लाइफस्पैन मशीन का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट व्यवहार एजिंग और जीवनकाल परख

Summary

इमेजिंग प्लेटफॉर्म "द लाइफस्पैन मशीन" बड़ी आबादी के आजीवन अवलोकन को स्वचालित करता है। हम जीवनकाल, तनाव प्रतिरोध, रोगजनन और व्यवहार उम्र बढ़ने के परख करने के लिए आवश्यक कदम दिखाते हैं। डेटा की गुणवत्ता और दायरा शोधकर्ताओं को जैविक और पर्यावरणीय भिन्नता की उपस्थिति के बावजूद उम्र बढ़ने में हस्तक्षेप का अध्ययन करने की अनुमति देता है।

Abstract

आनुवंशिक रूप से समान जानवरों को एक निरंतर वातावरण में रखा जाता है, जो जीवन काल का एक विस्तृत वितरण प्रदर्शित करता है, जो अध्ययन किए गए सभी जीवों में संरक्षित उम्र बढ़ने के लिए एक बड़े गैर-आनुवंशिक, स्टोकेस्टिक पहलू को दर्शाता है। इस स्टोकेस्टिक घटक का अर्थ है कि उम्र बढ़ने को समझने और जीवनकाल बढ़ाने या स्वास्थ्य में सुधार करने वाले सफल हस्तक्षेपों की पहचान करने के लिए, शोधकर्ताओं को एक साथ प्रयोगात्मक जानवरों की बड़ी आबादी की निगरानी करनी चाहिए। पारंपरिक मैनुअल डेथ स्कोरिंग बड़े पैमाने पर परिकल्पना परीक्षण के लिए आवश्यक थ्रूपुट और पैमाने को सीमित करता है, जिससे उच्च-थ्रूपुट जीवनकाल परख के लिए स्वचालित तरीकों का विकास होता है। लाइफस्पैन मशीन (एलएसएम) एक उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग प्लेटफॉर्म है जो नेमाटोड की जीवनभर ट्रैकिंग के लिए कस्टम इमेज प्रोसेसिंग और डेटा सत्यापन सॉफ्टवेयर के साथ संशोधित फ्लैटबेड स्कैनर को जोड़ती है। मंच एक अभूतपूर्व पैमाने पर जानवरों की बड़ी आबादी से अत्यधिक अस्थायी रूप से हल किए गए जीवनकाल डेटा उत्पन्न करके और अनुभवी शोधकर्ताओं द्वारा किए गए मैनुअल परख के बराबर सांख्यिकीय सटीकता और सटीकता पर एक प्रमुख तकनीकी अग्रिम का गठन करता है। हाल ही में, एलएसएम को उम्र बढ़ने के दौरान देखे गए व्यवहार और रूपात्मक परिवर्तनों को निर्धारित करने और उन्हें जीवनकाल से संबंधित करने के लिए और विकसित किया गया है। यहां, हम वर्णन करते हैं कि एलएसएम का उपयोग करके एक स्वचालित जीवनकाल प्रयोग की योजना कैसे बनाएं, चलाएं और विश्लेषण करें। हम व्यवहार डेटा और उच्च गुणवत्ता वाले उत्तरजीविता घटता के सफल संग्रह के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण कदमों पर प्रकाश डालते हैं।

Introduction

एजिंग एक जटिल, बहुआयामी प्रक्रिया है जो किसी जीव के शारीरिक कार्य में गिरावट की विशेषता है,^{जिससे समय के} साथ बीमारी और मृत्यु के जोखिम में वृद्धि होती है। जीवनकाल, जन्म से समय या मृत्यु तक वयस्कता की शुरुआत के रूप में मापा जाता है,^{उम्र 2 का} एक स्पष्ट परिणाम प्रदान करता है और आबादी³ के बीच उम्र बढ़ने की सापेक्ष दर को मापने के लिए एक अप्रत्यक्ष लेकिन कठोर मात्रात्मक प्रॉक्सी प्रदान करता है। उम्र बढ़ने के अध्ययन अक्सर जीवन काल के सटीक माप पर निर्भर करते हैं, नैदानिक परीक्षणों के समान, एक हस्तक्षेप और एक अनपेक्षित नियंत्रण समूह के संपर्क में आने वाली आबादी के बीच परिणामों की तुलना करने के लिए। दुर्भाग्य से, प्रजनन क्षमता के मुद्दे उम्र बढ़ने के अनुसंधान में व्याप्त हैं, कभी-कभी सांख्यिकीय रूप से कमजोर प्रयोगों के कारण^और अक्सर पर्यावरण में सूक्ष्म विविधताओं के लिए जीवन काल परख की अंतर्निहित संवेदनशीलता के कारण⁵. मजबूत प्रयोगों बड़ी आबादी के कई प्रतिकृतियों की आवश्यकता है, और इस प्रक्रिया को विशेष रूप से स्वचालन⁶ द्वारा की पेशकश की प्रयोगात्मक मापनीयता से लाभ.

जीवनकाल परख की कठोर मांग उम्र बढ़ने की प्रक्रिया की अप्रत्याशितता से ही उत्पन्न होती है। समान वातावरण में रखे गए आइसोजेनिक व्यक्ति अलग-अलग मृत्यु के समय और शारीरिक गिरावट की दर⁷ प्रदर्शित करते हैं, यह सुझाव देते हुए कि जीवनकाल में उच्च स्तर की स्थिरता ^7,8 शामिल है। इसलिए, उम्र बढ़ने की प्रक्रिया में मात्रात्मक परिवर्तनों को मापने के लिए बड़ी आबादी की आवश्यकता होती है, जैसे कि औसत या अधिकतम जीवनकाल में परिवर्तन, और व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता से उत्पन्न होने वाले पूर्वाग्रहों को दूर करने के लिए। इसके अलावा, उच्च-थ्रूपुट जीवनकाल परख की क्षमता उत्तरजीविता वक्र आकृतियों और उम्र बढ़ने की गतिशीलता के मॉडल के अध्ययन का समर्थन करने के लिए महत्वपूर्ण है⁹.

नेमाटोड कैनोराबडिटिस एलिगेंस अपने छोटे जीवनकाल, आनुवंशिक ट्रैक्टेबिलिटी और तेजी से पीढ़ी के समय के कारण उम्र बढ़ने के अनुसंधान के लिए एक अमूल्य मॉडल है, जो उच्च-थ्रूपुट उम्र बढ़ने और जीवनकाल परख के लिए इसकी उपयुक्तता को रेखांकित करता है। परंपरागत रूप से, सी में जीवनकाल। एलिगेंस को एक सिंक्रनाइज़ का पालन करके मापा गया है, ठोस मीडिया पर समय के साथ लगभग 50-100 जानवरों की छोटी आबादी और व्यक्तिगत मौतों के समय को लिखना। जानवरों की उम्र के रूप में और गतिशीलता खो देते हैं, मैन्युअल रूप से मौत के समय को स्कोर करने के लिए व्यक्तिगत रूप से जानवरों को उकसाने और सिर या पूंछ के छोटे आंदोलनों की जांच करने की आवश्यकता होती है। यह आमतौर पर एक थकाऊ और श्रमसाध्य प्रक्रिया है, हालांकि इसे^10,11,12 में तेजी लाने के प्रयास किए गए हैं। महत्वपूर्ण रूप से, धीमी प्रयोगात्मक पाइपलाइनें उम्र बढ़ने की हमारी समझ और परीक्षण किए गए हस्तक्षेपों की प्रभावशीलता में प्रगति में बाधा डालती हैं।

मात्रात्मक डेटा के लिए उम्र बढ़ने के अनुसंधान की मांगों को पूरा करने के लिए, डेटा संग्रह को स्वचालित करने के लिए कई प्रौद्योगिकियां विकसित की गई हैं, जिसमें माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों से फ्लैटबेड स्कैनर 13,14,15,16,17,18 तक दृष्टिकोण की एक उल्लेखनीय श्रृंखला शामिल है। एलएसएम अत्यधिक सटीक और सटीक जीवनकाल डेटा के संग्रह के लिए अपने व्यापक अनुकूलन में अन्य तरीकों से अलग है, जो उपयोगकर्ताओं को मान्य करने की अनुमति देता है, सही है, और स्वचालित विश्लेषण¹³ को परिष्कृत करने के लिए अनुमति देता है कि एक व्यापक सॉफ्टवेयर सूट के साथ संयुक्त सावधान उपकरण अंशांकन प्रोटोकॉल के विकास के माध्यम से प्राप्त किया जाता है. सॉफ्टवेयर सिद्धांत रूप में, व्यवहार में, विविध इमेजिंग तौर-तरीकों के लिए लागू किया जा सकता है, व्यवहार में, सबसे उपयोगकर्ताओं को फ्लैटबेड स्कैनर का उपयोग पर्यावरण के तापमान और आर्द्रता पर ठीक-ठीक नियंत्रण के लिए अनुमति देने के लिए संशोधित - जीवन काल¹⁹ पर उनके प्रमुख प्रभाव के कारण महत्वपूर्ण महत्व के कारकों. एलएसएम पर्यावरण की स्थिति और जीनोटाइप के आधार पर दिनों से लेकर महीनों तक के अंतराल पर हर 20 मिनट में नेमाटोड की छवियां लेता है। उत्पादित डेटा मैनुअल परख से डेटा की तुलना में बहुत अधिक अस्थायी संकल्प के हैं, और एकत्र की गई छवियां जीवन भर में नेमाटोड स्थिति का एक स्थायी दृश्य रिकॉर्ड प्रदान करती हैं। मशीन-लर्निंग विधियों का उपयोग करके, मृत्यु का समय स्वचालित रूप से प्रत्येक व्यक्ति को सौंपा जाता है। इन परिणामों को तेजी से, मैन्युअल रूप से "वर्म ब्राउज़र" नामक क्लाइंट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मान्य किया जा सकता है। अपने हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर का एक परिणाम के रूप में, एलएसएम जीवित रहता घटता है कि सांख्यिकीय अनुभवी शोधकर्ताओं के हाथों में मैनुअल मौत स्कोरिंग से अप्रभेद्य हैं उत्पन्न कर सकते हैं, कम कार्यभार और उच्च मापनीयता¹³ के अतिरिक्त लाभ के साथ.

एलएसएम का नवीनतम संस्करण नेमाटोड के जीवन भर में रूपात्मक और व्यवहार संबंधी डेटा एकत्र करके और प्रत्येक व्यक्ति के जीवनकाल के साथ इसकी रिपोर्टिंग करके व्यवहारिक उम्र बढ़ने के अध्ययन की अनुमति देता है। विशेष रूप से, एलएसएम प्रत्येक जानवर के जोरदार आंदोलन समाप्ति (वीएमसी) के समय को कैप्चर करता है, एक मील का पत्थर अक्सर किसी व्यक्ति के "स्वास्थ्य" को उसके जीवनकाल से अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक साथ जीवनकाल और व्यवहारिक उम्र बढ़ने के आंकड़ों को इकट्ठा करके, एलएसएम उन हस्तक्षेपों के अध्ययन का समर्थन करता है जो उम्र बढ़ने के विभिन्न फेनोटाइपिक परिणामों पर अंतर प्रभाव डाल सकते हैं²⁰. व्यवहार उम्र बढ़ने का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रकार के मैक्रोस्कोपिक रूप से अवलोकन योग्य फेनोटाइप का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि शरीर की गति या ग्रसनी पंपिंग²¹, ऊतक अखंडता²², और आंदोलन की गति या उत्तेजना-प्रेरित मोड़¹⁷। विभिन्न उम्र बढ़ने वाले फेनोटाइप के बीच तुलना उम्र बढ़ने की प्रक्रियाओं की कारण संरचना के विश्लेषण का समर्थन कर सकती है। उदाहरण के लिए, वीएमसी और जीवनकाल के बीच तुलना हाल ही में सी एलिगेंस²³ में दो अलग उम्र बढ़ने की प्रक्रियाओं को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.

