Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Atferdsmessige aldrings- og levetidsanalyser med høy gjennomstrømning ved bruk av levetidsmaskinen

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65462
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2
1Centre for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2Universitat Pompeu Fabra (UPF)

Summary

Bildeplattformen "The Lifespan Machine" automatiserer livslang observasjon av store populasjoner. Vi viser trinnene som kreves for å utføre levetid, stressmotstand, patogenese og atferdsmessige aldringsanalyser. Kvaliteten og omfanget av dataene tillater forskere å studere intervensjoner i aldring til tross for tilstedeværelsen av biologisk og miljømessig variasjon.

Abstract

Genetisk identiske dyr holdt i et konstant miljø viser en bred fordeling av levetid, noe som gjenspeiler et stort ikke-genetisk, stokastisk aspekt til aldring bevart på tvers av alle organismer som studeres. Denne stokastiske komponenten betyr at for å forstå aldring og identifisere vellykkede tiltak som forlenger levetiden eller forbedrer helsen, må forskere overvåke store populasjoner av forsøksdyr samtidig. Tradisjonell manuell dødsskåring begrenser gjennomstrømningen og skalaen som kreves for storskala hypotesetesting, noe som fører til utvikling av automatiserte metoder for levetidsanalyser med høy gjennomstrømning. Lifespan Machine (LSM) er en bildebehandlingsplattform med høy gjennomstrømning som kombinerer modifiserte planskannere med tilpasset bildebehandlings- og datavalideringsprogramvare for livslang sporing av nematoder. Plattformen utgjør et stort teknisk fremskritt ved å generere svært tidsmessig oppløste levetidsdata fra store populasjoner av dyr i en enestående skala og med en statistisk presisjon og nøyaktighet lik manuelle analyser utført av erfarne forskere. Nylig har LSM blitt videreutviklet for å kvantifisere atferdsmessige og morfologiske endringer observert under aldring og relatere dem til levetid. Her beskriver vi hvordan du planlegger, kjører og analyserer et automatisert levetidseksperiment ved hjelp av LSM. Vi fremhever videre de kritiske trinnene som kreves for vellykket innsamling av atferdsdata og overlevelseskurver av høy kvalitet.

Introduction

Aldring er en kompleks, mangesidig prosess preget av en nedgang i kroppens fysiologiske funksjon, noe som fører til økt risiko for sykdom og død over tid1. Levetid, målt som tiden fra fødselen eller begynnelsen av voksen alder til døden, gir et entydig utfall av aldring2 og en indirekte, men strengt kvantitativ proxy for å måle den relative aldringshastigheten mellom populasjoner3. Aldringsstudier avhenger ofte av nøyaktige målinger av levetid, i likhet med kliniske studier, for å sammenligne utfall mellom en populasjon utsatt for en intervensjon og en ueksponert kontrollgruppe. Dessverre gjennomsyrer reproduserbarhetsproblemer aldringsforskning, noen ganger på grunn av statistisk underpowered eksperimenter4 og ofte på grunn av den iboende følsomheten til levetidsanalyser for subtile variasjoner i miljøet5. Robuste eksperimenter krever flere replikater av store populasjoner, og denne prosessen drar spesielt nytte av den eksperimentelle skalerbarheten som tilbys av automatisering6.

De strenge kravene til levetidsanalyser stammer fra uforutsigbarheten i selve aldringsprosessen. Isogene individer plassert i identiske miljøer viser forskjellige dødstider og frekvenser av fysiologisk nedgang7, noe som tyder på at levetiden innebærer en høy grad av stokastisitet 7,8. Derfor er store populasjoner pålagt å måle kvantitative endringer i aldringsprosessen, for eksempel endringer i gjennomsnittlig eller maksimal levetid, og for å overvinne forstyrrelser som følge av individuell variabilitet. I tillegg er kapasitet for levetidsanalyser med høy gjennomstrømning avgjørende for å støtte studier av overlevelseskurveformer og modeller av dynamikken i aldring9.

Nematoden Caenorhabditis elegans er en uvurderlig modell for aldringsforskning på grunn av sin korte levetid, genetiske trekkbarhet og raske generasjonstid, noe som understreker dens egnethet for aldring med høy gjennomstrømning og levetidsanalyser. Tradisjonelt har levetiden i C. Elegans har blitt målt ved å følge en synkronisert, liten populasjon på rundt 50-100 dyr over tid på solide medier og skrive ned tidspunktet for individuelle dødsfall. Etter hvert som dyrene eldes og mister mobiliteten, krever manuell skåring av dødstidene individuelt prodding av dyrene og kontroll av små bevegelser av hodet eller halen. Dette er vanligvis en langtekkelig og arbeidskrevende prosess, selv om det er gjort anstrengelser for å akselerere den 10,11,12. Det er viktig at langsomme eksperimentelle rørledninger hindrer fremgang i vår forståelse av aldring og effektiviteten av testede inngrep.

