généré. Le navigateur de vers vous demande s’il faut afficher un résumé de la planification ou exécuter l’expérience. Cliquez sur Générer un fichier récapitulatif.
    4. Valider le fichier récapitulatif : après avoir soumis le programme de test, le navigateur de vers génère un résumé du calendrier. Ce résumé s’affiche à l’écran et est écrit sur le disque. Lisez-le et vérifiez les dates des captures programmées, ainsi que l’emplacement, le nom et le nombre de scanners.
    5. Soumettre le programme d’essai : lorsque vous êtes satisfait du fichier récapitulatif, chargez à nouveau le fichier XML correspondant au programme d’essai dans le navigateur de vers en sélectionnant l’option de menu Acquisition d’images > Envoyer le programme d’essai. L’explorateur de vers vous demande une deuxième fois s’il faut générer un résumé de la planification ou exécuter l’expérience. Cette fois-ci, cliquez sur Exécutez ! .
      REMARQUE : Quelques minutes après la soumission de l’expérience, il est sage d’utiliser l’interface Web pour confirmer que l’expérience a été soumise avec succès et que les numérisations sont collectées par tous les scanners. Il est fréquent que les premiers scans soient manqués, en particulier dans les grandes expériences.
    6. Organiser les expériences sur l’interface Web : un cluster d’analyseurs très actif peut produire des centaines de jeux de données expérimentaux collectés par de nombreux utilisateurs différents. Pour organiser cette liste, affectez les expériences à des groupes distincts, par exemple correspondant au nom de l’utilisateur responsable de la test.
      1. Créer un nouveau groupe ou modifier un groupe existant : Créez de nouveaux groupes sur l’interface Web en cliquant sur Gérer les groupes d’expériences sous la case intitulée Acquisition d’images. Sur la nouvelle page qui apparaîtra, ajoutez le nom souhaité dans Créer un nouveau groupe et cliquez sur Créer. Pour modifier le nom d’un groupe existant, dans la même zone, choisissez le groupe souhaité en regard de Modifier le groupe existant, puis sélectionnez Modifier.
      2. Attribuer des tests à un groupe : pour attribuer de nouveaux tests à un groupe spécifique, accédez à l’interface Web et recherchez le test souhaité, qui sera attribué par défaut au groupe Aucun groupe en bas de la liste des tests. Cliquez sur le lien situé à droite de la section de l’expérience, à l’endroit où il est indiqué Modifier, puis utilisez la liste déroulante pour sélectionner le nom du groupe à utiliser. Ensuite, sélectionnez Enregistrer.
    7. Annuler un test :
      REMARQUE : Le LSM continuera à fonctionner de manière autonome jusqu’à ce que les analyses finales soient spécifiées dans le calendrier de l’expérience. Une fois qu’un programme expérimental est terminé, le LSM poursuit, par défaut, à collecter des numérisations, mais rejette immédiatement les données d’image dans un processus appelé balayage automatique. Ces scans automatiques sont effectués pour empêcher les scanners de s’éteindre et de se refroidir, et de maintenir un profil de température standard afin que toute autre expérience exécutée dans le même espace (mais à partir d’une expérience différente) ne soit pas affectée par l’arrêt d’autres scanners.
      1. Arrêter les analyses automatiques : pour arrêter les analyses automatiques d’une expérience en cours sur l’interface Web, cliquez sur Modifier à côté de l’expérience souhaitée, puis sur Annuler les analyses en attente, puis sélectionnez Annuler les captures planifiées.

Figure 2
Figure 2 : Aperçu de l’image de capture et sélection de la zone de numérisation. (A) Pour chaque scanner de l’expérience, une image de capture d’aperçu est générée. (B) Sélection d’une rangée de plaques à la fois (cases rouges), ce qui augmente la vitesse de numérisation et empêche le flou de mouvement des vers en raison de zones de numérisation trop larges. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Acquisition d’images

REMARQUE : Les étapes suivantes peuvent être effectuées pendant l’exécution de l’expérience ou après son achèvement.

  1. Sortie du fichier de masque de l’expérience : les données d’image brutes des scanners contiennent de nombreuses zones qui n’ont pas besoin d’être traitées (zones situées à l’extérieur des plaques). Pour concentrer l’analyse sur chaque plaque individuellement, un « masque » est créé qui spécifie la zone occupée par chaque plaque sur chaque scanner. Générez ce masque en dessinant la position de chaque plaque en superposition sur les images collectées par les scanners.
    1. À l’aide du navigateur de vers, choisissez l’expérience souhaitée en sélectionnant Fichier > Sélectionner l’expérience en cours, puis cliquez sur le nom de l’expérience.
    2. De nouveau, dans le navigateur de vers, sélectionnez Acquisition d’images > Définir des masques d’échantillon > Générer un composite de masque d’expérience, puis enregistrez le masque à l’emplacement souhaité. Assurez-vous que le fichier obtenu ressemble à la figure 3A.