जबकि शुरू में सी एलिगेंस में जीवनकाल को मापने के लिए विकसित किया गया था, एलएसएम सी सहित नेमाटोड प्रजातियों की एक श्रृंखला से अस्तित्व और व्यवहार डेटा के संग्रह का समर्थन करता है। ब्रिगसे, सी। ट्रॉपिकलिस, सी। जपोनिका, सी। ब्रेनरी, और पी। पैसिफिकस²³. प्रौद्योगिकी जीवनकाल, तनाव प्रतिरोध और रोगज़नक़ प्रतिरोध पर जैविक और पर्यावरणीय हस्तक्षेपों के प्रभाव के अध्ययन की सुविधा प्रदान करती है और इसे आरएनए हस्तक्षेप या ऑक्सिन-इंड्यूसिबल प्रोटीन गिरावट प्रणालियों के लक्षित परख जैसे प्रयोगात्मक उपकरणों के साथ जोड़ा जा सकता है। आज तक, इसका उपयोग वैज्ञानिक साहित्य में 6,24,25,26,27,28,29,30 अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए किया गया है।

यहाँ, हम परिणामी अस्तित्व घटता के उत्पादन के लिए प्रयोगात्मक सेटअप के प्रारंभिक चरणों से, अगर प्लेटों का उपयोग कर एक जीवनकाल मशीन प्रयोग प्रदर्शन करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल रूपरेखा. एलएसएम की एक विशिष्ट विशेषता यह है कि प्रयास अत्यधिक फ्रंट-लोडेड है, जिसका अर्थ है कि शोधकर्ता का अधिकांश समय प्रयोगात्मक सेटअप के दौरान और कुछ हद तक, पोस्ट-इमेज अधिग्रहण के दौरान खर्च किया जाता है। डेटा संग्रह प्रयोग की पूरी अवधि के लिए पूरी तरह से स्वचालित है और शोधकर्ता को "हाथों से मुक्त" अनुभव करने की अनुमति देता है। यहाँ वर्णित चरणों अस्तित्व assays के कई अलग प्रकार के बीच आम में आयोजित कर रहे हैं - एक ही प्रयोगात्मक सेटअप जीवन काल, thermotolerance, oxidative तनाव, और रोगजनन assays के लिए किया जाता है. प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में, हम विश्लेषण पाइपलाइन की प्रभावशीलता का वर्णन करने और छवि विश्लेषण²³ के दौरान सबसे महत्वपूर्ण चरणों को उजागर करने के लिए हाल ही में प्रकाशित पांडुलिपि से डेटा के एक सबसेट पर चर्चा करते हैं।

Protocol

1. सॉफ्टवेयर और हार्डवेयर आवश्यकताएँ

1. फ्लैटबेड स्कैनर: सिद्धांत रूप में, एलएसएम को विभिन्न इमेजिंग उपकरणों का उपयोग करके लागू किया जा सकता है। स्कैनर संशोधनों और ध्यान केंद्रित करने के लिए विस्तृत निर्देश¹³ कहीं और उपलब्ध हैं. एलएसएम हार्डवेयर पूरक चित्रा 1 में दिखाया गया है।
2. डेटा विश्लेषण उपकरण: एलएसएम सॉफ्टवेयर में तीन इंटरैक्टिंग घटक होते हैं: एक लिनक्स-आधारित स्कैनर नियंत्रण सॉफ्टवेयर पैकेज, एक वेब-ब्राउज़र-आधारित मेटाडेटा प्रबंधन पैकेज और एक विंडोज और लिनक्स क्लाइंट छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज। GitHub रिपॉजिटरी (https://github.com/nstroustrup/lifespan) पर प्रकाशित सॉफ़्टवेयर टूल इंस्टॉल करने के निर्देशों का संदर्भ लें।
3. डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और सत्यापन सॉफ़्टवेयर: प्रयोगों को शेड्यूल करने, छवि विश्लेषण को मान्य करने, नेमाटोड आंदोलन के मैन्युअल एनोटेशन करने और उत्तरजीविता डेटा आउटपुट करने के लिए वर्म ब्राउज़र, क्लाइंट प्रोग्राम का उपयोग करें। विंडोज 7, विंडोज 8 और विंडोज 10 पर वर्म ब्राउज़र के लिए बाइनरी निष्पादन योग्य प्रदान किए जाते हैं, और वर्म ब्राउज़र को लिनक्स या ऐप्पल आईओएस पर स्रोत कोड से संकलित किया जाता है। ऊपर बताए गए GitHub रिपॉजिटरी पर एक इंस्टॉलेशन गाइड उपलब्ध है।

अनुपूरक चित्रा 1: जीवनकाल मशीन हार्डवेयर। भरी हुई प्लेटों को दिखाने के लिए एक खुले ढक्कन के साथ एक फ्लैटबेड स्कैनर इकाई, जिसे रबर की चटाई पर कटे हुए 16 उद्घाटन में नीचे की ओर रखा जाता है। रबर की चटाई को ग्लास स्कैनर की सतह पर रखा गया है। छवि विश्लेषण के दौरान मुद्दों से बचने के लिए प्लेटों के किनारों पर शर्तों के लिए लेबल लिखे गए हैं। नंबर ("1") और/या डिवाइस के नाम ("जब्बा") के साथ टेप को चिह्नित करना कई स्कैनर उपकरणों के साथ काम करते समय नमूना स्थान के बाद के सत्यापन की सुविधा प्रदान करता है। एलएसएम हार्डवेयर घटकों के बारे में अधिक जानकारी^{कहीं और 13} पाई जाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. प्रयोग के दिन से पहले सेटअप करें

1. इनक्यूबेटर का तापमान अंशांकन: पर्यावरण तापमान सी का एक प्रमुख निर्धारक है। एलिगेंस का जीवनकाल¹⁹. सटीक परिणाम का उत्पादन करने के लिए, एक ध्यान से calibrated तापमान पर छवि अधिग्रहण प्रदर्शन, प्रयोग भर में स्थिर रखा. इसे पूरा करने के लिए, प्रयोग की शुरुआत से कुछ दिन पहले, ऑपरेशन के दौरान प्रत्येक स्कैनर की सतह के तापमान को मापें और जांचें। उच्च-परिशुद्धता थर्मोकपल का उपयोग करें जैसा कि कहीं और वर्णित^{है 31} ( सामग्री की तालिका देखें)।
2. स्कैनर प्लेट लेआउट: प्रयोग की शुरुआत से पहले, प्रत्येक स्कैनर के लिए संस्कृति प्लेटों के इष्टतम लेआउट की योजना.
   नोट: इसका उद्देश्य स्कैनर के बीच और प्रत्येक स्कैनर की सतह पर तापमान भिन्नता के परिणामस्वरूप भ्रमित कारकों की शुरूआत से बचना है। स्कैनर उनके औसत सतह के तापमान में सूक्ष्म रूप से भिन्न होते हैं और इसके अलावा, उनकी सतह³¹ में सूक्ष्म तापमान पूर्वाग्रहों का प्रदर्शन करते हैं।
   1. स्कैनर प्लेट की स्थिति: बाद के डेटा विश्लेषण में इन थर्मल प्रभावों को नियंत्रित करने के लिए, स्कैनर स्थिति के संबंध में किसी भी जैविक सहसंयोजकों को यादृच्छिक करें, और सभी स्कैनर में प्लेट स्थान को मानकीकृत करें।
   2. स्कैनर में नमूनों की संख्या: 16 रबर मैट लेआउट ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करते समय, प्रत्येक स्कैनर में प्रति स्थिति चार प्लेटें रखें, जिसमें कुल कम से कम चार स्कैनर हों। यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक हालत स्कैनर तापमान के भ्रमित प्रभाव की पहचान की और डेटा^{विश्लेषण 13} के दौरान हटाया जा सकता है जैसे कि कई स्कैनर, भर में वितरित किया जाता है. इस विश्लेषण को और अधिक सरल बनाने के लिए, प्रत्येक स्कैनर पर एक साझा संदर्भ स्थिति (जैसे, जंगली प्रकार के नमूने) शामिल करें।
      नोट: सामान्य तौर पर, स्कैनर प्रशंसकों की नियुक्ति के कारण, रबर चटाई के ऊपरी-दाएं कोने पर प्लेटें desiccation के लिए अधिक प्रवण हैं। यदि आवश्यक हो तो इस स्थान को खाली छोड़ दें।
3. प्लेट्स और नमूना तैयार करना
   1. संस्कृति प्लेटों का डालना: स्कैनर संस्कृति प्लेटों ( सामग्री की तालिकादेखें) के इष्टतम सुखाने के लिए, नेमाटोड लोड करने से पहले 4 दिनों के लिए अगर मध्यम डालना. हालांकि स्कैनर फोकस प्लेटों में जोड़े जाने के लिए अगर के विभिन्न संस्करणों के लिए अनुमति देने के लिए समायोज्य है, मानक प्लेट की मात्रा 8 एमएल है।
      नोट: यह एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के साथ प्लेटें डालना उपयोगी हो सकता है, विशेष रूप से बड़े प्रयोगों के लिए.
   2. प्लेटों का बीजारोपण: उचित सुखाने और बैक्टीरियल लॉन के विकास के लिए अनुमति देने के लिए प्रयोग की शुरुआत से कम से कम 2 दिन पहले वांछित जीवाणु संस्कृति के साथ प्लेटों बीज। आमतौर पर, बैक्टीरियल कल्चर का 200 माइक्रोन एक लॉन बनाने के लिए पर्याप्त होता है जो कई हफ्तों तक 40 नेमाटोड खिलाएगा।
      नोट: आमतौर पर इमेजिंग के लिए उपयोग की जाने वाली प्लेटें मानक संस्कृति पेट्री व्यंजन की तुलना में अधिक कसकर सील कर दी जाती हैं; इसलिए, यह बीज और एक प्रयोगशाला हुड के अंदर प्लेटों सूखी करने के लिए सलाह दी है, आमतौर पर के बारे में 1 घंटे के लिए या ठीक से सूख जब तक.
4. सूत्रकृमि हैंडलिंग
   1. जनसंख्या का आकार: नेमाटोड की संख्या जिसे एक प्लेट पर मज़बूती से इमेज किया जा सकता है, जीनोटाइप पर निर्भर करता है, जिस उम्र में नेमाटोड चढ़ाया जाता है, और प्रत्येक प्लेट में जोड़े गए भोजन की मात्रा। प्रारंभिक वयस्कता में शुरू होने वाले जीवनकाल प्रयोगों के लिए, प्लेट प्रति लगभग 40 जानवरों को लोड करें। यह संख्या पर्याप्त भोजन सुनिश्चित करती है और भीड़ से बचती है।
   2. बढ़ती बड़ी आबादी: जनसंख्या विस्तार और सिंक्रनाइज़ेशन की तैयारी के लिए, चुने हुए सिंक्रनाइज़ेशन विधि (नीचे देखें) के लिए उपयुक्त नेमाटोड की आबादी से शुरू करें। अधिकतम अंडे के उत्पादन की उम्र में जानवरों पर सिंक्रनाइज़ेशन करने का लक्ष्य रखें, जो जंगली प्रकार के एन 2 जानवरों के लिए वयस्कता³² का दिन 2 है।
      नोट: वयस्कता के दूसरे दिन जानवरों का उपयोग करके आबादी को सिंक्रनाइज़ करने का एक अन्य कारण जनसंख्या विषमता के लिए योगदान कारक के रूप में मातृ आयु को हटाना है। सी में मातृ आयु। एलिगेंस को संतान में कई फिटनेस लक्षणों को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, दिन 2 जंगली प्रकार के जानवरों के साथ "उच्चतम गुणवत्ता" संतान³³ का उत्पादन करते हैं।
   3. आयु-सिंक्रनाइज़ेशन करना: सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए, जानवरों की उम्र को यथासंभव सटीक रूप से सिंक्रनाइज़ करें। इस प्रोटोकॉल में, उम्र तुल्यकालन एक संशोधित हाइपोक्लोराइट उपचार³⁴ का उपयोग कर किया जाता है. अन्य तरीकों में अंडे के ले-ऑफ द्वारा, एल 1 लार्वा गिरफ्तारी द्वारा, या मैन्युअल रूप से एल 4 लार्वा उठाकर सिंक्रनाइज़ेशन शामिल हो सकता है।
      नोट: हाइपोक्लोराइट उपचार द्वारा आयु सिंक्रनाइज़ेशन के लिए, प्रत्येक वयस्क हेर्मैफ्रोडाइट से तीन से चार अंडे प्राप्त करने की अपेक्षा करें।
   4. संतान मुक्त आबादी को बनाए रखना: L4 चरण के अंत में 5-फ्लोरो-2'-डीऑक्सीयूरिडीन (FUdR)³⁵ के दौरान नेमाटोड को उजागर करके संतान मुक्त आबादी बनाए रखें।
      नोट: कम खुराक पर, एफयूडीआर जर्मलाइन में मैक्रोस्कोपिक रूप से दिखाई देने वाले परिवर्तनों का उत्पादन किए बिना या ओओसाइट उत्पादन की दर को बदलने के बिना भ्रूण विकसित करने के लिए घातक है। अन्य तरीकों में तापमान-बाँझ म्यूटेंट का उपयोग करना, आरएनएआई निर्माणों को स्टरलाइज़ करना या इमेजिंग के लिए प्लेटों पर नेमाटोड को स्थानांतरित करने के लिए पोस्ट-प्रजनन जीर्णता तक प्रतीक्षा करना शामिल है।
   5. आबादी को स्थानांतरित करना: प्लेटों के बीच हजारों जानवरों को स्थानांतरित करते समय, प्लैटिनम / इरिडियम तार से जुड़े मानक प्रोटोकॉल श्रमसाध्य हो जाते हैं। नेमाटोड के तरल निलंबन से जुड़े तरीके स्थानान्तरण की सुविधा प्रदान करते हैं और उन्हें अधिक कुशल बनाते हैं। एम 9 + एमजी बफर (ना₂एचपीओ₄ 42.27 मिमी, केएच₂पीओ₄ 22.05 मिमी, एनएसीएल 85.56 मिमी, एमजीएसओ₄ 1 मिमी) के साथ नेमाटोड लीजिए, नेमाटोड गुरुत्वाकर्षण द्वारा व्यवस्थित होने के बाद कुल मात्रा को कम करें, और फिर जल्दी से नेमाटोड को इमेजिंग के लिए उपयोग की जाने वाली प्लेटों में स्थानांतरित करें।
      नोट: तरल निलंबन द्वारा नेमाटोड स्थानांतरित प्रत्येक थाली को स्थानांतरित जानवरों की संख्या में भिन्नता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता से बचने के लिए प्रत्येक प्लेट पर नेमाटोड की संख्या के अनुरूप होने की कोशिश करें।
   6. हस्तक्षेप लागू करना: एक प्रयोग के दौरान छवि अधिग्रहण को रोकना और पुनरारंभ करना छवि विश्लेषण को जटिल बनाता है (चर्चा देखें)। इसलिए, सभी आवश्यक सूत्रकृमि हैंडलिंग पूरा होने के बाद ही एलएसएम प्रयोगों को शुरू करें।
5. रबर मैट को स्टरलाइज़ करना: एक साथ बड़ी संख्या में मैट को स्वचालित करें, व्यक्तिगत रूप से उन्हें एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटकर।
   नोट: रबर मैट को फंगल या बैक्टीरियल दूषित पदार्थों के निर्माण से बचने के लिए उपयोग के बीच निष्फल किया जाना चाहिए। आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले अधिकांश प्रकार के रबर आक्रामक इथेनॉल उपचार द्वारा अपमानित होते हैं।