For å møte kravene til aldringsforskning for kvantitative data, har mange teknologier blitt utviklet for å automatisere datainnsamling, inkludert et bemerkelsesverdig utvalg av tilnærminger fra mikrofluidiske kamre til planskannere 13,14,15,16,17,18. LSM skiller seg fra andre metoder i sin omfattende optimalisering for innsamling av svært presise og nøyaktige levetidsdata, som oppnås gjennom utvikling av nøye utstyrskalibreringsprotokoller kombinert med en omfattende programvarepakke som lar brukerne validere, korrigere og forbedre automatiserte analyser13. Selv om programvaren i prinsippet kan brukes på ulike bildebehandlingsmodaliteter, bruker de fleste brukere i praksis planskannere modifisert for å muliggjøre finjustert kontroll over omgivelsestemperatur og fuktighet - faktorer av kritisk betydning på grunn av deres store effekt på levetiden19. LSM tar bilder av nematoder hvert 20. minutt over intervaller fra dager til måneder, avhengig av miljøforhold og genotype. Dataene som produseres har mye høyere tidsoppløsning sammenlignet med data fra manuelle analyser, og bildene som samles inn gir en permanent visuell registrering av nematodeposisjonen over hele levetiden. Ved hjelp av maskinlæringsmetoder tildeles dødstider automatisk til hver enkelt person. Disse resultatene kan raskt og manuelt valideres ved hjelp av en klientprogramvare kalt "Worm Browser". Som et resultat av maskinvaren og programvaren kan LSM generere overlevelseskurver som statistisk ikke kan skilles fra manuell dødsskåring i hendene på erfarne forskere, med den ekstra fordelen av redusert arbeidsbelastning og høyere skalerbarhet13.

Den nyeste versjonen av LSM tillater også studier av atferdsmessig aldring ved å samle morfologiske og atferdsdata gjennom nematodens liv og rapportere det sammen med levetiden til hver enkelt person. Spesielt fanger LSM tiden for hvert dyrs kraftige bevegelsesopphør (VMC), et landemerke som ofte brukes til å kvantifisere "helsen" til et individ som forskjellig fra levetiden. Ved samtidig å samle inn levetid og atferdsmessige aldringsdata, støtter LSM studiet av intervensjoner som kan ha forskjellige effekter på forskjellige fenotypiske utfall av aldring20. En rekke makroskopisk observerbare fenotyper kan brukes til å studere atferdsmessig aldring, for eksempel kroppsbevegelse eller svelgpumping21, vevsintegritet22 og bevegelseshastighet eller stimulusindusert sving17. Sammenligninger mellom ulike aldringsfenotyper kan støtte analyser av årsaksstrukturen til aldringsprosesser. For eksempel ble sammenligningen mellom VMC og levetid nylig brukt til å karakterisere to forskjellige aldringsprosesser i C. elegans23.

Mens den opprinnelig ble utviklet for å måle levetid i C. elegans, støtter LSM innsamling av overlevelses- og atferdsdata fra en rekke nematodearter, inkludert C. briggsae, C. tropicalis, C. japonica, C. brenneri, og p. Stillehavet23. Teknologien forenkler studiet av effekten av biologiske og miljømessige inngrep på levetid, stressmotstand og patogenresistens og kan kobles til eksperimentelle verktøy som målrettede analyser av RNA-interferens eller auxin-induserbare proteinnedbrytningssystemer. Hittil har den blitt brukt i den vitenskapelige litteraturen for et bredt spekter av applikasjoner 6,24,25,26,27,28,29,30.

Her skisserer vi en trinnvis protokoll for å utføre et Lifespan Machine-eksperiment ved hjelp av agarplater, fra de første stadiene av det eksperimentelle oppsettet til utgangen av de resulterende overlevelseskurvene. Et karakteristisk trekk ved LSM er at innsatsen er svært frontlastet, noe som betyr at mesteparten av forskerens tid blir brukt under eksperimentelt oppsett og i liten grad under post-image oppkjøp. Datainnsamlingen er fullstendig automatisert for hele eksperimentets varighet og lar forskeren få en "håndfri" opplevelse. Trinnene beskrevet her holdes til felles blant mange forskjellige typer overlevelsesanalyser - det samme eksperimentelle oppsettet utføres for levetid, termotoleranse, oksidativt stress og patogeneseanalyser. I delen om representative resultater diskuterer vi et delsett av data fra et nylig publisert manuskript for å illustrere effektiviteten av analysepipelinen og fremheve de viktigste trinnene under bildeanalyse23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Krav til programvare og maskinvare

  1. Planskannere: I prinsippet kan LSM implementeres ved hjelp av en rekke bildebehandlingsenheter. Detaljerte instruksjoner for skannermodifikasjoner og fokusering er tilgjengelig andre steder13. LSM-maskinvaren er vist i tilleggsfigur 1.
  2. Dataanalyseverktøy: LSM-programvaren har tre samvirkende komponenter: en Linux-basert programvarepakke for skannerkontroll, en nettleserbasert metadatahåndteringspakke og en Windows- og Linux-klientbildeanalyseprogramvarepakke. Se instruksjonene for installering av programvareverktøy publisert på GitHub-repositoriet (https://github.com/nstroustrup/lifespan).
  3. Datavisualiserings- og valideringsprogramvare: Bruk ormeleseren, et klientprogram, til å planlegge eksperimentene, validere bildeanalysen, utføre manuell annotering av nematodebevegelsen og sende ut overlevelsesdataene. Binære kjørbare filer leveres for Worm Browser på Windows 7, Windows 8 og Windows 10, og Worm Browser er kompilert fra kildekoden på Linux eller Apple iOS. En installasjonsveiledning er tilgjengelig på GitHub-depotet nevnt ovenfor.

Tilleggsfigur 1: Levetidsmaskinmaskinvare. En planskannerenhet med åpent lokk for å vise de lastede platene, som er plassert med forsiden ned i 16 åpninger kuttet på en gummimatte. Gummimatten er plassert på overflaten av en glassskanner. Etiketter for forholdene er skrevet på sidene av platene for å unngå problemer under bildeanalyse. Merking av tape med nummeret ("1") og/eller navnet på enheten ("Jabba") letter senere verifisering av prøveplasseringen når du arbeider med flere skannerenheter. Flere detaljer om LSM-maskinvarekomponentene finnes andre steder13. Klikk her for å laste ned denne filen.

