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Biology

Hochdurchsatz-Behavioralitäts- und Lifespan-Assays mit der Lifespan Machine

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65462
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2
1Centre for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2Universitat Pompeu Fabra (UPF)

Summary

Die Bildgebungsplattform "The Lifespan Machine" automatisiert die lebenslange Beobachtung großer Populationen. Wir zeigen die Schritte, die erforderlich sind, um Lebensdauer-, Stressresistenz-, Pathogenese- und Verhaltensalterungstests durchzuführen. Die Qualität und der Umfang der Daten ermöglichen es den Forschern, Interventionen beim Altern trotz des Vorhandenseins biologischer und umweltbedingter Variationen zu untersuchen.

Abstract

Genetisch identische Tiere, die in einer konstanten Umgebung gehalten werden, weisen eine breite Verteilung der Lebensspanne auf, was einen großen nicht-genetischen, stochastischen Aspekt des Alterns widerspiegelt, der in allen untersuchten Organismen konserviert ist. Diese stochastische Komponente bedeutet, dass Forscher große Populationen von Versuchstieren gleichzeitig überwachen müssen, um das Altern zu verstehen und erfolgreiche Interventionen zu identifizieren, die die Lebensdauer verlängern oder die Gesundheit verbessern. Die herkömmliche manuelle Sterbebewertung begrenzt den Durchsatz und die Skalierung, die für groß angelegte Hypothesentests erforderlich sind, was zur Entwicklung automatisierter Methoden für Hochdurchsatz-Lebensdauer-Assays führt. Die Lifespan Machine (LSM) ist eine Hochdurchsatz-Bildgebungsplattform, die modifizierte Flachbettscanner mit kundenspezifischer Bildverarbeitungs- und Datenvalidierungssoftware für die lebenslange Verfolgung von Nematoden kombiniert. Die Plattform stellt einen großen technischen Fortschritt dar, indem sie hochgradig zeitlich aufgelöste Lebensspannendaten von großen Tierpopulationen in einem noch nie dagewesenen Umfang und mit einer statistischen Präzision und Genauigkeit generiert, die manuellen Assays von erfahrenen Forschern entspricht. In jüngster Zeit wurde das LSM weiterentwickelt, um die während des Alterns beobachteten Verhaltens- und morphologischen Veränderungen zu quantifizieren und sie mit der Lebensspanne in Beziehung zu setzen. Hier beschreiben wir, wie ein automatisiertes Lebensdauerexperiment mit dem LSM geplant, durchgeführt und analysiert wird. Darüber hinaus heben wir die kritischen Schritte hervor, die für die erfolgreiche Erhebung von Verhaltensdaten und qualitativ hochwertigen Überlebenskurven erforderlich sind.

Introduction

Das Altern ist ein komplexer, vielschichtiger Prozess, der durch eine Abnahme der physiologischen Funktion eines Organismus gekennzeichnet ist, was im Laufe der Zeit zu einem Anstieg des Krankheits- und Sterberisikos führt1. Die Lebensspanne, gemessen als die Zeit von der Geburt oder dem Beginn des Erwachsenenalters bis zum Tod, liefert ein eindeutiges Ergebnis des Alterns2 und einen indirekten, aber streng quantitativen Proxy für die Messung der relativen Alterungsrate zwischen Populationen3. Alternsstudien beruhen oft auf genauen Messungen der Lebensspanne, ähnlich wie bei klinischen Studien, um die Ergebnisse zwischen einer Population, die einer Intervention ausgesetzt war, und einer nicht exponierten Kontrollgruppe zu vergleichen. Leider durchdringt die Alternsforschung Probleme mit der Reproduzierbarkeit, manchmal aufgrund statistisch unterdurchschnittlicher Experimente4 und oft aufgrund der inhärenten Empfindlichkeit von Lebensspannen-Assays gegenüber subtilen Schwankungen in der Umwelt5. Robuste Experimente erfordern mehrere Replikate großer Populationen, und dieser Prozess profitiert besonders von der experimentellen Skalierbarkeit, die die Automatisierung6 bietet.

Die strengen Anforderungen von Lifespan-Assays ergeben sich aus der Unvorhersehbarkeit des Alterungsprozesses selbst. Isogene Individuen, die in identischen Umgebungen untergebracht sind, weisen unterschiedliche Sterbezeiten und physiologische Abbauraten auf7, was darauf hindeutet, dass die Lebensspanne ein hohes Maß an Stochastizität beinhaltet 7,8. Daher sind große Populationen erforderlich, um quantitative Veränderungen im Alterungsprozess, wie z. B. Veränderungen der mittleren oder maximalen Lebenserwartung, zu messen und Verzerrungen zu überwinden, die sich aus individueller Variabilität ergeben. Darüber hinaus ist die Kapazität für Hochdurchsatz-Lebensdauer-Assays von entscheidender Bedeutung, um Studien von Überlebenskurvenformen und Modellen der Dynamik des Alterns zu unterstützen9.

Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist aufgrund seiner kurzen Lebensspanne, seiner genetischen Nachlässigkeit und seiner schnellen Generationszeit ein unschätzbares Modell für die Alternsforschung, was seine Eignung für Hochdurchsatz-Alterungs- und Lebensdauer-Assays unterstreicht. Traditionell ist die Lebensdauer in C. elegans wurde gemessen, indem man eine synchronisierte, kleine Population von etwa 50-100 Tieren über einen längeren Zeitraum auf festen Medien verfolgte und den Zeitpunkt der einzelnen Todesfälle aufschrieb. Wenn die Tiere älter werden und an Beweglichkeit verlieren, müssen die Tiere einzeln angestoßen und auf kleine Bewegungen des Kopfes oder Schwanzes überprüft werden, um die Sterbezeit manuell zu ermitteln. Dies ist in der Regel ein langwieriger und mühsamer Prozess, obwohl Anstrengungen unternommen wurden, um ihn zu beschleunigen 10,11,12. Wichtig ist, dass langsame experimentelle Pipelines den Fortschritt in unserem Verständnis des Alterns und der Wirksamkeit getesteter Interventionen behindern.

Um den Anforderungen der Alternsforschung an quantitative Daten gerecht zu werden, wurden viele Technologien zur Automatisierung der Datenerfassung entwickelt, darunter eine bemerkenswerte Bandbreite an Ansätzen, von mikrofluidischen Kammern bis hin zu Flachbettscannern 13,14,15,16,17,18. Das LSM unterscheidet sich von anderen Methoden durch seine umfassende Optimierung für die Erfassung hochpräziser und genauer Lebensdauerdaten, die durch die Entwicklung sorgfältiger Gerätekalibrierungsprotokolle in Kombination mit einer umfangreichen Software-Suite erreicht wird, die es den Benutzern ermöglicht, automatisierte Analysen zu validieren, zu korrigieren und zu verfeinern13. Obwohl die Software im Prinzip auf verschiedene Bildgebungsmodalitäten angewendet werden kann, verwenden die meisten Benutzer in der Praxis Flachbettscanner, die so modifiziert sind, dass sie eine fein abgestimmte Kontrolle über die Umgebungstemperatur und die Luftfeuchtigkeit ermöglichen - Faktoren, die aufgrund ihres großen Einflusses auf die Lebensdauer von entscheidender Bedeutung sind19. Das LSM nimmt alle 20 Minuten Bilder von Nematoden in Intervallen von Tagen bis Monaten auf, abhängig von den Umweltbedingungen und dem Genotyp. Die erzeugten Daten haben eine viel höhere zeitliche Auflösung als Daten aus manuellen Assays, und die gesammelten Bilder bieten eine dauerhafte visuelle Aufzeichnung der Nematodenposition über die gesamte Lebensspanne. Mittels Methoden des maschinellen Lernens werden jedem Einzelnen automatisch Sterbezeiten zugeordnet. Diese Ergebnisse können schnell und manuell mit einer Client-Software namens "Worm Browser" validiert werden. Aufgrund seiner Hard- und Software kann das LSM Überlebenskurven erstellen, die statistisch nicht von der manuellen Todesbewertung durch erfahrene Forscher zu unterscheiden sind, mit dem zusätzlichen Vorteil einer geringeren Arbeitsbelastung und einer höheren Skalierbarkeit13.

Die neueste Version des LSM ermöglicht auch die Untersuchung des Verhaltensalters, indem morphologische und verhaltensbezogene Daten während des gesamten Lebens des Fadenwurms gesammelt und zusammen mit der Lebensspanne jedes Individuums gemeldet werden. Insbesondere erfasst das LSM den Zeitpunkt der kräftigen Bewegungsbeendigung (VMC) jedes Tieres, ein Meilenstein, der häufig verwendet wird, um die "Gesundheitsspanne" eines Individuums im Unterschied zu seiner Lebensspanne zu quantifizieren. Durch die gleichzeitige Erfassung von Daten zur Lebensspanne und zum Verhalten des Alterns unterstützt das LSM die Untersuchung von Interventionen, die unterschiedliche Auswirkungen auf verschiedene phänotypische Ergebnisse des Alterns haben können20. Eine Vielzahl von makroskopisch beobachtbaren Phänotypen kann verwendet werden, um die Verhaltensalterung zu untersuchen, wie z. B. Körperbewegung oder Pharynxpumpen21, Gewebeintegrität22 und Bewegungsgeschwindigkeit oder stimulusinduziertes Drehen17. Vergleiche zwischen verschiedenen Alterungsphänotypen können Analysen der kausalen Struktur von Alterungsprozessen unterstützen. Zum Beispiel wurde kürzlich der Vergleich zwischen VMC und Lebensspanne verwendet, um zwei unterschiedliche Alterungsprozesse in C. elegans zu charakterisieren23.

Obwohl das LSM ursprünglich entwickelt wurde, um die Lebensdauer von C. elegans zu messen, unterstützt es die Erfassung von Überlebens- und Verhaltensdaten von einer Reihe von Nematodenarten, einschließlich C. briggsae, C. tropicalis, C. japonica, C. brenneri und P. Pacificus23. Die Technologie erleichtert die Untersuchung der Auswirkungen biologischer und umweltbedingter Eingriffe auf die Lebensdauer, Stressresistenz und Resistenz gegen Krankheitserreger und kann mit experimentellen Werkzeugen wie gezielten Assays der RNA-Interferenz oder Auxin-induzierbaren Proteinabbausystemen gekoppelt werden. Bis heute wird es in der wissenschaftlichen Literatur für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet 6,24,25,26,27,28,29,30.