Figure 3
Figure 3 : Spécification de l’emplacement des plaques pour chaque scanner à l’aide de masques d’échantillonnage. Pour garantir l’analyse indépendante des plaques dans les sélections de colonnes illustrées à la figure 1, les plaques individuelles doivent être identifiées en générant un masque d’image composite. (A) Une capture des numérisations des scanners est ouverte à l’aide d’un logiciel de manipulation d’images (notez le nom du scanner « han » au-dessus d’une sélection numérisée, et « a-d » se référant à chacune des colonnes). (B) Les différentes étapes de la génération du masque pour marquer l’emplacement de chaque plaque dans le composite de masque nécessitent que l’arrière-plan soit défini sur noir, (C) la suppression des bords irréguliers et des bords des plaques non sélectionnées par l’expansion puis le rétrécissement de l’arrière-plan, et (D) la sélection des plaques de premier plan et le remplissage complet des zones avec des pixels blancs. (E) Pour que le LSM puisse reconnaître les plaques individuelles dans les rangées numérisées, chaque région blanche d’une rangée est remplie d’une nuance de gris différente, généralement avec une luminosité croissante. (F) À ce stade, le masque est enregistré (compression LZW sans calque spécifié s’il est généré dans Photoshop). Le masque est ensuite analysé par le navigateur de vers et une visualisation du masque par le logiciel est générée. Une visualisation correcte du masque doit afficher un carré défini par plaque avec une petite croix au centre et une couleur différente pour chaque ligne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Annoter le masque de l’expérience : Ouvrez le fichier généré à l’étape précédente à l’aide d’un programme de manipulation d’images (tel que Photoshop ou GIMP) afin de marquer l’emplacement de chaque plaque dans l’image. Vous trouverez ci-dessous une vue d’ensemble de toutes les étapes de modification du masque à l’aide de Photoshop.
    1. Dans Photoshop, sélectionnez l’outil Remplissage avec la tolérance définie sur zéro, l’option contiguë sélectionnée et l’anticrénelage désélectionné. Cliquez sur l’arrière-plan gris pour le mettre complètement en noir. Assurez-vous que l’image résultante ressemble à la figure 3B.
    2. Utilisez l’outil baguette magique pour sélectionner l’arrière-plan noir, avec le crénelage désactivé, la tolérance définie sur zéro et l’option contiguë sélectionnée. Pour lisser les bords, agrandissez l’arrière-plan sélectionné de 30 pixels en cliquant sur Sélectionner > Modifier > Développer. Ensuite, réduisez la sélection de 20 pixels dans Sélectionner > Modifier > contrat. Assurez-vous que l’image résultante ressemble à la figure 3C.
    3. Remplissez entièrement l’arrière-plan lissé avec des pixels noirs, par exemple, en définissant la tolérance de l’outil Remplissage sur 255 et en remplissant la région sélectionnée. Ensuite, cliquez sur Sélectionner > Inverse pour inverser la sélection, puis sélectionnez le premier plan. Remplissez entièrement la nouvelle région avec des pixels blancs, par exemple, en définissant la tolérance de l’outil de remplissage sur 255 et en remplissant la région avec du blanc. Assurez-vous que l’image résultante ressemble à la figure 3D.
    4. Pour séparer chaque plaque à l’intérieur d’une seule région, remplissez chaque ligne avec un dégradé de gris différent en augmentant la luminosité. Cela peut être fait avec l’outil Remplissage, puis en sélectionnant la couleur souhaitée, avec la tolérance définie sur 0. Assurez-vous que l’image résultante ressemble à la figure 3E. Enregistrez-le dans une compression LZW sans « Couches » spécifiées.
      REMARQUE : L’ordre des plaques est défini par la couleur des régions spécifiées. Pour nommer les plaques 1 à 4 dans l’ordre de haut en bas, spécifiez les couleurs avec une luminosité croissante pour chaque rangée.
    5. Dans le navigateur de vers, sélectionnez Acquisition d’images > Définir des masques d’échantillon > Analyser les emplacements des plaques dessinées sur le composite de masque d’expérience, puis sélectionnez le fichier généré à l’étape précédente. Le logiciel va maintenant prendre quelques instants pour analyser le masque soumis.
    6. Le navigateur de vers affiche une visualisation de masque. Inspectez le masque pour détecter d’éventuelles erreurs dans le fichier. Assurez-vous que chaque rangée d’assiettes est remplie d’une couleur différente et délimitée par un rectangle coloré. Assurez-vous que l’image résultante ressemble à la figure 3F.
      REMARQUE : si une seule plaque affiche deux cercles ou plus, ou si deux cercles partagent la même couleur, revenez à l’étape 5.2 pour corriger le fichier de masque et chargez-le à nouveau dans le navigateur de vers.
    7. Après avoir vérifié que la visualisation du masque est correcte, dans le navigateur de vers, sélectionnez Acquisition d’image > Définir des masques d’échantillon > Soumettre le composite du masque d’expérience analysé au cluster. Le serveur d’analyse d’images va maintenant analyser l’emplacement de toutes les plaques de l’expérience.
  2. Appliquer le masque : Le LSM utilise des masques pour diviser les données de l’image brute en plaques individuelles. Pour démarrer ce processus, planifiez une tâche d’application de masque à l’aide de l’interface Web.