2. Oppsett før dagen for eksperimentet

  1. Temperaturkalibrering av inkubatoren: Miljøtemperatur er en viktig determinant for C. Elegans levetid19. For å produsere nøyaktige resultater, utfør bildeopptak ved en nøye kalibrert temperatur, holdt konstant gjennom hele eksperimentet. For å oppnå dette, noen dager før starten av eksperimentet, måle og kalibrere temperaturen på hver skanners overflate under drift. Bruk termoelementer med høy presisjon som beskrevet andre steder31 (se materialfortegnelsen).
  2. Skannerplateoppsett: Før eksperimentet starter, må du planlegge den optimale utformingen av kulturplatene for hver skanner.
    MERK: Hensikten med dette er å unngå innføring av forstyrrende faktorer som følge av temperaturvariasjon mellom skannerne og på tvers av hver skanners overflate. Skannere varierer subtilt i gjennomsnittlig overflatetemperatur og viser dessuten subtile temperaturforstyrrelser over overflaten31.
    1. Skannerplateposisjon: For å kontrollere for disse termiske effektene i den påfølgende dataanalysen, randomiser eventuelle biologiske kovariater angående skannerposisjonen, og standardiser plateplasseringen på tvers av alle skannerne.
    2. Antall prøver på tvers av skannerne: Når du bruker oppsettet med 16 gummimatter (se materialfortegnelsen), plasserer du fire plater per tilstand i hver skanner, med totalt minst fire skannere. Dette sikrer at hver tilstand er fordelt på flere skannere, slik at de forvirrende effektene av skannertemperaturen kan identifiseres og fjernes under dataanalyse13. For å gjøre denne analysen enklere, inkluder en delt referansebetingelse (f.eks. villtypeprøver) på hver skanner.
      NOTAT: Generelt, på grunn av plasseringen av skannerviftene, er platene øverst til høyre på gummimatten mer utsatt for uttørking. La denne plasseringen stå tom om nødvendig.
  3. Plater og prøvepreparering
    1. Helling av kulturplatene: For optimal tørking av skannerkulturplatene (se materialfortegnelsen), hell agar medium 4 dager før du legger i nematodene. Selv om skannerfokuset er justerbart for å tillate at forskjellige volumer agar legges til platene, er standard platevolum 8 ml.
      MERK: Det kan være nyttig å helle platene med en peristaltisk pumpe, spesielt for store eksperimenter.
    2. Såing av platene: Frø platene med ønsket bakteriekultur minst 2 dager før starten av forsøket for å muliggjøre riktig tørking og vekst av bakterieplenen. Vanligvis er 200 μL bakteriekultur tilstrekkelig til å danne en plen som vil mate 40 nematoder i flere uker.
      MERK: Platene som vanligvis brukes til avbildning er tettere forseglet enn standard kultur petriskåler; Derfor anbefales det å frø og tørke platene inne i en laboratoriehette, vanligvis i ca 1 time eller til de er riktig tørket.
  4. Håndtering av nematode
    1. Populasjonsstørrelse: Antall nematoder som kan avbildes pålitelig på en enkelt tallerken, avhenger av genotypen, alderen der nematoder er belagt, og mengden mat lagt til hver tallerken. For livstidseksperimenter som starter i tidlig voksen alder, last ca. 40 dyr per tallerken. Dette nummeret sikrer tilstrekkelig mat og unngår trengsel.
    2. Voksende store populasjoner: For å forberede befolkningsutvidelse og synkronisering, start med en populasjon av nematoder som passer for den valgte synkroniseringsmetoden (se nedenfor). Ta sikte på å utføre synkronisering på dyrene i deres alder av maksimal eggproduksjon, som for villtype N2-dyr er dag 2 i voksen alder32.
      MERK: En annen grunn til å synkronisere populasjoner ved å bruke dyr på deres andre dag i voksen alder, er å fjerne mors alder som en medvirkende faktor til populasjonsheterogenitet. Mors alder i C. Elegans har vist seg å påvirke flere treningsegenskaper i avkom, med dag 2 villtype dyr som produserer avkom av "høyeste kvalitet"33.
    3. Utføre alderssynkronisering: For å oppnå nøyaktige resultater, synkroniser dyrenes alder så nøyaktig som mulig. I denne protokollen utføres alderssynkronisering ved hjelp av en modifisert hypoklorittbehandling34. Andre metoder kan være synkronisering ved eggepermittering, ved L1 larvestans eller ved manuell plukking av L4-larver.
      MERK: For alderssynkronisering ved hypoklorittbehandling, forvent å få tre til fire egg fra hver voksen hermafroditt.
    4. Opprettholde avkomfrie populasjoner: Opprettholde avkomfrie populasjoner ved å eksponere nematoder i slutten av L4-stadiet for 5-fluor-2'-deoksyuridin (FUdR)35.
      MERK: Ved lave doser er FuDR dødelig for å utvikle embryoer uten å produsere makroskopisk synlige endringer i kimlinjen eller endre hastigheten på oocyttproduksjonen. Andre metoder inkluderer bruk av temperatursterile mutanter, bruk av steriliserende RNAi-konstruksjoner, eller bare venter til postreproduktiv senescens for å overføre nematoder til plater for avbildning.
    5. Overføring av populasjoner: Ved overføring av tusenvis av dyr mellom plater, blir standardprotokollen som involverer en platina / iridiumtråd arbeidskrevende. Metoder som involverer flytende suspensjon av nematoder letter overføringene og gjør dem mer effektive. Samle nematoder med M9 + Mg buffer (Na2HPO4 42,27 mM, KH2PO4 22,05 mM, NaCl 85,56 mM, MgSO4 1 mM), reduser totalvolumet når nematoder bosette seg ved tyngdekraften, og deretter raskt overføre nematoder til platene som brukes til avbildning.
      MERK: Overføring av nematoder med flytende suspensjon kan føre til variasjon i antall dyr som overføres til hver plate. Prøv å være konsistent med antall nematoder på hver plate for å unngå eksperimentell variabilitet.
    6. Bruk av tiltak: Å stoppe og starte bildeopptak på nytt under et eksperiment kompliserer bildeanalysen (se diskusjon). Start derfor LSM-eksperimentene først etter at all nødvendig nematodehåndtering er fullført.
  5. Sterilisering av gummimattene: Autoklav et stort antall matter samtidig, ved å pakke dem individuelt inn i aluminiumsfolie.
    MERK: Gummimattene bør steriliseres mellom bruk for å unngå oppbygging av sopp- eller bakterieforurensninger. De fleste typer gummi som vanligvis brukes, brytes ned ved aggressiv etanolbehandling.