3. प्रयोग के दिन सेटअप

1. प्लेट समर्थन और स्कैनर ग्लास तैयारी: प्लेट हैंडलिंग को सरल बनाने के लिए, स्कैनर सतह पर सीधे पेट्री व्यंजन लोड नहीं है, लेकिन बजाय कांच के पैन ( सामग्री की तालिकादेखें) द्वारा समर्थित रबर मैट का उपयोग कर उन्हें जगह में पकड़. आबादी को इस ग्लास के माध्यम से चित्रित किया जाता है, इसलिए ग्लास को साफ रखें और एंटी-फॉग, हाइड्रोफोबिक और स्टरलाइज़िंग कोटिंग के साथ इलाज करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
   1. इनक्यूबेटर में प्लेटों को लोड करने से पहले, एंटी-फॉग ग्लास क्लीनर के साथ दोनों तरफ प्लेट सपोर्ट ग्लास की सतह को साफ करें।
   2. प्लेटों को उनके समर्थन ग्लास पर लोड करने से पहले, ग्लास के किनारे फॉगिंग को कम करने के लिए एक सुरक्षात्मक हाइड्रोफोबिक ग्लास उपचार ( सामग्री की तालिकादेखें) लागू करें जो रबर की चटाई के संपर्क में होगा। इस उपचार को अच्छी तरह से फैलाएं, और अगले चरण पर आगे बढ़ने से पहले इसे 5-10 मिनट के लिए कांच पर छोड़ दें। किसी भी अवशेष को हटाने के लिए आवेदन के बाद सख्ती से साफ करें।
   3. कांच की सतह कीटाणुरहित करने के लिए 70% इथेनॉल लागू करें जो रबर मैट के संपर्क में होगा। 1 मिनट या 2 मिनट के लिए छोड़ दें, और फिर एक कपड़े या कागज तौलिया के साथ हटा दें।
2. स्कैनर पर प्लेटों को लोड करना
   1. सबसे पहले, ऑटोक्लेव्ड रबर मैट को ट्रीटेड प्लेट सपोर्ट ग्लास के ऊपर रखें।
   2. लोड नेमाटोड के साथ इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया प्लेटों से ढक्कन निकालें, और कांच की सतह का सामना करना पड़ रबर चटाई स्थानों पर उन्हें जगह है. सुनिश्चित करें कि रबर की चटाई सभी प्लेटों के चारों ओर कसकर सील कर दी गई है, उदाहरण के लिए, शीर्ष पर एक और ग्लास शीट जोड़कर और यह सुनिश्चित करके कि यह सपाट है या प्रत्येक प्लेट के शीर्ष पर टैप करके (ढीली प्लेटें थोड़ी आगे बढ़ेंगी और कांच से टकराएंगी, जिससे आवाज आएगी, जबकि टैप किए जाने पर कसकर सुरक्षित प्लेटें नहीं चलेंगी)।
      नोट: प्लेट सामग्री और इच्छित स्कैनर के बारे में जानकारी के साथ अंकन टेप के साथ प्लेट समर्थन ग्लास की प्रत्येक शीट को व्यक्तिगत रूप से लेबल करना उपयोगी है। इस डेटा का उपयोग प्रयोग के बाद प्लेट स्थानों के बारे में किसी भी संभावित अस्पष्टता को हल करने के लिए किया जा सकता है।
   3. स्कैनर में प्लेटों लोड करने से पहले, प्लेट लोड हो रहा है के दौरान प्रयोगकर्ता की उंगलियों की रक्षा के लिए स्कैनर प्रशंसकों अनप्लग करें.
   4. धीरे प्लेटों और उन्हें स्कैनर की सतह पर समर्थन कांच की चादर स्लाइड.
      नोट: रबर की चटाई पर सीधे दबाव डालने से बचें, क्योंकि इससे चटाई प्लेट सपोर्ट ग्लास के पार स्लाइड हो जाती है। जब मैट स्लाइड करते हैं, तो प्लेटें अक्सर चटाई से ढीली हो जाती हैं।
   5. स्कैनर प्रशंसकों को पुनः सक्रिय करें, और नेत्रहीन पुष्टि करें कि सामने और साइड के पंखे संचालित हैं। यदि स्कैनर बंद हैं, तो उन्हें इस बिंदु पर चालू करें।

4. पूर्व छवि अधिग्रहण

नोट: छवि अधिग्रहण के दौरान सभी सॉफ़्टवेयर-आधारित चरणों को सारांशित करने वाला एक व्यापक फ़्लोचार्ट चित्र 1में दर्शाया गया है।

चित्र 1: लाइफस्पैन मशीन छवि विश्लेषण पाइपलाइन का चित्रमय अवलोकन। पूर्व-, दौरान, और बाद छवि अधिग्रहण कदम काफी हद तक वेब इंटरफेस (WI, लाल रंग में) और वर्म ब्राउज़र (WB, हरे रंग में) पर किए जाते हैं। कुछ चरणों को अन्य प्लेटफार्मों (O, नीले रंग में) में किया जाता है, जैसे चरण 3a में TXT दस्तावेज़, चरण 4b में फ़ोटोशॉप या समकक्ष, और चरण 13 में JMP या समकक्ष। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1. छवि अधिग्रहण सेटअप: एक फ़ाइल उत्पन्न करें जो छवि अधिग्रहण को कॉन्फ़िगर करने के लिए प्रयोग अनुसूची और प्रत्येक स्कैनर पर प्लेटों के स्थान को निर्दिष्ट करती है।
   नोट: इस फ़ाइल में महत्वपूर्ण मेटाडेटा शामिल है जैसे प्रयोग का शीर्षक, छवि कैप्चर की आवृत्ति और प्रयोग की कुल अवधि। सामान्यतया, यह फ़ाइल जनरेट नहीं होती है de novo प्रत्येक प्रयोग के लिए, लेकिन इसके बजाय, पिछले प्रयोगों से प्रयोग फ़ाइलों को टेम्पलेट के रूप में पुन: उपयोग किया जाता है। उपयोगकर्ता के पहले प्रयोग के लिए, एक टेम्पलेट फ़ाइल प्रदान की जाती है (अनुपूरक फ़ाइल 1).
   1. पूर्वावलोकन कैप्चर का अनुरोध करें: प्रत्येक स्कैनर पर सभी प्लेटों का स्थान प्रदान करें। इस प्रक्रिया को तेज करने के लिए कई उपकरण प्रदान किए जाते हैं। सबसे पहले, संपूर्ण स्कैनर सतह की एक छवि प्राप्त करने के लिए स्कैनर का उपयोग करें, जिसे "पूर्वावलोकन कैप्चर" कहा जाता है। सुनिश्चित करें कि पूर्वावलोकन कैप्चर छवियां स्पष्ट रूप से प्रत्येक प्लेट की पूरी सतह को बिना धारियों या प्लेट किनारों की फसल के छवि (चित्रा 2ए) दिखाती हैं।
      1. वेब इंटरफ़ेस का उपयोग करके, मुख्य पृष्ठ का छवि अधिग्रहण अनुभाग ढूंढें, और कैप्चर डिवाइस और इमेज सर्वर नामक लिंक का अनुसरण करें। उस पृष्ठ पर, इमेज कैप्चर और प्रोसेसिंग सर्वर बॉक्स में नए उपकरणों (यानी, स्कैनर) के लिए खोजें चिह्नित बटन पर क्लिक करें। सर्वर के बगल में [लॉग] लिंक पर क्लिक करके स्कैनर का पता लगाने में सर्वर की प्रगति की निगरानी करें।
         नोट: सुनिश्चित करें कि वांछित स्कैनर "चालू" संचालित हैं और इस चरण को करने से पहले सर्वर में प्लग किए गए हैं।
      2. वेब इंटरफ़ेस के एक ही पृष्ठ पर, सुनिश्चित करें कि सर्वर से जुड़ा प्रत्येक स्कैनर इमेज कैप्चर डिवाइस बॉक्स पर दिखाई देता है। "वर्तमान स्थिति" के अंतर्गत एक "अनुपलब्ध" लेबल अब प्रदर्शित नहीं होता है यदि डिवाइस का सफलतापूर्वक पता लगाया जाता है। नव-लोड की गई प्लेटों वाले प्रत्येक स्कैनर के अनुरूप चेकबॉक्स का चयन करें।
      3. इमेज कैप्चर डिवाइसेस सेक्शन में सबसे नीचे, Request Preview Capture बटन पर क्लिक करें। 1 मिनट या 2 मिनट के भीतर, स्कैनर को प्रकाश करना चाहिए और स्कैनिंग शुरू करना चाहिए।
         नोट: ग्लास सपोर्ट शीट की प्रारंभिक स्थिति को अक्सर सभी प्लेटों को देखने योग्य सीमा में लाने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। पूर्वावलोकन कैप्चर छवियों का निरीक्षण करके और प्लेट की स्थिति में समायोजन करके और नई पूर्वावलोकन कैप्चर छवियों को फिर से लेकर पदों को ठीक किया जा सकता है। यदि स्कैन बहुत धीरे-धीरे आगे बढ़ते हैं (एक कैप्चर स्कैन के लिए कई मिनट) या यदि पूर्वावलोकन कैप्चर छवियों में लंबी सफेद धारियाँ होती हैं, तो यह एक संकेत है कि एक प्लेट, रबर की चटाई, या कोई अन्य वस्तु स्कैनर के अंशांकन क्षेत्र के भीतर प्रकाश को अवरुद्ध कर रही है (स्कैनर सतह पर सफेद तीर द्वारा इंगित)। सभी वस्तुओं को इस तरह से स्थानांतरित किया जाना चाहिए कि केवल ग्लास सपोर्ट ग्लास इस क्षेत्र पर कब्जा कर ले।
   2. स्कैन क्षेत्रों को परिभाषित करें: वर्म ब्राउज़र पर अगले चरणों का पालन करने के लिए पूर्वावलोकन कैप्चर छवियों का विश्लेषण करें, और उन्हें एक एकल समग्र छवि में इकट्ठा करें, जिसका उपयोग डेटा विश्लेषण के लिए प्रत्येक प्लेट के स्थान को निर्दिष्ट करने के लिए किया जाता है। सुनिश्चित करें कि परिणामी छवि चित्रा 2 बी के समान दिखती है।
      1. सबसे पहले, वर्म ब्राउज़र का उपयोग करके, मेनू विकल्प फ़ाइल > ओपन इमेज का चयन करके प्रत्येक पूर्वावलोकन कैप्चर छवि खोलें, और वांछित छवि चुनें।
      2. प्रत्येक छवि पर, प्लेटों के साथ क्षेत्रों के लिए कॉलम का चयन करने के लिए क्लिक करें (यदि रबर चटाई 16 प्लेट स्थानों है, 4 कॉलम का चयन करें).
         नोट: स्कैन क्षेत्रों को लंबा कॉलम (चौड़ी पंक्तियां नहीं) के रूप में निर्दिष्ट किया जाना चाहिए क्योंकि स्कैनर कैप्चर व्यापक क्षेत्रों के लिए धीमा है, जिसके परिणामस्वरूप नेमाटोड आंदोलन के कारण धुंधली छवियां होती हैं।
      3. एक बार सभी छवियों को परिभाषित कर रहे हैं, मेनू आइटम का चयन करके डिस्क के लिए क्षेत्र विनिर्देशों निर्यात छवि अधिग्रहण > स्कैन क्षेत्रों को परिभाषित करें > डिस्क के लिए चयनित स्कैन क्षेत्रों को बचाने और वांछित स्थान का चयन.
   3. प्रयोग शेड्यूल जनरेट करें:
      1. पूरक फ़ाइल 1 के प्रारूप के बाद, एक फ़ाइल को इकट्ठा करें जिसमें प्रयोग का नाम, स्कैनर पर प्रत्येक कॉलम के भौतिक स्थान (चरण 4.1.2.3 में उत्पन्न स्कैन क्षेत्रों की फ़ाइल से कॉपी किया गया), प्रयोग की कुल अवधि, और छवि कैप्चर आवृत्ति, और इसे TXT और XML फ़ाइल के रूप में सहेजें।
      2. फिर, वर्म ब्राउज़र पर, इमेज एक्विजिशन > सबमिट एक्सपेरिमेंट शेड्यूल पर क्लिक करें और जेनरेट की गई एक्सएमएल फाइल चुनें। वर्म ब्राउज़र पूछेगा कि शेड्यूल का सारांश आउटपुट करना है या प्रयोग चलाना है। Generate a Summary फाइल पर क्लिक करें।
   4. सारांश फ़ाइल को मान्य करें: प्रयोग अनुसूची सबमिट करने के बाद, वर्म ब्राउज़र शेड्यूल का सारांश आउटपुट करेगा। यह सारांश स्क्रीन पर दिखाया गया है और डिस्क पर लिखा गया है। इसे पढ़ें, और अनुसूचित कैप्चर की तिथियों, साथ ही स्कैनर के स्थान, नाम और संख्या को सत्यापित करें।
   5. प्रयोग अनुसूची सबमिट करें: सारांश फ़ाइल से संतुष्ट होने पर, मेनू विकल्प छवि अधिग्रहण > सबमिट प्रयोग शेड्यूल का चयन करके वर्म ब्राउज़र में प्रयोग अनुसूची के लिए XML फ़ाइल को फिर से लोड करें। वर्म ब्राउज़र दूसरी बार संकेत देगा कि शेड्यूल का सारांश आउटपुट करना है या प्रयोग चलाना है। इस बार रन पर क्लिक करें! .
      नोट: प्रयोग प्रस्तुत करने के कुछ मिनट बाद, यह प्रयोग सफलतापूर्वक प्रस्तुत किया गया है और स्कैन सभी स्कैनर द्वारा एकत्र किया जा रहा है की पुष्टि करने के लिए वेब इंटरफेस का उपयोग करने के लिए बुद्धिमान है. पहले कुछ स्कैन याद किया जा करने के लिए सामान्य है, विशेष रूप से बड़े प्रयोगों में.
   6. वेब इंटरफ़ेस पर प्रयोगों को व्यवस्थित करें: एक व्यस्त स्कैनर क्लस्टर कई अलग-अलग उपयोगकर्ताओं द्वारा एकत्र किए गए सैकड़ों प्रयोगात्मक डेटासेट का उत्पादन कर सकता है। इस सूची को व्यवस्थित करने के लिए, अलग-अलग समूहों को प्रयोग असाइन करें, उदाहरण के लिए प्रयोग के लिए उत्तरदायी उपयोगकर्ता के नाम के अनुरूप.
      1. एक नया समूह बनाएं या किसी मौजूदा को संशोधित करें: छवि प्राप्ति नामक बॉक्स के तहत प्रयोग समूह प्रबंधित करें पर क्लिक करके वेब इंटरफ़ेस पर नए समूह बनाएं। दिखाई देने वाले नए पेज पर, Create New Group पर वांछित नाम जोड़ें और Create पर क्लिक करें। किसी मौजूदा समूह का नाम संशोधित करने के लिए, उसी बॉक्स पर, मौजूदा समूह संशोधित करें के आगे इच्छित समूह चुनें और फिर संशोधित करें का चयन करें.
      2. किसी समूह को प्रयोग असाइन करें: किसी विशिष्ट समूह को नए प्रयोग असाइन करने के लिए, वेब इंटरफ़ेस पर जाएं और वांछित प्रयोग खोजें, जो डिफ़ॉल्ट रूप से प्रयोग सूची के निचले भाग में कोई समूह समूह नहीं होगा. प्रयोग अनुभाग के दाईं ओर दिए गए लिंक पर क्लिक करें जहां यह संपादित करें कहता है, और उपयोग करने के लिए समूह के नाम का चयन करने के लिए ड्रॉप-डाउन सूची का उपयोग करें। फिर, सेव करें चुनें.
   7. प्रयोग रद्द करें:
      नोट: एलएसएम स्वायत्त रूप से काम करना जारी रखेगा जब तक कि अंतिम स्कैन प्रयोग अनुसूची पर निर्दिष्ट नहीं किए जाते। एक प्रयोगात्मक अनुसूची पूरी होने के बाद, एलएसएम डिफ़ॉल्ट रूप से, स्कैन एकत्र करना जारी रखेगा लेकिन तुरंत ऑटोस्कैनिंग नामक प्रक्रिया में छवि डेटा को त्याग देगा। ये ऑटोस्कैन स्कैनर को बंद होने और ठंडा होने से रोकने के लिए किए जाते हैं, और एक मानक तापमान प्रोफ़ाइल बनाए रखते हैं ताकि एक ही स्थान पर चलने वाले किसी भी अन्य प्रयोग (लेकिन एक अलग प्रयोग से) अन्य स्कैनर के बंद होने से प्रभावित न हों।
      1. ऑटोस्कैन रोकें: वेब इंटरफ़ेस पर चल रहे प्रयोग से ऑटोस्कैन को रोकने के लिए, वांछित प्रयोग के बगल में संपादित करें पर क्लिक करें, फिर लंबित स्कैन रद्द करें, और अनुसूचित कैप्चर रद्द करें चुनें।