    1. Avant d’envoyer le travail, vérifiez que tous les scanners ont identifié des régions dans le masque. Accédez à la page principale de l’interface Web, localisez le nom de l’expérience et la colonne nommée Analyse d’image, puis cliquez sur Exécuter l’analyse. Vérifiez que les régions de tous les périphériques sous Échantillons d’expérience sont identifiées.
    2. Pour appliquer le masque, sur la même interface, cliquez sur Nouvelle tâche pour tous les échantillons. Dans la zone Planifier une tâche pour des images individuelles, cochez la case Appliquer le masque, puis Enregistrer la tâche.
      REMARQUE : Le masque sera appliqué à toutes les images déjà capturées, ainsi qu’à toutes les images capturées à l’avenir.
  3. Effectuer le contrôle de la qualité des plaques :
    REMARQUE : Les plaques souffrant de contamination, de dessiccation ou de buée sont censurées à ce stade de l’analyse de l’image. Un exemple de plaques contaminées, desséchées, embuées et optimales est illustré à la figure 4. D’autres raisons de censurer incluent la famine, les assiettes vides ou les larves dans les populations stériles. Les plaques non valides contiennent souvent des formes complexes que la machine vise à interpréter comme des nématodes. Il est important d’exclure les plaques non valides à cette étape afin d’éviter de longs temps de traitement dans les étapes ultérieures de l’analyse d’image.
    1. À l’aide de l’interface Web, excluez les plaques à censurer en recherchant l’expérience souhaitée et la colonne nommée Annoter les informations sur la plaque et en sélectionnant Par image.
    2. Pour inspecter les plaques, cliquez sur Afficher les images.
      REMARQUE : Si l’étape d’affichage des images ne fonctionne pas correctement, il se peut que le serveur Linux ne soit pas configuré correctement. Des instructions sur la façon de procéder sont disponibles dans le guide d’installation du logiciel dans le référentiel GitHub susmentionné.
    3. Pour exclure des plaques, cochez la case Censurer, sélectionnez une option dans la liste déroulante nommée Raison censurée, puis cliquez sur Enregistrer pour chaque page.
  4. Ajouter des informations de métadonnées : les métadonnées décrivent le contenu de chaque plaque d’une expérience. Ces informations sont ensuite incluses dans tous les fichiers de données statistiques générés par la suite.
    1. Pour ajouter des informations de métadonnées relatives à la souche, au génotype, à la température, à l’aliment, etc., accédez à la page principale de l’interface Web, recherchez l’expérience souhaitée et la colonne nommée Annoter les informations sur la plaque, puis sélectionnez Par position.
    2. Saisissez les étiquettes et sélectionnez les scanners pour lesquels enregistrer les métadonnées en cliquant sur Enregistrer sur les appareils dans le coin inférieur gauche.
    3. Pour réutiliser les métadonnées entre différents scanners sans avoir à saisir à nouveau toutes les étiquettes, accédez à Charger à partir de l’appareil dans le coin supérieur droit, sélectionnez le scanner à partir duquel réutiliser les métadonnées, puis cliquez sur Charger à partir de l’appareil.
  5. Spécifier l’heure de l’âge zéro : par défaut, le LSM mesure le temps par rapport au début de l’ère UNIX. C’est rarement pratique, de sorte qu’il est nécessaire de spécifier une heure de référence (par exemple, la date à laquelle tous les individus ont éclos ou ont atteint l’âge adulte).
    1. Pour spécifier les informations sur l’heure zéro, accédez à la page principale de l’interface Web, recherchez l’expérience souhaitée et la colonne nommée Analyse d’image, puis sélectionnez Exécuter l’analyse.
    2. Sur la nouvelle page qui s’affiche, sélectionnez Nouvelle tâche pour toutes les régions. Dans la zone intitulée Mettre à jour les informations sur la région, sélectionnez Heure à laquelle les animaux avaient 0 âge, ajoutez les informations, puis cliquez sur Mettre à jour les champs sélectionnés.
      REMARQUE : Si tous les animaux ne partagent pas le même temps d’âge zéro, sélectionnez plutôt Nouvel emploi pour des types d’animaux spécifiques et répétez les étapes ci-dessus pour chaque groupe.
  6. Programmer la détection des vers : Le LSM peut automatiser la détection de chaque nématode en fonction de sa position sur la plaque.
    1. Pour lancer la détection automatisée des nématodes pour chaque image, rendez-vous sur la page principale de l’interface Web, recherchez l’expérience souhaitée et la colonne nommée Analyse d’image, puis sélectionnez Exécuter l’analyse.
    2. Sur la nouvelle page qui s’affiche, cliquez sur Nouvelle tâche pour toutes les régions, puis sur la case Planifier une tâche pour les images individuelles, puis cochez les cases Filtre médian > Seuil > Détection des vers > Enregistrer la tâche. Ces travaux seront appliqués à toutes les images passées et futures capturées.
      REMARQUE : Afin de planifier un travail uniquement pour une souche ou une condition spécifique, cliquez plutôt sur Travaux pour des types d’animaux spécifiques. La classification des objets s’effectue à l’aide de modèles SVM qui sont spécifiés sous forme de fichiers stockés dans le sous-dossier Models du répertoire de stockage à long terme du LSM. Les jeux de paramètres de détection des nématodes V2.0 pour le LSM peuvent être téléchargés à partir du référentiel GitHub.