3. Oppsett på dagen for eksperimentet

  1. Platestøtte og klargjøring av skannerglassplater: For å forenkle platehåndteringen må du ikke legge petriskålene direkte på skanneroverflaten, men i stedet holde dem på plass ved hjelp av gummimatter støttet av glassruter (se materialfortegnelsen). Populasjoner er avbildet gjennom dette glasset, så hold glasset rent og behandlet med anti-tåke, hydrofob og steriliseringsbelegg (se materialfortegnelsen).
    1. Før du legger platene inn i inkubatoren, rengjør overflaten av platestøtteglasset på begge sider med anti-duggglassrenser.
    2. Før du legger platene på støtteglasset, må du bruke en beskyttende hydrofob glassbehandling (se materialfortegnelsen) for å minimere tåke på siden av glasset som kommer i kontakt med gummimatten. Spre denne behandlingen godt, og la den ligge på glasset i 5-10 min før du går videre til neste trinn. Rengjør kraftig etter påføring for å fjerne rester.
    3. Påfør 70% etanol for å desinfisere overflaten av glasset som kommer i kontakt med gummimatten. La stå i 1 min eller 2 min, og fjern deretter med en klut eller et papirhåndkle.
  2. Legge platene på skannerne
    1. Plasser først de autoklaverte gummimattene på toppen av det behandlede platestøtteglasset.
    2. Fjern lokket fra platene som brukes til avbildning med lastede nematoder, og plasser dem på gummimatte steder som vender mot glassoverflaten. Forsikre deg om at gummimatten er tett forseglet rundt alle platene, for eksempel ved å legge en annen glassplate på toppen og sørge for at den ligger flatt eller ved å banke på toppen av hver plate (løse plater vil bevege seg litt og treffe glasset, lage en lyd, mens tett sikrede plater ikke beveger seg når de tappes).
      MERK: Det er nyttig å merke hvert ark med platestøtteglass individuelt med merketape med informasjon om plateinnholdet og den tiltenkte skanneren. Disse dataene kan brukes etter eksperimentet for å løse eventuelle uklarheter angående plateplasseringene.
    3. Før du legger platene i skannerne, må du koble fra skannerviftene for å beskytte eksperimentørens fingre under platelasting.
    4. Skyv platene og glassplaten som støtter dem forsiktig på overflaten av skanneren.
      NOTAT: Unngå å legge trykk direkte på gummimatten, da dette får matten til å gli over platestøtteglasset. Når mattene glir, blir platene ofte slått løs fra matten.
    5. Aktiver skannerviftene på nytt, og bekreft visuelt at front- og sideviftene er drevet. Hvis skannerne er slått av, slår du dem på på dette tidspunktet.

4. Oppkjøp før bilde

MERK: Et omfattende flytskjema som oppsummerer alle programvarebaserte trinn under bildeopptak, er vist i figur 1.