चित्रा 2: पूर्वावलोकन कैप्चर छवि और स्कैन क्षेत्र चयन। (ए) प्रयोग में प्रत्येक स्कैनर के लिए, एक पूर्वावलोकन कैप्चर छवि उत्पन्न होती है। (बी) एक समय में प्लेटों की एक पंक्ति का चयन (लाल बक्से), जो स्कैनिंग की गति को बढ़ाता है और बहुत व्यापक क्षेत्रों को स्कैन करने के परिणामस्वरूप वर्म मोशन ब्लर को रोकता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. छवि अधिग्रहण

नोट: प्रयोग के चलने के दौरान या समाप्त होने के बाद दोनों चरणों का पालन किया जा सकता है।

1. प्रयोग की मुखौटा फ़ाइल आउटपुट करें: स्कैनर से कच्चे छवि डेटा में कई क्षेत्र होते हैं जिन्हें संसाधित करने की आवश्यकता नहीं होती है (प्लेटों के बाहर के क्षेत्र)। व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक प्लेट पर विश्लेषण ध्यान केंद्रित करने के लिए, एक "मुखौटा" प्रत्येक स्कैनर पर प्रत्येक प्लेट के कब्जे वाले क्षेत्र को निर्दिष्ट करता है कि बनाया जाता है. स्कैनर द्वारा एकत्र छवियों पर एक ओवरले के रूप में प्रत्येक प्लेट की स्थिति ड्राइंग द्वारा इस मुखौटा उत्पन्न करें.
   1. वर्म ब्राउज़र का उपयोग करके, फ़ाइल का चयन करके वांछित प्रयोग चुनें > वर्तमान प्रयोग का चयन करें, और फिर प्रयोग के नाम पर क्लिक करें।
   2. फिर वर्म ब्राउज़र पर, छवि अधिग्रहण का चयन करें > नमूना मास्क को परिभाषित करें > प्रयोग मास्क समग्र उत्पन्न करें, और वांछित स्थान में मुखौटा को बचाने के लिए. सुनिश्चित करें कि परिणामी फ़ाइल चित्रा 3 ए के समान दिखती है।

