Adfærdsmæssig aldring og levetidsanalyser med høj kapacitet ved hjælp af levetidsmaskinen

Summary

Billedbehandlingsplatformen "The Lifespan Machine" automatiserer livslang observation af store populationer. Vi viser de trin, der kræves for at udføre levetid, stressresistens, patogenese og adfærdsmæssige aldringsanalyser. Kvaliteten og omfanget af dataene giver forskere mulighed for at studere interventioner i aldring på trods af tilstedeværelsen af biologisk og miljømæssig variation.

Abstract

Genetisk identiske dyr, der holdes i et konstant miljø, viser en bred fordeling af levetider, hvilket afspejler et stort ikke-genetisk, stokastisk aspekt til aldring bevaret på tværs af alle undersøgte organismer. Denne stokastiske komponent betyder, at for at forstå aldring og identificere vellykkede interventioner, der forlænger levetiden eller forbedrer sundheden, skal forskere overvåge store populationer af forsøgsdyr samtidigt. Traditionel manuel dødsscoring begrænser den gennemstrømning og skala, der kræves til hypotesetest i stor skala, hvilket fører til udvikling af automatiserede metoder til analyser med høj kapacitet. Lifespan Machine (LSM) er en billedbehandlingsplatform med høj kapacitet, der kombinerer modificerede flatbedscannere med brugerdefineret billedbehandlings- og datavalideringssoftware til livslang sporing af nematoder. Platformen udgør et stort teknisk fremskridt ved at generere meget tidsmæssigt opløste levetidsdata fra store populationer af dyr i en hidtil uset skala og med en statistisk præcision og nøjagtighed svarende til manuelle analyser udført af erfarne forskere. For nylig er LSM blevet videreudviklet til at kvantificere de adfærdsmæssige og morfologiske ændringer, der observeres under aldring og relatere dem til levetiden. Her beskriver vi, hvordan man planlægger, kører og analyserer et automatiseret levetidseksperiment ved hjælp af LSM. Vi fremhæver yderligere de kritiske trin, der kræves for en vellykket indsamling af adfærdsdata og overlevelseskurver af høj kvalitet.

Introduction

Aldring er en kompleks, mangefacetteret proces præget af et fald i organismens fysiologiske funktion, hvilket fører til en stigning i risikoen for sygdom og død over tid¹. Levetid, målt som tiden fra fødsel eller begyndelsen af voksenalderen til døden, giver et entydigt resultat af aldring² og en indirekte, men strengt kvantitativ proxy til måling af den relative aldringshastighed mellem populationer³. Aldringsundersøgelser afhænger ofte af nøjagtige målinger af levetid, svarende til kliniske forsøg, for at sammenligne resultater mellem en population udsat for en intervention og en ikke-eksponeret kontrolgruppe. Desværre gennemsyrer reproducerbarhedsproblemer aldringsforskning, nogle gange på grund af statistisk underdrevne eksperimenter⁴ og ofte på grund af levetidsanalysernes iboende følsomhed over for subtile variationer i miljøet⁵. Robuste eksperimenter kræver flere replikater af store populationer, og denne proces drager især fordel af den eksperimentelle skalerbarhed, der tilbydes af automatisering⁶.

De strenge krav til levetidsanalyser stammer fra uforudsigeligheden af selve aldringsprocessen. Isogene individer, der er anbragt i identiske miljøer, viser forskellige dødstider og fysiologiske tilbagegangshastigheder⁷, hvilket tyder på, at levetid indebærer en høj grad af stokasticitet ^7,8. Derfor er store populationer forpligtet til at måle kvantitative ændringer i aldringsprocessen, såsom ændringer i den gennemsnitlige eller maksimale levetid, og for at overvinde forstyrrelser som følge af individuel variabilitet. Derudover er en kapacitet til analyser med høj kapacitet afgørende for at understøtte undersøgelser af overlevelseskurveformer og modeller af aldringsdynamikken⁹.

Nematoden Caenorhabditis elegans er en uvurderlig model for aldringsforskning på grund af dens korte levetid, genetiske trækbarhed og hurtige generationstid, hvilket understreger dens egnethed til høj gennemstrømning aldring og levetidsanalyser. Traditionelt er levetiden i C. Elegans er målt ved at følge en synkroniseret, lille population på omkring 50-100 dyr over tid på solide medier og skrive tidspunktet for individuelle dødsfald ned. Da dyr ældes og mister mobilitet, kræver manuel scoring af dødstiderne individuelt at stikke dyrene og kontrollere for små bevægelser af hoved eller hale. Dette er normalt en kedelig og besværlig proces, selvom der er gjort en indsats for at fremskynde den 10,11,12. Det er vigtigt, at langsomme eksperimentelle rørledninger hindrer fremskridt i vores forståelse af aldring og effektiviteten af testede interventioner.

For at imødekomme kravene fra aldringsforskning til kvantitative data er der udviklet mange teknologier til automatisering af dataindsamling, herunder et bemærkelsesværdigt udvalg af tilgange fra mikrofluidiske kamre til flatbedscannere 13,14,15,16,17,18. LSM adskiller sig fra andre metoder ved sin omfattende optimering til indsamling af meget præcise og nøjagtige levetidsdata, hvilket opnås gennem udvikling af omhyggelige udstyrskalibreringsprotokoller kombineret med en omfattende softwarepakke, der giver brugerne mulighed for at validere, korrigere og forfine automatiserede analyser¹³. Selvom softwaren i princippet kan anvendes til forskellige billedbehandlingsmetoder, bruger de fleste brugere i praksis flatbedscannere, der er modificeret til at muliggøre finjusteret kontrol over den omgivende temperatur og fugtighed - faktorer af kritisk betydning på grund af deres store indvirkning på levetiden¹⁹. LSM tager billeder af nematoder hvert 20. minut over intervaller fra dage til måneder afhængigt af miljøforholdene og genotypen. De producerede data har en meget højere tidsmæssig opløsning sammenlignet med data fra manuelle analyser, og de indsamlede billeder giver en permanent visuel registrering af nematodepositionen i hele levetiden. Ved hjælp af maskinlæringsmetoder tildeles dødstider automatisk til hver enkelt person. Disse resultater kan hurtigt valideres manuelt ved hjælp af en klientsoftware kaldet "Worm Browser". Som et resultat af sin hardware og software kan LSM generere overlevelseskurver, der statistisk ikke kan skelnes fra manuel dødsscoring i hænderne på erfarne forskere, med den ekstra fordel af nedsat arbejdsbyrde og højere skalerbarhed¹³.

Den seneste version af LSM giver også mulighed for undersøgelse af adfærdsmæssig aldring ved at indsamle morfologiske og adfærdsmæssige data gennem hele nematodens liv og rapportere det sammen med hver enkelt persons levetid. LSM fanger især tidspunktet for hvert dyrs kraftige bevægelsesophør (VMC), et vartegn, der ofte bruges til at kvantificere et individs "sundhedsperiode" til forskel fra dets levetid. Ved samtidig at indsamle levetids- og adfærdsmæssige aldringsdata understøtter LSM undersøgelsen af interventioner, der kan have forskellige virkninger på forskellige fænotypiske resultater af aldring²⁰. En række makroskopisk observerbare fænotyper kan bruges til at studere adfærdsmæssig aldring, såsom kropsbevægelse eller svælgpumpning²¹, vævsintegritet²² og bevægelseshastighed eller stimulus-induceret drejning¹⁷. Sammenligninger mellem forskellige aldringsfænotyper kan understøtte analyser af aldringsprocessernes årsagsstruktur. For eksempel blev sammenligningen mellem VMC og levetid for nylig brugt til at karakterisere to forskellige aldringsprocesser i C. elegans²³.

Mens LSM oprindeligt blev udviklet til at måle levetiden i C. elegans, understøtter LSM indsamling af overlevelses- og adfærdsdata fra en række nematodearter, herunder C. briggsae, C. tropicalis, C. japonica, C. brenneri og P. Pacificus²³. Teknologien letter undersøgelsen af effekten af biologiske og miljømæssige interventioner på levetid, stressresistens og patogenresistens og kan kobles til eksperimentelle værktøjer såsom målrettede assays af RNA-interferens eller auxin-inducerbare proteinnedbrydningssystemer. Til dato er det blevet brugt i den videnskabelige litteratur til en bred vifte af applikationer 6,24,25,26,27,28,29,30.