Hier skizzieren wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Durchführung eines Lifespan Machine-Experiments mit Agarplatten, von den Anfangsphasen des Versuchsaufbaus bis zur Ausgabe der resultierenden Überlebenskurven. Eine Besonderheit des LSM ist, dass der Aufwand stark frontlastig ist, was bedeutet, dass der Großteil der Zeit des Forschers während des Versuchsaufbaus und zu einem geringen Teil auch während der Post-Bildaufnahme aufgewendet wird. Die Datenerfassung ist für die gesamte Dauer des Experiments vollständig automatisiert und ermöglicht dem Forscher eine "freihändige" Erfahrung. Die hier beschriebenen Schritte gelten für viele verschiedene Arten von Überlebensassays - derselbe Versuchsaufbau wird für Lebensdauer-, Thermotoleranz-, oxidativen Stress- und Pathogenese-Assays durchgeführt. Im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" diskutieren wir eine Teilmenge von Daten aus einem kürzlich veröffentlichten Manuskript, um die Effektivität der Analyse-Pipeline zu veranschaulichen und die wichtigsten Schritte während der Bildanalysehervorzuheben 23.

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Protocol

1. Software- und Hardwareanforderungen

  1. Flachbettscanner: Prinzipiell kann der LSM mit einer Vielzahl von bildgebenden Geräten realisiert werden. Detaillierte Anweisungen für Scanner-Modifikationen und Fokussierung finden Sie an anderer Stelle13. Die LSM-Hardware ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt.
  2. Datenanalyse-Tools: Die LSM-Software besteht aus drei interagierenden Komponenten: einem Linux-basierten Softwarepaket für die Scannersteuerung, einem Webbrowser-basierten Metadaten-Management-Paket und einem Windows- und Linux-Client-Bildanalyse-Softwarepaket. Weitere Informationen finden Sie in den Anweisungen zum Installieren von Softwaretools, die im GitHub-Repository (https://github.com/nstroustrup/lifespan) veröffentlicht sind.
  3. Datenvisualisierungs- und Validierungssoftware: Verwenden Sie den Worm Browser, ein Client-Programm, um die Experimente zu planen, die Bildanalyse zu validieren, die Bewegung des Fadenwurms manuell zu kommentieren und die Überlebensdaten auszugeben. Für den Wurm-Browser unter Windows 7, Windows 8 und Windows 10 werden ausführbare Binärdateien bereitgestellt, und der Wurm-Browser wird unter Linux oder Apple iOS aus dem Quellcode kompiliert. Eine Installationsanleitung ist im oben erwähnten GitHub-Repository verfügbar.

Ergänzende Abbildung 1: Lebensdauer der Maschinenhardware. Eine Flachbett-Scannereinheit mit offenem Deckel zur Anzeige der geladenen Platten, die mit der Vorderseite nach unten in 16 Öffnungen gelegt werden, die auf einer Gummimatte geschnitten sind. Die Gummimatte wird auf die Oberfläche eines Glasscanners gelegt. Beschriftungen für die Bedingungen sind an den Seiten der Platten angebracht, um Probleme bei der Bildanalyse zu vermeiden. Das Markieren des Bandes mit der Nummer ("1") und/oder dem Namen des Gerätes ("Jabba") erleichtert die spätere Überprüfung der Probenposition bei der Arbeit mit mehreren Scannergeräten. Weitere Details zu den LSM-Hardwarekomponenten finden Sie an anderer Stelle13. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

2. Aufbau vor dem Tag des Experiments

  1. Temperaturkalibrierung des Inkubators: Die Umgebungstemperatur ist eine wichtige Determinante von C. elegans Lebensspanne19. Um genaue Ergebnisse zu erzielen, führen Sie die Bildaufnahme bei einer sorgfältig kalibrierten Temperatur durch, die während des gesamten Experiments konstant gehalten wird. Um dies zu erreichen, messen und kalibrieren Sie einige Tage vor Beginn des Experiments die Temperatur der Oberfläche jedes Scanners während des Betriebs. Verwenden Sie hochpräzise Thermoelemente, wie an anderer Stelle31 beschrieben (siehe Werkstofftabelle).
  2. Layout der Scannerplatten: Planen Sie vor Beginn des Experiments das optimale Layout der Kulturplatten für jeden Scanner.
    HINWEIS: Damit soll die Einführung von Störfaktoren vermieden werden, die sich aus Temperaturschwankungen zwischen den Scannern und auf der Oberfläche der einzelnen Scanner ergeben. Scanner unterscheiden sich geringfügig in ihrer durchschnittlichen Oberflächentemperatur und weisen darüber hinaus subtile Temperaturverzerrungen über ihre Oberflächeauf 31.
    1. Position der Scannerplatte: Um diese thermischen Effekte in der anschließenden Datenanalyse zu kontrollieren, randomisieren Sie alle biologischen Kovariaten in Bezug auf die Scannerposition und standardisieren Sie die Position der Platte für alle Scanner.
    2. Anzahl der Proben auf den Scannern: Wenn Sie das Layout mit 16 Gummimatten (siehe Materialtabelle) verwenden, legen Sie vier Platten pro Bedingung in jeden Scanner, mit insgesamt mindestens vier Scannern. Dadurch wird sichergestellt, dass jeder Zustand auf mehrere Scanner verteilt ist, so dass die Störeffekte der Scannertemperatur während der Datenanalyse identifiziert und entfernt werden können13. Um diese Analyse einfacher zu gestalten, fügen Sie jedem Scanner eine gemeinsame Referenzbedingung (z. B. Wildtyp-Proben) hinzu.
      HINWEIS: Im Allgemeinen sind die Platten in der oberen rechten Ecke der Gummimatte aufgrund der Platzierung der Scannerlüfter anfälliger für Austrocknung. Lassen Sie diesen Speicherort bei Bedarf leer.
  3. Platten und Probenvorbereitung
    1. Gießen der Kulturplatten: Für eine optimale Trocknung der Scanner-Kulturplatten (siehe Materialtabelle) gießen Sie 4 Tage vor dem Laden der Nematoden Agar-Agar-Medium. Obwohl der Fokus des Scanners einstellbar ist, um die Zugabe verschiedener Agarvolumina zu den Platten zu ermöglichen, beträgt das Standardvolumen der Platte 8 ml.
      HINWEIS: Es kann hilfreich sein, die Platten mit einer Peristaltikpumpe zu gießen, insbesondere bei großen Experimenten.
    2. Aussaat der Platten: Säen Sie die Platten mindestens 2 Tage vor Beginn des Versuchs mit der gewünschten Bakterienkultur aus, um die richtige Trocknung und das Wachstum des Bakterienrasens zu ermöglichen. In der Regel reichen 200 μl Bakterienkultur aus, um einen Rasen zu bilden, der 40 Nematoden mehrere Wochen lang ernährt.
      HINWEIS: Die Platten, die normalerweise für die Bildgebung verwendet werden, sind dichter verschlossen als Standardkultur-Petrischalen. Daher wird empfohlen, die Platten in einer Laborhaube zu säen und zu trocknen, in der Regel etwa 1 h lang oder bis sie richtig getrocknet sind.
  4. Umgang mit Nematoden
    1. Populationsgröße: Die Anzahl der Nematoden, die auf einem einzigen Teller zuverlässig abgebildet werden können, hängt vom Genotyp, dem Alter, in dem Nematoden angerichtet werden, und der Menge an Nahrung ab, die jedem Teller hinzugefügt wird. Für Lebensspannenexperimente, die im frühen Erwachsenenalter beginnen, werden etwa 40 Tiere pro Platte geladen. Diese Zahl sorgt für ausreichend Nahrung und vermeidet Gedränge.
    2. Wachsende große Populationen: Um sich auf die Populationserweiterung und -synchronisierung vorzubereiten, beginnen Sie mit einer Population von Nematoden, die für die gewählte Synchronisationsmethode geeignet ist (siehe unten). Ziel ist es, die Synchronisation bei den Tieren in ihrem Alter der maximalen Eiproduktion durchzuführen, was bei Wildtyp-N2-Tieren Tag 2 des Erwachsenenalters32 ist.
      ANMERKUNG: Ein weiterer Grund für die Synchronisierung von Populationen durch die Verwendung von Tieren am zweiten Tag des Erwachsenenalters besteht darin, das Alter der Mutter als einen Faktor zu entfernen, der zur Heterogenität der Population beiträgt. Das Alter der Mutter in C. Es hat sich gezeigt, dass Elegans mehrere Fitnessmerkmale bei den Nachkommen beeinflusst, wobei Wildtyp-Tiere am Tag 2 die "hochwertigsten" Nachkommen hervorbringen33.
    3. Durchführung der Alterssynchronisation: Um genaue Ergebnisse zu erhalten, synchronisieren Sie das Alter der Tiere so genau wie möglich. In diesem Protokoll wird die Alterssynchronisation unter Verwendung einer modifizierten Hypochloritbehandlung34 durchgeführt. Andere Methoden können die Synchronisierung durch Eiablage, durch L1-Larvenarrest oder durch manuelles Pflücken von L4-Larven sein.
      HINWEIS: Für die Alterssynchronisierung durch Hypochloritbehandlung sollten Sie davon ausgehen, dass Sie drei bis vier Eier von jedem erwachsenen Hermaphroditen erhalten.
    4. Aufrechterhaltung nachkommenfreier Populationen: Aufrechterhaltung nachkommenfreier Populationen durch Exposition von Nematoden während ihres späten L4-Stadiums gegenüber 5-Fluor-2'-Desoxyuridin (FUdR)35.
      HINWEIS: In niedrigen Dosen ist FuDR tödlich für sich entwickelnde Embryonen, ohne makroskopisch sichtbare Veränderungen der Keimbahn oder die Geschwindigkeit der Eizellproduktion zu verändern. Andere Methoden sind die Verwendung temperatursteriler Mutanten, die Verwendung sterilisierender RNAi-Konstrukte oder das einfache Warten bis zur postreproduktiven Seneszenz, um die Nematoden für die Bildgebung auf Platten zu übertragen.
    5. Übertragung von Populationen: Beim Transfer von Tausenden von Tieren zwischen Platten wird das Standardprotokoll mit einem Platin/Iridium-Draht mühsam. Methoden, bei denen Nematoden flüssig suspendiert werden, erleichtern den Transfer und machen ihn effizienter. Sammeln Sie die Nematoden mit M9 + Mg-Puffer (Na2HPO4 42,27 mM, KH2PO4 22,05 mM, NaCl 85,56 mM, MgSO4 1 mM), reduzieren Sie das Gesamtvolumen, sobald sich die Nematoden durch die Schwerkraft abgesetzt haben, und übertragen Sie die Nematoden dann schnell auf die für die Bildgebung verwendeten Platten.
      HINWEIS: Das Umfüllen der Nematoden durch flüssige Suspension kann zu Schwankungen in der Anzahl der Tiere führen, die auf jede Platte übertragen werden. Versuchen Sie, mit der Anzahl der Nematoden auf jeder Platte konsistent zu sein, um experimentelle Variabilität zu vermeiden.
    6. Anwenden von Interventionen: Das Stoppen und Neustarten der Bildaufnahme während eines Experiments erschwert die Bildanalyse (siehe Diskussion). Starten Sie die LSM-Experimente daher erst, wenn alle notwendigen Nematodenbehandlungen abgeschlossen sind.
  5. Sterilisieren der Gummimatten: Autoklavieren Sie eine große Anzahl von Matten gleichzeitig, indem Sie sie einzeln in Aluminiumfolie einwickeln.
    HINWEIS: Die Gummimatten sollten zwischen den Anwendungen sterilisiert werden, um die Ansammlung von Pilzen oder bakteriellen Verunreinigungen zu vermeiden. Die meisten Kautschuksorten, die typischerweise verwendet werden, werden durch aggressive Ethanolbehandlung abgebaut.