चित्रा 3: नमूना मास्क का उपयोग कर प्रत्येक स्कैनर के लिए प्लेट स्थानों की विशिष्टता. चित्रा 1 में दिखाया स्तंभ चयन के भीतर प्लेटों के स्वतंत्र विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए, व्यक्तिगत प्लेटों एक छवि मुखौटा समग्र उत्पन्न करके की पहचान की जानी चाहिए. (ए) स्कैनर के स्कैन का एक कैप्चर एक छवि हेरफेर सॉफ्टवेयर के साथ खोला जाता है (स्कैन किए गए चयन के ऊपर स्कैनर "हान" का नाम नोट करें, और प्रत्येक कॉलम का जिक्र करते हुए "ए-डी")। (बी) मुखौटा समग्र में प्रत्येक प्लेट के स्थान को चिह्नित करने के लिए मुखौटा पीढ़ी के अलग-अलग कदम पृष्ठभूमि काले करने के लिए सेट करने की आवश्यकता है, (सी) दांतेदार किनारों और गैर चयनित प्लेटों के किनारों को हटाने विस्तार और फिर पृष्ठभूमि के सिकुड़ने, और (डी) अग्रभूमि प्लेटों का चयन और सफेद पिक्सल के साथ पूरी तरह से क्षेत्रों को भरने. (ई) एलएसएम के लिए स्कैन की गई पंक्तियों में अलग-अलग प्लेटों को पहचानने के लिए, एक पंक्ति में प्रत्येक सफेद क्षेत्र ग्रे की एक अलग छाया से भरा होता है, आमतौर पर बढ़ती चमक में। (एफ) इस स्तर पर, मुखौटा सहेजा जाता है (फ़ोटोशॉप में उत्पन्न होने पर निर्दिष्ट परतों के साथ एलजेडडब्ल्यू संपीड़न)। मास्क को तब वर्म ब्राउज़र द्वारा स्कैन किया जाता है, और सॉफ़्टवेयर द्वारा मास्क का एक विज़ुअलाइज़ेशन उत्पन्न होता है। एक सही मुखौटा दृश्य केंद्र में एक छोटे से पार और प्रत्येक पंक्ति के लिए एक अलग रंग के साथ प्लेट प्रति एक परिभाषित वर्ग प्रदर्शित करना चाहिए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. प्रयोग के मुखौटे को एनोटेट करें: छवि में प्रत्येक प्लेट के स्थान को चिह्नित करने के लिए छवि हेरफेर कार्यक्रम (जैसे फ़ोटोशॉप या जीआईएमपी) के साथ पिछले चरण में उत्पन्न फ़ाइल खोलें। फ़ोटोशॉप का उपयोग करके सभी मुखौटा-संपादन चरणों का अवलोकन नीचे वर्णित है।
   1. फ़ोटोशॉप में, शून्य पर सेट सहिष्णुता के साथ भरण टूल का चयन करें, सन्निहित विकल्प चयनित, और एंटी-अलियासिंग अचयनित। इसे पूरी तरह से काले रंग में सेट करने के लिए ग्रे पृष्ठभूमि पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि परिणामी छवि चित्रा 3 बी के समान दिखती है।
   2. काली पृष्ठभूमि का चयन करने के लिए जादू की छड़ी उपकरण का उपयोग करें, एलियासिंग को बंद करने के लिए, सहिष्णुता शून्य पर सेट है, और सन्निहित विकल्प चयनित है। किनारों को चिकना करने के लिए, Select > Modify > Expand पर क्लिक करके चयनित पृष्ठभूमि को 30 पिक्सेल तक विस्तृत करें। फिर, चयन को 20 पिक्सेल से छोटा करें > अनुबंध को संशोधित करें > चुनें. सुनिश्चित करें कि परिणामी छवि चित्रा 3 सी के समान दिखती है।
   3. चिकनी पृष्ठभूमि को पूरी तरह से काले पिक्सेल से भरें, उदाहरण के लिए, फिल टूल टॉलरेंस को 255 पर सेट करके और चयनित क्षेत्र को भरकर। फिर, चयन को उलटने >के लिए व्युत्क्रम चुनें पर क्लिक करें और अग्रभूमि का चयन करें। नए क्षेत्र को पूरी तरह से सफेद पिक्सेल से भरें, उदाहरण के लिए, भरण उपकरण सहिष्णुता को 255 पर सेट करके और क्षेत्र को सफेद रंग से भरकर। सुनिश्चित करें कि परिणामी छवि चित्रा 3 डी के समान दिखती है।
   4. एक ही क्षेत्र के अंदर प्रत्येक प्लेट को अलग करने के लिए, बढ़ती चमक में ग्रे की एक अलग ढाल के साथ प्रत्येक पंक्ति भरें. यह भरण उपकरण के साथ किया जा सकता है और फिर वांछित रंग का चयन करके, सहिष्णुता 0 पर सेट के साथ। सुनिश्चित करें कि परिणामी छवि चित्रा 3E के समान दिखती है। इसे एक LZW संपीड़न में सहेजें जिसमें कोई "परतें" निर्दिष्ट नहीं है।
      नोट: प्लेटों का क्रम निर्दिष्ट क्षेत्रों के रंग से निर्धारित होता है। प्लेटों को ऊपर से नीचे के क्रम में 1-4 नाम देने के लिए, प्रत्येक पंक्ति के लिए बढ़ती चमक में रंग निर्दिष्ट करें।
   5. वर्म ब्राउज़र पर, छवि अधिग्रहण > नमूना मास्क परिभाषित करें > प्रयोग मास्क समग्र पर खींचे गए प्लेट स्थानों का विश्लेषण करें, और पिछले चरण में उत्पन्न फ़ाइल का चयन करें। सॉफ्टवेयर अब प्रस्तुत मुखौटा का विश्लेषण करने के लिए कुछ क्षणों का समय लगेगा.
   6. वर्म ब्राउज़र एक मुखौटा दृश्य प्रदर्शित करेगा. फ़ाइल में संभावित त्रुटियों के लिए मास्क का निरीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि प्लेटों की प्रत्येक पंक्ति एक अलग रंग से भरी हुई है और एक रंगीन आयत द्वारा उल्लिखित है। सुनिश्चित करें कि परिणामी छवि चित्रा 3 एफ के समान दिखती है।
      नोट: यदि एक एकल प्लेट दो वृत्त या अधिक दिखाता है, या यदि दो वृत्त समान रंग साझा करते हैं, तो मास्क फ़ाइल को सही करने के लिए चरण 5.2 पर वापस जाएँ, और इसे फिर से वर्म ब्राउज़र में लोड करें।
   7. मास्क दृश्य सही है कि सत्यापित करने के बाद, वर्म ब्राउज़र पर, छवि अधिग्रहण का चयन करें > नमूना मास्क परिभाषित करें > क्लस्टर के लिए विश्लेषण प्रयोग मास्क समग्र सबमिट करें. छवि विश्लेषण सर्वर अब प्रयोग में सभी प्लेटों के स्थान का विश्लेषण करेगा।
3. मास्क लगाएं: एलएसएम कच्चे छवि डेटा को अलग-अलग प्लेटों में विभाजित करने के लिए मास्क का उपयोग करता है। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, वेब इंटरफ़ेस का उपयोग करके मास्क एप्लिकेशन कार्य शेड्यूल करें।
   1. नौकरी जमा करने से पहले, सत्यापित करें कि सभी स्कैनर ने मास्क में क्षेत्रों की पहचान की है। वेब इंटरफ़ेस के मुख्य पृष्ठ पर जाएं, प्रयोग का नाम और छवि विश्लेषण नामक कॉलम का पता लगाएं, और रन एनालिसिस पर क्लिक करें। सत्यापित करें कि प्रयोग नमूने के तहत सभी उपकरणों की पहचान क्षेत्रों है.
   2. मास्क लगाने के लिए, उसी इंटरफ़ेस पर, New Job for All Samples पर क्लिक करें। व्यक्तिगत छवियों के लिए कार्य शेड्यूल करें नाम के बॉक्स पर, मास्क लागू करें और फिर कार्य सहेजें बॉक्स का चयन करें.
      नोट: मुखौटा पहले से कैप्चर की गई सभी छवियों के साथ-साथ भविष्य में कैप्चर की गई किसी भी छवि पर लागू किया जाएगा।
4. प्लेट गुणवत्ता नियंत्रण करें:
   नोट: छवि विश्लेषण के इस चरण में संदूषण, निर्जलीकरण, या फॉगिंग से पीड़ित प्लेटों को सेंसर किया जाता है। दूषित, सूखा, कोहरे और इष्टतम प्लेटों का एक उदाहरण चित्र 4में दिखाया गया है। सेंसर करने के अन्य कारणों में भुखमरी, खाली प्लेटें या बाँझ आबादी में लार्वा शामिल हैं। अमान्य प्लेटों में अक्सर जटिल आकार होते हैं जिन्हें मशीन का उद्देश्य नेमाटोड के रूप में व्याख्या करना है। छवि विश्लेषण के बाद के चरणों में लंबे प्रसंस्करण समय को रोकने के लिए इस चरण में अमान्य प्लेटों को बाहर करना महत्वपूर्ण है।
   1. वेब इंटरफ़ेस का उपयोग करके, वांछित प्रयोग और एनोटेट प्लेट सूचना नामक कॉलम ढूंढकर और छवि द्वारा चयन करके सेंसर की जाने वाली प्लेटों को बाहर करें।
   2. प्लेटों का निरीक्षण करने के लिए, प्रदर्शन छवियों पर क्लिक करें।
      नोट:: छवियाँ प्रदर्शित करने के लिए चरण ठीक से काम नहीं कर रहा है, तो Linux सर्वर ठीक से कॉन्फ़िगर नहीं किया जा सकता है। ऐसा करने के निर्देश उपरोक्त GitHub रिपॉजिटरी में सॉफ़्टवेयर इंस्टॉलेशन गाइड में उपलब्ध हैं।
   3. प्लेटों को बाहर करने के लिए, बॉक्स चिह्न सेंसर को चेक करें, कारण सेंसर नामक ड्रॉप-डाउन बॉक्स पर एक विकल्प चुनें, और फिर प्रत्येक पृष्ठ के लिए सहेजें पर क्लिक करें।
5. मेटाडेटा जानकारी जोड़ें: मेटाडेटा एक प्रयोग में प्रत्येक प्लेट की सामग्री का वर्णन करता है। यह जानकारी तब बाद में उत्पन्न सभी सांख्यिकीय डेटा फ़ाइलों में शामिल की जाती है।
   1. तनाव, जीनोटाइप, तापमान, भोजन, आदि के सापेक्ष मेटाडेटा जानकारी जोड़ने के लिए, वेब इंटरफ़ेस के मुख्य पृष्ठ पर जाएं, वांछित प्रयोग और एनोटेट प्लेट जानकारी नामक कॉलम ढूंढें, और स्थिति द्वारा चुनें।
   2. लेबल दर्ज करें, और उन स्कैनर का चयन करें जिनके लिए नीचे-बाएँ कोने में Save To Devices पर क्लिक करके मेटाडेटा को सहेजना है।
   3. सभी लेबलों को फिर से दर्ज किए बिना विभिन्न स्कैनर के बीच मेटाडेटा का पुन: उपयोग करने के लिए, ऊपरी-दाएं कोने में डिवाइस से लोड पर जाएं, उस स्कैनर का चयन करें जिससे मेटाडेटा का पुन: उपयोग करना है, और लोड फ्रॉम डिवाइस पर क्लिक करें।
6. "शून्य-आयु" समय निर्दिष्ट करें: डिफ़ॉल्ट रूप से, एलएसएम यूनिक्स युग की शुरुआत के संबंध में समय को मापता है। यह शायद ही कभी सुविधाजनक होता है, इसलिए संदर्भ समय के विनिर्देश की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, वह तारीख जिस पर सभी व्यक्तियों ने रचा या वयस्कता तक पहुंच गया)।
   1. शून्य-आयु समय की जानकारी निर्दिष्ट करने के लिए, वेब इंटरफ़ेस के मुख्य पृष्ठ पर जाएं, वांछित प्रयोग और छवि विश्लेषण नामक कॉलम ढूंढें, और विश्लेषण चलाएं चुनें।
   2. दिखाई देने वाले नए पृष्ठ पर, सभी क्षेत्रों के लिए नई नौकरी का चयन करें। अद्यतन क्षेत्र जानकारी नाम के बॉक्स में, वह समय चुनें जिस पर जानवरों की 0 आयु थी, जानकारी जोड़ें, और फिर चयनित फ़ील्ड अपडेट करें पर क्लिक करें।
      नोट: यदि सभी जानवर एक ही शून्य-आयु समय साझा नहीं करते हैं, तो विशिष्ट पशु प्रकारों के लिए नई नौकरी के बजाय चयन करें, और प्रत्येक समूह के लिए ऊपर दिए गए चरणों को दोहराएं।
7. कृमि का पता लगाने का अनुसूची: एलएसएम प्लेट पर अपनी स्थिति के आधार पर प्रत्येक नेमाटोड का पता लगाने को स्वचालित कर सकता है।
   1. प्रत्येक छवि के लिए नेमाटोड का स्वचालित पता लगाने शुरू करने के लिए, वेब इंटरफ़ेस के मुख्य पृष्ठ पर जाएं, वांछित प्रयोग और छवि विश्लेषण नामक कॉलम ढूंढें, और विश्लेषण चलाएं चुनें।
   2. दिखाई देने वाले नए पृष्ठ पर, सभी क्षेत्रों के लिए नई नौकरी पर क्लिक करें, फिर व्यक्तिगत छवियों के लिए अनुसूची एक नौकरी नाम के बॉक्स पर, और बॉक्स का चयन करें माध्यिका फ़िल्टर > थ्रेसहोल्ड > वर्म डिटेक्शन > सेव जॉब। ये नौकरियां कैप्चर की गई सभी अतीत और भविष्य की छवियों पर लागू होंगी।
      नोट: केवल एक विशिष्ट तनाव या स्थिति के लिए एक नौकरी शेड्यूल करने के लिए, विशिष्ट पशु प्रकारों के लिए नौकरियां पर इसके बजाय क्लिक करें। ऑब्जेक्ट वर्गीकरण एसवीएम मॉडल का उपयोग करके किया जाता है जो एलएसएम की दीर्घकालिक भंडारण निर्देशिका के मॉडल सबफ़ोल्डर में संग्रहीत फ़ाइलों के रूप में निर्दिष्ट होते हैं। LSM के लिए V2.0 नेमाटोड डिटेक्शन पैरामीटर सेट को GitHub रिपॉजिटरी से डाउनलोड किया जा सकता है।

चित्रा 4: वेब इंटरफ़ेस का उपयोग करके प्लेट गुणवत्ता नियंत्रण। वर्म मूवमेंट विश्लेषण से पहले वेब इंटरफेस पर सबऑप्टिमल प्लेटों को सेंसर करना इमेज प्रोसेसिंग पाइपलाइन को तेज करने के लिए महत्वपूर्ण है। हटाने के अधीन प्लेटों के उदाहरणों में (ए) निर्जलीकरण, (बी) संदूषण, या (सी) फॉगिंग की स्थितियां शामिल हैं, जैसा कि विरोध किया गया है। (डी) इष्टतम प्लेटों को आगे के विश्लेषण में शामिल किया जाना है। 10 मिमी का एक स्केल बार एक पूर्वावलोकन कैप्चर छवि पर आरोपित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

6. छवि अधिग्रहण के बाद

नोट: वर्म डिटेक्शन पूरा होने के बाद, प्रयोग से एकत्र किए गए सभी डेटा को प्रत्येक व्यक्ति को उनके जीवनकाल में ट्रैक करने और सभी व्यक्तियों की मृत्यु के समय की पहचान करने के लिए समय के साथ एकत्रित किया जाना चाहिए। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक प्रयोग में सभी जानवरों की मृत्यु हो गई है और जब तक सभी कृमि का पता लगाने का काम पूरा नहीं हो जाता है, और उसके बाद निम्न चरणों का पालन करें:

1. आंदोलन विश्लेषण अनुसूची:
   1. आंदोलन विश्लेषण मृत्यु के समय का अनुमान लगाने के लिए समय के साथ सभी प्रयोगात्मक डेटा को एकीकृत करता है। इस काम को शुरू करने के लिए, वेब इंटरफ़ेस के मुख्य पृष्ठ पर जाएं, और छवि विश्लेषण नामक कॉलम में वांछित प्रयोग खोजें। विश्लेषण चलाएँ लिंक का चयन करें.
   2. दिखाई देने वाले नए पृष्ठ पर, लिंक पर क्लिक करें सभी क्षेत्रों के लिए नई नौकरी, और पुल-डाउन मेनू से, एक संपूर्ण क्षेत्र के लिए एक नौकरी अनुसूची, वर्म मूवमेंट का विश्लेषण करें का चयन करें, और बटन पर क्लिक करें नौकरी बचाओ.
   3. एलएसएम छवि अधिग्रहण सर्वर स्वचालित रूप से सभी प्लेटों में आंदोलन का विश्लेषण करना शुरू कर देगा।
      नोट: आंदोलन विश्लेषण एकल सबसे बड़ा काम है। एक आधुनिक मल्टी कोर प्रोसेसर पर, एक 1 महीने लंबे जीवनकाल प्रयोग से प्रत्येक थाली के विश्लेषण 20 मिनट या अधिक ले जा सकते हैं.
2. स्टोरीबोर्ड उत्पन्न करें: आंदोलन विश्लेषण पूरा होने के बाद, एलएसएम स्टोरीबोर्ड उपयोगकर्ताओं को स्वचालित परिणामों को मैन्युअल रूप से मान्य करने और यह सुनिश्चित करने की अनुमति देता है कि सॉफ्टवेयर नेमाटोड आकृति विज्ञान और व्यवहार के बारे में सही धारणाएं बना रहा है।
   1. वेब इंटरफ़ेस के मुख्य पृष्ठ पर, वांछित प्रयोग और छवि विश्लेषण नामक कॉलम का पता लगाएं, और विश्लेषण चलाएं चुनें। दिखाई देने वाले नए पेज पर, New Experiment Job पर क्लिक करें. फिर, अनुभाग में एक संपूर्ण क्षेत्र के लिए एक नौकरी शेड्यूल करें, जनरेट एनिमल स्टोरीबोर्ड का चयन करें, और सेव जॉब पर क्लिक करें।
   2. एलएसएम स्टोरीबोर्ड उत्पन्न करने के बाद, वर्म ब्राउज़र पर जाएं, और वांछित प्रयोग का चयन करें। मुख्य मेनू पर वापस, सत्यापन का चयन करें > प्रत्येक कीड़े की मृत्यु के तुरंत बाद संपूर्ण प्रयोग > ब्राउज़ करें।
3. वर्म ब्राउज़र पर स्टोरीबोर्ड को एनोटेट करें: वर्म ब्राउज़र पर एक विशिष्ट स्टोरीबोर्ड जैसा दिखना चाहिए आकृती 5.
   1. "गैर-कृमि" वस्तुओं को एनोटेट करें
      नोट: आंदोलन के दौरान पता चला प्रत्येक वस्तु स्टोरीबोर्ड पर दिखाया गया है, अनुमानित मौत के समय द्वारा आदेशित। जब तक उपयोगकर्ता अन्यथा निर्दिष्ट नहीं करता है, प्रत्येक वस्तु को परिणामी उत्तरजीविता घटता में शामिल किया जाएगा। एलएसएम ऑब्जेक्ट वर्गीकरण को जानबूझकर उच्च झूठी-सकारात्मक दर के लिए कैलिब्रेट किया जाता है, जो कि अनिर्धारित नेमाटोड की संख्या को कम करने के लिए व्यापार-बंद के रूप में होता है। उच्च गुणवत्ता वाले उत्तरजीविता घटता प्राप्त करने के लिए गैर-कृमि वस्तुओं का बहिष्करण महत्वपूर्ण है (प्रतिनिधि परिणाम देखें)। बड़ी संख्या में गैर-कृमि वस्तुएं आमतौर पर स्टोरीबोर्ड के पहले और अंतिम पृष्ठों पर पाई जाती हैं, जिन्हें थोक में मैन्युअल रूप से जल्दी से बाहर रखा जा सकता है।
      1. स्टोरीबोर्ड पर गैर-कृमि वस्तुओं को बाहर करने के लिए, ऑब्जेक्ट की छवि पर एक बार राइट-क्लिक करें। बहिष्कृत वस्तु को अब एक सफेद बॉक्स द्वारा रेखांकित किया जाएगा। एक साथ कई वस्तुओं को बाहर करने के लिए, नियंत्रण कुंजी दबाए रखें, और किसी भी ऑब्जेक्ट पर एक बार राइट-क्लिक करें, और स्टोरीबोर्ड पेज पर सभी ऑब्जेक्ट्स को बाहर रखा जाएगा।
      2. किसी ऑब्जेक्ट को विश्लेषण से बाहर करने के बाद, उस ऑब्जेक्ट को दो बार फिर से राइट-क्लिक करके फिर से शामिल किया जा सकता है।
      3. स्टोरीबोर्ड एनोटेशन के दौरान किए गए एनोटेशन को सहेजने के लिए, सहेजें बटन पर क्लिक करें। एनोटेट करते समय प्रगति को बार-बार सहेजने की अनुशंसा की जाती है।
   2. मृत्यु के समय की व्याख्या करें:
      नोट: उपयोगकर्ता के हस्तक्षेप के बिना, एलएसएम अधिकांश आबादी के लिए मृत्यु के समय का सटीक अनुमान लगाता है। हालांकि, यह नियमित रूप से मैन्युअल प्रत्येक प्रयोग से व्यक्तियों की एक यादृच्छिक सबसेट मान्य द्वारा स्वचालित परिणामों की सटीकता की पुष्टि करने के लिए सिफारिश की है. सबसे कम और सबसे लंबे समय तक रहने वाले व्यक्तियों पर अतिरिक्त ध्यान दिया जाना चाहिए, क्योंकि स्वचालित विश्लेषण में कोई भी त्रुटि इन समूहों में क्लस्टर होती है।
      1. स्टोरीबोर्ड के किसी भी ऑब्जेक्ट पर एक बार बायाँ-क्लिक करें ताकि एक नई विंडो खुल सके जो उस ऑब्जेक्ट के बारे में विस्तृत, समय-श्रृंखला जानकारी प्रदर्शित करती है। यह विंडो पूरे प्रयोग में ऑब्जेक्ट की एकत्र की गई सभी छवियों के निरीक्षण की अनुमति देती है, साथ ही ऑब्जेक्ट की गति गतिशीलता और आकृति विज्ञान की मात्रा का ठहराव भी करती है। उसी इंटरफ़ेस का उपयोग करके, मैन्युअल रूप से मृत्यु के समय को एनोटेट करें। मृत्यु समय एनोटेशन के लिए इंटरफ़ेस चित्रा 6 में दिखाया गया है।
      2. मृत्यु के समय को मैन्युअल रूप से एनोटेट करने के लिए, मृत्यु के समय के अनुरूप बिंदु पर नीचे पट्टी पर बायाँ-क्लिक करें। समय सीमा के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए कीबोर्ड के स्पेस बार और दाएं या बाएं तीरों का उपयोग करें, या वांछित समय सीमा पर सीधे बार पर क्लिक करें।
         नोट: दृश्य समय के साथ जानवरों की आंदोलन स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है, जैसे एक्स-अक्ष अंकन समय के साथ एक क्षैतिज बार ग्राफ। गुलाबी/बैंगनी खंड उस समय अवधि को इंगित करता है जिसमें वस्तु जोर से आगे बढ़ रही है, पीला कमजोर गति को इंगित करता है, लाल गैर-चलती जानवरों को इंगित करता है, और हरा मृत्यु से जुड़े विस्तार की अवधि को इंगित करता है। नेमाटोड विशेषता मृत्यु से जुड़े रूपात्मक घटनाओं को प्रदर्शित करते हैं: आमतौर पर मृत्यु से पहले होने वाला एक क्रमिक शरीर संकुचन, इसके बाद मृत्यु के दौरान या तुरंत बाद तेजी से शरीर का विस्तार होता है (चित्र 6बी)। धूल या छाया जैसी गैर-कृमि वस्तुएं शरीर के आकार में इन गतिशीलता को नहीं दिखाती हैं और इसके बजाय, आमतौर पर समय के साथ आकार और तीव्रता में एक रैखिक, क्रमिक परिवर्तन का पालन करती हैं। ये विभिन्न शरीर के आकार की गतिशीलता तेजी से वर्गीकरण और मैनुअल बहिष्करण के लिए एक तेज़ और सीधी विधि प्रदान करती है।
      3. विश्लेषण दृष्टिकोण के आधार पर, मृत्यु के समय को या तो आंदोलन समाप्ति (आंदोलन दृश्य में लाल पट्टी की शुरुआत) या मृत्यु से जुड़े विस्तार (आंदोलन दृश्य में हरी पट्टी) के समय के रूप में माना जा सकता है। संकुचन और विस्तार घटनाओं को मैन्युअल रूप से एनोटेट करने के लिए, वांछित समय सीमा पर नीचे पट्टी पर राइट-क्लिक करें।
   3. कुछ अल्पविकसित मृत्यु दर डेटा विज़ुअलाइज़ेशन वर्म ब्राउज़र क्लाइंट के भीतर मूल रूप से प्रदान किए जाते हैं। स्टोरीबोर्ड (चित्रा 7) में मौजूद प्रत्येक आबादी के लिए उत्तरजीविता घटता और मृत्यु समय निदान दिखाया जाता है। बाईं ओर उत्तरजीविता घटता देखें और स्टोरीबोर्ड के दाईं ओर प्रत्येक व्यक्ति के लिए मृत्यु के समय की तुलना में जोरदार आंदोलन समाप्ति (वीएमसी) के समय की तुलना करते हुए तितर बितर कथानक।
      नोट: विशिष्ट उपभेदों, स्कैनर, या प्लेटों जैसी स्थितियों के लिए नीचे पट्टी पर उप-सेटिंग द्वारा विभिन्न प्रयोगात्मक मापदंडों के अनुसार इन परिणामों को समूहित करना संभव है। व्यक्तिगत कीड़े VMC बनाम मौत के समय साजिश में अलग-अलग बिंदुओं पर बायाँ-क्लिक करके उनकी मौत के समय के आधार पर चुना जा सकता है.
4. डिस्क पर मृत्यु दर डेटा लिखना: एलएसएम सीएसवी फाइलों के रूप में मृत्यु दर डेटा का उत्पादन करता है। आउटपुट किए गए उत्तरजीविता घटता को प्लॉट करें, और आर, एसएएस, एसटीएटीए या जेएमपी जैसे किसी भी सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर पर उनका विश्लेषण करें।
   1. इन फ़ाइलों को उत्पन्न करने के लिए, वर्म ब्राउज़र पर प्रयोग चुनें, और मेनू पर, डेटा फ़ाइलें, डेथ टाइम्स चुनें, और फिर वर्तमान प्रयोग के लिए जनरेट डेथ टाइम्स पर क्लिक करें। एलएसएम प्रयोग के उत्तरजीविता डेटा के साथ एक आउटपुट फ़ाइल उत्पन्न करेगा, जिसे परिणाम निर्देशिका में सहेजा जाएगा।
   2. यदि स्टोरीबोर्ड पर बाय-हैंड एनोटेशन किए गए हैं, तो वर्म ब्राउज़र पर एक प्रॉम्प्ट दिखाई देगा जिसमें पूछा जाएगा कि हाथ से एनोटेशन को कैसे संभालना है। आउटपुट किए गए डेथ टाइम फ़ाइल पर बाय-हैंड एनोटेशन शामिल करने के लिए "तुरंत" पर क्लिक करें।
      नोट:: मृत्यु दर डेटा फ़ाइलें imageserver.ini फ़ाइल में निर्दिष्ट परिणाम निर्देशिका में लिखे जाते हैं। विभिन्न प्रकार की फाइलें लिखी जाती हैं, लेकिन सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला संस्करण "survival_simple/survival=machine_hand" है, जिसमें स्टोरीबोर्ड का उपयोग करके किए गए सभी मैनुअल एनोटेशन शामिल हैं।
   3. पसंद के सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में मृत्यु दर के आंकड़ों का विश्लेषण करें।

चित्रा 5: वर्म ब्राउज़र पर पशु स्टोरीबोर्ड। (ए) सभी स्थिर कीड़े मशीन-एनोटेट मौत के समय के कालानुक्रमिक क्रम में दिखाए जाते हैं। स्टोरीबोर्ड को नेविगेट करने के लिए, (बी) नीचे-दाएं कोने पर बटन दबाएं, और (सी) अक्सर एनोटेशन को बचाएं। (डी) एक गैर-ग्रे पृष्ठभूमि वाले चित्र दो कृमि मृत्यु की घटनाओं (हरे रंग के रूप में प्रारंभिक मृत्यु, बाद में लाल के रूप में मृत्यु) को दर्शाते हैं, जो या तो तब हो सकते हैं जब दो कीड़े एक-दूसरे के करीब मर जाते हैं, या जब मृत कीड़े एक गुजरने वाले कीड़े द्वारा स्थानांतरित हो जाते हैं और इस प्रकार, दो बार मृत के रूप में पता लगाया जाता है। (ई) एक छवि के निचले कोने में एक लाल टैग एक पता लगाया मौत के समय के साथ कीड़े की पहचान करता है; (एफ) एक हरा टैग इंगित करता है कि कोई वस्तु मृत्यु के समय को रिकॉर्ड करने के लिए अभी भी लंबे समय तक नहीं रही। (जी) एक ही फ्रेम में एकाधिक कीड़े शिफ्ट दबाकर और बाएं क्लिक करके ध्वजांकित किया जा सकता है। (एच) गैर-कृमि वस्तुओं को राइट-क्लिक द्वारा विश्लेषण से बाहर रखा गया है। (I) विस्फोट कीड़े इसी छवि (एक हाथ एनोटेशन विंडो खोलता है) पर क्लिक करके विश्लेषण से सेंसर कर रहे हैं और शिफ्ट दबाने और राइट क्लिक जब तक एक "पशु विस्फोट" संदेश प्रकट होता है. 0.5 मिमी का एक स्केल बार और लेबल वर्म ब्राउज़र विंडो के स्क्रीनशॉट पर आरोपित हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 6: वर्म ब्राउज़र पर वस्तुओं और मृत्यु के समय की एनोटेशन का निरीक्षण। वर्म ब्राउज़र स्टोरीबोर्ड पर किसी भी ऑब्जेक्ट पर बायाँ-क्लिक करने से एक नया इंटरफ़ेस खुलता है और उपयोगकर्ता को ऑब्जेक्ट की गति की गतिशीलता का निरीक्षण करने की अनुमति मिलती है। दाईं ओर, (ए) आंदोलन स्कोर प्रदर्शित होता है, जो वस्तु आंदोलन को निर्धारित करता है; यह लगातार टिप्पणियों के बीच पिक्सेल तीव्रता में परिवर्तन से अनुमान लगाया जाता है। इसके अतिरिक्त, दाईं ओर, (बी) कुल वस्तु तीव्रता में परिवर्तन प्रदर्शित होता है, जो वस्तु आकार में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करता है। बाईं ओर, ऊपरी पट्टी मृत्यु के समय का (सी) मशीन अनुमान दिखाती है, जबकि नीचे की पट्टी (डी) मानव बाय-हैंड एनोटेशन है। सलाखों के किसी भी बिंदु पर क्लिक करने और अंतरिक्ष कुंजी दबाने से उपयोगकर्ता को उस समय सीमा के माध्यम से स्थानांतरित करने की अनुमति मिलती है जिसमें कृमि को छवि दी गई है। इन सलाखों पर, गुलाबी जोरदार आंदोलन में बिताए गए समय का प्रतिनिधित्व करता है, लाल मृत्यु में बिताए समय का प्रतिनिधित्व करता है, और पीला बीच में सब कुछ है। मृत्यु के बाद विस्तार और संकुचन में बिताए गए समय को हरे रंग में दिखाया गया है। लेबल एक वर्म ब्राउज़र विंडो के स्क्रीनशॉट पर आरोपित हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 7: वर्म ब्राउज़र पर जनसंख्या सारांश आँकड़े। स्कैनर डिवाइस "ओबिवान" के लिए जनसंख्या के आंकड़े, अस्तित्व के एक भूखंड (बाएं पैनल) और जोरदार आंदोलन समाप्ति (वीएमसी) समय बनाम मृत्यु समय (दाएं पैनल) के एक बिखरे हुए भूखंड के साथ। प्लॉट किए गए विवरण (ए) एक शर्त हैं, (बी) एक स्कैनर से प्राप्त किया गया है जो पहले चयन करके प्राप्त किया गया है (सी) तनाव द्वारा उत्तरजीविता समूहीकरण। (डी) स्कैटर प्लॉट में चौकोर आकार हाथ से एनोटेट की गई घटनाओं को दर्शाते हैं, जबकि (ई) गोलाकार आकार मशीन-एनोटेट की गई घटनाओं को दर्शाते हैं। (एफ) बाय-हैंड एनोटेशन अक्सर मौत की घटनाओं के लिए आवश्यक होता है जो जल्दी होते हैं या (जी) जहां जोरदार आंदोलन समाप्ति समय का समय मृत्यु के समय के साथ मेल खाता है। लेबल एक वर्म ब्राउज़र विंडो के स्क्रीनशॉट पर आरोपित हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Representative Results