Her skitserer vi en trin-for-trin protokol til udførelse af et Lifespan Machine eksperiment ved hjælp af agarplader, fra de indledende faser af den eksperimentelle opsætning til output af de resulterende overlevelseskurver. Et karakteristisk træk ved LSM er, at indsatsen er meget front-loaded, hvilket betyder, at størstedelen af forskerens tid bruges under eksperimentel opsætning og i mindre grad under post-image erhvervelse. Dataindsamlingen er fuldstændig automatiseret i hele eksperimentets varighed og giver forskeren mulighed for at få en "håndfri" oplevelse. De trin, der beskrives her, har til fælles blandt mange forskellige typer overlevelsesassays - den samme eksperimentelle opsætning udføres for levetid, termotolerance, oxidativ stress og patogeneseassays. I afsnittet om repræsentative resultater diskuterer vi en delmængde af data fra et nyligt offentliggjort manuskript for at illustrere effektiviteten af analysepipelinen og fremhæve de vigtigste trin under billedanalyse²³.

Protocol

1. Software- og hardwarekrav

1. Flatbedscannere: I princippet kan LSM implementeres ved hjælp af en række billedbehandlingsenheder. Detaljerede instruktioner til scannerændringer og fokusering findes andetsteds¹³. LSM-hardwaren er vist i supplerende figur 1.
2. Dataanalyseværktøjer: LSM-softwaren har tre interaktive komponenter: en Linux-baseret softwarepakke til scannerstyring, en webbrowserbaseret metadatastyringspakke og en softwarepakke til Windows- og Linux-klientbilledanalyse. Se instruktionerne til installation af softwareværktøjer, der er udgivet på GitHub-lageret (https://github.com/nstroustrup/lifespan).
3. Datavisualiserings- og valideringssoftware: Brug Worm Browser, et klientprogram, til at planlægge eksperimenterne, validere billedanalysen, udføre manuel annotering af nematodebevægelsen og output overlevelsesdataene. Binære eksekverbare filer leveres til Worm Browser på Windows 7, Windows 8 og Windows 10, og Worm Browser er kompileret fra kildekode på Linux eller Apple iOS. En installationsvejledning er tilgængelig på GitHub-lageret nævnt ovenfor.

Supplerende figur 1: Levetid for maskinhardware. En flatbedscannerenhed med åbent låg til at vise de ilagte plader, som er placeret nedad i 16 åbninger skåret på en gummimåtte. Gummimåtten placeres på overfladen af en glasscanner. Etiketter til betingelserne er skrevet på siderne af pladerne for at undgå problemer under billedanalyse. Mærkningstape med nummer ("1") og/eller navn på enheden ("Jabba") letter senere verifikation af prøvestedet, når der arbejdes med flere scannerenheder. Flere detaljer om LSM-hardwarekomponenterne findes andetsteds¹³. Klik her for at downloade denne fil.

2. Opsætning før forsøgsdagen

1. Temperaturkalibrering af inkubatoren: Miljøtemperatur er en vigtig determinant for C. Elegans levetid¹⁹. For at producere nøjagtige resultater skal du udføre billedoptagelse ved en omhyggeligt kalibreret temperatur, der holdes konstant under hele eksperimentet. For at opnå dette måles og kalibreres temperaturen på hver scanners overflade under drift et par dage før eksperimentets start. Brug termoelementer med høj præcision som beskrevet andetsteds³¹ (se materialetabellen).
2. Scannerpladelayout: Før eksperimentets start skal du planlægge det optimale layout af kulturpladerne for hver scanner.
   BEMÆRK: Formålet med dette er at undgå introduktion af forstyrrende faktorer som følge af temperaturvariation mellem scannerne og på tværs af hver scanners overflade. Scannere adskiller sig subtilt i deres gennemsnitlige overfladetemperatur og udviser desuden subtile temperaturforstyrrelser på tværs af deres overflade³¹.
   1. Scannerpladeposition: For at kontrollere for disse termiske effekter i den efterfølgende dataanalyse skal du randomisere eventuelle biologiske kovariater vedrørende scannerpositionen og standardisere pladeplaceringen på tværs af alle scannere.
   2. Antal prøver på tværs af scannerne: Når du bruger 16-gummimåttens layout (se materialetabellen), skal du placere fire plader pr. tilstand i hver scanner med i alt mindst fire scannere. Dette sikrer, at hver tilstand fordeles på flere scannere, således at de forvirrende virkninger af scannertemperaturen kan identificeres og fjernes under dataanalyse¹³. For at gøre denne analyse mere ligetil skal du medtage en fælles referencebetingelse (f.eks. vildtypeprøver) på hver scanner.
      BEMÆRK: På grund af placeringen af scannerventilatorerne er pladerne i øverste højre hjørne af gummimåtten generelt mere tilbøjelige til udtørring. Lad denne placering være tom, hvis det er nødvendigt.
3. Plader og prøveforberedelse
   1. Hældning af dyrkningspladerne: For optimal tørring af scannerkulturpladerne (se materialetabellen) hældes agarmedium 4 dage før påfyldning af nematoderne. Selvom scannerfokus er justerbart for at gøre det muligt at tilføje forskellige mængder agar til pladerne, er standardpladevolumenet 8 ml.
      BEMÆRK: Det kan være nyttigt at hælde pladerne med en peristaltisk pumpe, især til store eksperimenter.
   2. Såning af pladerne: Frø pladerne med den ønskede bakteriekultur mindst 2 dage før eksperimentets start for at muliggøre korrekt tørring og vækst af bakterieplænen. Typisk er 200 μL bakteriekultur tilstrækkelig til at danne en græsplæne, der vil fodre 40 nematoder i flere uger.
      BEMÆRK: De plader, der typisk bruges til billeddannelse, er tættere forseglet end petriskåle med standardkultur; Derfor anbefales det at frø og tørre pladerne inde i en laboratoriehætte, normalt i ca. 1 time eller indtil de er tørret korrekt.
4. Nematode håndtering
   1. Befolkningsstørrelse: Antallet af nematoder, der pålideligt kan afbildes på en enkelt plade, afhænger af genotypen, den alder, hvor nematoder er belagt, og mængden af mad, der tilsættes til hver plade. For levetidsforsøg, der starter i tidlig voksenalder, skal du indlæse ca. 40 dyr pr. Plade. Dette nummer sikrer tilstrækkelig mad og undgår trængsel.
   2. Voksende store populationer: For at forberede sig på populationsudvidelse og synkronisering skal du starte med en population af nematoder, der passer til den valgte synkroniseringsmetode (se nedenfor). Målet er at udføre synkronisering på dyrene i deres alder med maksimal ægproduktion, hvilket for vildtype N2-dyr er dag 2 i voksenalderen³².
      BEMÆRK: En anden grund til at synkronisere populationer ved at bruge dyr på deres anden dag i voksenalderen er at fjerne moderens alder som en medvirkende faktor til populationsheterogenitet. Moderens alder i C. Elegans har vist sig at påvirke flere fitnessegenskaber hos afkommet, hvor dag 2 vildtypedyr producerer afkom af "højeste kvalitet"³³.
   3. Udførelse af alderssynkronisering: For at opnå nøjagtige resultater skal du synkronisere dyrenes alder så præcist som muligt. I denne protokol udføres alderssynkronisering under anvendelse af en modificeret hypochloritbehandling³⁴. Andre metoder kan omfatte synkronisering ved æglægning, ved L1-larvestop eller ved manuelt at plukke L4-larver.
      BEMÆRK: For alderssynkronisering ved hypochloritbehandling skal du forvente at få tre til fire æg fra hver voksen hermafrodit.
   4. Opretholdelse af afkomsfrie populationer: Oprethold afkomsfrie populationer ved at udsætte nematoder i deres sene L4-stadium for 5-fluor-2'-deoxyuridin (FUdR)³⁵.
      BEMÆRK: Ved lave doser er FuDR dødelig for udvikling af embryoner uden at producere makroskopisk synlige ændringer i kimlinjen eller ændre hastigheden af oocytproduktionen. Andre metoder omfatter anvendelse af temperatursterile mutanter, anvendelse af steriliserende RNAi-konstruktioner eller simpelthen venter til postreproduktiv ældning for at overføre nematoderne til plader til billeddannelse.
   5. Overførsel af populationer: Ved overførsel af tusindvis af dyr mellem plader bliver standardprotokollen, der involverer en platin / iridiumtråd, besværlig. Metoder, der involverer flydende suspension af nematoder, letter overførslerne og gør dem mere effektive. Opsaml nematoderne med M9 + Mg buffer (Na₂HPO₄ 42,27 mM, KH₂PO₄ 22,05 mM, NaCl 85,56 mM, MgSO₄ 1 mM), reducer det samlede volumen, når nematoderne sætter sig ved tyngdekraften, og overfør derefter hurtigt nematoderne til pladerne, der bruges til billeddannelse.
      BEMÆRK: Overførsel af nematoderne med flydende suspension kan føre til variation i antallet af dyr, der overføres til hver plade. Prøv at være konsistent med antallet af nematoder på hver plade for at undgå eksperimentel variabilitet.
   6. Anvendelse af interventioner: At stoppe og genstarte billedoptagelse under et eksperiment komplicerer billedanalysen (se diskussion). Start derfor først LSM-eksperimenterne, når al den nødvendige nematodehåndtering er afsluttet.
5. Sterilisering af gummimåtterne: Autoklave et stort antal måtter samtidigt ved individuelt at pakke dem ind i aluminiumsfolie.
   BEMÆRK: Gummimåtterne skal steriliseres mellem brug for at undgå ophobning af svampe- eller bakterieforureninger. De fleste typer gummi, der typisk anvendes, nedbrydes ved aggressiv ethanolbehandling.