Figure 1
Figur 1: Grafisk oversikt over pipeline for bildeanalyse av Lifespan Machine. Trinnene før, under og etter bildeinnsamling utføres i stor grad på webgrensesnittet (WI, i rødt) og på Worm Browser (WB, i grønt). Noen trinn utføres på andre plattformer (O, i blått), for eksempel TXT-dokumenter i trinn 3a, Photoshop eller tilsvarende i trinn 4b og JMP eller tilsvarende i trinn 13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Oppsett for bildeopptak: Generer en fil som angir eksperimentplanen og plasseringen av platene på hver skanner for å konfigurere bildeopptaket.
    MERK: Denne filen inneholder viktige metadata som tittelen på eksperimentet, hyppigheten av bildeopptak og den totale varigheten av eksperimentet. Denne filen genereres vanligvis ikke de novo for hvert eksperiment, men i stedet, brukes eksperimentfiler fra tidligere eksperimenter på nytt som maler. For en brukers første eksperiment finnes det en malfil (Tilleggsfil 1).
    1. Be om opptak av forhåndsvisning: Angi plasseringen av alle platene på hver skanner. Flere verktøy er gitt for å fremskynde denne prosessen. Bruk først skanneren til å ta et bilde av hele skanneroverflaten, kalt "Preview capture". Sørg for at forhåndsvisningen av opptaksbilder tydelig viser hele overflaten på hver plate som skal avbildes (figur 2A), uten striper eller beskjæring av platekanter.
      1. Bruk webgrensesnittet, finn Image Acquisition-delen på hovedsiden, og følg lenken som heter Capture Devices og Image Servers. På den siden klikker du på knappen merket Søk etter nye enheter (dvs. skannere) i boksen Image Capture and Processing Servers . Overvåk serverens fremgang i å oppdage skannere ved å klikke på [log] -lenken ved siden av serveren.
        MERK: Forsikre deg om at de ønskede skannerne er slått på og koblet til serveren før du utfører dette trinnet.
      2. På samme side i webgrensesnittet kontrollerer du at hver skanner som er koblet til serveren, vises i boksen Enheter for bildeopptak . En "Manglende" etikett under "Gjeldende status" vises ikke lenger hvis enheten oppdages. Merk av i avmerkingsboksen som tilsvarer hver skanner som inneholder nylastede plater.
      3. På bunnen av Image Capture Devices-delen klikker du på Be om forhåndsvisning av opptak-knappen . Innen 1 min eller 2 min skal skannerne lyse og begynne å skanne.
        MERK: Startposisjonen til glassstøtteplatene må ofte justeres for å bringe alle platene inn i det synlige området. Posisjoner kan korrigeres ved å inspisere, forhåndsvise, ta bilder og gjøre justeringer i plateposisjonen og ta nye forhåndsvisningsbilder. Hvis skanningene går ekstremt sakte (flere minutter for én opptaksskanning), eller hvis forhåndsvisning av bilder inneholder lange hvite striper, er dette et tegn på at en plate, gummimatten eller et annet objekt blokkerer lyset i skannerens kalibreringsområde (angitt med hvite piler på skanneroverflaten). Alle gjenstandene skal flyttes slik at bare glassstøtteglasset opptar denne regionen.
    2. Definer skanneområdene: Følg de neste trinnene i ormeleseren for å analysere forhåndsvisningen, ta bilder, og sett dem sammen til ett sammensatt bilde, som brukes til å angi plasseringen av hver plate for dataanalysen. Sørg for at det resulterende bildet ligner på figur 2B.
      1. Først åpner du hvert forhåndsvisningsbilde ved å velge menyalternativet File > Open Image, og velger ønsket bilde.
      2. På hvert bilde klikker du for å velge kolonnene for regioner med plater (hvis gummimatten har 16 plateplasseringer, velg 4 kolonner).
        MERK: Skanneområdene bør spesifiseres som høye kolonner (ikke brede rader) ettersom skanneropptaket er tregere for større områder, noe som resulterer i uskarpe bilder på grunn av nematodebevegelse.
      3. Når alle bildene er definert, eksporterer du regionspesifikasjonene til disk ved å velge menypunktet Image Acquisition > Definer skanneområder > Lagre valgte skanneområder på disk og velge ønsket sted.
    3. Generer eksperimentplanen:
      1. Etter formatet til tilleggsfil 1 setter du sammen en fil som inneholder eksperimentnavnet, de fysiske plasseringene til hver kolonne på skannerne (kopiert fra skanneområdefilen som ble generert i trinn 4.1.2.3), den totale varigheten av eksperimentet og bildeopptaksfrekvensen, og lagrer dette både som en TXT og som en XML-fil.
      2. Deretter, på Worm Browser, klikker du på Image Acquisition > Submit Experiment Schedule, og velger den genererte XML-filen. Ormeleseren vil spørre om du vil sende et sammendrag av tidsplanen eller kjøre eksperimentet. Klikk på Generer en sammendragsfil.
    4. Valider sammendragsfilen: Når du har sendt inn eksperimentplanen, sender ormeleseren et sammendrag av tidsplanen. Dette sammendraget vises på skjermen og skrives til disk. Les den, og bekreft datoene for planlagte opptak, samt plassering, navn og antall skannere.
    5. Send inn eksperimenttidsplanen: Når du er fornøyd med sammendragsfilen, laster du inn XML-filen for eksperimentplanen på nytt i ormesøkingen ved å velge menyalternativet Bildeinnhenting > Send inn eksperimentplan. Ormeleseren spør en gang til om det skal sendes et sammendrag av tidsplanen eller om eksperimentet skal kjøres. Denne gangen klikker du på Kjør! .
      MERK: Noen minutter etter at du har sendt inn eksperimentet, er det lurt å bruke nettgrensesnittet for å bekrefte at eksperimentet er sendt inn og skanninger samles inn av alle skannerne. Det er vanlig at de første skanningene blir savnet, spesielt i store eksperimenter.
    6. Organiser eksperimenter på webgrensesnittet: En travel skannerklynge kan produsere hundrevis av eksperimentelle datasett samlet inn av mange forskjellige brukere. For å organisere denne listen, tilordne eksperimenter til separate grupper, for eksempel tilsvarende navnet på brukeren som er ansvarlig for eksperimentet.
      1. Opprett en ny gruppe eller endre en eksisterende: Opprett nye grupper på webgrensesnittet ved å klikke på Administrer eksperimentgrupper under boksen Image Acquisition. På den nye siden som vises, legg til ønsket navn på Opprett ny gruppe og klikk på Opprett. Hvis du vil endre navnet på en eksisterende gruppe, velger du ønsket gruppe ved siden av Endre eksisterende gruppe i samme boks, og deretter velger du Endre.
      2. Tilordne eksperimenter til en gruppe: Hvis du vil tilordne nye eksperimenter til en bestemt gruppe, går du til nettgrensesnittet og finner det ønskede eksperimentet, som som standard tilordnes Ingen gruppe-gruppen nederst i eksperimentlisten. Klikk på lenken til høyre i eksperimentdelen der det står Rediger, og bruk rullegardinlisten til å velge navnet på gruppen som skal brukes. Velg deretter Lagre.
    7. Avbryt et eksperiment:
      MERK: LSM vil fortsette å arbeide autonomt til de endelige skanningene er spesifisert i eksperimentplanen. Etter at en eksperimentell tidsplan er fullført, vil LSM som standard fortsette å samle inn skanninger, men umiddelbart forkaste bildedataene i en prosess som kalles autoskanning. Disse autoskanningene utføres for å forhindre at skannerne slår seg av og avkjøles, og opprettholder en standard temperaturprofil slik at andre eksperimenter som kjører i samme rom (men fra et annet eksperiment), ikke påvirkes av avstenging av andre skannere.
      1. Stopp autoskanninger: For å stoppe autoskanningene fra et pågående eksperiment på nettgrensesnittet, klikk på Rediger ved siden av ønsket eksperiment, deretter Avbryt ventende skanninger og velg Avbryt planlagte opptak.