3. Aufbau am Tag des Experiments

  1. Plattenauflage und Scannerglasvorbereitung: Um die Handhabung der Platten zu vereinfachen, laden Sie die Petrischalen nicht direkt auf die Scanneroberfläche, sondern halten Sie sie mit Gummimatten fest, die von Glasscheiben getragen werden (siehe Materialtabelle). Populationen werden durch dieses Glas abgebildet, also halten Sie das Glas sauber und behandeln Sie es mit einer Anti-Beschlag-, hydrophoben und sterilisierenden Beschichtung (siehe Materialtabelle).
    1. Bevor Sie die Platten in den Inkubator laden, reinigen Sie die Oberfläche des Plattenträgerglases beidseitig mit Anti-Beschlag-Glasreiniger.
    2. Bevor Sie die Platten auf ihr Trägerglas laden, tragen Sie eine hydrophobe Glasschutzbehandlung auf (siehe Materialtabelle), um das Beschlagen auf der Seite des Glases, die mit der Gummimatte in Berührung kommt, zu minimieren. Verteilen Sie diese Behandlung gut und lassen Sie sie 5-10 Minuten auf dem Glas, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Nach dem Auftragen kräftig reinigen, um Rückstände zu entfernen.
    3. Tragen Sie 70%iges Ethanol auf, um die Oberfläche des Glases zu desinfizieren, die mit der Gummimatte in Berührung kommt. 1 Minute oder 2 Minuten einwirken lassen und dann mit einem Tuch oder Papiertuch entfernen.
  2. Einlegen der Platten auf die Scanner
    1. Legen Sie zunächst die autoklavierten Gummimatten auf das behandelte Plattenträgerglas.
    2. Nehmen Sie den Deckel von den Platten ab, die für die Bildgebung mit geladenen Nematoden verwendet werden, und legen Sie sie auf Gummimatten, die der Glasoberfläche zugewandt sind. Stellen Sie sicher, dass die Gummimatte um alle Teller herum dicht verschlossen ist, z. B. indem Sie eine weitere Glasscheibe darauf legen und sicherstellen, dass sie flach aufliegt, oder indem Sie auf die Oberseite jeder Platte klopfen (lose Platten bewegen sich leicht und schlagen auf das Glas, was ein Geräusch verursacht, während sich fest befestigte Platten beim Klopfen nicht bewegen).
      HINWEIS: Es ist sinnvoll, jede Platte des Plattenträgerglases einzeln mit Markierungsband mit Informationen über den Platteninhalt und den vorgesehenen Scanner zu beschriften. Diese Daten können nach dem Experiment verwendet werden, um mögliche Unklarheiten bezüglich der Plattenpositionen zu beseitigen.
    3. Bevor Sie die Platten in die Scanner einlegen, ziehen Sie den Netzstecker der Scannerlüfter, um die Finger des Versuchsleiters während des Plattenladens zu schützen.
    4. Schieben Sie die Platten und die Glasscheibe, die sie stützt, vorsichtig auf die Oberfläche des Scanners.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, direkt auf die Gummimatte zu drücken, da dies dazu führt, dass die Matte über das Plattenträgerglas rutscht. Wenn die Matten verrutschen, werden die Platten oft von der Matte gelöst.
    5. Aktivieren Sie die Scannerlüfter wieder und vergewissern Sie sich visuell, dass die vorderen und seitlichen Lüfter mit Strom versorgt werden. Wenn die Scanner ausgeschaltet sind, schalten Sie sie an dieser Stelle ein.

4. Aufnahme vor dem Bild

HINWEIS: Ein umfassendes Flussdiagramm, das alle softwarebasierten Schritte während der Bildaufnahme zusammenfasst, ist in Abbildung 1 dargestellt.

Figure 1
Abbildung 1: Grafische Übersicht über die Pipeline für die Bildanalyse von Lifespan Machine. Die Schritte vor, während und nach der Bildaufnahme werden größtenteils auf der Weboberfläche (WI, in rot) und im Wurm-Browser (WB, in grün) durchgeführt. Einige Schritte werden auf anderen Plattformen ausgeführt (O, in blau), z. B. TXT-Dokumente in Schritt 3a, Photoshop oder gleichwertig in Schritt 4b und JMP oder gleichwertig in Schritt 13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Bildaufnahme-Setup: Generieren Sie eine Datei, die den Versuchszeitplan und die Position der Platten auf jedem Scanner angibt, um die Bildaufnahme zu konfigurieren.
    HINWEIS: Diese Datei enthält wichtige Metadaten wie den Titel des Experiments, die Häufigkeit der Bildaufnahmen und die Gesamtdauer des Experiments. In der Regel wird diese Datei nicht generiert de novo für jedes Experiment, aber stattdessen werden Experimentdateien aus vorherigen Experimenten als Vorlagen wiederverwendet. Für das erste Experiment eines Benutzers wird eine Vorlagendatei (Ergänzungsdatei 1).
    1. Vorschauaufnahmen anfordern: Geben Sie die Position aller Platten auf jedem Scanner an. Es stehen mehrere Tools zur Verfügung, um diesen Prozess zu beschleunigen. Verwenden Sie zunächst den Scanner, um ein Bild der gesamten Scanneroberfläche zu erhalten, das als "Vorschau der Aufnahme" bezeichnet wird. Stellen Sie sicher, dass die Vorschaubilder die gesamte Oberfläche jeder abzubildenden Platte deutlich zeigen (Abbildung 2A), ohne Streifen oder das Beschneiden von Plattenkanten.
      1. Suchen Sie über die Weboberfläche den Abschnitt "Bilderfassung " auf der Hauptseite und folgen Sie dem Link " Aufnahmegeräte und Bildserver". Klicken Sie auf dieser Seite auf die Schaltfläche "Nach neuen Geräten (d. h. Scannern) suchen" im Feld "Server für Bilderfassung und -verarbeitung ". Überwachen Sie den Fortschritt des Servers bei der Erkennung von Scannern, indem Sie auf den Link [Protokoll] neben dem Server klicken.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die gewünschten Scanner eingeschaltet und an den Server angeschlossen sind, bevor Sie diesen Schritt ausführen.
      2. Stellen Sie sicher, dass auf derselben Seite der Weboberfläche jeder an den Server angeschlossene Scanner im Feld Bilderfassungsgeräte angezeigt wird. Ein "Missing"-Label unter "Aktueller Status" wird nicht mehr angezeigt, wenn das Gerät erfolgreich erkannt wurde. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für jeden Scanner, der neu geladene Platten enthält.
      3. Klicken Sie unten im Abschnitt "Bildaufnahmegeräte " auf die Schaltfläche "Vorschauaufnahme anfordern ". Innerhalb von 1 Minute oder 2 Minuten sollten die Scanner aufleuchten und mit dem Scannen beginnen.
        HINWEIS: Die Ausgangsposition der Glasträgerplatten muss häufig angepasst werden, um alle Platten in den sichtbaren Bereich zu bringen. Positionen können korrigiert werden, indem Sie Vorschauaufnahmebilder überprüfen, Anpassungen an der Plattenposition vornehmen und neue Vorschauaufnahmebilder erneut aufnehmen. Wenn Scans extrem langsam ablaufen (mehrere Minuten für einen Aufnahmescan) oder wenn Vorschaubilder lange weiße Streifen enthalten, ist dies ein Zeichen dafür, dass eine Platte, die Gummimatte oder ein anderes Objekt das Licht im Kalibrierungsbereich des Scanners blockiert (gekennzeichnet durch weiße Pfeile auf der Scanneroberfläche). Alle Objekte sollten so positioniert werden, dass nur das Glasträgerglas diesen Bereich einnimmt.
    2. Definieren Sie die Scanbereiche: Führen Sie die nächsten Schritte im Worm Browser aus, um die Vorschaubilder zu analysieren und sie zu einem einzigen zusammengesetzten Bild zusammenzusetzen, das verwendet wird, um die Position jeder Platte für die Datenanalyse anzugeben. Stellen Sie sicher, dass das resultierende Bild in etwa wie in Abbildung 2B aussieht.
      1. Öffnen Sie zunächst mit dem Wurm-Browser jedes Vorschau-Capture-Bild, indem Sie die Menüoption Datei > Bild öffnen auswählen und das gewünschte Bild auswählen.
      2. Klicken Sie auf jedem Bild, um die Spalten für Bereiche mit Platten auszuwählen (wenn die Gummimatte 16 Plattenpositionen hat, wählen Sie 4 Spalten aus).
        HINWEIS: Die Scanbereiche sollten als hohe Spalten (nicht als breite Zeilen) angegeben werden, da die Scannererfassung für breitere Bereiche langsamer ist, was zu verschwommenen Bildern aufgrund von Nematodenbewegungen führt.
      3. Sobald alle Bilder definiert sind, exportieren Sie die Regionsspezifikationen auf die Festplatte, indem Sie den Menüpunkt Bildaufnahme > Scanbereiche definieren > Ausgewählte Scanbereiche auf Festplatte speichern auswählen und den gewünschten Speicherort auswählen.
    3. Generieren Sie den Testzeitplan:
      1. Stellen Sie nach dem Format der ergänzenden Datei 1 eine Datei zusammen, die den Namen des Experiments, die physischen Positionen der einzelnen Spalten auf den Scannern (kopiert aus der in Schritt 4.1.2.3 generierten Scanbereichsdatei), die Gesamtdauer des Experiments und die Häufigkeit der Bildaufnahme enthält, und speichern Sie diese sowohl als TXT- als auch als XML-Datei.
      2. Klicken Sie dann im Wurm-Browser auf Bildaufnahme > Submit Experiment Schedule und wählen Sie die generierte XML-Datei aus. Der Wurm-Browser fragt Sie, ob eine Zusammenfassung des Zeitplans ausgegeben oder das Experiment ausgeführt werden soll. Klicken Sie auf Zusammenfassungsdatei generieren.
    4. Überprüfen Sie die Zusammenfassungsdatei: Nach dem Absenden des Experimentzeitplans gibt der Wurm-Browser eine Zusammenfassung des Zeitplans aus. Diese Zusammenfassung wird auf dem Bildschirm angezeigt und auf die Festplatte geschrieben. Lesen Sie es, und überprüfen Sie die Daten der geplanten Aufnahmen sowie den Standort, den Namen und die Anzahl der Scanner.
    5. Übermitteln Sie den Versuchsplan: Wenn Sie mit der Zusammenfassungsdatei zufrieden sind, laden Sie die XML-Datei für den Versuchsplan erneut in den Wurm-Browser, indem Sie die Menüoption Bildaufnahme > Versuchsplan übermitteln auswählen. Der Wurm-Browser fragt ein zweites Mal, ob eine Zusammenfassung des Zeitplans ausgegeben oder das Experiment ausgeführt werden soll. Klicken Sie dieses Mal auf Ausführen! .
      HINWEIS: Einige Minuten nach dem Einreichen des Experiments ist es ratsam, die Webschnittstelle zu verwenden, um zu bestätigen, dass das Experiment erfolgreich übermittelt wurde und Scans von allen Scannern erfasst werden. Es ist üblich, dass die ersten Scans übersehen werden, insbesondere bei großen Experimenten.
    6. Organisieren von Experimenten auf der Weboberfläche: Ein ausgelasteter Scanner-Cluster kann Hunderte von experimentellen Datensätzen erzeugen, die von vielen verschiedenen Benutzern gesammelt wurden. Um diese Liste zu organisieren, ordnen Sie Experimente separaten Gruppen zu, z. B. entsprechend dem Namen des Benutzers, der für das Experiment verantwortlich ist.
      1. Erstellen Sie eine neue Gruppe oder ändern Sie eine vorhandene: Erstellen Sie neue Gruppen auf der Weboberfläche, indem Sie unter dem Feld "Bilderfassung" auf "Experimentgruppen verwalten" klicken. Fügen Sie auf der neuen Seite, die angezeigt wird, den gewünschten Namen unter Neue Gruppe erstellen hinzu und klicken Sie auf Erstellen. Um den Namen einer vorhandenen Gruppe zu ändern, wählen Sie im selben Feld die gewünschte Gruppe neben Vorhandene Gruppe ändern aus, und wählen Sie dann Ändern aus.
      2. Zuweisen von Experimenten zu einer Gruppe: Um einer bestimmten Gruppe neue Experimente zuzuweisen, gehen Sie zur Weboberfläche und suchen Sie das gewünschte Experiment, das standardmäßig der Gruppe Keine Gruppe am unteren Rand der Experimentliste zugewiesen wird. Klicken Sie auf den Link auf der rechten Seite des Testabschnitts, wo Bearbeiten steht, und wählen Sie in der Dropdown-Liste den Namen der zu verwendenden Gruppe aus. Wählen Sie dann Speichern aus.
    7. Abbrechen eines Tests:
      HINWEIS: Das LSM arbeitet weiterhin autonom, bis die letzten Scans im Experimentplan angegeben sind. Nach Abschluss eines experimentellen Zeitplans sammelt das LSM standardmäßig weiterhin Scans, verwirft die Bilddaten jedoch sofort in einem Prozess, der als automatisches Scannen bezeichnet wird. Diese automatischen Scans werden durchgeführt, um zu verhindern, dass sich die Scanner ausschalten und abkühlen, und um ein Standardtemperaturprofil beizubehalten, damit andere Experimente, die im selben Raum ausgeführt werden (aber aus einem anderen Experiment), nicht durch das Herunterfahren anderer Scanner beeinträchtigt werden.
      1. Automatische Scans beenden: Um die automatischen Scans eines laufenden Experiments auf der Weboberfläche zu stoppen, klicken Sie neben dem gewünschten Experiment auf Bearbeiten , dann auf Ausstehende Scans abbrechen und wählen Sie Geplante Aufnahmen abbrechen aus.