Figure 4
Figure 4 : Contrôle de la qualité des plaques à l’aide de l’interface Web. La censure des plaques sous-optimales sur l’interface Web avant l’analyse du mouvement des vers est cruciale pour accélérer le pipeline de traitement de l’image. Des exemples de plaques sujettes à l’enlèvement comprennent des conditions de (A) dessiccation, (B) de contamination ou (C) de buée, par opposition. (D) Plaques optimales à inclure dans une analyse ultérieure. Une barre d’échelle de 10 mm est superposée à une image de capture d’aperçu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Acquisition post-image

REMARQUE : Une fois la détection des vers terminée, toutes les données recueillies dans le cadre de l’expérience doivent être agrégées au fil du temps pour suivre chaque individu tout au long de sa vie et identifier les heures de décès de tous les individus. Attendez que tous les animaux de l’expérience soient morts et que toutes les tâches de détection des vers soient terminées, puis effectuez les étapes suivantes :

  1. Planifiez l’analyse du mouvement :
    1. L’analyse des mouvements intègre toutes les données expérimentales dans le temps pour estimer les temps de mortalité. Pour démarrer cette tâche, accédez à la page principale de l’interface Web et recherchez l’expérience souhaitée dans la colonne intitulée Analyse d’image. Sélectionnez le lien Exécuter l’analyse.
    2. Sur la nouvelle page qui s’affiche, cliquez sur le lien Nouvelle tâche pour toutes les régions, et dans le menu déroulant, Planifier une tâche pour une région entière, sélectionnez Analyser le mouvement du ver, puis cliquez sur le bouton Enregistrer la tâche.
    3. Le serveur d’acquisition d’images LSM commencera automatiquement à analyser les mouvements sur toutes les plaques.
      REMARQUE : L’analyse du mouvement est le travail le plus important. Sur un processeur multicœur moderne, l’analyse de chaque plaque issue d’une expérience de durée de vie de 1 mois peut prendre 20 minutes ou plus.
  2. Générer un storyboard : Une fois l’analyse du mouvement terminée, le storyboard LSM permet aux utilisateurs de valider manuellement les résultats automatisés et de s’assurer que le logiciel fait des hypothèses correctes sur la morphologie et le comportement du nématode.
    1. Sur la page principale de l’interface web, recherchez l’expérience souhaitée et la colonne nommée Analyse d’image, puis sélectionnez Exécuter l’analyse. Sur la nouvelle page qui s’affiche, cliquez sur Nouveau travail d’expérience. Ensuite, dans la section Planifier une tâche pour une région entière, sélectionnez Générer un storyboard animal, puis cliquez sur Enregistrer la tâche.
    2. Une fois que le LSM a fini de générer le storyboard, accédez au navigateur de vers et sélectionnez l’expérience souhaitée. De retour dans le menu principal, sélectionnez Validation > Parcourir l’intégralité de l’expérience > immédiatement après la mort de chaque ver.
  3. Annoter les storyboards sur le navigateur Worm : un storyboard typique sur le navigateur Worm doit ressembler à ceci Graphique 5.
    1. Annoter des objets « non-worm »
      REMARQUE : Chaque objet détecté lors d’un mouvement est affiché sur le storyboard, trié par l’heure de mort estimée. Sauf indication contraire de l’utilisateur, chaque objet sera inclus dans les courbes de survie résultantes. La classification des objets LSM est intentionnellement calibrée pour avoir un taux élevé de faux positifs, afin de minimiser le nombre de nématodes non détectés. L’exclusion des objets non vermifuges est importante pour obtenir des courbes de survie de haute qualité (voir les résultats représentatifs). Un grand nombre d’objets autres que des vers se trouvent généralement sur la première et la dernière page du storyboard, qui peuvent être rapidement exclus manuellement en bloc.
      1. Pour exclure des objets autres que des vers sur la table de montage séquentiel, cliquez une fois avec le bouton droit de la souris sur l’image de l’objet. L’objet exclu sera maintenant délimité par une boîte blanche. Pour exclure de nombreux objets simultanément, maintenez la touche Ctrl enfoncée et cliquez avec le bouton droit de la souris une fois sur n’importe quel objet, et tous les objets de la page de storyboard seront exclus.
      2. Après avoir exclu un objet de l’analyse, cet objet peut être réinclus en cliquant à nouveau deux fois avec le bouton droit de la souris.
      3. Pour enregistrer les annotations faites lors de l’annotation du storyboard, cliquez sur le bouton Enregistrer . Il est recommandé d’enregistrer fréquemment la progression lors de l’annotation.
    2. Annotez les heures de décès :
      REMARQUE : Sans l’intervention de l’utilisateur, le RMLL estime avec précision les temps de mortalité pour la plupart des populations. Cependant, il est recommandé de confirmer régulièrement l’exactitude des résultats automatisés en validant manuellement un sous-ensemble aléatoire d’individus de chaque expérience. Une attention particulière doit être accordée aux individus qui vivent le plus court et le plus longtemps, car toute erreur dans l’analyse automatisée a tendance à se regrouper dans ces groupes.
      1. Cliquez une fois avec le bouton gauche de la souris sur n’importe quel objet de la table de montage séquentiel pour ouvrir une nouvelle fenêtre qui affiche des informations détaillées sur les séries chronologiques de cet objet. Cette fenêtre permet l’inspection de toutes les images recueillies de l’objet tout au long de l’expérience, ainsi que la quantification de la dynamique du mouvement et de la morphologie de l’objet. À l’aide de la même interface, annotez manuellement les heures de décès. L’interface pour l’annotation de l’heure de décès est illustrée à la figure 6.
      2. Pour annoter manuellement les heures de décès, cliquez avec le bouton gauche de la souris sur la barre inférieure à l’endroit correspondant à l’heure de décès. Utilisez la barre d’espace et les flèches droite ou gauche du clavier pour vous déplacer dans les intervalles de temps, ou cliquez directement sur la barre à l’intervalle de temps souhaité.
        REMARQUE : La visualisation représente l’état de déplacement des animaux au fil du temps, comme un graphique à barres horizontales avec le temps de marquage de l’axe des abscisses. La section rose/violette indique la période de temps pendant laquelle l’objet se déplace vigoureusement, le jaune indique un mouvement faible, le rouge indique des animaux immobiles et le vert indique la période d’expansion associée à la mort. Les nématodes présentent des événements morphologiques caractéristiques associés à la mort : une contraction graduelle du corps qui se produit généralement avant la mort, suivie d’une expansion rapide du corps pendant ou immédiatement après la mort (figure 6B). Les objets non vermifuges tels que la poussière ou les ombres ne présentent pas cette dynamique dans la taille du corps et, au lieu de cela, suivent généralement un changement linéaire et progressif de taille et d’intensité au fil du temps. Ces différentes dynamiques de taille corporelle fournissent une méthode rapide et simple pour une classification rapide et une exclusion manuelle.
      3. Selon l’approche d’analyse, le temps de mort peut être considéré soit comme le moment de la cessation du mouvement (le début de la barre rouge dans la visualisation du mouvement), soit comme le moment de l’expansion associée à la mort (la barre verte dans la visualisation du mouvement). Pour annoter manuellement les événements de contraction et d’expansion, cliquez avec le bouton droit de la souris sur la barre inférieure à l’intervalle de temps souhaité.
    3. Certaines visualisations rudimentaires des données de mortalité sont fournies en mode natif dans le client Worm Browser. Les courbes de survie et les diagnostics de temps de décès sont présentés pour chaque population présente dans le storyboard (figure 7). Voir les courbes de survie sur le côté gauche et le nuage de points comparant le temps d’arrêt des mouvements vigoureux (VMC) au moment de la mort pour chaque individu sur le côté droit du storyboard.
      REMARQUE : Il est possible de regrouper ces résultats en fonction de différents paramètres expérimentaux en sous-réglant sur la barre inférieure pour des conditions telles que des souches, des scanners ou des plaques spécifiques. Les vers individuels peuvent être sélectionnés en fonction de leur heure de mort en cliquant avec le bouton gauche de la souris sur des points individuels dans le graphique VMC en fonction du temps de mort.
  4. Écriture des données de mortalité sur le disque : Le LSM produit des données de mortalité sous forme de fichiers CSV. Tracez les courbes de survie en sortie et analysez-les sur n’importe quel logiciel statistique tel que R, SAS, STATA ou JMP.
    1. Pour générer ces fichiers, choisissez l’expérience dans le navigateur de vers, puis dans le menu, sélectionnez Fichiers de données, Heures de décès, puis cliquez sur Générer les heures de mort pour l’expérience en cours. Le LSM générera un fichier de sortie avec les données de survie de l’expérience, qui sera enregistré dans le répertoire des résultats.
    2. Si des annotations manuelles ont été effectuées sur le storyboard, une invite s’affiche dans le navigateur de vers pour vous demander comment gérer les annotations manuelles. Cliquez sur « Immédiatement » pour inclure des annotations manuscrites dans le fichier des heures de décès générées.
      REMARQUE : Les fichiers de données de mortalité sont écrits dans le répertoire de résultats spécifié dans le fichier imageserver.ini. Une variété de fichiers sont écrits, mais la version la plus couramment utilisée est « survival_simple/survival=machine_hand », qui comprend toutes les annotations manuelles faites à l’aide du storyboard.
    3. Analysez les données de mortalité dans le logiciel statistique de votre choix.