जीवनकाल परख में प्रायोगिक प्रजनन क्षमता चुनौतीपूर्ण है और पर्याप्त सांख्यिकीय संकल्प ^4,36 प्राप्त करने के लिए दोनों कसकर नियंत्रित प्रयोगात्मक स्थितियों और बड़ी आबादी की आवश्यकता होती है। एलएसएम उच्च अस्थायी संकल्प के साथ निरंतर वातावरण में जानवरों की बड़ी आबादी के सर्वेक्षण के लिए विशिष्ट रूप से उपयुक्त है। एलएसएम की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, विश्लेषण के महत्वपूर्ण चरणों को उजागर करें, और शोधकर्ताओं को उनके श्रम प्रयासों को प्राथमिकता देने में मदद करें, हम एक इष्टतम, पहले प्रकाशित प्रयोग²³ से डेटा का एक सबसेट प्रस्तुत करते हैं। खुराक-प्रतिक्रिया परख के रूप में इस प्रयोग की प्रकृति के कारण, जीवन काल परिवर्तनों का मज़बूती से पता लगाने के लिए पर्याप्त संख्या में जानवरों की आवश्यकता थी। हाथ से, इस प्रयोग के लिए कई शोधकर्ताओं से गहन समय की प्रतिबद्धता की आवश्यकता होगी या, यदि कम किया जाता है, तो कमजोर परिणाम सामने आते हैं। डेटासेट ने मैसेंजर आरएनए ट्रांसक्रिप्शन के लिए आवश्यक आरएनए पोलीमरेज़ II (बी) सबयूनिट जीन (आरपीबी -2) को हटाने के बाद जीवनकाल में मात्रात्मक परिवर्तनों को मापा। सी में ऑक्सिन-इंड्यूसिबल सिस्टम³⁷ का उपयोग करना। एलिगेंस, आरपीबी -2 के अंतर्जात स्थान को ऑक्सिन (α-नेफ्टालेनेसेटिक एसिड) के विभिन्न सांद्रता का उपयोग करके आरपीबी -2 को सशर्त रूप से सर्वव्यापी और नीचा दिखाने के लिए एक डिग्रोन अनुक्रम के साथ टैग किया गया था। प्रयोग AMP100 [rpb-2 (cer135); eft-3p::TIR-1] पर CRISPR-सम्मिलित AID टैग rpb-2::GFPΔpiRNA::AID::3xFLAG²³ के अनुरूप cer135 के साथ किया गया था। प्रयोगात्मक स्थितियां 20 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर थीं और यूवी-निष्क्रिय NEC937 (OP50 ΔuvrA; कानर)³⁸ई। कोलाई। हेर्मैफ्रोडाइट्स को देर से L4 चरण के दौरान नेमाटोड को 5-फ्लोरो-2-डीऑक्सीयूरिडीन (FUdR) युक्त प्लेटों में स्थानांतरित करके निष्फल किया गया था। नेमाटोड को वयस्कता के दिन 2 के दौरान ऑक्सिन की विभिन्न सांद्रता वाली प्लेटों में स्थानांतरित किया गया था। मूल अध्ययन में, लेखकों ने दिखाया कि ऑक्सिन की उपस्थिति में, आरपीबी -2 गिरावट ने खुराक पर निर्भर तरीके से जीवनकाल को छोटा कर दिया²³. 

यहां, हम उस योगदान को प्रदर्शित करते हैं जो प्रयोग के बाद डेटा सत्यापन और एनोटेशन अंतिम उत्तरजीविता वक्र आउटपुट (चित्रा 8) में करते हैं। वर्म ब्राउज़र स्टोरीबोर्ड के भीतर छवि विश्लेषण के अंतिम चरणों में, हमने स्टोरीबोर्ड एनोटेशन से पहले उत्पादित कच्चे उत्तरजीविता घटता की तुलना गैर-कृमि वस्तुओं के मैनुअल बहिष्करण के बाद उत्पादित उत्तरजीविता घटता से की और गैर-कीड़ा वस्तुओं और व्यक्तिगत मृत्यु समय दोनों के एनोटेशन के बाद उत्पादित उत्तरजीविता घटता की तुलना की (चित्रा 8ए-सी)। हमने पाया कि स्टोरीबोर्ड एनोटेशन (चित्रा 8 ए) से पहले उत्पादित प्रारंभिक अस्तित्व घटता गैर-कृमि वस्तुओं के अनुचित समावेश से विकृत हो गए थे, जो जीवित वक्रों की पूंछ में सबसे स्पष्ट था। मैनुअल एनोटेशन से पहले, उत्तरजीविता घटता में मशीन द्वारा संभावित कृमि वस्तुओं के रूप में पता लगाई गई सभी वस्तुएं शामिल थीं, जिनमें से लगभग आधे, जानबूझकर उच्च झूठी सकारात्मक दर के कारण, गैर-कृमि वस्तुएं थीं और उन्हें मैन्युअल रूप से बाहर रखा जाना था(चित्रा 8डी)। यह डिज़ाइन द्वारा है, क्योंकि झूठी नकारात्मक से बचने के लिए एल्गोरिदम को अपेक्षाकृत उच्च झूठी-सकारात्मक दर के लिए कैलिब्रेट किया जाता है, क्योंकि गलत तरीके से शामिल वस्तुओं को खोजने और पुनर्प्राप्त करने की तुलना में गलत तरीके से शामिल वस्तुओं को बाहर करना बहुत आसान है। मैनुअल स्टोरीबोर्ड एनोटेशन के दौरान गैर-कृमि वस्तुओं को बाहर करने के बाद, परिणामी उत्तरजीविता वक्र बहुत अधिक रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 8 बी, ई) के थे, और स्टोरीबोर्ड पर मौत के समय के आगे मैनुअल एनोटेशन ने अनुमानित औसत जीवनकाल में ~ 4% से अधिक के परिवर्तन का उत्पादन नहीं किया। इसलिए, हम प्रदर्शित करते हैं कि एलएसएम की छवि विश्लेषण पाइपलाइन के दौरान गैर-कृमि वस्तुओं को हटाना अच्छी तरह से हल किए गए उत्तरजीविता घटता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण कदम है।

चित्रा 8: उत्तरजीविता घटता पर मैन्युअल डेटा सत्यापन का प्रभाव। आरपीबी -2 का क्षरण सी को छोटा करता है। खुराक पर निर्भर तरीके से ऑक्सिन (K-NAA: α-napthaleneacetic एसिड) की उपस्थिति में एलिगेंस जीवनकाल। (ए) प्लेटों के गुणवत्ता नियंत्रण के बाद एलएसएम कच्चे उत्पादन से प्लॉट किए गए उत्तरजीविता वक्र और वर्म ब्राउज़र स्टोरीबोर्ड पर वर्म ऑब्जेक्ट्स के मैनुअल एनोटेशन के बिना। (बी) स्टोरीबोर्ड पर कृमि वस्तुओं के मैनुअल एनोटेशन के बाद प्लॉट किए गए उत्तरजीविता घटता। (सी) स्टोरीबोर्ड पर कृमि वस्तुओं और मृत्यु के समय के मैनुअल एनोटेशन के बाद प्लॉट किए गए उत्तरजीविता घटता। (डी) एलएसएम द्वारा पता लगाए गए सभी वस्तुओं का सारांश। सेंसर की गई कृमि वस्तुओं में स्वचालित रूप से बाहर रखी गई वस्तुएं शामिल थीं (उदाहरण के लिए, स्कैन किए गए क्षेत्र के बाहर जाने वाले कीड़े के कारण) या प्रयोगकर्ता द्वारा मैन्युअल रूप से (उदाहरण के लिए, कीड़े फटने के कारण)। (ई) हाथ से कृमि वस्तु एनोटेशन (बाएं) और अतिरिक्त हाथ मौत के समय एनोटेशन (दाएं) के बाद अनुमानित औसत जीवनकाल का सारणीबद्ध प्रतिनिधित्व। विभिन्न ऑक्सिन सांद्रता के पड़ोसी समूहों और पता लगाने की सांख्यिकीय शक्ति के बीच औसत जीवनकाल में प्रतिशत अंतर। सभी ग्राफ सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर जेएमपी पर प्लॉट किए गए थे। इस आंकड़े के लिए डेटा ओसवाल एट ^अल.23 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

उम्र बढ़ने का अध्ययन करने के लिए एक एकल अंत-बिंदु के रूप में जीवनकाल से आगे बढ़ते हुए, हमने तब व्यवहारिक उम्र बढ़ने पर विचार किया और जांच की कि प्रयोगात्मक छवि विश्लेषण के कौन से चरण इसे मापने के लिए सबसे महत्वपूर्ण थे। जोरदार आंदोलन समाप्ति (वीएमसी) और जीवनकाल के बीच संबंधों पर ध्यान केंद्रित करते हुए, हमने छवि विश्लेषण और सत्यापन(चित्रा 9ए-डी)के विभिन्न चरणों में एलएसएम आउटपुट की तुलना की। हमने पाया कि गैर-कृमि वस्तुओं ने स्पष्ट वीएमसी और जीवनकाल के बीच एक अनूठा संबंध दिखाया, जिसमें दोनों को हर वस्तु(चित्रा 9ए)में लगभग एक साथ होने के रूप में एनोटेट किया गया। इसके विपरीत, सच्चे नेमाटोड आमतौर पर अपनी मृत्यु के समय (चित्रा 9 ए) से कई दिन पहले सख्ती से आगे बढ़ना बंद कर देते थे। वीएमसी और जीवनकाल के बीच संबंधों में यह अंतर गैर-कृमि वस्तुओं को तेजी से पहचानने और बाहर करने के लिए एक अतिरिक्त साधन प्रदान करता है।

चित्रा 9: जोरदार आंदोलन समाप्ति (वीएमसी) विश्लेषण पर मैनुअल डेटा सत्यापन का प्रभाव। (ए) वर्म ब्राउज़र स्टोरीबोर्ड पर वर्म ऑब्जेक्ट्स के मैनुअल एनोटेशन के बिना बिहेवियरल एजिंग डेटा, गैर-वर्म ऑब्जेक्ट्स (काले रंग में) बनाम वर्म ऑब्जेक्ट्स (लाल रंग में) में मौत के समय और वीएमसी समय के बीच संबंध प्रदर्शित करता है। (बी) स्टोरीबोर्ड पर कृमि वस्तुओं के मैनुअल एनोटेशन के बाद प्लॉट किए गए व्यवहार उम्र बढ़ने का डेटा। (सी) स्टोरीबोर्ड पर कृमि वस्तुओं और मृत्यु के समय के मैनुअल एनोटेशन के बाद प्लॉट किए गए व्यवहार उम्र बढ़ने का डेटा। (डी) छवि विश्लेषण पाइपलाइन के विभिन्न चरणों में औसत शेष जीवनकाल (एआरएल; मृत्यु आयु और वीएमसी आयु के बीच अवरोधन से प्राप्त) का सारणीबद्ध प्रतिनिधित्व और कृमि वस्तु एनोटेशन और आगे मृत्यु समय एनोटेशन के बीच एआरएल में प्रतिशत अंतर। (ई) पोस्ट-इमेज अधिग्रहण विश्लेषण के विभिन्न चरणों में अनुमानित एआरएल का ग्राफिक प्रतिनिधित्व, और कृमि जीवनकाल (जो ऑक्सिन एकाग्रता पर निर्भर है: α-नेप्थलीनेसेटिक एसिड) के साथ उनका संबंध। स्पलाइन फिट एक क्यूबिक स्पलाइन विधि का उपयोग करके किया गया था। सभी ग्राफ सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर जेएमपी पर प्लॉट किए गए थे। इस आंकड़े के लिए डेटा ओसवाल एट ^अल.23 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