Figure 2
Abbildung 2: Vorschau des Aufnahmebildes und Auswahl des Scanbereichs. (A) Für jeden Scanner im Experiment wird ein Vorschaubild generiert. (B) Auswahl jeweils einer Reihe von Platten (rote Kästchen), wodurch die Scangeschwindigkeit erhöht und eine Bewegungsunschärfe des Wurms durch zu breite Scanbereiche verhindert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Bildaufnahme

Hinweis: Die folgenden Schritte können sowohl während der Ausführung des Experiments als auch nach dessen Abschluss ausgeführt werden.

  1. Ausgabe der Maskendatei des Experiments: Rohbilddaten von Scannern enthalten viele Bereiche, die nicht verarbeitet werden müssen (Bereiche außerhalb von Platten). Um die Analyse auf jede Platte einzeln zu fokussieren, wird eine "Maske" erstellt, die den Bereich angibt, der von jeder Platte auf jedem Scanner eingenommen wird. Generieren Sie diese Maske, indem Sie die Position jeder Platte als Überlagerung auf die von den Scannern erfassten Bilder zeichnen.
    1. Wählen Sie im Wurm-Browser das gewünschte Experiment aus, indem Sie Datei > Aktuelles Experiment auswählen auswählen auswählen und dann auf den Namen des Experiments klicken.
    2. Wählen Sie im Wurm-Browser erneut "Bilderfassung" > "Beispielmasken definieren" > "Experimentmasken-Komposit generieren" und speichern Sie die Maske am gewünschten Speicherort. Stellen Sie sicher, dass die resultierende Datei in etwa wie in Abbildung 3A aussieht.