Figure 5
Figure 5 : Storyboard d’animaux sur le navigateur de vers. (A) Tous les vers stationnaires sont représentés dans l’ordre chronologique de l’heure de la mort annotée par la machine. Pour naviguer dans le storyboard, appuyez sur les boutons situés dans le coin inférieur droit (B) et (C) enregistrez souvent les annotations. (D) Les images avec un arrière-plan non gris représentent deux événements de mort de ver (mort précoce en vert, mort ultérieure en rouge), qui peuvent se produire soit lorsque deux vers meurent à proximité l’un de l’autre, soit lorsque des vers morts sont déplacés par un ver de passage et sont, ainsi, détectés comme morts deux fois. (E) Une étiquette rouge dans le coin inférieur d’une image identifie les vers avec une heure de mort détectée ; (F) une étiquette verte indique l’endroit où un objet n’est pas resté immobile assez longtemps pour enregistrer une heure de mort. (G) Plusieurs vers dans la même image peuvent être signalés en appuyant sur la touche Maj et en cliquant avec le bouton gauche de la souris. (H) Les objets autres que des vers sont exclus de l’analyse par un clic droit. (I) Les vers explosés sont censurés de l’analyse en cliquant sur l’image correspondante (une fenêtre d’annotation manuelle s’ouvre) et en appuyant sur la touche Maj et en cliquant avec le bouton droit de la souris jusqu’à ce qu’un message « animal explosé » apparaisse. Une barre d’échelle de 0,5 mm et des étiquettes sont superposées à la capture d’écran d’une fenêtre du navigateur de vers. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Inspection d’objets et annotation des heures de mort dans le navigateur de vers. Un clic gauche sur n’importe quel objet du storyboard de Worm Browser ouvre une nouvelle interface et permet à l’utilisateur d’inspecter la dynamique de mouvement de l’objet. Sur le côté droit, le score de mouvement (A) est affiché, qui quantifie le mouvement de l’objet ; Ceci est estimé par la variation de l’intensité des pixels entre les observations consécutives. De plus, sur le côté droit, (B) la variation de l’intensité totale de l’objet est affichée, ce qui quantifie les changements dans la taille de l’objet. Sur le côté gauche, la barre supérieure montre l’estimation de l’heure de mort par la machine (C), tandis que la barre inférieure est l’annotation (D) de la main de l’homme. En cliquant sur n’importe quel point des barres et en appuyant sur la touche espace, l’utilisateur peut se déplacer dans les intervalles de temps au cours desquels le ver a été imagé. Sur ces barres, le rose représente le temps passé dans un mouvement vigoureux, le rouge représente le temps passé dans la mort, et le jaune est tout ce qui se trouve entre les deux. Le temps passé en expansion et en contraction après le temps de mort est indiqué en vert. Les étiquettes sont superposées à la capture d’écran d’une fenêtre du navigateur de vers. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Statistiques récapitulatives de la population dans le navigateur de vers. Statistiques de population pour l’appareil de balayage « obiwan », avec un graphique de la survie (panneau de gauche) et un nuage de points du temps d’arrêt du mouvement vigoureux (VMC) par rapport au temps de mort (panneau de droite). Les graphiques sont les détails de (A) une condition, obtenus à partir de (B) un scanner obtenu en sélectionnant d’abord (C) le groupe de survie par souche. (D) Les formes carrées dans le nuage de points représentent les événements annotés à la main, tandis que (E) les formes circulaires représentent les événements annotés par machine. (F) L’annotation manuelle est souvent requise pour les événements de décès qui surviennent tôt ou (G) ceux où le moment de l’arrêt des mouvements vigoureux coïncide avec le moment du décès. Les étiquettes sont superposées à la capture d’écran d’une fenêtre du navigateur de vers. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Representative Results

La reproductibilité expérimentale des essais de durée de vie est difficile et nécessite à la fois des conditions expérimentales étroitement contrôlées et de grandes populations pour atteindre une résolution statistique suffisante 4,36. Le LSM est particulièrement adapté à l’étude de grandes populations d’animaux dans un environnement constant avec une résolution temporelle élevée. Afin de démontrer la capacité du LSM, de mettre en évidence les étapes cruciales de l’analyse et d’aider les chercheurs à hiérarchiser leurs efforts de travail, nous présentons un sous-ensemble de données issues d’une expérience optimale précédemment publiée23. En raison de la nature de cette expérience en tant qu’essai dose-réponse, un nombre important d’animaux a été nécessaire pour détecter de manière fiable les altérations de la durée de vie. À la main, cette expérience nécessiterait un engagement de temps intense de la part de plusieurs chercheurs ou, si elle était réduite, conduirait à des résultats sous-alimentés. L’ensemble de données a mesuré les changements quantitatifs de la durée de vie après l’élimination du gène de la sous-unité de l’ARN polymérase II (b) (RPB-2), nécessaire à la transcription de l’ARN messager. Utilisation du système inductible par l’auxine37 en C. elegans, le locus endogène de RPB-2 a été marqué avec une séquence de degron pour ubiquityler et dégrader conditionnellement RPB-2 en utilisant différentes concentrations d’auxine (acide α-naphtalénéacétique). L’expérience a été réalisée sur AMP100 [rpb-2 (cer135) ; eft-3p ::TIR-1] avec cer135 correspondant à la balise AID insérée par CRISPR rpb-2 ::GFPΔpiRNA ::AID ::3xFLAG23. Les conditions expérimentales ont été réalisées à une température de 20 °C et avec du NEC937 inactivé par les UV (OP50 ΔuvrA ; KanR)38E. Coli. Les hermaphrodites ont été stérilisés en transférant des nématodes à la fin du stade L4 sur des plaques contenant de la 5-fluoro-2-désoxyuridine (FUdR). Les nématodes ont été transférés au cours du jour 2 de l’âge adulte dans des plaques contenant différentes concentrations d’auxine. Dans l’étude originale, les auteurs ont montré qu’en présence d’auxine, la dégradation du RPB-2 raccourcissait la durée de vie de manière dose-dépendante23. 

Ici, nous démontrons la contribution de la validation et de l’annotation des données post-expérience à la courbe de survie finale (Figure 8). Dans les dernières étapes de l’analyse d’images dans le storyboard de Worm Browser, nous avons comparé les courbes de survie brutes produites avant l’annotation du storyboard aux courbes de survie produites après l’exclusion manuelle d’objets non-vermifuges ainsi qu’aux courbes de survie produites après l’annotation d’objets non-vermifuges et d’heures de mort individuelles (Figure 8A-C). Nous avons constaté que les courbes de survie initiales produites avant l’annotation du storyboard (Figure 8A) étaient déformées par l’inclusion incorrecte d’objets autres que des vers, ce qui était le plus apparent dans les queues des courbes de survie. Avant l’annotation manuelle, les courbes de survie incluaient tous les objets détectés par la machine comme des objets vers potentiels, dont environ la moitié, en raison du taux de faux positifs intentionnellement élevé, étaient des objets non vermifuges et devaient être exclus manuellement (Figure 8D). C’est à dessein, car les algorithmes sont calibrés pour avoir un taux de faux positifs relativement élevé afin d’éviter les faux négatifs, car il est beaucoup plus facile d’exclure des objets incorrectement inclus que de rechercher et de récupérer des objets incorrectement exclus. Après avoir exclu les objets autres que des vers lors de l’annotation manuelle du storyboard, les courbes de survie résultantes étaient d’une résolution beaucoup plus élevée (Figure 8B,E), et une annotation manuelle supplémentaire des heures de mort sur le storyboard a produit des changements ne dépassant pas ~4% dans la durée de vie moyenne estimée. Nous démontrons donc que l’élimination d’objets non-worm au cours du pipeline d’analyse d’images du LSM est l’étape cruciale pour obtenir des courbes de survie bien résolues.