3. Opsætning på forsøgsdagen

1. Pladestøtte og forberedelse af scannerglas: For at forenkle tallerkenhåndteringen må du ikke lægge petriskålene direkte på scanneroverfladen, men i stedet holde dem på plads ved hjælp af gummimåtter understøttet af ruder (se materialetabellen). Populationer er afbildet gennem dette glas, så hold glasset rent og behandlet med anti-tåge, hydrofob og steriliserende belægning (se materialetabellen).
   1. Før pladerne lægges i inkubatoren, skal du rengøre overfladen af pladestøtteglasset på begge sider med anti-tågeglasrenser.
   2. Før pladerne lægges på deres støtteglas, skal du anvende en beskyttende hydrofob glasbehandling (se materialetabellen) for at minimere tåge på den side af glasset, der vil være i kontakt med gummimåtten. Spred denne behandling godt, og lad den stå på glasset i 5-10 minutter, før du fortsætter til næste trin. Rengør kraftigt efter påføring for at fjerne eventuelle rester.
   3. Påfør 70% ethanol for at desinficere overfladen af glasset, der vil være i kontakt med gummimatten. Lad stå i 1 min eller 2 min, og fjern derefter med en klud eller køkkenrulle.
2. Ilægning af pladerne på scannerne
   1. Placer først de autoklaverede gummimåtter oven på det behandlede pladestøtteglas.
   2. Fjern låget fra pladerne, der bruges til billeddannelse med indlæste nematoder, og læg dem på gummimåtteplaceringer, der vender mod glasoverfladen. Sørg for, at gummimåtten er tæt forseglet omkring alle pladerne, for eksempel ved at tilføje en anden glasplade ovenpå og sikre, at den ligger fladt eller ved at banke på toppen af hver plade (løse plader bevæger sig lidt og rammer glasset og giver en lyd, mens tæt sikrede plader ikke bevæger sig, når de tappes).
      BEMÆRK: Det er nyttigt at mærke hvert ark pladestøtteglas individuelt med markeringstape med oplysninger om pladens indhold og den tilsigtede scanner. Disse data kan bruges efter eksperimentet til at løse eventuelle uklarheder vedrørende pladens placering.
   3. Før du lægger pladerne i scannerne, skal du tage stikket ud af scannerventilatorerne for at beskytte eksperimentatorens fingre under pladeindlæsning.
   4. Skub forsigtigt pladerne og glaspladen, der understøtter dem, på scannerens overflade.
      BEMÆRK: Undgå at trykke direkte på gummimåtten, da dette får måtten til at glide hen over pladestøtteglasset. Når måtterne glider, bliver pladerne ofte slået løs fra måtten.
   5. Genaktiver scannerblæserne, og bekræft visuelt, at front- og sideblæserne er strømforsynede. Hvis scannerne er slukket, skal du tænde dem på dette tidspunkt.

4. Erhvervelse før billede

BEMÆRK: Et omfattende rutediagram, der opsummerer alle de softwarebaserede trin under billedoptagelse, er vist i figur 1.

Figur 1: Grafisk oversigt over pipelinen til analyse af levetidsmaskinens billedanalyse. Trinnene før, under og efter billedoptagelse udføres stort set på webgrænsefladen (WI, i rødt) og på Worm Browser (WB, i grønt). Nogle trin udføres på andre platforme (O, i blåt), f.eks. TXT-dokumenter i trin 3a, Photoshop eller tilsvarende i trin 4b og JMP eller tilsvarende i trin 13. Klik her for at se en større version af denne figur.

1. Opsætning af billedoptagelse: Generer en fil, der angiver eksperimentplanen og placeringen af plader på hver scanner for at konfigurere billedoptagelsen.
   BEMÆRK: Denne fil indeholder vigtige metadata såsom eksperimentets titel, hyppigheden af billedoptagelser og eksperimentets samlede varighed. Denne fil genereres typisk ikke de novo for hvert eksperiment, men i stedet genbruges eksperimentfiler fra tidligere eksperimenter som skabeloner. Til en brugers første eksperiment leveres en skabelonfil (Supplerende fil 1).
   1. Anmod om eksempeloptagelser: Angiv placeringen af alle pladerne på hver scanner. Der leveres flere værktøjer til at fremskynde denne proces. Brug først scanneren til at få et billede af hele scanneroverfladen, kaldet "Preview capture". Sørg for, at eksempelbillederne tydeligt viser hele overfladen på hver plade, der skal afbildes (figur 2A), uden striber eller beskæring af pladekanter.
      1. Brug webgrænsefladen til at finde afsnittet Image Acquisition på hovedsiden, og følg linket kaldet Capture Devices and Image Servers. På denne side skal du klikke på knappen markeret Søg efter nye enheder (dvs. scannere) i feltet Image Capture and Processing Servers . Overvåg serverens fremskridt med at registrere scannere ved at klikke på linket [log] ved siden af serveren.
         BEMÆRK: Sørg for, at de ønskede scannere er tændt og tilsluttet serveren, før du udfører dette trin.
      2. På samme side i webgrænsefladen skal du kontrollere, at hver scanner, der er tilsluttet serveren, vises i boksen Image Capture Devices . Etiketten "Mangler" under "Aktuel status" vises ikke længere, hvis enheden registreres. Marker afkrydsningsfeltet for hver scanner, der indeholder nyligt indlæste plader.
      3. Nederst i afsnittet Image Capture Devices skal du klikke på knappen Anmod om forhåndsvisning . Inden for 1 min eller 2 min skal scannerne lyse op og begynde at scanne.
         BEMÆRK: Glasstøttepladernes startposition skal ofte justeres for at bringe alle pladerne ind i det synlige område. Positioner kan korrigeres ved at inspicere eksempeloptagelsesbilleder og foretage justeringer af pladepositionen og tage nye eksempeloptagelsesbilleder igen. Hvis scanninger forløber ekstremt langsomt (flere minutter for en optagelsesscanning), eller hvis eksempelbilleder indeholder lange hvide striber, er dette et tegn på, at en plade, gummimåtten eller et andet objekt blokerer lys i scannerens kalibreringsområde (angivet med hvide pile på scanneroverfladen). Alle genstande skal flyttes således, at kun glasstøtteglasset optager denne region.
   2. Definer scanningsområderne: Følg de næste trin i ormebrowseren for at analysere eksempelhentningsbillederne og samle dem i et enkelt sammensat billede, som bruges til at angive placeringen af hver plade til dataanalysen. Sørg for, at det resulterende billede ligner figur 2B.
      1. Brug først ormebrowseren til at åbne hvert eksempeloptagelsesbillede ved at vælge menupunktet Filer > Åbn billede, og vælg det ønskede billede.
      2. På hvert billede skal du klikke for at vælge kolonnerne for områder med plader (hvis gummimåtten har 16 pladeplaceringer, skal du vælge 4 kolonner).
         BEMÆRK: Scanningsområderne skal angives som høje kolonner (ikke brede rækker), da scanneroptagelsen er langsommere for bredere områder, hvilket resulterer i slørede billeder på grund af nematodebevægelse.
      3. Når alle billederne er defineret, skal du eksportere områdespecifikationerne til disken ved at vælge menupunktet Billedanskaffelse > Definer scanningsområder > Gem valgte scanningsområder på disken og vælge den ønskede placering.
   3. Opret eksperimentplanen:
      1. Følg formatet for supplerende fil 1, saml en fil, der indeholder eksperimentnavnet, de fysiske placeringer af hver kolonne på scannerne (kopieret fra scanningsområdefilen, der blev genereret i trin 4.1.2.3), eksperimentets samlede varighed og billedoptagelsesfrekvensen, og gem denne både som en TXT og som en XML-fil.
      2. Klik derefter på Worm Browser på Image Acquisition > Submit Experiment Schedule, og vælg den genererede XML-fil. Ormebrowseren spørger, om der skal udskrives en oversigt over tidsplanen, eller om eksperimentet skal køres. Klik på Generer en oversigtsfil.
   4. Valider oversigtsfilen: Når du har indsendt eksperimentplanen, udsender ormebrowseren en oversigt over tidsplanen. Dette resumé vises på skærmen og skrives til disken. Læs den, og bekræft datoerne for planlagte optagelser samt placeringen, navnet og antallet af scannere.
   5. Indsend eksperimentplanen: Når du er tilfreds med oversigtsfilen, skal du indlæse XML-filen for eksperimentplanen igen i ormebrowseren ved at vælge menupunktet Billedanskaffelse > Indsend eksperimentplan. Ormebrowseren spørger endnu en gang, om der skal udsendes en oversigt over tidsplanen, eller om eksperimentet skal køres. Denne gang skal du klikke på Kør! .
      BEMÆRK: Et par minutter efter indsendelse af eksperimentet er det klogt at bruge webgrænsefladen til at bekræfte, at eksperimentet er blevet indsendt med succes, og scanninger indsamles af alle scannere. Det er normalt, at de første par scanninger går glip af, især i store eksperimenter.
   6. Organiser eksperimenter på webgrænsefladen: En travl scannerklynge kan producere hundredvis af eksperimentelle datasæt, der indsamles af mange forskellige brugere. Hvis du vil organisere denne liste, skal du tildele eksperimenter til separate grupper, f.eks. svarende til navnet på den bruger, der er ansvarlig for eksperimentet.
      1. Opret en ny gruppe, eller rediger en eksisterende: Opret nye grupper på webgrænsefladen ved at klikke på Administrer eksperimentgrupper under feltet Billedindsamling. På den nye side, der vises, skal du tilføje det ønskede navn på Opret ny gruppe og klikke på Opret. Hvis du vil ændre navnet på en eksisterende gruppe, skal du i det samme felt vælge den ønskede gruppe ud for Rediger eksisterende gruppe og derefter vælge Rediger.
      2. Tildel eksperimenter til en gruppe: Hvis du vil tildele nye eksperimenter til en bestemt gruppe, skal du gå til webgrænsefladen og finde det ønskede eksperiment, der som standard tildeles gruppen Ingen gruppe nederst på eksperimentlisten. Klik på linket til højre for eksperimentafsnittet, hvor der står Rediger, og brug rullelisten til at vælge navnet på den gruppe, der skal bruges. Vælg derefter Gem.
   7. Annuller et eksperiment:
      BEMÆRK: LSM fortsætter med at arbejde autonomt, indtil de endelige scanninger er angivet i eksperimentplanen. Når en eksperimentel tidsplan er afsluttet, vil LSM som standard fortsætte med at indsamle scanninger, men straks kassere billeddataene i en proces kaldet autoscanning. Disse autoscanninger udføres for at forhindre scannerne i at slukke og afkøle og opretholde en standardtemperaturprofil, så andre eksperimenter, der kører i samme rum (men fra et andet eksperiment), ikke påvirkes af nedlukning af andre scannere.
      1. Stop autoscanninger: For at stoppe autoscans fra et igangværende eksperiment på webgrænsefladen skal du klikke på Rediger ud for det ønskede eksperiment, derefter Annuller ventende scanninger og vælge Annuller planlagte optagelser.