Figure 3
Abbildung 3: Angabe der Plattenpositionen für jeden Scanner anhand von Mustermasken. Um die unabhängige Analyse von Platten innerhalb der in Abbildung 1 gezeigten Spaltenauswahl zu gewährleisten, müssen einzelne Platten durch Generieren eines Bildmaskenkomposits identifiziert werden. (A) Eine Aufnahme der Scans der Scanner wird mit einer Bildbearbeitungssoftware geöffnet (beachten Sie den Namen des Scanners "han" über einer gescannten Auswahl und "a-d" bezieht sich auf jede der Spalten). (B) Die einzelnen Schritte der Maskenerzeugung zum Markieren der Position jeder Platte in der Maskenzusammenstellung erfordern das Setzen des Hintergrunds auf Schwarz, (C) das Entfernen von gezackten Kanten und Kanten von nicht ausgewählten Platten durch Vergrößern und Verkleinern des Hintergrunds und (D) das Auswählen der Vordergrundplatten und das Ausfüllen der Bereiche vollständig mit weißen Pixeln.Damit das LSM einzelne Platten in den gescannten Reihen erkennt, wird jeder weiße Bereich in einer Reihe mit einem anderen Grauton gefüllt, in der Regel mit zunehmender Helligkeit. (F) In dieser Phase wird die Maske gespeichert (LZW-Komprimierung ohne Angabe von Ebenen, wenn sie in Photoshop erstellt wurde). Die Maske wird dann vom Worm Browser gescannt und eine Visualisierung der Maske durch die Software erzeugt. Eine korrekte Maskenvisualisierung sollte ein definiertes Quadrat pro Platte mit einem kleinen Kreuz in der Mitte und einer anderen Farbe für jede Zeile anzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Kommentieren Sie die Maske des Experiments: Öffnen Sie die Datei, die im vorherigen Schritt mit einem Bildbearbeitungsprogramm (z. B. Photoshop oder GIMP) erstellt wurde, um die Position der einzelnen Platten im Bild zu markieren. Im Folgenden finden Sie eine Übersicht über alle Schritte zur Maskenbearbeitung mit Photoshop.
    1. Wählen Sie in Photoshop das Füllwerkzeug aus, wobei die Toleranz auf Null gesetzt ist, die zusammenhängende Option ausgewählt und das Anti-Aliasing deaktiviert ist. Klicken Sie auf den grauen Hintergrund, um ihn komplett auf schwarz zu setzen. Stellen Sie sicher, dass das resultierende Bild in etwa wie in Abbildung 3B aussieht.
    2. Verwenden Sie das Zauberstab-Werkzeug, um den schwarzen Hintergrund auszuwählen, wobei das Aliasing deaktiviert, die Toleranz auf Null und die zusammenhängende Option ausgewählt ist. Um die Kanten zu glätten, erweitern Sie den ausgewählten Hintergrund um 30 Pixel, indem Sie auf Auswählen > Ändern > Erweitern klicken. Verkleinern Sie dann die Auswahl um 20 Pixel unter Auswählen > > Vertrag ändern. Stellen Sie sicher, dass das resultierende Bild in etwa wie in Abbildung 3C aussieht.
    3. Füllen Sie den geglätteten Hintergrund vollständig mit schwarzen Pixeln, indem Sie z. B. die Toleranz des Werkzeugs "Füllung " auf 255 einstellen und den ausgewählten Bereich füllen. Klicken Sie dann auf Wählen > Invers, um die Auswahl umzukehren, und wählen Sie den Vordergrund aus. Füllen Sie den neuen Bereich vollständig mit weißen Pixeln, indem Sie z. B. die Toleranz des Füllwerkzeugs auf 255 festlegen und den Bereich mit Weiß füllen. Stellen Sie sicher, dass das resultierende Bild ähnlich wie in Abbildung 3D aussieht.
    4. Um jede Platte innerhalb eines einzelnen Bereichs zu trennen, füllen Sie jede Zeile mit einem anderen Grauverlauf in zunehmender Helligkeit. Dies kann mit dem Füllwerkzeug und dann durch Auswahl der gewünschten Farbe erfolgen, wobei die Toleranz auf 0 gesetzt ist. Stellen Sie sicher, dass das resultierende Bild in etwa wie in Abbildung 3E aussieht. Speichern Sie es in einer LZW-Komprimierung ohne Angabe von "Layers".
      HINWEIS: Die Reihenfolge der Platten wird durch die Farbe der angegebenen Bereiche festgelegt. Um die Tafeln 1-4 von oben nach unten zu benennen, geben Sie die Farben in zunehmender Helligkeit für jede Reihe an.
    5. Wählen Sie im Wurm-Browser "Bildaufnahme" > "Mustermasken definieren" > "Auf Experimentmasken-Komposit gezeichnete Plattenpositionen analysieren" und wählen Sie die im vorherigen Schritt generierte Datei aus. Die Software benötigt nun einige Augenblicke, um die eingereichte Maske zu analysieren.
    6. Der Wurm-Browser zeigt eine Maskenvisualisierung an. Überprüfen Sie die Maske auf mögliche Fehler in der Datei. Stellen Sie sicher, dass jede Plattenreihe mit einer anderen Farbe gefüllt und durch ein farbiges Rechteck umrandet ist. Stellen Sie sicher, dass das resultierende Bild ähnlich wie in Abbildung 3F aussieht.
      HINWEIS: Wenn eine einzelne Platte zwei oder mehr Kreise zeigt oder wenn zwei Kreise die gleiche Farbe haben, gehen Sie zurück zu Schritt 5.2, um die Maskendatei zu korrigieren, und laden Sie sie erneut in den Wurm-Browser.
    7. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Maskenvisualisierung korrekt ist, wählen Sie im Wurm-Browser Bilderfassung > Beispielmasken definieren > Analysiertes Experimentmaskenkomposit an Cluster senden aus. Der Bildanalyseserver analysiert nun die Position aller Platten im Experiment.
  2. Anwenden der Maske: Das LSM verwendet Masken, um die Rohbilddaten in einzelne Platten aufzuteilen. Um diesen Prozess zu starten, planen Sie einen Maskenauftrag über die Weboberfläche.
    1. Vergewissern Sie sich vor dem Absenden des Auftrags, dass alle Scanner Bereiche in der Maske erkannt haben. Rufen Sie die Hauptseite der Weboberfläche auf, suchen Sie den Namen des Experiments und die Spalte mit dem Namen Bildanalyse, und klicken Sie auf Analyse ausführen. Vergewissern Sie sich, dass für alle Geräte unter "Experimentbeispiele " Regionen identifiziert wurden.
    2. Um die Maske anzuwenden, klicken Sie auf derselben Oberfläche auf Neuer Auftrag für alle Proben. Aktivieren Sie im Feld " Auftrag für einzelne Bilder planen" das Kontrollkästchen "Maske anwenden" und dann "Auftrag speichern".
      HINWEIS: Die Maske wird auf alle bereits aufgenommenen Bilder sowie auf alle in Zukunft aufgenommenen Bilder angewendet.
  3. Führen Sie eine Qualitätskontrolle der Platte durch:
    HINWEIS: Platten, die verunreinigt, ausgetrocknet oder beschlagen sind, werden in dieser Phase der Bildanalyse zensiert. Ein Beispiel für kontaminierte, getrocknete, beschlagene und optimale Platten ist in Abbildung 4 dargestellt. Andere Gründe für die Zensur sind Hunger, leere Teller oder Larven in sterilen Populationen. Ungültige Platten enthalten oft komplexe Formen, die die Maschine als Nematoden interpretieren will. Es ist wichtig, ungültige Platten in diesem Schritt auszuschließen, um lange Bearbeitungszeiten in späteren Schritten der Bildanalyse zu vermeiden.
    1. Schließen Sie über die Weboberfläche die zu zensierenden Platten aus, indem Sie das gewünschte Experiment und die Spalte mit dem Namen Platteninformationen kommentieren suchen und Nach Bild auswählen.
    2. Um die Platten zu inspizieren, klicken Sie auf Bilder anzeigen.
      HINWEIS: Wenn der Schritt zum Anzeigen von Bildern nicht ordnungsgemäß funktioniert, ist der Linux-Server möglicherweise nicht ordnungsgemäß konfiguriert. Eine Anleitung dazu finden Sie in der Software-Installationsanleitung im oben genannten GitHub-Repository.
    3. Um Platten auszuschließen, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Zensur, wählen Sie eine Option im Dropdown-Feld mit dem Namen Grund zensiert aus und klicken Sie dann für jede Seite auf Speichern.
  4. Metadateninformationen hinzufügen: Metadaten beschreiben den Inhalt jeder Platte in einem Experiment. Diese Informationen werden dann in alle anschließend generierten statistischen Datendateien aufgenommen.
    1. Um Metadateninformationen in Bezug auf den Stamm, den Genotyp, die Temperatur, das Futter usw. hinzuzufügen, gehen Sie auf die Hauptseite der Weboberfläche, suchen Sie das gewünschte Experiment und die Spalte mit dem Namen Platteninformationen kommentieren und wählen Sie Nach Position.
    2. Geben Sie die Etiketten ein und wählen Sie die Scanner aus, für die die Metadaten gespeichert werden sollen, indem Sie in der unteren linken Ecke auf Auf Geräten speichern klicken.
    3. Um Metadaten zwischen verschiedenen Scannern wiederzuverwenden, ohne alle Beschriftungen erneut eingeben zu müssen, gehen Sie in der oberen rechten Ecke zu Vom Gerät laden , wählen Sie den Scanner aus, von dem Metadaten wiederverwendet werden sollen, und klicken Sie auf Vom Gerät laden.
  5. Geben Sie die "Zero-Age"-Zeit an: Standardmäßig misst das LSM die Zeit in Bezug auf den Beginn der UNIX-Epoche. Dies ist selten praktisch, daher ist die Angabe einer Referenzzeit erforderlich (z. B. das Datum, an dem alle Individuen geschlüpft sind oder das Erwachsenenalter erreicht haben).
    1. Um die Zeitinformationen für Null anzugeben, wechseln Sie zur Hauptseite der Weboberfläche, suchen Sie das gewünschte Experiment und die Spalte mit dem Namen Bildanalyse, und wählen Sie Analyse ausführen aus.
    2. Wählen Sie auf der neuen Seite, die angezeigt wird, die Option Neuer Auftrag für alle Regionen aus. Wählen Sie im Feld "Regionsinformationen aktualisieren" die Option "Zeit, zu der Tiere ein Alter von 0 hatten" aus, fügen Sie die Informationen hinzu und klicken Sie dann auf " Ausgewählte Felder aktualisieren".
      HINWEIS: Wenn nicht alle Tiere die gleiche Null-Alters-Zeit haben, wählen Sie stattdessen Neuer Auftrag für bestimmte Tiertypen und wiederholen Sie die obigen Schritte für jede Gruppe.
  6. Planen Sie die Wurmerkennung: Das LSM kann die Erkennung jedes Fadenwurms basierend auf seiner Position auf der Platte automatisieren.
    1. Um die automatische Erkennung von Nematoden für jedes Bild zu starten, gehen Sie auf die Hauptseite der Weboberfläche, suchen Sie das gewünschte Experiment und die Spalte mit dem Namen Bildanalyse und wählen Sie Analyse ausführen aus.
    2. Klicken Sie auf der neuen Seite, die angezeigt wird, auf Neuer Auftrag für alle Regionen, dann auf das Feld Auftrag für einzelne Bilder planen und aktivieren Sie die Kontrollkästchen Medianfilter > Schwellenwert > Wurmerkennung > Auftrag speichern. Diese Aufträge werden auf alle in der Vergangenheit und in Zukunft aufgenommenen Bilder angewendet.
      HINWEIS: Um einen Auftrag nur für einen bestimmten Stamm oder eine bestimmte Bedingung zu planen, klicken Sie stattdessen auf Aufträge für bestimmte Tierarten. Die Objektklassifizierung erfolgt mithilfe von SVM-Modellen, die als Dateien angegeben sind, die im Unterordner "Modelle " des Langzeitspeicherverzeichnisses des LSM gespeichert sind. Die Parametersätze für die Nematodenerkennung der Version 2.0 für das LSM können aus dem GitHub-Repository heruntergeladen werden.

Figure 4
Abbildung 4: Qualitätskontrolle der Platte über die Weboberfläche. Die Zensur suboptimaler Platten auf der Weboberfläche vor der Analyse der Schneckenbewegung ist entscheidend für die Beschleunigung der Bildverarbeitungspipeline. Beispiele für Platten, die entfernt werden müssen, umfassen Bedingungen wie (A) Austrocknung, (B) Kontamination oder (C) Vernebelung. (D) Optimale Platten, die in die weitere Analyse einbezogen werden sollen. Eine Maßstabsleiste von 10 mm wird über ein Vorschaubild der Aufnahme gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Bildaufnahme nach der Bildaufnahme

HINWEIS: Nachdem der Wurmnachweis abgeschlossen ist, müssen alle im Rahmen des Experiments gesammelten Daten im Laufe der Zeit aggregiert werden, um jedes Individuum über seine gesamte Lebensspanne hinweg zu verfolgen und die Todeszeiten aller Individuen zu identifizieren. Warten Sie, bis alle Tiere im Experiment gestorben sind und alle Wurmerkennungsaufgaben abgeschlossen sind, und führen Sie dann die folgenden Schritte aus:

  1. Planen Sie die Bewegungsanalyse ein:
    1. Die Bewegungsanalyse integriert alle experimentellen Daten über die Zeit, um die Sterbezeiten abzuschätzen. Um diesen Auftrag zu starten, gehen Sie auf die Hauptseite der Weboberfläche und suchen Sie das gewünschte Experiment in der Spalte Bildanalyse. Wählen Sie den Link Analyse ausführen aus.
    2. Klicken Sie auf der neuen Seite, die angezeigt wird, auf den Link Neuer Auftrag für alle Regionen, und wählen Sie im Pulldown-Menü Auftrag für eine gesamte Region planen die Option Wurmbewegung analysieren und klicken Sie auf die Schaltfläche Auftrag speichern.
    3. Der LSM-Bilderfassungsserver beginnt automatisch mit der Analyse der Bewegung auf allen Platten.
      HINWEIS: Die Bewegungsanalyse ist der größte Einzelauftrag. Auf einem modernen Multi-Core-Prozessor kann die Analyse jeder Platte aus einem 1-monatigen Lifespan-Experiment 20 Minuten oder länger dauern.
  2. Generieren Sie ein Storyboard: Nachdem die Bewegungsanalyse abgeschlossen ist, können Benutzer mit dem LSM-Storyboard die automatisierten Ergebnisse manuell validieren und sicherstellen, dass die Software korrekte Annahmen über die Morphologie und das Verhalten der Nematoden trifft.
    1. Suchen Sie auf der Hauptseite der Weboberfläche das gewünschte Experiment und die Spalte mit dem Namen Bildanalyse, und wählen Sie Analyse ausführen aus. Klicken Sie auf der neuen Seite, die angezeigt wird, auf Neuer Experimentauftrag. Wählen Sie dann im Abschnitt "Planen Sie einen Auftrag für eine gesamte Region" die Option "Tier-Storyboard generieren" aus und klicken Sie auf "Auftrag speichern".
    2. Nachdem der LSM die Generierung des Storyboards abgeschlossen hat, wechseln Sie zum Wurm-Browser, und wählen Sie das gewünschte Experiment aus. Wählen Sie im Hauptmenü Validierung > Durchsuchen des gesamten Experiments > Unmittelbar nach dem Tod jedes Wurms.
  3. Kommentieren Sie die Storyboards im Wurm-Browser: Ein typisches Storyboard im Wurm-Browser sollte wie folgt aussehen: Abbildung 5.
    1. Kommentieren von "Nicht-Wurm"-Objekten
      HINWEIS: Jedes Objekt, das während der Bewegung erkannt wird, wird auf dem Storyboard angezeigt, sortiert nach der geschätzten Todeszeit. Sofern der Benutzer nichts anderes angibt, wird jedes Objekt in die resultierenden Überlebenskurven einbezogen. Die LSM-Objektklassifizierung ist absichtlich so kalibriert, dass sie eine hohe Falsch-Positiv-Rate aufweist, um die Anzahl der unentdeckten Nematoden zu minimieren. Der Ausschluss von Nicht-Wurm-Objekten ist wichtig, um qualitativ hochwertige Überlebenskurven zu erhalten (siehe die repräsentativen Ergebnisse). Auf der ersten und der letzten Seite des Storyboards befindet sich in der Regel eine große Anzahl von Nicht-Wurm-Objekten, die schnell manuell in großen Mengen ausgeschlossen werden können.
      1. Um Nicht-Wurm-Objekte im Storyboard auszuschließen, klicken Sie einmal mit der rechten Maustaste auf das Bild des Objekts. Das ausgeschlossene Objekt wird nun durch einen weißen Kasten umrandet. Um viele Objekte gleichzeitig auszuschließen, halten Sie die Strg-Taste gedrückt und klicken Sie einmal mit der rechten Maustaste auf ein beliebiges Objekt, und alle Objekte auf der Storyboard-Seite werden ausgeschlossen.
      2. Nachdem ein Objekt aus der Analyse ausgeschlossen wurde, kann dieses Objekt durch zweimaliges Klicken mit der rechten Maustaste wieder aufgenommen werden.
      3. Um die während der Storyboard-Anmerkung erstellten Anmerkungen zu speichern, klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern . Es wird empfohlen, den Fortschritt während des Kommentierens häufig zu speichern.
    2. Kommentieren Sie die Todeszeiten:
      HINWEIS: Ohne Benutzereingriff schätzt das LSM die Sterbezeiten für die meisten Bevölkerungsgruppen genau. Es wird jedoch empfohlen, die Genauigkeit der automatisierten Ergebnisse routinemäßig zu bestätigen, indem eine zufällige Teilmenge von Personen aus jedem Experiment manuell validiert wird. Besonderes Augenmerk sollte auf die am kürzesten und längsten lebenden Personen gelegt werden, da sich Fehler in der automatisierten Analyse tendenziell in diesen Gruppen häufen.
      1. Klicken Sie einmal mit der linken Maustaste auf ein beliebiges Objekt des Storyboards, um ein neues Fenster zu öffnen, in dem detaillierte Zeitreiheninformationen zu diesem Objekt angezeigt werden. Dieses Fenster ermöglicht die Inspektion aller Bilder, die während des Experiments vom Objekt gesammelt wurden, sowie die Quantifizierung der Bewegungsdynamik und -morphologie des Objekts. Verwenden Sie dieselbe Benutzeroberfläche, um die Todeszeiten manuell zu kommentieren. Die Schnittstelle für die Sterbezeit-Annotation ist in Abbildung 6 dargestellt.
      2. Um die Todeszeiten manuell zu kommentieren, klicken Sie mit der linken Maustaste auf die untere Leiste an der Stelle, die dem Zeitpunkt des Todes entspricht. Verwenden Sie die Leertaste und die Pfeiltasten nach rechts oder links auf der Tastatur, um sich durch die Zeitrahmen zu bewegen, oder klicken Sie direkt auf die Leiste im gewünschten Zeitrahmen.
        HINWEIS: Die Visualisierung stellt den Bewegungszustand von Tieren im Laufe der Zeit dar, wie ein horizontales Balkendiagramm mit der Markierungszeit der x-Achse. Der rosa/violette Bereich zeigt die Zeitspanne an, in der sich das Objekt stark bewegt, gelb zeigt schwache Bewegung an, rot zeigt nicht bewegte Tiere an und grün zeigt die Periode der todassoziierten Ausdehnung an. Nematoden zeigen charakteristische todassoziierte morphologische Ereignisse: eine allmähliche Körperkontraktion, die in der Regel vor dem Tod auftritt, gefolgt von einer schnellen Körperausdehnung während oder unmittelbar nach dem Tod (Abbildung 6B). Nicht-Wurm-Objekte wie Staub oder Schatten zeigen diese Dynamik in der Körpergröße nicht und folgen stattdessen typischerweise einer linearen, allmählichen Veränderung von Größe und Intensität im Laufe der Zeit. Diese unterschiedlichen Körpergrößendynamiken bieten eine schnelle und unkomplizierte Methode zur schnellen Klassifizierung und zum manuellen Ausschluss.
      3. Je nach Analyseansatz kann die Sterbezeit entweder als Zeitpunkt der Bewegungsbeendigung (Beginn des roten Balkens in der Bewegungsvisualisierung) oder als Zeitpunkt der todassoziierten Ausdehnung (der grüne Balken in der Bewegungsvisualisierung) betrachtet werden. Um Kontraktions- und Expansionsereignisse manuell zu kommentieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die untere Leiste im gewünschten Zeitrahmen.
    3. Einige rudimentäre Visualisierungen von Mortalitätsdaten werden nativ im Worm Browser-Client bereitgestellt. Überlebenskurven und Sterbezeitdiagnosen werden für jede im Storyboard vorhandene Population angezeigt (Abbildung 7). Sehen Sie sich die Überlebenskurven auf der linken Seite und das Streudiagramm an, in dem der Zeitpunkt der Beendigung der Bewegung (VMC) mit dem Todeszeitpunkt für jedes Individuum auf der rechten Seite des Storyboards verglichen wird.
      HINWEIS: Es ist möglich, diese Ergebnisse nach verschiedenen experimentellen Parametern zu gruppieren, indem Sie in der unteren Leiste eine Untereinstellung für Bedingungen wie bestimmte Stämme, Scanner oder Platten vornehmen. Einzelne Würmer können anhand ihrer Todeszeiten ausgewählt werden, indem Sie mit der linken Maustaste auf einzelne Punkte im VMC-Vergleich mit der Todeszeit klicken.
  4. Schreiben der Mortalitätsdaten auf die Festplatte: Das LSM erzeugt Mortalitätsdaten in Form von CSV-Dateien. Zeichnen Sie die ausgegebenen Überlebenskurven und analysieren Sie sie mit einer beliebigen Statistiksoftware wie R, SAS, STATA oder JMP.
    1. Um diese Dateien zu generieren, wählen Sie das Experiment im Wurm-Browser aus, wählen Sie im Menü Datendateien, Todeszeiten und klicken Sie dann auf Sterbezeiten für aktuelles Experiment generieren. Das LSM generiert eine Ausgabedatei mit den Überlebensdaten des Experiments, die im Ergebnisverzeichnis gespeichert wird.
    2. Wenn manuelle Anmerkungen auf dem Storyboard durchgeführt wurden, wird im Wurm-Browser eine Eingabeaufforderung angezeigt, in der Sie gefragt werden, wie mit manuellen Anmerkungen umgegangen werden soll. Klicken Sie auf "Sofort", um handschriftliche Anmerkungen in die ausgegebene Sterbezeitdatei einzufügen.
      Hinweis: Sterblichkeitsdatendateien werden in das Ergebnisverzeichnis geschrieben, das in der imageserver.ini Datei angegeben ist. Es wird eine Vielzahl von Dateien geschrieben, aber die am häufigsten verwendete Version ist "survival_simple/survival=machine_hand", die alle manuellen Anmerkungen enthält, die mit dem Storyboard erstellt wurden.
    3. Analysieren Sie die Mortalitätsdaten in der Statistiksoftware Ihrer Wahl.

Figure 5
Abbildung 5: Tier-Storyboard im Wurm-Browser. (A) Alle stationären Würmer werden in chronologischer Reihenfolge der maschinell annotierten Todeszeit angezeigt. Um im Storyboard zu navigieren, drücken Sie die Schaltflächen in der unteren rechten Ecke und (C) speichern Sie die Anmerkungen häufig. (D) Die Bilder mit nicht-grauem Hintergrund zeigen zwei Wurmtodereignisse (früher Tod als grün, später Tod als rot), die entweder auftreten können, wenn zwei Würmer nahe beieinander sterben, oder wenn tote Würmer von einem vorbeiziehenden Wurm bewegt werden und somit zweimal als tot erkannt werden. (E) Eine rote Markierung in der unteren Ecke eines Bildes kennzeichnet Würmer mit einer nachgewiesenen Todeszeit; (F) Ein grünes Etikett zeigt an, wenn ein Objekt nicht lange genug still stand, um einen Todeszeitpunkt aufzuzeichnen. (G) Mehrere Würmer im selben Frame können durch Drücken der Umschalttaste und Linksklick markiert werden. (H) Nicht-Wurm-Objekte werden durch einen Rechtsklick von der Analyse ausgeschlossen. (I) Explodierte Würmer werden von der Analyse zensiert, indem man auf das entsprechende Bild klickt (es öffnet sich ein manuelles Anmerkungsfenster) und die Umschalttaste gedrückt und mit der rechten Maustaste klickt, bis die Meldung "Tier explodiert" erscheint. Ein Maßstabsbalken von 0,5 mm und Beschriftungen werden über den Screenshot eines Worm-Browser-Fensters gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Untersuchen von Objekten und Kommentieren von Todeszeiten im Wurm-Browser. Ein Linksklick auf ein beliebiges Objekt im Storyboard des Wurm-Browsers öffnet eine neue Benutzeroberfläche und ermöglicht es dem Benutzer, die Bewegungsdynamik des Objekts zu überprüfen. Auf der rechten Seite wird der Bewegungswert (A) angezeigt, der die Objektbewegung quantifiziert; Dies wird durch die Änderung der Pixelintensitäten zwischen aufeinanderfolgenden Beobachtungen geschätzt. Zusätzlich wird auf der rechten Seite (B) die Änderung der Gesamtobjektintensität angezeigt, wodurch Änderungen der Objektgröße quantifiziert werden. Auf der linken Seite zeigt der obere Balken die (C) maschinelle Schätzung der Todeszeit, während der untere Balken die (D) menschliche Handanmerkung darstellt. Durch Klicken auf einen beliebigen Punkt der Balken und Drücken der Leertaste kann sich der Benutzer durch die Zeitrahmen bewegen, in denen der Wurm abgebildet wurde. Auf diesen Balken steht Rosa für die Zeit, die in kräftiger Bewegung verbracht wird, Rot für die Zeit, die im Tod verbracht wird, und Gelb für alles dazwischen. Die Zeit, die nach der Sterbezeit in Expansion und Kontraktion verbracht wurde, ist grün dargestellt. Beschriftungen werden über den Screenshot eines Worm-Browser-Fensters gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Statistik der Bevölkerungszusammenfassung im Wurm-Browser. Populationsstatistik für das Scannergerät "obiwan", mit einem Diagramm des Überlebens (linkes Bild) und einem Streudiagramm der Zeit der kraftvollen Bewegungsbeendigung (VMC) im Vergleich zur Todeszeit (rechtes Bild). Die Diagramme sind Details von (A) einer Bedingung, die von (B) einem Scanner erhalten wurde, der durch die erste Auswahl von (C) der Überlebensgruppe nach Stamm erreicht wurde. (D) Die quadratischen Formen im Streudiagramm stellen die von Hand kommentierten Ereignisse dar, während (E) die kreisförmigen Formen die mit Maschinenanmerkungen versehenen Ereignisse darstellen. (F) Manuelle Anmerkungen sind oft erforderlich für Todesereignisse, die früh eintreten, oder (G) solche, bei denen der Zeitpunkt der Beendigung der Bewegung mit dem Zeitpunkt des Todes zusammenfällt. Beschriftungen werden über den Screenshot eines Worm-Browser-Fensters gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Representative Results