Figure 8
Figure 8 : L’effet de la validation manuelle des données sur les courbes de survie. La dégradation de RPB-2 raccourcit le C. elegans durée de vie en présence d’auxine (K-NAA : acide α-naptalèneacétique) de manière dose-dépendante. (A) Courbes de survie tracées à partir de la sortie brute LSM après contrôle qualité des plaques et sans annotation manuelle des objets ver sur le storyboard du navigateur de vers. (B) Courbes de survie tracées après l’annotation manuelle des objets ver sur le storyboard. (C) Courbes de survie tracées après annotation manuelle des objets vers et des heures de mort sur le storyboard. (D) Récapitulatif de tous les objets détectés par le LSM. Les objets ver censurés comprenaient des objets exclus automatiquement (par exemple, en raison de vers se déplaçant en dehors de la zone numérisée) ou manuellement par l’expérimentateur (par exemple, en raison de l’éclatement de vers). (E) Représentation tabulaire de la durée de vie moyenne estimée après l’annotation manuelle de l’objet ver (à gauche) et l’annotation supplémentaire de l’heure de mort à la main (à droite). Différence en pourcentage de la durée de vie moyenne entre les groupes voisins de différentes concentrations d’auxine et de la puissance statistique de détection. Tous les graphiques ont été tracés à l’aide du logiciel statistique JMP. Les données de cette figure ont été adaptées avec la permission d’Oswal et al.23. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Au-delà de la durée de vie en tant que point final unique pour l’étude du vieillissement, nous avons ensuite examiné le vieillissement comportemental et étudié quelles étapes de l’analyse d’images post-expérimentales étaient les plus cruciales pour le mesurer. En nous concentrant sur la relation entre l’arrêt vigoureux des mouvements (VMC) et la durée de vie, nous avons comparé les résultats du LSM à différents stades de l’analyse et de la validation de l’image (Figure 9A-D). Nous avons constaté que les objets autres que les vers présentaient une relation unique entre la VMC apparente et la durée de vie, les deux étant annotés comme se produisant presque simultanément dans chaque objet (Figure 9A). En revanche, les vrais nématodes ont généralement cessé de se déplacer vigoureusement plusieurs jours avant leur mort (figure 9A). Cette différence dans la relation entre la VMC et la durée de vie fournit un moyen supplémentaire d’identifier et d’exclure rapidement les objets autres que les vers.

Figure 9
Figure 9 : L’effet de la validation manuelle des données sur l’analyse de l’arrêt vigoureux des mouvements (VMC). (A) Données de vieillissement comportemental sans annotation manuelle des objets ver sur le storyboard de l’explorateur de vers, affichant la relation entre les heures de mort et les heures VMC dans les objets non-ver (en noir) par rapport aux objets vers (en rouge). (B) Données de vieillissement comportemental tracées après annotation manuelle d’objets worm sur le storyboard. (C) Données sur le vieillissement comportemental tracées après annotation manuelle des objets vers et des heures de mort sur le storyboard. (D) Représentation tabulaire de la durée de vie restante moyenne (ARL ; obtenue à partir de l’intersection entre l’âge de décès et l’âge de VMC) à travers différentes étapes du pipeline d’analyse d’images et de la différence en pourcentage de l’ARL entre l’annotation d’objet ver et l’annotation de l’heure de mort ultérieure. (E) Représentation graphique des ARL estimés à travers les différentes étapes de l’analyse post-acquisition d’image, et leur relation avec la durée de vie du ver (qui dépend de la concentration d’auxine : acide α-naptalèneacétique). L’ajustement de la spline a été effectué à l’aide d’une méthode de spline cubique. Tous les graphiques ont été tracés à l’aide du logiciel statistique JMP. Les données de cette figure ont été adaptées avec la permission d’Oswal et al.23. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nous avons constaté que l’annotation et l’exclusion d’objets autres que des vers à l’aide du navigateur de vers étaient suffisantes pour fournir une estimation approximative de la relation entre la VMC et les temps de mort (Figure 9A-C), récapitulant la dynamique attendue du déclin physiologique chez les nématodes23. Pour explorer davantage cette question, nous avons considéré le même ensemble de données sur l’ARN polymérase II et estimé la durée de vie restante moyenne (ARL) après VMC pour chaque sous-population comme l’ordonnée à l’origine d’un modèle de régression linéaire reliant la durée de vie à la VMC. Pour comprendre l’effet de l’annotation des données sur l’ARL, nous avons recalculé l’ARL après chaque étape de l’annotation des données (Figure 9E). Nous avons constaté que l’annotation manuelle des heures de décès dans l’analyse comportementale du vieillissement était particulièrement importante chez les vers à plus longue durée de vie, dans ce cas, ceux exposés aux plus faibles concentrations d’auxine (Figure 9D, E). Contrairement à son effet minime sur les courbes de survie, l’annotation manuelle des heures de décès a eu un effet substantiel sur la relation quantitative entre la VMC et la durée de vie, augmentant l’ARL estimé, par exemple à 0 μM d’auxine, de 8,09 jours à 10,42 jours après l’annotation de l’heure de décès ; cela représente une différence d’ARL de 29 %. Par conséquent, nous avons constaté que la relation entre la VMC et les heures de décès expliquée par l’ARL était beaucoup plus sensible à l’annotation manuelle des heures de décès par rapport aux mesures des heures de décès pour la durée de vie seule. Cette sensibilité peut s’expliquer par les durées relatives de la LMR et de la durée de vie ; les mêmes ajustements de l’heure de décès seront généralement faibles par rapport à la durée de vie, mais importants par rapport à l’ARL. Ainsi, les ajustements apportés aux heures de décès auront un effet relatif plus important sur l’ARL par rapport à la durée de vie.