Figur 2: Forhåndsvisning af billede og valg af scanningsområde. (A) For hver scanner i eksperimentet genereres et eksempeloptagelsesbillede. (B) Valg af en række plader ad gangen (røde felter), hvilket øger scanningshastigheden og forhindrer sløring af ormens bevægelse som følge af scanningsområder, der er for brede. Klik her for at se en større version af denne figur.

5. Optagelse af billeder

BEMÆRK: Følgende trin kan udføres, både mens eksperimentet kører, eller efter at det er afsluttet.

1. Udskriv eksperimentets maskefil: Rå billeddata fra scannere indeholder mange områder, der ikke behøver at blive behandlet (områder uden for plader). For at fokusere analysen på hver plade individuelt oprettes en "maske", der angiver det område, der er optaget af hver plade på hver scanner. Generer denne maske ved at tegne hver plades position som et overlay på billeder indsamlet af scannerne.
   1. Brug ormebrowseren til at vælge det ønskede eksperiment ved at vælge Filer > Vælg aktuelt eksperiment og derefter klikke på eksperimentnavnet.
   2. Vælg igen Billedanskaffelse i ormebrowseren, > Definer eksempelmasker > generer eksperimentmaskesammensætning, og gem masken på den ønskede placering. Sørg for, at den resulterende fil ligner figur 3A.