Die experimentelle Reproduzierbarkeit in Lifespan-Assays ist eine Herausforderung und erfordert sowohl streng kontrollierte Versuchsbedingungen als auch große Populationen, um eine ausreichende statistische Auflösung zu erreichen 4,36. Das LSM eignet sich hervorragend für die Erfassung großer Tierpopulationen in einer konstanten Umgebung mit hoher zeitlicher Auflösung. Um die Leistungsfähigkeit des LSM zu demonstrieren, die entscheidenden Schritte der Analyse hervorzuheben und den Forschern zu helfen, ihren Arbeitsaufwand zu priorisieren, präsentieren wir eine Teilmenge von Daten aus einem optimalen, zuvor veröffentlichten Experiment23. Da es sich bei diesem Experiment um einen Dosis-Wirkungs-Assay handelte, war eine beträchtliche Anzahl von Tieren erforderlich, um Veränderungen der Lebensspanne zuverlässig nachzuweisen. Von Hand würde dieses Experiment einen intensiven Zeitaufwand von mehreren Forschern erfordern oder, wenn es verkleinert würde, zu schwachen Ergebnissen führen. Der Datensatz maß quantitative Veränderungen der Lebensspanne nach Entfernung des RNA-Polymerase-II(b)-Untereinheitsgens (RPB-2), das für die Boten-RNA-Transkription erforderlich ist. Unter Verwendung des Auxin-induzierbaren Systems37 in C. elegans wurde der endogene Locus von RPB-2 mit einer Degron-Sequenz markiert, um RPB-2 unter Verwendung verschiedener Konzentrationen von Auxin (α-Naphtalenessigsäure) bedingt zu ubiquitylieren und abzubauen. Das Experiment wurde an AMP100 [rpb-2 (cer135); eft-3p::TIR-1] durchgeführt, wobei cer135 dem CRISPR-eingefügten AID-Tag rpb-2::GFPΔpiRNA::AID::3xFLAG23 entspricht. Die Versuchsbedingungen waren bei einer Temperatur von 20 °C und unter Verwendung von UV-inaktiviertem NEC937 (OP50 ΔuvrA; KanR)38E. Coli. Hermaphroditen wurden sterilisiert, indem Nematoden während des späten L4-Stadiums auf Platten übertragen wurden, die 5-Fluor-2-Desoxyuridin (FUdR) enthielten. Die Nematoden wurden am 2. Tag des Erwachsenenalters auf Platten übertragen, die unterschiedliche Konzentrationen von Auxin enthielten. In der ursprünglichen Studie zeigten die Autoren, dass der RPB-2-Abbau in Gegenwart von Auxin die Lebensdauer dosisabhängig verkürzte23. 

Hier zeigen wir den Beitrag, den die Datenvalidierung und -annotation nach dem Experiment zur endgültigen Ausgabe der Überlebenskurve leistet (Abbildung 8). In den letzten Schritten der Bildanalyse innerhalb des Storyboards des Wurmbrowsers verglichen wir die rohen Überlebenskurven, die vor der Storyboard-Annotation erstellt wurden, mit den Überlebenskurven, die nach dem manuellen Ausschluss von Nicht-Wurm-Objekten erstellt wurden, sowie mit den Überlebenskurven, die nach der Annotation von Nicht-Wurm-Objekten und individuellen Todeszeiten erstellt wurden (Abbildung 8A-C). Wir fanden heraus, dass die anfänglichen Überlebenskurven, die vor der Storyboard-Annotation (Abbildung 8A) erstellt wurden, durch die unsachgemäße Einbeziehung von Nicht-Wurm-Objekten verzerrt wurden, was am deutlichsten in den Ausläufern der Überlebenskurven zu sehen war. Vor der manuellen Annotation umfassten die Überlebenskurven alle Objekte, die von der Maschine als potentielle Wurmobjekte erkannt wurden, von denen etwa die Hälfte aufgrund der absichtlich hohen Falsch-Positiv-Rate Nicht-Wurm-Objekte waren und manuell ausgeschlossen werden mussten (Abbildung 8D). Dies ist beabsichtigt, da die Algorithmen so kalibriert sind, dass sie eine relativ hohe Falsch-Positiv-Rate aufweisen, um falsch negative Ergebnisse zu vermeiden, da es viel einfacher ist, falsch eingeschlossene Objekte auszuschließen, als falsch ausgeschlossene Objekte zu suchen und wiederherzustellen. Nach dem Ausschluss von Nicht-Wurm-Objekten während der manuellen Storyboard-Annotation waren die resultierenden Überlebenskurven von viel höherer Auflösung (Abbildung 8B, E), und eine weitere manuelle Annotation der Todeszeiten auf dem Storyboard führte zu Änderungen von nicht mehr als ~4% in der geschätzten mittleren Lebensdauer. Wir zeigen daher, dass die Entfernung von Nicht-Wurm-Objekten während der Bildanalyse-Pipeline des LSM der entscheidende Schritt ist, um gut aufgelöste Überlebenskurven zu erhalten.

Figure 8
Abbildung 8: Der Effekt der manuellen Datenvalidierung auf die Überlebenskurven. Der Abbau von RPB-2 verkürzt das C. Die Lebensdauer von elegans in Gegenwart von Auxin (K-NAA: α-napthalinessigsäure) ist dosisabhängig. (A) Überlebenskurven, die aus der LSM-Rohausgabe nach Qualitätskontrolle der Platten und ohne manuelle Annotation der Wurmobjekte auf dem Storyboard des Wurmbrowsers aufgetragen wurden. (B) Überlebenskurven, die nach manueller Annotation der Wurmobjekte auf dem Storyboard gezeichnet wurden. (C) Überlebenskurven, die nach manueller Annotation der Wurmobjekte und Todeszeiten auf dem Storyboard gezeichnet wurden. (D) Zusammenfassung aller vom LSM erkannten Objekte. Zu den zensierten Wurmobjekten gehörten Objekte, die automatisch ausgeschlossen wurden (z. B. aufgrund von Würmern, die sich außerhalb des gescannten Bereichs bewegten) oder manuell vom Versuchsleiter (z. B. aufgrund von Würmern, die platzten). (E) Tabellarische Darstellung der geschätzten mittleren Lebensdauer nach der Annotation des Wurmobjekts durch die Hand (links) und der zusätzlichen Annotation des Sterbezeitpunkts durch Hand (rechts). Prozentualer Unterschied in der mittleren Lebensdauer zwischen benachbarten Gruppen unterschiedlicher Auxinkonzentrationen und der statistischen Nachweissicherheit. Alle Diagramme wurden mit der Statistiksoftware JMP gezeichnet. Die Daten für diese Abbildung wurden mit Genehmigung von Oswal et al.23 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Über die Lebensspanne als einzigen Endpunkt für die Untersuchung des Alterns hinaus betrachteten wir das verhaltensbedingte Altern und untersuchten, welche Schritte der postexperimentellen Bildanalyse für seine Messung am wichtigsten waren. Wir konzentrierten uns auf den Zusammenhang zwischen kräftiger Bewegungsbeendigung (VMC) und Lebensdauer und verglichen die LSM-Ausgabe in verschiedenen Stadien der Bildanalyse und -validierung (Abbildung 9A-D). Wir fanden heraus, dass Nicht-Wurm-Objekte eine einzigartige Beziehung zwischen der scheinbaren VMC und der Lebensdauer zeigten, wobei die beiden als nahezu gleichzeitig auftretend in jedem Objekt annotiert wurden (Abbildung 9A). Im Gegensatz dazu hörten echte Nematoden in der Regel mehrere Tage vor ihrem Tod auf, sich kräftig zu bewegen (Abbildung 9A). Dieser Unterschied in der Beziehung zwischen VMC und Lebensdauer bietet eine zusätzliche Möglichkeit, Objekte ohne Wurm schnell zu identifizieren und auszuschließen.

Figure 9
Abbildung 9: Die Auswirkungen der manuellen Datenvalidierung auf die Analyse der kräftigen Bewegungsentwöhnung (VMC). (A) Verhaltensalterungsdaten ohne manuelle Annotation von Wurmobjekten auf dem Storyboard des Wurmbrowsers, die die Beziehung zwischen den Todeszeiten und den VMC-Zeiten in Nicht-Wurm-Objekten (in Schwarz) im Vergleich zu Wurmobjekten (in Rot) anzeigen. (B) Verhaltensalterungsdaten, die nach manueller Annotation von Wurmobjekten auf dem Storyboard gezeichnet wurden. (C) Verhaltensalterungsdaten, die nach manueller Annotation von Wurmobjekten und Todeszeiten auf dem Storyboard gezeichnet wurden. (D) Tabellarische Darstellung der durchschnittlichen verbleibenden Lebensdauer (ARL; ermittelt aus dem Schnittpunkt zwischen dem Sterbealter und dem VMC-Alter) über verschiedene Schritte der Bildanalyse-Pipeline und die prozentuale Differenz in der ARL zwischen der Annotation des Wurmobjekts und der weiteren Annotation der Todeszeit. (E) Grafische Darstellung der geschätzten ARLs in verschiedenen Schritten der Analyse nach der Bildaufnahme und ihre Beziehung zur Lebensdauer des Wurms (die von der Auxinkonzentration abhängt: α-Napathalinessigsäure). Die Spline-Anpassung wurde mit einer kubischen Spline-Methode durchgeführt. Alle Diagramme wurden mit der Statistiksoftware JMP gezeichnet. Die Daten für diese Abbildung wurden mit Genehmigung von Oswal et al.23 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Wir fanden heraus, dass die Annotation und der Ausschluss von Nicht-Wurm-Objekten mit dem Wurm-Browser ausreichte, um eine grobe Schätzung des Zusammenhangs zwischen der VMC und den Todeszeiten zu liefern (Abbildung 9A-C), die die erwartete Dynamik des physiologischen Rückgangs von Nematoden rekapituliert23. Um dies weiter zu untersuchen, betrachteten wir denselben RNA-Polymerase-II-Datensatz und schätzten die durchschnittliche verbleibende Lebensdauer (ARL) nach VMC für jede Subpopulation als Schnittpunkt eines linearen Regressionsmodells, das die Lebensdauer mit VMC in Beziehung setzt. Um die Auswirkungen der Datenannotation auf die ARL zu verstehen, haben wir die ARL nach jedem Schritt der Datenannotation neu berechnet (Abbildung 9E). Wir fanden heraus, dass die manuelle Kommentierung der Sterbezeiten in der Verhaltensalterungsanalyse besonders wichtig bei langlebigeren Würmern war, in diesem Fall bei denen, die den niedrigsten Konzentrationen von Auxin ausgesetzt waren (Abbildung 9D,E). Im Gegensatz zu ihrem minimalen Effekt auf die Überlebenskurven hatte die manuelle Annotation der Sterbezeiten einen erheblichen Einfluss auf den quantitativen Zusammenhang zwischen der VMC und der Lebensspanne, indem sie die geschätzte ARL, z. B. bei 0 μM Auxin, von 8,09 Tagen auf 10,42 Tage nach der Sterbezeitannotation erhöhte; dies entspricht einer ARL-Differenz von 29 %. Daher fanden wir heraus, dass die Beziehung zwischen VMC und Sterbezeiten, die durch ARL erklärt wurden, viel empfindlicher auf die manuelle Annotation der Sterbezeiten reagierte als auf Messungen der Sterbezeiten allein für die Lebensspanne. Diese Empfindlichkeit lässt sich durch die relative Dauer des ARL und die Lebensdauer erklären; Die gleichen Anpassungen der Sterbezeit sind in der Regel gering im Verhältnis zur Lebensspanne, aber groß im Verhältnis zur ARL. Daher haben Anpassungen der Sterbezeiten einen größeren relativen Effekt auf die ARL als auf die Lebenserwartung.