Figure 2
Figur 2: Forhåndsvis valg av bilde og skanneområde. (A) For hver skanner i eksperimentet genereres et forhåndsvisningsbilde. (B) Valg av én rad plater om gangen (røde bokser), noe som øker hastigheten på skanningen og forhindrer uskarphet i ormebevegelser som følge av skanneområder som er for brede. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. Oppkjøp av bilder

MERK: Følgende trinn kan utføres både mens eksperimentet kjører eller etter at det er fullført.

  1. Send ut maskefilen for eksperimentet: Råbildedata fra skannere inneholder mange områder som ikke trenger å behandles (områder utenfor platene). For å fokusere analysen på hver plate individuelt, opprettes en "maske" som spesifiserer området okkupert av hver plate på hver skanner. Generer denne masken ved å tegne posisjonen til hver plate som et overlegg på bilder som er samlet inn av skannerne.
    1. Bruk ormesøking til å velge ønsket eksperiment ved å velge Fil > Velg gjeldende eksperiment, og klikk deretter på eksperimentnavnet.
    2. I ormeleseren velger du Bildeopptak på nytt > Definer eksempelmasker > Generer eksperimentmaskekompositt, og lagrer masken på ønsket sted. Kontroller at resultatfilen ligner på figur 3A.

Figure 3
Figur 3: Spesifikasjon av plateplasseringene for hver skanner ved hjelp av prøvemasker. For å sikre uavhengig analyse av plater innenfor kolonnevalgene vist i figur 1, må individuelle plater identifiseres ved å generere en bildemaskekompositt. (A) En fangst av skanningene av skannerne åpnes med en bildemanipulasjonsprogramvare (merk navnet på skanneren "han" over et skannet utvalg, og "a-d" refererer til hver av kolonnene). (B) De individuelle trinnene for maskegenerering for å markere plasseringen av hver plate i maskekompositten krever at bakgrunnen settes til svart, (C) fjerning av takkede kanter og kanter på ikke-valgte plater ved å utvide og deretter krympe bakgrunnen, og (D) velge forgrunnsplatene og fylle områdene helt med hvite piksler. (E) For at LSM skal gjenkjenne individuelle plater i de skannede radene, er hvert hvite område på rad fylt med en annen gråtone, vanligvis med økende lysstyrke. (F) På dette stadiet lagres masken (LZW-komprimering uten lag spesifisert hvis generert i Photoshop). Masken skannes deretter av ormeleseren, og en visualisering av masken av programvaren genereres. En korrekt maskevisualisering skal vise en definert firkant per plate med et lite kryss i midten og en annen farge for hver rad. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Kommenter eksperimentets maske: Åpne filen som ble generert i forrige trinn med et bildemanipuleringsprogram (for eksempel Photoshop eller GIMP) for å markere plasseringen av hver plate i bildet. En oversikt over alle maskeredigeringstrinnene ved hjelp av Photoshop er beskrevet nedenfor.
    1. I Photoshop velger du fyllverktøyet med toleransen satt til null, det sammenhengende alternativet valgt og utjevningen umerket. Klikk på den grå bakgrunnen for å sette den helt til svart. Sørg for at det resulterende bildet ligner på figur 3B.
    2. Bruk tryllestavverktøyet til å merke den svarte bakgrunnen, med aliaset satt til av, toleransen satt til null og det sammenhengende alternativet valgt. For å jevne ut kantene, utvid den valgte bakgrunnen med 30 piksler ved å klikke på Velg > Endre > Utvid. Deretter forminsker du det merkede området med 20 piksler på Velg > Endre > kontrakt. Sørg for at det resulterende bildet ligner på figur 3C.
    3. Fyll den jevne bakgrunnen helt med svarte bildepunkter, for eksempel ved å sette toleransen for fyllverktøyet til 255 og fylle det merkede området. Klikk deretter på Velg > omvendt for å invertere utvalget, og velg forgrunnen. Fyll det nye området helt med hvite bildepunkter, for eksempel ved å sette toleransen for fyllverktøyet til 255 og fylle området med hvitt. Kontroller at det resulterende bildet ligner på figur 3D.
    4. Hvis du vil skille hver plate i ett enkelt område, fyller du hver rad med forskjellig gråtonegradering i økende lysstyrke. Dette kan gjøres med fyllverktøyet og deretter ved å velge ønsket farge, med toleransen satt til 0. Kontroller at det resulterende bildet ligner på figur 3E. Lagre den i en LZW-komprimering uten "Lag" angitt.
      MERK: Rekkefølgen av plater er satt av fargen på de angitte områdene. Hvis du vil gi platene navn 1–4 i en rekkefølge fra topp til bunn, angir du fargene med økende lysstyrke for hver rad.
    5. I ormeleseren velger du Bildeinnhenting > Definer prøvemasker > Analyser plateplasseringer tegnet på eksperimentmaskekompositt, og velger filen som ble generert i forrige trinn. Programvaren vil nå ta litt tid å analysere den innsendte masken.
    6. Ormeleseren viser en maskevisualisering. Kontroller masken for potensielle feil i filen. Forsikre deg om at hver rad med plater er fylt med en annen farge og fremhevet av et farget rektangel. Sørg for at det resulterende bildet ligner på figur 3F.