Figur 3: Specifikation af pladeplaceringerne for hver scanner ved hjælp af prøvemasker. For at sikre en uafhængig analyse af pladerne inden for kolonnevalgene vist i figur 1 skal de enkelte plader identificeres ved at generere en sammensat billedmaske. (A) En optagelse af scannernes scanninger åbnes med et billedmanipulationsprogram (bemærk navnet på scanneren "han" over en scannet markering og "a-d" henviser til hver af kolonnerne). (B) De enkelte trin i maskegenerering for at markere placeringen af hver plade i maskekompositten kræver, at baggrunden indstilles til sort, (C) fjernelse af takkede kanter og kanter på ikke-valgte plader ved udvidelse og derefter krympning af baggrunden og (D) valg af forgrundsplader og udfyldning af områderne helt med hvide pixels. (E) For at LSM kan genkende individuelle plader i de scannede rækker, fyldes hvert hvidt område i træk med en anden grå nuance, normalt i stigende lysstyrke. (F) På dette tidspunkt gemmes masken (LZW-komprimering uden lag angivet, hvis den genereres i Photoshop). Masken scannes derefter af ormebrowseren, og der genereres en visualisering af masken af softwaren. En korrekt maskevisualisering skal vise en defineret firkant pr. plade med et lille kryds i midten og en anden farve for hver række. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Anmærk eksperimentets maske: Åbn den fil, der blev genereret i det forrige trin, med et billedmanipulationsprogram (f.eks. Photoshop eller GIMP) for at markere placeringen af hver plade i billedet. En oversigt over alle maskeredigeringstrin ved hjælp af Photoshop er beskrevet nedenfor.
   1. I Photoshop skal du vælge fyldværktøjet med tolerancen indstillet til nul, den sammenhængende indstilling valgt og kantudjævningen ikke markeret. Klik på den grå baggrund for at indstille den helt til sort. Sørg for, at det resulterende billede ligner figur 3B.
   2. Brug tryllestavsværktøjet til at vælge den sorte baggrund med aliasen slået fra, tolerancen indstillet til nul og den sammenhængende indstilling valgt. For at udjævne kanterne skal du udvide den valgte baggrund med 30 pixels ved at klikke på Vælg > Rediger > Udvid. Formindsk derefter markeringen med 20 pixel på Vælg > Rediger > kontrakt. Sørg for, at det resulterende billede ligner figur 3C.
   3. Udfyld den udjævnede baggrund helt med sorte pixel, f.eks. ved at indstille tolerancen for værktøjet Fyld til 255 og udfylde det markerede område. Klik derefter på Vælg > Inverse for at invertere markeringen, og vælg forgrunden. Fyld det nye område helt med hvide pixel, f.eks. ved at indstille fyldværktøjets tolerance til 255 og fylde området med hvidt. Sørg for, at det resulterende billede ligner figur 3D.
   4. For at adskille hver plade i et enkelt område skal du fylde hver række med en anden gradient af grå for at øge lysstyrken. Dette kan gøres med værktøjet Fyld og derefter ved at vælge den ønskede farve med tolerancen indstillet til 0. Sørg for, at det resulterende billede ligner figur 3E. Gem det i en LZW-komprimering uden "lag" angivet.
      BEMÆRK: Rækkefølgen af plader indstilles af farven på de angivne regioner. Hvis du vil navngive pladerne 1-4 i rækkefølge oppefra og ned, skal du angive farverne i stigende lysstyrke for hver række.
   5. Vælg Billedanskaffelse i ormebrowseren, > Definer eksempelmasker > Analysér pladeplaceringer, der er tegnet på Sammensat eksperimentmaskesammensætning, og vælg den fil, der blev genereret i forrige trin. Softwaren tager nu et øjeblik at analysere den indsendte maske.
   6. Ormebrowseren viser en maskevisualisering. Undersøg masken for potentielle fejl i filen. Sørg for, at hver række plader er fyldt med en anden farve og skitseret af et farvet rektangel. Sørg for, at det resulterende billede ligner figur 3F.
      BEMÆRK: Hvis en enkelt plade viser to cirkler eller mere, eller hvis to cirkler har samme farve, skal du gå tilbage til trin 5.2 for at rette maskefilen og indlæse den igen i ormebrowseren.
   7. Når du har kontrolleret, at maskevisualiseringen er korrekt, skal du i ormebrowseren vælge Billedanskaffelse > definere eksempelmasker > sende analyseret eksperimentmaskesammensætning til klynge. Billedanalyseserveren analyserer nu placeringen af alle pladerne i eksperimentet.
3. Anvend masken: LSM bruger masker til at opdele de rå billeddata i individuelle plader. For at starte denne proces skal du planlægge et maskeprogramjob ved hjælp af webgrænsefladen.
   1. Før du sender jobbet, skal du kontrollere, at alle scannere har identificeret områder i masken. Gå til hovedsiden i webgrænsefladen, find navnet på eksperimentet og kolonnen med navnet Billedanalyse, og klik på Kør analyse. Kontroller, at alle enheder under Eksperimenteksempler har identificeret områder.
   2. For at anvende masken skal du på den samme grænseflade klikke på Nyt job for alle prøver. I feltet Planlæg et job for individuelle billeder skal du markere feltet Anvend maske og derefter Gem job.
      BEMÆRK: Masken vil blive anvendt på alle de billeder, der allerede er taget, samt på alle billeder, der er taget i fremtiden.
4. Udfør pladekvalitetskontrol:
   BEMÆRK: Plader, der lider af forurening, udtørring eller tåge, censureres på dette stadium af billedanalysen. Et eksempel på forurenede, udtørrede, tågede og optimale plader er vist i figur 4. Andre grunde til censur omfatter sult, tomme plader eller larver i sterile populationer. Ugyldige plader vil ofte indeholde komplekse former, som maskinen har til formål at fortolke som nematoder. Det er vigtigt at udelukke ugyldige plader i dette trin for at forhindre lange behandlingstider i senere trin af billedanalysen.
   1. Brug webgrænsefladen til at ekskludere de plader, der skal censureres, ved at finde det ønskede eksperiment og kolonnen med navnet Anmærk pladeoplysninger og vælge Efter billede.
   2. For at inspicere pladerne skal du klikke på Vis billeder.
      BEMÆRK: Hvis trinnet til visning af billeder ikke fungerer korrekt, er Linux-serveren muligvis ikke konfigureret korrekt. Instruktioner om, hvordan du gør dette, findes i softwareinstallationsvejledningen i det førnævnte GitHub-lager.
   3. For at ekskludere plader skal du markere afkrydsningsfeltet Censor, vælge en indstilling i rullemenuen med navnet Årsag censureret og derefter klikke på Gem for hver side.
5. Tilføj metadataoplysninger: Metadata beskriver indholdet af hver plade i et eksperiment. Disse oplysninger medtages derefter i alle de statistiske datafiler, der efterfølgende genereres.
   1. Hvis du vil tilføje metadataoplysninger vedrørende stamme, genotype, temperatur, mad osv., skal du gå til hovedsiden i webgrænsefladen, finde det ønskede eksperiment og kolonnen Anmærk pladeoplysninger og vælge Efter position.
   2. Indtast etiketterne, og vælg de scannere, som metadataene skal gemmes for, ved at klikke på Gem på enheder i nederste venstre hjørne.
   3. Hvis du vil genbruge metadata mellem forskellige scannere uden at skulle indtaste alle etiketterne igen, skal du gå til Indlæs fra enhed i øverste højre hjørne, vælge den scanner, hvorfra metadata skal genbruges, og klikke på Indlæs fra enhed.
6. Angiv "nul-alder" -tiden: Som standard måler LSM tid i forhold til starten af UNIX-epoken. Dette er sjældent praktisk, så specifikationen af en referencetid er påkrævet (for eksempel den dato, hvor alle individer klækkede eller nåede voksenalderen).
   1. Hvis du vil angive nulaldertidsoplysningerne, skal du gå til hovedsiden i webgrænsefladen, finde det ønskede eksperiment og kolonnen med navnet Billedanalyse og vælge Kør analyse.
   2. På den nye side, der vises, skal du vælge Nyt job for alle områder. I feltet med navnet Opdater regionsoplysninger skal du vælge Tidspunkt, hvor dyr havde 0 alder, tilføje oplysningerne og derefter klikke på Opdater valgte felter.
      BEMÆRK: Hvis alle dyrene ikke deler den samme nulalder, skal du i stedet vælge Nyt job for specifikke dyretyper og gentage ovenstående trin for hver gruppe.
7. Planlæg ormdetektion: LSM kan automatisere detektionen af hver nematode baseret på dens position på pladen.
   1. For at starte den automatiske detektion af nematoder for hvert billede skal du gå til hovedsiden i webgrænsefladen, finde det ønskede eksperiment og kolonnen med navnet Billedanalyse og vælge Kør analyse.
   2. På den nye side, der vises, skal du klikke på Nyt job for alle regioner, derefter på feltet Planlæg et job for individuelle billeder og markere felterne Median Filter > Threshold > Worm Detection > Save Job. Disse job vil blive anvendt på alle tidligere og fremtidige billeder, der tages.
      BEMÆRK: Hvis du kun vil planlægge et job for en bestemt stamme eller tilstand, skal du i stedet klikke på Job for specifikke dyretyper. Objektklassificering udføres ved hjælp af SVM-modeller, der er angivet som filer, der er gemt i undermappen Modeller i LSM'ens langtidslagringsmappe. V2.0 nematodedetekteringsparametersæt til LSM kan downloades fra GitHub-lageret.

Figur 4: Pladekvalitetskontrol ved hjælp af webgrænsefladen. Censurering af suboptimale plader på webgrænsefladen før ormebevægelsesanalysen er afgørende for at fremskynde billedbehandlingsrørledningen. Eksempler på plader, der skal fjernes, omfatter betingelser for (A) udtørring, (B) forurening eller (C) tåge, som modsat. D) Optimale plader, der skal indgå i yderligere analyse. En skalabjælke på 10 mm er overlejret på et eksempeloptagelsesbillede. Klik her for at se en større version af denne figur.

6. Erhvervelse efter billede

BEMÆRK: Når ormdetektion er afsluttet, skal alle data indsamlet fra eksperimentet aggregeres over tid for at spore hvert individ i hele deres levetid og identificere alle individernes dødstider. Vent, indtil alle dyr i forsøget er døde, og indtil alle ormedetekteringsjob er fuldført, og udfør derefter følgende trin:

1. Planlæg bevægelsesanalysen:
   1. Bevægelsesanalysen integrerer alle eksperimentelle data over tid for at estimere dødstiderne. For at starte dette job skal du gå til hovedsiden i webgrænsefladen og finde det ønskede eksperiment i kolonnen med navnet Billedanalyse. Vælg linket Kør analyse.
   2. På den nye side, der vises, skal du klikke på linket Nyt job for alle regioner, og fra rullemenuen, Planlæg et job for en hel region, vælg Analysér ormbevægelse, og klik på knappen Gem job.
   3. LSM-billedoptagelsesserveren begynder automatisk at analysere bevægelse på tværs af alle pladerne.
      BEMÆRK: Bevægelsesanalyse er det største enkeltstående job. På en moderne multi-core processor kan analysen af hver plade fra et 1 måned lang levetidseksperiment tage 20 minutter eller mere.
2. Generer et storyboard: Når bevægelsesanalysen er afsluttet, giver LSM-storyboardet brugerne mulighed for manuelt at validere de automatiserede resultater og sikre, at softwaren gør korrekte antagelser om nematodemorfologi og adfærd.
   1. Find det ønskede eksperiment og kolonnen Billedanalyse på hovedsiden i webgrænsefladen, og vælg Kør analyse. På den nye side, der vises, skal du klikke på Nyt eksperimentjob. Vælg derefter Generer dyrestoryboard i afsnittet Planlæg et job for en hel region, og klik på Gem job.
   2. Når LSM er færdig med at generere storyboardet, skal du gå til Worm Browser og vælge det ønskede eksperiment. Tilbage i hovedmenuen skal du vælge Validering > gennemse hele eksperimentet > umiddelbart efter hver orms død.
3. Anmærk storyboards på Worm Browser: Et typisk storyboard på Worm Browser skal se sådan ud Figur 5.
   1. Anmærk objekter uden orm
      BEMÆRK: Hvert objekt, der registreres under bevægelse, vises på storyboardet, sorteret efter den estimerede dødstid. Medmindre brugeren angiver andet, medtages hvert objekt i de resulterende overlevelseskurver. LSM-objektklassificeringen er bevidst kalibreret til at have en høj falsk-positiv rate som en afvejning for at minimere antallet af uopdagede nematoder. Udelukkelsen af ikke-ormobjekter er vigtig for at opnå overlevelseskurver af høj kvalitet (se de repræsentative resultater). Et stort antal objekter uden orm findes typisk på den første og den sidste side af storyboardet, som hurtigt manuelt kan udelukkes i bulk.
      1. Hvis du vil udelukke objekter, der ikke er orme, på storyboardet, skal du højreklikke én gang på objektets billede. Det ekskluderede objekt vil nu blive skitseret af en hvid boks. Hvis du vil udelukke mange objekter samtidigt, skal du holde ctrl-tasten nede og højreklikke én gang på et objekt, hvorefter alle objekter på storyboardsiden udelukkes.
      2. Når et objekt er udeladt fra analysen, kan objektet medtages igen ved at højreklikke to gange igen.
      3. For at gemme de kommentarer, der er foretaget under storyboard-kommentaren, skal du klikke på knappen Gem . Det anbefales ofte at gemme fremskridtene, mens du kommenterer.
   2. Kommenter dødstiderne:
      BEMÆRK: Uden brugerintervention estimerer LSM nøjagtigt dødstiderne for de fleste befolkninger. Det anbefales dog rutinemæssigt at bekræfte nøjagtigheden af de automatiserede resultater ved manuelt at validere en tilfældig delmængde af individer fra hvert eksperiment. Der bør lægges ekstra vægt på de kortest og længstlevende individer, da eventuelle fejl i automatiseret analyse har tendens til at samle sig i disse grupper.
      1. Venstreklik én gang på et objekt på storyboardet for at åbne et nyt vindue, der viser detaljerede tidsserieoplysninger om objektet. Dette vindue tillader inspektion af alle de billeder, der er indsamlet af objektet gennem hele eksperimentet, samt kvantificering af objektets bevægelsesdynamik og morfologi. Brug den samme grænseflade til manuelt at kommentere dødstiderne. Grænsefladen for annotering af dødstidspunkt er vist i figur 6.
      2. For manuelt at kommentere dødstiderne skal du venstreklikke på den nederste bjælke på det punkt, der svarer til dødstidspunktet. Brug mellemrumstasten og højre eller venstre pil på tastaturet til at bevæge dig gennem tidsrammerne, eller klik direkte på linjen inden for den ønskede tidsramme.
         BEMÆRK: Visualiseringen repræsenterer dyrenes bevægelsestilstand over tid, ligesom et vandret søjlediagram med x-aksens markeringstid. Den lyserøde / lilla sektion angiver den tidsperiode, hvor objektet bevæger sig kraftigt, gul angiver svag bevægelse, rød angiver ikke-bevægelige dyr, og grøn angiver perioden med dødsrelateret ekspansion. Nematoder viser karakteristiske dødsassocierede morfologiske hændelser: en gradvis kropskontraktion, der normalt forekommer før døden, efterfulgt af en hurtig kropsudvidelse under eller umiddelbart efter døden (figur 6B). Ikke-ormeobjekter som støv eller skygger viser ikke disse dynamikker i kropsstørrelse og følger i stedet typisk en lineær, gradvis ændring i størrelse og intensitet over tid. Disse forskellige kropsstørrelsesdynamikker giver en hurtig og ligetil metode til hurtig klassificering og manuel udelukkelse.
      3. Afhængigt af analysemetoden kan dødstidspunktet betragtes som enten tidspunktet for bevægelsesophør (starten på den røde bjælke i bevægelsesvisualiseringen) eller som tidspunktet for dødsrelateret ekspansion (den grønne bjælke i bevægelsesvisualiseringen). For manuelt at kommentere sammentræknings- og udvidelseshændelser skal du højreklikke på den nederste bjælke på den ønskede tidsramme.
   3. Nogle rudimentære mortalitetsdatavisualiseringer leveres indbygget i Worm Browser-klienten. Overlevelseskurver og dødstidsdiagnostik vises for hver population, der er til stede i storyboardet (figur 7). Se overlevelseskurverne på venstre side og spredningsplottet, der sammenligner tidspunktet for kraftig bevægelsesophør (VMC) med dødstidspunktet for hver enkelt person på højre side af storyboardet.
      BEMÆRK: Det er muligt at gruppere disse resultater efter forskellige eksperimentelle parametre ved at underindstille på den nederste bjælke for forhold som specifikke stammer, scannere eller plader. Individuelle orme kan vælges baseret på deres dødstider ved at venstreklikke på individuelle punkter i VMC versus dødstidsplottet.
4. Skrivning af dødelighedsdata til disk: LSM producerer dødelighedsdata i form af CSV-filer. Plot de outputte overlevelseskurver, og analyser dem på enhver statistisk software såsom R, SAS, STATA eller JMP.
   1. For at generere disse filer skal du vælge eksperimentet i ormens browser, og i menuen skal du vælge Datafiler, dødstider og derefter klikke på Generer dødstider for aktuelt eksperiment. LSM genererer en outputfil med eksperimentets overlevelsesdata, som gemmes i resultatmappen.
   2. Hvis der er udført manuelle annoteringer på storyboardet, vises en prompt i Worm Browser, der spørger, hvordan man håndterer håndannoteringer. Klik på "Straks" for at inkludere manuelle kommentarer på den udsendte dødstidsfil.
      BEMÆRK: Dødelighedsdatafiler skrives til resultatmappen, der er angivet i imageserver.ini filen. En række filer skrives, men den mest almindeligt anvendte version er "survival_simple/survival=machine_hand", som indeholder alle de manuelle kommentarer foretaget ved hjælp af storyboardet.
   3. Analyser dødelighedsdataene i den valgte statistiske software.

Figur 5: Animal storyboard på Worm Browser. (A) Alle stationære orme vises i kronologisk rækkefølge efter maskinkommenteret dødstidspunkt. For at navigere i storyboardet skal du trykke på knapperne i (B) nederste højre hjørne og (C) gemme kommentarerne ofte. (D) Billederne med en ikke-grå baggrund viser to ormedødshændelser (tidlig død som grøn, senere død som rød), som enten kan forekomme, når to orme dør tæt på hinanden, eller når døde orme flyttes af en forbipasserende orm og således opdages som døde to gange. (E) Et rødt mærke i nederste hjørne af et billede identificerer orme med en registreret dødstid; (F) et grønt mærke angiver, hvor en genstand ikke forblev stille længe nok til at registrere et dødstidspunkt. (G) Flere orme i samme ramme kan markeres ved at trykke på Skift og venstreklikke. (H) Objekter, der ikke er orme, udelukkes fra analysen med et højreklik. (I) Eksploderede orme censureres fra analysen ved at klikke på det tilsvarende billede (et manuelt annotationsvindue åbnes) og trykke på skift og højreklikke, indtil meddelelsen "dyr eksploderet" vises. En skalalinje på 0,5 mm og etiketter er overlejret på skærmbilledet af et ormebrowservindue. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Inspektion af objekter og annotering af dødstider i Worm Browser. Venstreklik på et objekt på Worm Browser storyboard åbner en ny grænseflade og giver brugeren mulighed for at inspicere objektets bevægelsesdynamik. På højre side vises (A) bevægelsesscoren, som kvantificerer objektbevægelsen; Dette estimeres ved ændringen i pixelintensiteter mellem på hinanden følgende observationer. Derudover vises (B) ændringen i den samlede objektintensitet på højre side, hvilket kvantificerer ændringer i objektstørrelsen. På venstre side viser den øverste bjælke (C) maskinens estimat af dødstidspunktet, mens den nederste bjælke er (D) menneskelig håndannotation. Ved at klikke på et hvilket som helst punkt på søjlerne og trykke på mellemrumstasten kan brugeren bevæge sig gennem de tidsrammer, hvor ormen er afbildet. På disse søjler repræsenterer pink den tid, der bruges i kraftig bevægelse, rød repræsenterer den tid, der bruges i døden, og gul er alt derimellem. Den tid, der bruges i ekspansion og sammentrækning efter dødstidspunktet, vises med grønt. Etiketter er overlejret på skærmbilledet af et ormebrowservindue. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Befolkningsoversigtsstatistik på Worm Browser. Befolkningsstatistik for scannerenheden "obiwan", med et plot af overlevelsen (venstre panel) og et spredningsplot af VMC-tiden (vigorous movement cessation) versus dødstiden (højre panel). De afbildede er detaljer om (A) en tilstand, opnået fra (B) en scanner opnået ved først at vælge (C) overlevelsesgrupperingen efter stamme. (D) De firkantede former i spredningsplottet viser de manuelt kommenterede begivenheder, mens (E) de cirkulære former skildrer de maskinkommenterede begivenheder. (F) Manuel annotering er ofte påkrævet for dødshændelser, der forekommer tidligt, eller (G) dem, hvor tidspunktet for kraftig bevægelsesophør falder sammen med dødstidspunktet. Etiketter er overlejret på skærmbilledet af et ormebrowservindue. Klik her for at se en større version af denne figur.