Fichier supplémentaire 1 : Structure du fichier de planification de l’expérience Lifespan Machine. Le programme d’expérimentation se compose de trois parties. Tout d’abord, les informations de base sur l’expérience sont incluses, telles que le nom et la spécification de capture. À partir de cette partie, seul le nom de l’expérience doit généralement être modifié pour chaque nouvelle expérience. La deuxième partie du document est générée par l’exportation des zones de numérisation à partir du navigateur de vers et spécifie l’emplacement physique des zones de numérisation pour chaque scanner (« asuna », « bulma », « moscou », « rio », « yuno » et « yuki » dans cet exemple). Ceux-ci sont remplacés à chaque nouvelle expérience et sont copiés à partir des fichiers TXT générés individuellement pour chaque scanner à l’étape 4.1.2.3. La troisième partie du document fournit des informations sur la durée de l’expérience, qui doit également être modifiée pour chaque nouvelle expérience, et la fréquence de capture. L’appareil balayera chaque zone définie une à la fois à des intervalles spécifiés pendant toute la durée de l’expérience. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Ici, nous fournissons un protocole détaillé et accessible pour effectuer une expérience à l’aide de la dernière version de la Lifespan Machine. Nous avons montré que l’étape critique pour obtenir des courbes de survie bien résolues est l’exclusion manuelle des objets non-vermifuges lors de l’acquisition post-image. L’annotation manuelle de l’heure de décès a un faible effet sur la forme globale des courbes de survie, ce qui démontre que l’estimation entièrement automatisée de l’heure de décès est efficace même sans annotation manuelle (Figure 8). Au contraire, l’acquisition de données de haute qualité sur le vieillissement comportemental nécessite une annotation plus minutieuse des heures de mort, en particulier chez les individus à longue durée de vie (Figure 9). Par conséquent, le temps nécessaire à l’annotation du storyboard à la main dépendra en fin de compte du résultat spécifique mesuré. Dans l’ensemble, nous constatons que lorsque l’on travaille avec le LSM, les efforts du chercheur sont les plus cruciaux lors du montage expérimental et, dans une moindre mesure, lors de l’analyse post-acquisition d’images. Enfin, nous soulignons la valeur des tests automatisés à haut débit dans la production de données de survie et de vieillissement comportemental hautement résolues tout en augmentant la productivité des chercheurs et en soutenant la reproductibilité expérimentale.

Le LSM héberge les nématodes sur des plaques de gélose, recréant ainsi le test classique de durée de vie manuel dans un contexte automatisé. D’autres outils ont été développés pour automatiser la mesure de la durée de vie de C. elegans à l’aide de différentes méthodes de confinement des nématodes. Il s’agit notamment d’approches dans lesquelles des nématodes uniques sont logés dans des milieux solides (WorMotel15) ou dans un dispositif microfluidique (Lifespan-on-a-chip11) ou celles qui suivent une plus grande population d’animaux à l’aide de la microfluidique (WormFarm14). Les avantages des plates-formes microfluidiques comprennent la possibilité d’un contrôle précis et en temps réel de l’environnement et l’élimination automatisée de la descendance par exclusion de taille. Cependant, les appareils susmentionnés ne se sont pas jusqu’à présent avérés facilement évolutifs, car ils nécessitent une manipulation manuelle importante et reposent souvent sur une capture quotidienne d’images ou de vidéos déclenchée par un expérimentateur. D’autres plates-formes, telles que le Stress-Chip39, utilisent les scanners à plat modifiés conçus pour le LSM pour imager des dispositifs microfluidiques personnalisés.

Contrairement à d’autres méthodes, le LSM dispose de nombreuses fonctions d’annotation et de validation des données, permettant ainsi aux utilisateurs d’effectuer systématiquement le contrôle de qualité requis pour collecter des données de durée de vie à haute résolution, précises et exactes dans un contexte à haut débit13. La technique est polyvalente en raison de son utilisation des protocoles de laboratoire actuels à base de plaques de gélose et offre un avantage unique pour l’évolutivité expérimentale en raison de la facilité relative de la mise en réseau de grands groupes de scanners à plat. Bien que le LSM nécessite un investissement initial en temps pour construire et exploiter et pour former les utilisateurs au logiciel spécialisé, ces coûts sont compensés par la production robuste et à haut débit des données sur la durée de vie. Des grappes de 50 scanners ou plus ont été déployées dans plusieurs laboratoires, fonctionnant en continu depuis plus d’une décennie40.

Les RMLL ont des limites. Les animaux sont logés dans des scanners pendant la collecte automatisée des données de survie, ce qui limite la capacité des chercheurs à effectuer des interventions expérimentales en même temps que l’observation et nécessite soit la stérilisation des animaux, soit le début des expériences après la phase de reproduction des nématodes. Les changements de température sont une rare exception à la limitation des interventions, car la température ambiante peut être modulée sans qu’il soit nécessaire d’ouvrir les scanners et d’accéder aux animaux. Dans les cas où des interventions pratiques doivent être appliquées aux nématodes en milieu de vie, une solution courante consiste à retarder le début de l’observation automatisée jusqu’à ce que la manipulation nécessaire des animaux ait été effectuée. De plus, il existe une variation inhérente dans l’emplacement des plaques à l’intérieur et à travers les scanners. Ceux-ci peuvent être soumis à d’infimes différences locales dans les conditions environnementales (telles que la température, la lumière, la ventilation, etc.), qui pourraient influencer le C. Durée de vie d’Elegans 19. Cette influence de l’environnement peut être quantifiée et étudiée à l’aide de modèles de régression accélérée du temps de défaillance41. Une façon d’atténuer cet effet consiste simplement à mettre à l’échelle le nombre de plaques et de scanners pour obtenir une mesure rigoureuse indépendante des fluctuations environnementales. Généralement, les plaques de la même affection sont réparties au hasard dans chaque scanner, et les populations de plus de 500 individus par condition et entre les scanners ont démontré des estimations de survie statistiquement robustes31.