Ergänzende Datei 1: Struktur der Lifespan Machine-Experimentzeitplandatei. Der Versuchsplan besteht aus drei Teilen. Zuerst werden die grundlegenden Informationen über das Experiment aufgenommen, z. B. der Name und die Erfassungsspezifikation. Ab diesem Teil muss in der Regel nur der Name des Experiments für jedes neue Experiment geändert werden. Der zweite Teil des Dokuments wird durch das Exportieren von Scanbereichen aus dem Worm Browser generiert und gibt den physischen Speicherort der Scanbereiche für jeden Scanner an ("asuna", "bulma", "moscow", "rio", "yuno" und "yuki" in diesem Beispiel). Diese werden für jedes neue Experiment ersetzt und aus den TXT-Dateien kopiert, die für jeden Scanner einzeln in Schritt 4.1.2.3 generiert wurden. Der dritte Teil des Dokuments enthält Informationen über die Dauer des Experiments, die auch für jedes neue Experiment angepasst werden sollte, und die Aufnahmehäufigkeit. Das Gerät scannt jeden definierten Bereich nacheinander in festgelegten Intervallen für die Dauer des gesamten Experiments. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Hier stellen wir ein detailliertes, zugängliches Protokoll für die Durchführung eines Experiments mit der neuesten Version der Lifespan Machine zur Verfügung. Wir haben gezeigt, dass der entscheidende Schritt für das Erreichen gut aufgelöster Überlebenskurven der manuelle Ausschluss von Nicht-Wurm-Objekten während der Post-Bild-Aufnahme ist. Die manuelle Sterbezeit-Annotation hat einen geringen Einfluss auf die Gesamtform der Überlebenskurven und zeigt, dass die vollautomatische Sterbezeit-Schätzung auch ohne manuelle Annotation effizient ist (Abbildung 8). Im Gegenteil, die Erfassung qualitativ hochwertiger verhaltensbezogener Alterungsdaten erfordert eine sorgfältigere Annotation der Sterbezeiten, insbesondere bei langlebigen Individuen (Abbildung 9). Daher hängt die Zeit, die für die manuelle Storyboard-Anmerkung benötigt wird, letztendlich von dem spezifischen Ergebnis ab, das gemessen wird. Insgesamt stellen wir fest, dass bei der Arbeit mit dem LSM die Bemühungen des Forschers während des Versuchsaufbaus und in geringerem Maße während der Analyse nach der Bildaufnahme am wichtigsten sind. Schließlich heben wir den Wert automatisierter Hochdurchsatz-Assays hervor, um hochaufgelöste Überlebens- und Verhaltensalterungsdaten zu erzeugen und gleichzeitig die Produktivität der Forscher zu steigern und die experimentelle Reproduzierbarkeit zu unterstützen.

Das LSM beherbergt Nematoden auf Agarplatten und bildet so den klassischen Hands-Lifespan-Assay in einem automatisierten Kontext nach. Andere Werkzeuge wurden entwickelt, um die Messung der Lebensdauer von C. elegans mit verschiedenen Methoden des Nematodeneinschlusses zu automatisieren. Dazu gehören Ansätze, bei denen einzelne Nematoden in festen Medien (WorMotel15) oder in einem mikrofluidischen Gerät (Lifespan-on-a-Chip11) untergebracht werden, oder solche, die eine größere Population von Tieren mithilfe von Mikrofluidik verfolgen (WormFarm14). Zu den Vorteilen von Mikrofluidik-Plattformen gehören die Möglichkeit einer präzisen Echtzeit-Umgebungskontrolle und die automatisierte Entfernung von Nachkommen durch Größenausschluss. Die oben genannten Geräte haben sich jedoch bisher als nicht einfach skalierbar erwiesen, da sie eine umfangreiche manuelle Handhabung erfordern und oft auf tägliche Bild- oder Videoaufnahmen angewiesen sind, die von einem Experimentator ausgelöst werden. Andere Plattformen, wie z. B. der Stress-Chip39, verwenden die modifizierten Flachbettscanner, die für das LSM entwickelt wurden, um kundenspezifische mikrofluidische Geräte abzubilden.

Im Gegensatz zu anderen Methoden verfügt das LSM über umfangreiche Datenannotations- und Validierungsfunktionen, die es den Anwendern ermöglichen, systematisch die Qualitätskontrolle durchzuführen, die erforderlich ist, um hochauflösende, präzise und genaue Lebensdauerdaten in einem Hochdurchsatzkontext zu sammeln13. Die Technik ist vielseitig einsetzbar, da sie aktuelle Agarplatten-basierte Laborprotokolle verwendet, und bietet einen einzigartigen Vorteil für die experimentelle Skalierbarkeit, da es relativ einfach ist, große Gruppen von Flachbettscannern anzuordnen. Obwohl das LSM einen anfänglichen Zeitaufwand für die Erstellung und den Betrieb sowie für die Schulung der Benutzer in der spezialisierten Software erfordert, werden diese Kosten durch die robuste Produktion von Lebensdauerdaten mit hohem Durchsatz ausgeglichen. Lebensspanne Maschinencluster mit 50 oder mehr Scannern wurden in mehreren Laboren eingesetzt und laufen seit mehr als einem Jahrzehntununterbrochen 40.

Das LSM hat Einschränkungen. Die Tiere werden während der automatisierten Erfassung von Überlebensdaten in Scannern untergebracht, was die Fähigkeit der Forscher einschränkt, gleichzeitig mit der Beobachtung experimentelle Eingriffe durchzuführen und entweder die Sterilisation der Tiere oder den Beginn von Experimenten nach der Fortpflanzungsphase der Nematoden zu erfordern. Temperaturänderungen sind eine seltene Ausnahme von der Begrenzung der Eingriffe, da die Umgebungstemperatur moduliert werden kann, ohne dass die Scanner geöffnet und die Tiere betreten werden müssen. In Fällen, in denen die Nematoden in der Lebensmitte manuell behandelt werden müssen, besteht eine gängige Lösung darin, den Beginn der automatisierten Beobachtung zu verzögern, bis die notwendige Behandlung der Tiere durchgeführt wurde. Darüber hinaus gibt es eine inhärente Variation in der Position der Platten innerhalb und über den Scannern hinweg. Diese können winzigen, lokalen Unterschieden in den Umgebungsbedingungen (z. B. Temperatur, Licht, Belüftung usw.) unterliegen, die C beeinflussen können. elegans Lebensspanne19. Dieser Umwelteinfluss kann weiter quantifiziert und untersucht werden, indem beschleunigte Ausfallzeitregressionsmodelle41 verwendet werden. Eine Möglichkeit, diesen Effekt abzuschwächen, besteht darin, einfach die Anzahl der Platten und Scanner zu skalieren, um eine strenge Messung unabhängig von Umgebungsschwankungen zu erreichen. In der Regel sind Platten der gleichen Erkrankung zufällig in jedem Scanner verteilt, und Populationsgrößen von mehr als 500 Individuen pro Erkrankung und über Scanner hinweg haben statistisch robuste Überlebensschätzungen gezeigt31.

Insgesamt ermöglicht das LSM die hochgenaue und große Populationserfassung von Überlebens- und Verhaltensalterungsdaten und könnte es ermöglichen, bisher nicht durchführbare Screenings auf quantitative Weise durchzuführen. Auf diese Weise leistet das LSM einen wichtigen technischen Fortschritt für die standardisierte Erfassung von Überlebenskurven und bietet einen neuartigen Rahmen für die gekoppelte Untersuchung von Lebensspanne und Verhaltensalterung bei Nematoden.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Acknowledgments

Wir danken Julian Ceron und Jeremy Vicencio (IDIBELL Barcelona) für die Produktion des rpb-2(cer135) Allels. Dieses Projekt wurde gefördert durch den Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union (Finanzhilfevereinbarung Nr. 852201), das spanische Ministerium für Wirtschaft, Industrie und Wettbewerbsfähigkeit (MEIC) an die EMBL-Partnerschaft, das Centro de Excelencia Severo Ochoa (CEX2020-001049-S, MCIN/AEI /10.13039/501100011033), das CERCA-Programm/Generalitat de Catalunya, den MEIC Excelencia-Preis BFU2017-88615-P, und eine Auszeichnung der Glenn Foundation for Medical Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Naphtaleneacetic  acid (Auxin) Sigma N0640 Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR) Sigma F0503 27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria
Glass cleaner Kristal-M QB-KRISTAL-M125ml
Hydrophobic anti-fog glass treatment Rain-X Scheibenreiniger  C. 059140
Rubber matt Local crafstman Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock
Scanner glass Local hardware supplier 9" x 11.5" inch glass sheet
Scanner plates Life Sciences 351006 50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish
USB Reference Thermometer USB Brando ULIFE055500  For calibrating temperature of scanners

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References

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Del Carmen-Fabregat, A., Sedlackova, … More

Del Carmen-Fabregat, A., Sedlackova, L., Oswal, N., Stroustrup, N. High-Throughput Behavioral Aging and Lifespan Assays Using the Lifespan Machine. J. Vis. Exp. (203), e65462, doi:10.3791/65462 (2024).

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