      Hvis én enkelt plate viser to sirkler eller mer, eller hvis to sirkler har samme farge, går du tilbake til trinn 5.2 for å korrigere maskefilen og laster den inn i ormesøkingen på nytt.
    7. Når du har kontrollert at maskevisualiseringen er riktig, velger du Image Acquisition > Define Sample Masks > Submit Analyzed Experiment Mask Composite to Cluster i Worm Browser. Bildeanalyseserveren vil nå analysere plasseringen av alle platene i eksperimentet.
  2. Påfør masken: LSM bruker masker til å dele råbildedataene i individuelle plater. Hvis du vil starte denne prosessen, planlegger du en maskesøknadsjobb ved hjelp av webgrensesnittet.
    1. Før du sender inn jobben, må du kontrollere at alle skannerne har identifisert områder i masken. Gå til hovedsiden i webgrensesnittet, finn navnet på eksperimentet og kolonnen som heter Bildeanalyse, og klikk på Kjør analyse. Kontroller at regioner er identifisert på alle enhetene under Eksperimenteksempler .
    2. For å bruke masken, på samme grensesnitt, klikk på Ny jobb for alle prøver. I boksen Planlegg en jobb for enkeltbilder merker du av for Bruk maske og deretter Lagre jobb.
      MERK: Masken vil bli brukt på alle bildene som allerede er tatt, samt på bilder tatt i fremtiden.
  3. Utfør platekvalitetskontroll:
    MERK: Plater som lider av forurensning, uttørking eller tåke blir sensurert på dette stadiet av bildeanalyse. Et eksempel på forurensede, uttørkede, tåkete og optimale plater er vist i figur 4. Andre grunner til å sensurere inkluderer sult, tomme plater eller larver i sterile populasjoner. Ugyldige plater vil ofte inneholde komplekse former som maskinen tar sikte på å tolke som nematoder. Det er viktig å utelate ugyldige plater i dette trinnet for å unngå lange behandlingstider i senere trinn av bildeanalysen.
    1. Bruk nettgrensesnittet til å ekskludere platene som skal sensureres, ved å finne det ønskede eksperimentet og kolonnen Annotate Plate Information og velge Etter bilde.
    2. For å inspisere platene, klikk på Vis bilder.
      MERK: Hvis trinnet for visning av bilder ikke fungerer som det skal, kan det hende at Linux-serveren ikke er riktig konfigurert. Instruksjoner om hvordan du gjør dette er tilgjengelig i programvareinstallasjonsveiledningen i det nevnte GitHub-depotet.
    3. For å ekskludere plater, merk av i boksen Merk av for Sensur, velg et alternativ i rullegardinlisten som heter Årsak sensurert, og klikk deretter på Lagre for hver side.
  4. Legg til metadatainformasjon: Metadata beskriver innholdet på hver plate i et eksperiment. Denne informasjonen blir deretter inkludert i alle de statistiske datafilene som senere genereres.
    1. For å legge til metadatainformasjon i forhold til belastning, genotype, temperatur, mat osv., Gå til hovedsiden i webgrensesnittet, finn ønsket eksperiment og kolonnen Annotate Plate Information, og velg Etter plassering.
    2. Skriv inn etikettene, og velg skannerne du vil lagre metadataene for ved å klikke på Lagre på enheter nederst til venstre.
    3. For å gjenbruke metadata mellom forskjellige skannere uten å måtte skrive inn alle etikettene på nytt, gå til Last fra enhet øverst til høyre, velg skanneren du vil gjenbruke metadata fra, og klikk på Last fra enhet.
  5. Spesifiser nullalderen: Som standard måler LSM tid i forhold til starten av UNIX-epoken. Dette er sjelden praktisk, så spesifiseringen av en referansetid er nødvendig (for eksempel datoen da alle individer klekket eller nådde voksen alder).
    1. Hvis du vil angi informasjon om nullalder, går du til hovedsiden i webgrensesnittet, finner ønsket eksperiment og kolonnen Bildeanalyse, og velger Kjør analyse.
    2. På den nye siden som vises, velger du Ny jobb for alle områder. I boksen Oppdater regioninformasjon velger du Tidspunkt da dyrene hadde 0 Alder, legger til informasjonen og klikker deretter på Oppdater valgte felt.
      MERK: Hvis alle dyrene ikke deler samme nullalderstid, velger du i stedet Ny jobb for bestemte dyretyper og gjentar trinnene ovenfor for hver gruppe.
  6. Planlegg ormedeteksjonen: LSM kan automatisere deteksjonen av hver nematode basert på dens posisjon på platen.
    1. For å starte automatisk gjenkjenning av nematoder for hvert bilde, gå til hovedsiden i webgrensesnittet, finn ønsket eksperiment og kolonnen Bildeanalyse, og velg Kjør analyse.
    2. På den nye siden som vises, klikker du på Ny jobb for alle regioner, deretter på boksen Planlegg en jobb for individuelle bilder, og merk av i boksene Medianfilter > Terskel > Ormdeteksjon > Lagre jobb. Disse jobbene vil bli brukt på alle tidligere og fremtidige bilder tatt.
      MERK: For å planlegge en jobb bare for en bestemt stamme eller tilstand, klikk i stedet på Jobber for bestemte dyretyper. Objektklassifisering utføres ved hjelp av SVM-modeller som er angitt som filer som er lagret i undermappen Modeller i LSMs langsiktige lagringskatalog. V2.0 nematodedeteksjonsparametersett for LSM kan lastes ned fra GitHub-repositoriet.