Representative Results

Eksperimentel reproducerbarhed i levetidsanalyser er udfordrende og kræver både stramt kontrollerede eksperimentelle forhold og store populationer for at opnå tilstrækkelig statistisk opløsning ^4,36. LSM er unikt egnet til kortlægning af store populationer af dyr i et konstant miljø med høj tidsmæssig opløsning. For at demonstrere LSM's evne, fremhæve de afgørende trin i analysen og hjælpe forskere med at prioritere deres arbejdsindsats, præsenterer vi en delmængde af data fra et optimalt, tidligere offentliggjort eksperiment²³. På grund af dette forsøgs karakter som dosis-respons-assay var der behov for et betydeligt antal dyr for pålideligt at påvise levetidsændringer. I hånden ville dette eksperiment kræve en intens tidsforpligtelse fra flere forskere eller, hvis det blev nedskaleret, føre til underdrevne resultater. Datasættet målte kvantitative ændringer i levetid efter fjernelse af RNA-polymerase II (b) underenhedsgenet (RPB-2), der kræves til messenger RNA-transkription. Brug af det auxin-inducerbare system³⁷ in C. elegans, det endogene locus af RPB-2 blev mærket med en degron sekvens til betinget allestedsnærværende og nedbryde RPB-2 ved hjælp af forskellige koncentrationer af auxin (α-naphtaleneeddikesyre). Eksperimentet blev udført på AMP100 [rpb-2 (cer135); eft-3p::TIR-1] med cer135 svarende til det CRISPR-indsatte AID-tag rpb-2::GFPΔpiRNA::AID::3xFLAG²³. De eksperimentelle betingelser var ved en temperatur på 20 °C og ved anvendelse af UV-inaktiveret NEC937 (OP50 ΔuvrA; KanR)³⁸E. Coli. Hermafroditter blev steriliseret ved at overføre nematoder i det sene L4-stadium til plader indeholdende 5-fluor-2-deoxyuridin (FUdR). Nematoder blev overført i løbet af dag 2 i voksenalderen til plader indeholdende forskellige koncentrationer af auxin. I den oprindelige undersøgelse viste forfatterne, at RPB-2-nedbrydning i nærvær af auxin forkortede levetiden på en dosisafhængig måde²³. 

Her demonstrerer vi det bidrag, som datavalidering og annotering efter eksperiment yder til det endelige overlevelseskurveoutput (figur 8). I de sidste trin af billedanalysen i Worm Browser-storyboardet sammenlignede vi rå overlevelseskurver produceret før storyboard-annotation med overlevelseskurverne produceret efter manuel udelukkelse af ikke-ormobjekter og også med overlevelseskurverne produceret efter annoteringen af både ikke-ormobjekter og individuelle dødstider (figur 8A-C). Vi fandt ud af, at de oprindelige overlevelseskurver, der blev produceret før storyboard-annotation (figur 8A), blev forvrænget af forkert inkludering af ikke-ormobjekter, hvilket var mest tydeligt i overlevelseskurvernes haler. Før manuel annotering omfattede overlevelseskurverne alle objekter, der blev detekteret af maskinen som potentielle ormeobjekter, hvoraf ca. halvdelen på grund af den bevidst høje falske positive rate var ikke-ormeobjekter og måtte udelukkes manuelt (figur 8D). Dette er tilsigtet, da algoritmerne er kalibreret til at have en relativt høj falsk-positiv rate for at undgå falske negativer, da det er meget lettere at udelukke forkert inkluderede objekter end at søge efter og gendanne forkert udelukkede objekter. Efter at have ekskluderet objekter uden orm under manuel storyboard-annotering, var de resulterende overlevelseskurver af meget højere opløsning (figur 8B, E), og yderligere manuel annotering af dødstiderne på storyboardet producerede ændringer på højst ~ 4% i den estimerede gennemsnitlige levetid. Vi demonstrerer derfor, at fjernelsen af ikke-ormeobjekter under LSM's billedanalysepipeline er det afgørende skridt for at opnå velopløste overlevelseskurver.

Figur 8: Effekten af manuel datavalidering på overlevelseskurver. Nedbrydningen af RPB-2 forkorter C. elegans levetid i nærvær af auxin (K-NAA: α-napthaleneeddikesyre) på en dosisafhængig måde. (A) Overlevelseskurver plottet ud fra LSM råoutput efter kvalitetskontrol af pladerne og uden manuel annotering af ormeobjekterne på Worm Browser storyboardet. (B) Overlevelseskurver plottet efter manuel annotering af ormeobjekterne på storyboardet. (C) Overlevelseskurver plottet efter manuel annotering af ormeobjekterne og dødstider på storyboardet. D) Sammenfatning af alle genstande, der er detekteret af LSM. De censurerede ormeobjekter omfattede objekter, der blev udelukket automatisk (f.eks. på grund af orme, der bevægede sig uden for det scannede område) eller manuelt af eksperimentatoren (f.eks. på grund af orme, der sprængte). (E) Tabelgengivelse af den estimerede gennemsnitlige levetid efter manuel annotering af ormeobjekter (venstre) og yderligere anmærkning om dødstid ved hånden (højre). Procentvis forskel i den gennemsnitlige levetid mellem nabogrupper med forskellige auxinkoncentrationer og den statistiske detektionsstyrke. Alle grafer blev plottet på statistiksoftwaren JMP. Dataene for denne figur blev tilpasset med tilladelse fra Oswal et ^al.23. Klik her for at se en større version af denne figur.

Ved at bevæge os ud over levetiden som et enkelt endepunkt for at studere aldring overvejede vi derefter adfærdsmæssig aldring og undersøgte, hvilke trin i den posteksperimentelle billedanalyse der var mest afgørende for at måle den. Med fokus på forholdet mellem kraftig bevægelsesophør (VMC) og levetid sammenlignede vi LSM-outputtet på forskellige stadier af billedanalyse og validering (figur 9A-D). Vi fandt ud af, at ikke-ormeobjekter viste et unikt forhold mellem den tilsyneladende VMC og levetid, hvor de to blev kommenteret som forekommende næsten samtidigt i hvert objekt (figur 9A). I modsætning hertil ophørte ægte nematoder normalt med at bevæge sig kraftigt flere dage før deres dødstid (figur 9A). Denne forskel i forholdet mellem VMC og levetid giver et ekstra middel til hurtigt at identificere og ekskludere ikke-ormeobjekter.

Figur 9: Effekten af manuel datavalidering på VMC-analyse (vigorous movement cessation). (A) Adfærdsmæssige aldringsdata uden manuel annotering af ormeobjekter på Worm Browser-storyboardet, der viser forholdet mellem dødstider og VMC-tider i ikke-ormobjekter (i sort) versus ormeobjekter (i rødt). (B) Adfærdsmæssige aldringsdata plottet efter manuel annotering af ormobjekter på storyboardet. (C) Adfærdsmæssige aldringsdata plottet efter manuel annotering af ormeobjekter og dødstider på storyboardet. (D) Tabelgengivelse af den gennemsnitlige resterende levetid (ARL; opnået fra skæringspunktet mellem dødsalderen og VMC-alderen) på tværs af forskellige trin i billedanalysepipelinen og procentvis forskel i ARL mellem ormens objektannotation og yderligere dødstidsannotering. (E) Grafisk repræsentation af de estimerede ARL'er på tværs af forskellige trin i analysen efter billederhvervelse og deres forhold til ormens levetid (som afhænger af auxinkoncentrationen: α-napthaleneeddikesyre). Spline fit blev udført ved hjælp af en kubisk spline metode. Alle grafer blev plottet på statistiksoftwaren JMP. Dataene for denne figur blev tilpasset med tilladelse fra Oswal et ^al.23. Klik her for at se en større version af denne figur.