हमने पाया कि वर्म ब्राउज़र का उपयोग करके गैर-कृमि वस्तुओं का एनोटेशन और बहिष्करण वीएमसी और मृत्यु के समय (चित्रा 9ए-सी) के बीच संबंधों का एक मोटा अनुमान प्रदान करने के लिए पर्याप्त था, नेमाटोड²³ में शारीरिक गिरावट की अपेक्षित गतिशीलता को पुन: प्रस्तुत करना। इसे और अधिक जानने के लिए, हमने उसी आरएनए पोलीमरेज़ II डेटा सेट पर विचार किया और प्रत्येक उप-जनसंख्या के लिए वीएमसी के बाद औसत शेष जीवनकाल (एआरएल) का अनुमान लगाया, जो वीएमसी से संबंधित रैखिक प्रतिगमन मॉडल के अवरोधन के रूप में था। एआरएल पर डेटा एनोटेशन के प्रभाव को समझने के लिए, हमने डेटा एनोटेशन (चित्रा 9ई) के प्रत्येक चरण के बाद एआरएल की पुनर्गणना की। हमने पाया कि व्यवहार उम्र बढ़ने के विश्लेषण में मौत के समय का मैनुअल एनोटेशन लंबे समय तक रहने वाले कीड़े में विशेष रूप से महत्वपूर्ण था, इस उदाहरण में, ऑक्सिन की सबसे कम सांद्रता के संपर्क में आने वाले(चित्रा 9डी,ई)। उत्तरजीविता घटता पर इसके न्यूनतम प्रभाव के विपरीत, मृत्यु के समय के मैनुअल एनोटेशन का वीएमसी और जीवनकाल के बीच मात्रात्मक संबंध पर पर्याप्त प्रभाव पड़ा, अनुमानित एआरएल में वृद्धि, उदाहरण के लिए ऑक्सिन के 0 माइक्रोन पर, मृत्यु समय एनोटेशन के 8.09 दिनों से 10.42 दिनों तक; यह 29% के ARL अंतर का प्रतिनिधित्व करता है। इसलिए, हमने पाया कि एआरएल द्वारा समझाया गया वीएमसी और मृत्यु के समय के बीच संबंध अकेले जीवनकाल के लिए मृत्यु के समय के माप की तुलना में मृत्यु के समय के हाथ से एनोटेशन के प्रति अधिक संवेदनशील था। इस संवेदनशीलता को एआरएल और जीवनकाल की सापेक्ष अवधि द्वारा समझाया जा सकता है; मृत्यु के समय के लिए समान समायोजन आमतौर पर जीवनकाल के सापेक्ष छोटा होगा लेकिन एआरएल के सापेक्ष बड़ा होगा। इस प्रकार, मृत्यु के समय में समायोजन का जीवनकाल की तुलना में एआरएल पर बड़ा सापेक्ष प्रभाव पड़ेगा।

पूरक फ़ाइल 1: जीवनकाल मशीन प्रयोग अनुसूची फ़ाइल की संरचना। प्रयोग अनुसूची में तीन भाग होते हैं। सबसे पहले, प्रयोग के बारे में बुनियादी जानकारी शामिल है, जैसे नाम और कैप्चर विनिर्देश। इस भाग से, आम तौर पर प्रत्येक नए प्रयोग के लिए केवल प्रयोग का नाम बदलने की आवश्यकता होती है। दस्तावेज़ का दूसरा भाग वर्म ब्राउज़र से स्कैन क्षेत्रों को निर्यात करके उत्पन्न होता है और प्रत्येक स्कैनर ("असुना", "बुल्मा", "मॉस्को", "रियो", "यूनो", और "युकी" इस उदाहरण में) के लिए स्कैन क्षेत्रों के भौतिक स्थान को निर्दिष्ट करता है। ये प्रत्येक नए प्रयोग के लिए प्रतिस्थापित कर रहे हैं और चरण 4.1.2.3 के दौरान व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक स्कैनर के लिए उत्पन्न TXT फ़ाइलों से कॉपी कर रहे हैं. दस्तावेज़ का तीसरा भाग प्रयोग की अवधि के बारे में जानकारी प्रदान करता है, जिसे प्रत्येक नए प्रयोग के लिए भी संशोधित किया जाना चाहिए, और कैप्चर आवृत्ति। डिवाइस पूरे प्रयोग की अवधि के लिए निर्दिष्ट अंतराल पर एक समय में प्रत्येक परिभाषित क्षेत्र को स्कैन करेगा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहां, हम लाइफस्पैन मशीन के नवीनतम संस्करण का उपयोग करके प्रयोग करने के लिए एक विस्तृत, सुलभ प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हमने दिखाया है कि अच्छी तरह से हल किए गए उत्तरजीविता घटता को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण कदम पोस्ट-इमेज अधिग्रहण के दौरान गैर-कृमि वस्तुओं का मैन्युअल बहिष्करण है। मैनुअल मौत के समय एनोटेशन का उत्तरजीविता घटता के समग्र आकार पर एक छोटा प्रभाव पड़ता है, यह दर्शाता है कि पूरी तरह से स्वचालित मृत्यु समय का अनुमान मैनुअल एनोटेशन (चित्रा 8) के बिना भी कुशल है। इसके विपरीत, उच्च गुणवत्ता वाले व्यवहारिक उम्र बढ़ने के डेटा के अधिग्रहण के लिए मृत्यु के समय की अधिक सावधानीपूर्वक एनोटेशन की आवश्यकता होती है, खासकर लंबे समय तक रहने वाले व्यक्तियों (चित्रा 9) में। इसलिए, बाय-हैंड स्टोरीबोर्ड एनोटेशन के लिए आवश्यक समय की मात्रा अंततः मापा जा रहे विशिष्ट परिणाम पर निर्भर करेगी। कुल मिलाकर, हम पाते हैं कि एलएसएम के साथ काम करते समय, शोधकर्ता के प्रयास प्रयोगात्मक सेटअप के दौरान सबसे महत्वपूर्ण होते हैं और, कुछ हद तक, पोस्ट-इमेज अधिग्रहण विश्लेषण के दौरान। अंत में, हम शोधकर्ताओं की उत्पादकता बढ़ाने और प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता का समर्थन करते हुए अत्यधिक हल किए गए अस्तित्व और व्यवहारिक उम्र बढ़ने के डेटा के उत्पादन में उच्च-थ्रूपुट, स्वचालित परख के मूल्य को उजागर करते हैं।

एलएसएम घरों अगर प्लेटों पर नेमाटोड, एक स्वचालित संदर्भ में शास्त्रीय बाय-हैंड जीवनकाल परख को फिर से बनाना। अन्य उपकरणों में जीवन काल की माप को स्वचालित करने के लिए विकसित किया गया है सी. एलिगेंस नेमाटोड कारावास के विभिन्न तरीकों का उपयोग कर. इनमें ऐसे दृष्टिकोण शामिल हैं जिनमें एकल नेमाटोड ठोस मीडिया (वर्मोटेल¹⁵) में या एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस (लाइफस्पैन-ऑन-ए-चिप¹¹) के भीतर रखे जाते हैं या जो माइक्रोफ्लुइडिक्स (वर्मफार्म¹⁴) का उपयोग करके जानवरों की एक बड़ी आबादी को ट्रैक करते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों के फायदों में सटीक, वास्तविक समय पर्यावरण नियंत्रण और आकार बहिष्करण द्वारा संतान को स्वचालित रूप से हटाने की संभावना शामिल है। हालांकि, उपरोक्त उपकरण अब तक आसानी से स्केलेबल साबित नहीं हुए हैं, क्योंकि उन्हें व्यापक मैनुअल हैंडलिंग की आवश्यकता होती है और अक्सर एक प्रयोगवादी द्वारा ट्रिगर की गई दैनिक छवि या वीडियो कैप्चर पर भरोसा करते हैं। अन्य प्लेटफ़ॉर्म, जैसे कि स्ट्रेस-चिप³⁹, कस्टम माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की छवि के लिए एलएसएम के लिए डिज़ाइन किए गए संशोधित फ्लैटबेड स्कैनर का उपयोग करते हैं।

अन्य तरीकों के विपरीत, एलएसएम में व्यापक डेटा एनोटेशन और सत्यापन सुविधाएं हैं, इस प्रकार उपयोगकर्ताओं को उच्च-थ्रूपुट संदर्भ^13में उच्च-रिज़ॉल्यूशन, सटीक और सटीक जीवनकाल डेटा एकत्र करने के लिए आवश्यक गुणवत्ता नियंत्रण को व्यवस्थित रूप से करने की अनुमति मिलती है। तकनीक वर्तमान अगर-प्लेट-आधारित प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के उपयोग के कारण बहुमुखी है और फ्लैटबेड स्कैनर के बड़े समूहों को व्यवस्थित करने की सापेक्ष आसानी के कारण प्रयोगात्मक मापनीयता के लिए एक अनूठा लाभ प्रदान करती है। हालांकि एलएसएम को विशेष सॉफ्टवेयर पर उपयोगकर्ताओं को बनाने और संचालित करने और प्रशिक्षित करने के लिए प्रारंभिक समय के निवेश की आवश्यकता होती है, इन लागतों को जीवनकाल डेटा के मजबूत, उच्च-थ्रूपुट उत्पादन द्वारा संतुलित किया जाता है। 50 स्कैनर या उससे अधिक के लाइफस्पैन मशीन क्लस्टर कई प्रयोगशालाओं में तैनात किए गए हैं, जो एक दशक से अधिक समय से लगातार चल रहे^हैं।

एलएसएम की सीमाएं हैं। जीवित रहने के डेटा के स्वचालित संग्रह के दौरान जानवरों को स्कैनर में रखा जाता है, इस प्रकार शोधकर्ताओं की क्षमता को अवलोकन के साथ-साथ प्रयोगात्मक हस्तक्षेप करने की क्षमता सीमित हो जाती है और जानवरों की नसबंदी या नेमाटोड के प्रजनन चरण के बाद प्रयोग शुरू करने की आवश्यकता होती है। तापमान में परिवर्तन हस्तक्षेपों की सीमा के लिए एक दुर्लभ अपवाद है, क्योंकि स्कैनर खोलने और जानवरों तक पहुंचने की आवश्यकता के बिना पर्यावरण के तापमान को संशोधित किया जा सकता है। ऐसे मामलों में जहां हाथों पर हस्तक्षेप को नेमाटोड मध्य-जीवन पर लागू किया जाना चाहिए, एक सामान्य समाधान स्वचालित अवलोकन की शुरुआत में देरी करना है जब तक कि जानवरों की आवश्यक हैंडलिंग का प्रदर्शन नहीं किया जाता है। इसके अतिरिक्त, स्कैनर के भीतर और उसके पार प्लेटों के स्थान में एक अंतर्निहित भिन्नता है। ये पर्यावरणीय परिस्थितियों (जैसे तापमान, प्रकाश, वेंटिलेशन, आदि) में मिनट, स्थानीय अंतर के अधीन हो सकते हैं, जो सी को प्रभावित कर सकते हैं। एलिगेंस का जीवनकाल¹⁹. इस पर्यावरणीय प्रभाव को आगे मात्रा निर्धारित किया जा सकता है और त्वरित विफलता समय प्रतिगमन मॉडल⁴¹ का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है। इस प्रभाव को कम करने का एक तरीका पर्यावरणीय उतार-चढ़ाव से स्वतंत्र कठोर माप प्राप्त करने के लिए प्लेटों और स्कैनर की संख्या को स्केल करना है। आमतौर पर, एक ही स्थिति की प्लेटें प्रत्येक स्कैनर के भीतर बेतरतीब ढंग से वितरित की जाती हैं, और जनसंख्या आकार प्रति स्थिति 500 व्यक्तियों से बड़ा है और स्कैनर में सांख्यिकीय रूप से मजबूत अस्तित्व अनुमान^31का प्रदर्शन किया है।

कुल मिलाकर, एलएसएम अस्तित्व और व्यवहारिक उम्र बढ़ने के डेटा के उच्च-सटीकता और बड़े-जनसंख्या संग्रह की अनुमति देता है, और पहले से अक्षम स्क्रीन को मात्रात्मक तरीके से प्रदर्शन करने में सक्षम कर सकता है। इस तरह, एलएसएम उत्तरजीविता घटता के मानकीकृत संग्रह के लिए एक प्रमुख तकनीकी अग्रिम योगदान देता है और नेमाटोड में जीवनकाल और व्यवहारिक उम्र बढ़ने के युग्मित अध्ययन के लिए एक उपन्यास ढांचा प्रदान करता है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Naphtaleneacetic  acid (Auxin)	Sigma	N0640	Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR)	Sigma	F0503	27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria
Glass cleaner	Kristal-M	QB-KRISTAL-M125ml
Hydrophobic anti-fog glass treatment	Rain-X Scheibenreiniger	C. 059140
Rubber matt	Local crafstman		Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock
Scanner glass	Local hardware supplier		9" x 11.5" inch glass sheet
Scanner plates	Life Sciences	351006	50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish
USB Reference Thermometer	USB Brando	ULIFE055500	For calibrating temperature of scanners