Dans l’ensemble, le LSM permet la collecte de données de survie et de vieillissement comportemental à grande échelle et de haute précision à grande échelle, et pourrait permettre d’effectuer des dépistages auparavant irréalisables de manière quantitative. De cette manière, le LSM apporte une avancée technique majeure pour la collecte standardisée des courbes de survie et fournit un nouveau cadre pour l’étude couplée de la durée de vie et du vieillissement comportemental chez les nématodes.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Nous remercions Julian Ceron et Jeremy Vicencio (IDIBELL Barcelona) pour la production de l’allèle rpb-2(cer135). Ce projet a été financé par le Conseil européen de la recherche (ERC) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (convention de subvention n° 852201), le ministère espagnol de l’Économie, de l’Industrie et de la Compétitivité (MEIC) au partenariat EMBL, le Centro de Excelencia Severo Ochoa (CEX2020-001049-S, MCIN/AEI /10.13039/501100011033), le programme CERCA/Generalitat de Catalunya, le prix MEIC Excelencia BFU2017-88615-P, et un prix de la Fondation Glenn pour la recherche médicale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Naphtaleneacetic  acid (Auxin) Sigma N0640 Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR) Sigma F0503 27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria
Glass cleaner Kristal-M QB-KRISTAL-M125ml
Hydrophobic anti-fog glass treatment Rain-X Scheibenreiniger  C. 059140
Rubber matt Local crafstman Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock
Scanner glass Local hardware supplier 9" x 11.5" inch glass sheet
Scanner plates Life Sciences 351006 50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish
USB Reference Thermometer USB Brando ULIFE055500  For calibrating temperature of scanners

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References

  1. Harman, D. The aging process: Major risk factor for disease and death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5360-5363 (1991).
  2. Vaupel, J. W. Biodemography of human ageing. Nature. 464 (7288), 536-542 (2010).
  3. Mair, W., Goymer, P., Pletcher, S. D., Partridge, L. Demography of dietary restriction and death in Drosophila. Science. 301 (5640), 1731-1733 (2003).
  4. Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational analysis of lifespan experiment reproducibility. Frontiers in Genetics. 8, 92 (2017).
  5. Lucanic, M., et al. Impact of genetic background and experimental reproducibility on identifying chemical compounds with robust longevity effects. Nature Communications. 8 (1), 14256 (2017).
  6. Banse, S. A., et al. Automated lifespan determination across Caenorhabditis strains and species reveals assay-specific effects of chemical interventions. Geroscience. 41 (6), 945-960 (2019).
  7. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  8. Kirkwood, T. B., et al. What accounts for the wide variation in life span of genetically identical organisms reared in a constant environment. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (3), 439-443 (2005).
  9. Stroustrup, N., et al. The temporal scaling of Caenorhabditis elegans ageing. Nature. 530 (7588), 103-107 (2016).
  10. Hamilton, B., et al. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes & Development. 19 (13), 1544-1555 (2005).
  11. Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nature Genetics. 33 (1), 40-48 (2003).
  12. Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The replica set method: A high-throughput approach to quantitatively measure Caenorhabditis elegans lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819 (2018).
  13. Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  14. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  15. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. Elife. 6, 26652 (2017).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Kerr, R. A., Roux, A. E., Goudeau, J. F., Kenyon, C. The C. elegans observatory: High-throughput exploration of behavioral aging. Frontiers in Aging. 3, 932696 (2022).
  18. Javer, A., Ripoll-Sánchez, L., Brown, A. E. Powerful and interpretable behavioural features for quantitative phenotyping of Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1758), 20170375 (2018).
  19. Miller, H., et al. Genetic interaction with temperature is an important determinant of nematode longevity. Aging Cell. 16 (6), 1425-1429 (2017).
  20. Bansal, A., Zhu, L. J., Yen, K., Tissenbaum, H. A. Uncoupling lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans longevity mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E277-E286 (2015).
  21. Huang, C., Xiong, C., Kornfeld, K. Measurements of age-related changes of physiological processes that predict lifespan of Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (21), 8084-8089 (2004).
  22. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  23. Oswal, N., Martin, O. M., Stroustrup, S., Bruckner, M. A. M., Stroustrup, N. A hierarchical process model links behavioral aging and lifespan in C. elegans. PLoS Computational Biology. 18 (9), 1010415 (2022).
  24. Sen, I., et al. DAF-16/FOXO requires protein phosphatase 4 to initiate transcription of stress resistance and longevity promoting genes. Nature Communications. 11 (1), 138 (2020).
  25. Schiffer, J. A., et al. et al.Caenorhabditis elegans processes sensory information to choose between freeloading and self-defense strategies. Elife. 9, 56186 (2020).
  26. Bazopoulou, D., et al. Developmental ROS individualizes organismal stress resistance and lifespan. Nature. 576 (7786), 301-305 (2019).
  27. Guerrero-Rubio, M. A., Hernández-García, S., García-Carmona, F., Gandía-Herrero, F. Extension of life-span using a RNAi model and in vivo antioxidant effect of Opuntia fruit extracts and pure betalains in Caenorhabditis elegans. Food Chemistry. 274, 840-847 (2019).
  28. Janssens, G. E., et al. Transcriptomics-based screening identifies pharmacological inhibition of Hsp90 as a means to defer aging. Cell Reports. 27 (2), 467-480 (2019).
  29. Kasimatis, K. R., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Phillips, P. C. Auxin-mediated sterility induction system for longevity and mating studies in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (8), 2655-2662 (2018).
  30. Lin, X. -X., et al. DAF-16/FOXO and HLH-30/TFEB function as combinatorial transcription factors to promote stress resistance and longevity. Nature Communications. 9 (1), 4400 (2018).
  31. Stroustrup, N., et al. The temporal scaling of Caenorhabditis elegans ageing. Nature. 530 (7588), 103-107 (2016).
  32. Byerly, L., Cassada, R., Russell, R. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
  33. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  34. Wilkinson, D. S., Taylor, R. C., Dillin, A. Analysis of aging in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 107, 353-381 (2012).
  35. Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental Gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
  36. Lithgow, G. J., Driscoll, M., Phillips, P. A long journey to reproducible results. Nature. 548 (7668), 387-388 (2017).
  37. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
  38. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2010).
  39. Banse, S. A., Blue, B. W., Robinson, K. J., Jarrett, C. M., Phillips, P. C. The Stress-Chip: A microfluidic platform for stress analysis in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 14 (5), e0216283 (2019).
  40. Banse, S. A., et al. Automated lifespan determination across Caenorhabditis strains and species reveals assay-specific effects of chemical interventions. Geroscience. 41 (6), 945-960 (2019).
  41. Swindell, W. R. Accelerated failure time models provide a useful statistical framework for aging research. Experimental Gerontology. 44 (3), 190-200 (2009).

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Del Carmen-Fabregat, A., Sedlackova, L., Oswal, N., Stroustrup, N. High-Throughput Behavioral Aging and Lifespan Assays Using the Lifespan Machine. J. Vis. Exp. (203), e65462, doi:10.3791/65462 (2024).

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