Vi fandt, at annotering og udelukkelse af ikke-ormeobjekter ved hjælp af Worm Browser var tilstrækkelig til at give et groft skøn over forholdet mellem VMC og dødstider (figur 9A-C), hvilket opsummerer den forventede dynamik i det fysiologiske fald i nematoder²³. For yderligere at undersøge dette overvejede vi det samme RNA-polymerase II-datasæt og estimerede den gennemsnitlige resterende levetid (ARL) efter VMC for hver subpopulation som skæringspunktet for en lineær regressionsmodel, der relaterer levetiden til VMC. For at forstå effekten af dataannotering på ARL genberegnede vi ARL efter hvert trin i dataannoteringen (figur 9E). Vi fandt ud af, at den manuelle annotering af dødstider i adfærdsmæssig aldringsanalyse var særlig vigtig i længerelevende orme, i dette tilfælde dem, der blev udsat for de laveste koncentrationer af auxin (figur 9D, E). I modsætning til den minimale effekt på overlevelseskurverne havde manuel annotering af dødstiderne en betydelig effekt på det kvantitative forhold mellem VMC og levetid, hvilket øgede den estimerede ARL, for eksempel ved 0 μM auxin, fra 8,09 dage til 10,42 dage efter dødstidsannotering; dette repræsenterer en ARL-forskel på 29%. Derfor fandt vi, at forholdet mellem VMC og dødstider forklaret af ARL var meget mere følsomt over for hånd-hånd-annotering af dødstiderne sammenlignet med målinger af dødstider for levetid alene. Denne følsomhed kan forklares ved ARL's relative varighed og levetid; de samme justeringer af dødstiden vil normalt være små i forhold til levetiden, men store i forhold til ARL. Således vil justeringer af dødstiderne have en større relativ effekt på ARL sammenlignet med levetiden.

Supplerende fil 1: Struktur af Lifespan Machine-eksperimentskemafilen. Forsøgsplanen består af tre dele. Først medtages de grundlæggende oplysninger om eksperimentet, f.eks. specifikationen for navn og registrering. Fra denne del skal normalt kun navnet på eksperimentet ændres for hvert nyt eksperiment. Den anden del af dokumentet genereres ved at eksportere scanningsområder fra Worm Browser og angiver den fysiske placering af scanningsområderne for hver scanner ("asuna", "bulma", "moskva", "rio", "yuno" og "yuki" i dette eksempel). Disse erstattes for hvert nyt eksperiment og kopieres fra de TXT-filer, der genereres for hver scanner individuelt under trin 4.1.2.3. Den tredje del af dokumentet indeholder oplysninger om eksperimentets varighed, som også bør ændres for hvert nyt eksperiment, og fangstfrekvensen. Enheden scanner hvert defineret område et ad gangen med bestemte intervaller i hele eksperimentets varighed. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Her leverer vi en detaljeret, tilgængelig protokol til udførelse af et eksperiment ved hjælp af den nyeste version af Lifespan Machine. Vi har vist, at det kritiske trin for at opnå velopløste overlevelseskurver er manuel udelukkelse af ikke-ormeobjekter under erhvervelse efter billede. Manuel dødstidsannotering har en lille effekt på overlevelseskurvernes overordnede form, hvilket viser, at fuldautomatisk estimering af dødstid er effektiv, selv uden manuel annotering (figur 8). Tværtimod kræver erhvervelsen af adfærdsmæssige aldringsdata af høj kvalitet mere omhyggelig annotering af dødstiderne, især hos langlivede individer (figur 9). Derfor vil den tid, der kræves til storyboard-annotering i hånden, i sidste ende afhænge af det specifikke resultat, der måles. Samlet set finder vi, at når man arbejder med LSM, er forskerens indsats mest afgørende under den eksperimentelle opsætning og i mindre grad under post-image acquisition analysen. Endelig fremhæver vi værdien af automatiserede assays med høj kapacitet til at producere højt opløste overlevelses- og adfærdsmæssige aldringsdata, samtidig med at forskernes produktivitet øges og eksperimentel reproducerbarhed understøttes.

LSM huser nematoder på agarplader og genskaber den klassiske levetidsanalyse i en automatiseret sammenhæng. Andre værktøjer er blevet udviklet til at automatisere måling af levetid i C. elegans ved hjælp af forskellige metoder til nematodeindeslutning. Disse omfatter tilgange, hvor enkelte nematoder er anbragt i faste medier (WorMotel¹⁵) eller i en mikrofluidisk enhed (Lifespan-on-a-chip¹¹) eller dem, der sporer en større population af dyr ved hjælp af mikrofluidik (WormFarm¹⁴). Fordelene ved mikrofluidiske platforme inkluderer muligheden for præcis miljøkontrol i realtid og automatisk fjernelse af afkom ved størrelsesudelukkelse. Imidlertid har de førnævnte enheder hidtil ikke vist sig let skalerbare, da de kræver omfattende manuel håndtering og ofte er afhængige af daglig billed- eller videooptagelse udløst af en eksperimentalist. Andre platforme, såsom Stress-Chip³⁹, bruger de modificerede flatbedscannere designet til LSM til at afbilde brugerdefinerede mikrofluidiske enheder.

I modsætning til andre metoder har LSM omfattende dataannotations- og valideringsfaciliteter, hvilket giver brugerne mulighed for systematisk at udføre den kvalitetskontrol, der kræves for at indsamle præcise og nøjagtige levetidsdata i høj opløsning i en kontekst med høj kapacitet¹³. Teknikken er alsidig på grund af dens anvendelse af nuværende agarpladebaserede laboratorieprotokoller og giver en unik fordel for eksperimentel skalerbarhed på grund af den relative lethed ved at opstille store grupper af flatbedscannere. Selvom LSM kræver en indledende tidsinvestering for at bygge og drive og træne brugere på den specialiserede software, opvejes disse omkostninger af den robuste, høje gennemstrømningsproduktion af levetidsdata. Levetid Maskinklynger på 50 scannere eller mere er blevet implementeret i flere laboratorier og kører kontinuerligt i mere end et årti⁴⁰.

LSM har begrænsninger. Dyrene anbringes i scannere under den automatiserede indsamling af overlevelsesdata, hvilket begrænser forskernes mulighed for at udføre eksperimentelle indgreb samtidig med observation og kræver enten sterilisering af dyrene eller start af forsøg efter nematodernes reproduktionsfase. Ændringer i temperaturen er en sjælden undtagelse fra begrænsningen af indgreb, da omgivelsestemperaturen kan moduleres uden behov for at åbne scannerne og få adgang til dyrene. I tilfælde, hvor der skal anvendes praktiske indgreb på nematoderne midt i livet, er en almindelig løsning at udsætte starten på automatiseret observation, indtil den nødvendige håndtering af dyrene er udført. Derudover er der en iboende variation i placeringen af plader i og på tværs af scannerne. Disse kan være underlagt små, lokale forskelle i miljøforhold (såsom temperatur, lys, ventilation osv.), Som kan påvirke C. Elegans levetid¹⁹. Denne miljøpåvirkning kan yderligere kvantificeres og undersøges ved hjælp af accelererede fejltidsregressionsmodeller⁴¹. En måde at afbøde denne effekt på er ved blot at skalere antallet af plader og scannere for at opnå en streng måling uafhængig af miljømæssige udsving. Almindeligvis er plader af samme tilstand tilfældigt fordelt inden for hver scanner, og populationsstørrelser større end 500 individer pr. tilstand og på tværs af scannere har vist statistisk robuste overlevelsesestimater³¹.

Alt i alt giver LSM mulighed for høj nøjagtighed og stor befolkningsindsamling af overlevelses- og adfærdsmæssige aldringsdata og kan gøre det muligt at udføre tidligere umulige skærme på en kvantitativ måde. På denne måde bidrager LSM med et stort teknisk fremskridt for den standardiserede samling af overlevelseskurver og giver en ny ramme for den koblede undersøgelse af levetid og adfærdsmæssig aldring hos nematoder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Naphtaleneacetic  acid (Auxin)	Sigma	N0640	Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR)	Sigma	F0503	27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria
Glass cleaner	Kristal-M	QB-KRISTAL-M125ml
Hydrophobic anti-fog glass treatment	Rain-X Scheibenreiniger	C. 059140
Rubber matt	Local crafstman		Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock
Scanner glass	Local hardware supplier		9" x 11.5" inch glass sheet
Scanner plates	Life Sciences	351006	50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish
USB Reference Thermometer	USB Brando	ULIFE055500	For calibrating temperature of scanners