Figure 4
Figur 4: Platekvalitetskontroll ved hjelp av webgrensesnittet. Sensur av suboptimale plater på webgrensesnittet før ormebevegelsesanalysen er avgjørende for å øke hastigheten på bildebehandlingsrørledningen. Eksempler på plater som er gjenstand for fjerning inkluderer betingelser for (A) uttørking, (B) forurensning eller (C) tåkelegging, som motsatt. (D) Optimale plater som skal inkluderes i videre analyse. En skalastang på 10 mm legges over på et forhåndsvisningsbilde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

6. Oppkjøp etter bilde

MERK: Etter at ormeregistreringen er fullført, må alle data som samles inn fra eksperimentet, aggregeres over tid for å spore hver enkelt person over hele levetiden og identifisere alle individers dødstider. Vent til alle dyrene i forsøket er døde og til alle ormedeteksjonsjobbene er fullført, og utfør deretter følgende trinn:

  1. Planlegg bevegelsesanalysen:
    1. Bevegelsesanalysen integrerer alle eksperimentelle data over tid for å estimere dødstider. For å starte denne jobben, gå til hovedsiden i webgrensesnittet, og finn ønsket eksperiment i kolonnen Bildeanalyse. Velg koblingen Kjør analyse.
    2. På den nye siden som vises, klikk på lenken Ny jobb for alle regioner, og fra rullegardinmenyen, Planlegg en jobb for en hel region, velg Analyser ormbevegelse, og klikk på knappen Lagre jobb.
    3. LSM-bildeopptaksserveren vil automatisk begynne å analysere bevegelse over alle platene.
      MERK: Bevegelsesanalyse er den største enkeltjobben. På en moderne flerkjerneprosessor kan analysen av hver plate fra et 1 måneds langt levetidseksperiment ta 20 min eller mer.
  2. Generer et storyboard: Etter at bevegelsesanalysen er fullført, lar LSM-storyboardet brukere manuelt validere de automatiserte resultatene og sikre at programvaren gjør riktige antagelser om nematodens morfologi og oppførsel.
    1. Finn ønsket eksperiment og kolonnen Bildeanalyse på hovedsiden i webgrensesnittet, og velg Kjør analyse. På den nye siden som vises, klikker du på Ny eksperimentjobb. Deretter, i seksjonen Planlegg en jobb for en hel region, velg Generer Animal Storyboard, og klikk på Lagre jobb.
    2. Etter at LSM er ferdig med å generere storyboardet, gå til Worm Browser, og velg ønsket eksperiment. Gå tilbake til hovedmenyen, velg Validering > Bla gjennom hele eksperimentet > umiddelbart etter hver orms død.
  3. Kommenter storyboards på Worm Browser: Et typisk storyboard på Worm Browser skal se ut som Figur 5.
    1. Kommentere objekter uten orm
      MERK: Hvert objekt oppdaget under bevegelse vises på storyboardet, bestilt etter estimert dødstid. Med mindre brukeren spesifiserer noe annet, vil hvert objekt bli inkludert i de resulterende overlevelseskurvene. LSM-objektklassifiseringen er bevisst kalibrert for å ha en høy falsk-positiv rate, som en avveining for å minimere antall uoppdagede nematoder. Utelukkelse av ikke-ormeobjekter er viktig for å oppnå overlevelseskurver av høy kvalitet (se representative resultater). Et stort antall ikke-ormobjekter finnes vanligvis på de første og siste sidene i storyboardet, som raskt kan utelukkes manuelt i bulk.
      1. Hvis du vil utelate objekter som ikke er ormer, i dreieboken, høyreklikker du én gang på bildet av objektet. Det ekskluderte objektet vil nå bli skissert av en hvit boks. For å ekskludere mange objekter samtidig, hold kontrolltasten og høyreklikk en gang på et objekt, og alle objekter på storyboardsiden vil bli ekskludert.
      2. Etter å ha ekskludert et objekt fra analyse, kan objektet inkluderes på nytt ved å høyreklikke to ganger igjen.
      3. For å lagre merknadene som ble gjort under storyboard-merknaden, klikk på Lagre-knappen . Det anbefales å lagre fremdriften ofte mens du kommenterer.
    2. Kommenter dødstider:
      MERK: Uten brukerintervensjon estimerer LSM nøyaktig dødstidene for de fleste populasjoner. Det anbefales imidlertid å rutinemessig bekrefte nøyaktigheten av de automatiserte resultatene ved å manuelt validere et tilfeldig delsett av individer fra hvert eksperiment. Ekstra oppmerksomhet bør rettes mot de korteste og lengstlevende individene, da eventuelle feil i automatisert analyse har en tendens til å klynge seg i disse gruppene.
      1. Venstreklikk en gang på et hvilket som helst objekt i storyboardet for å åpne et nytt vindu som viser detaljert, tidsserieinformasjon om det objektet. Dette vinduet tillater inspeksjon av alle bildene samlet av objektet gjennom hele eksperimentet, samt kvantifisering av objektets bevegelsesdynamikk og morfologi. Bruk det samme grensesnittet, og kommenter dødstidene manuelt. Grensesnittet for dødstidsannotasjon er vist i figur 6.
      2. For å manuelt kommentere dødstider, venstreklikker du på den nederste linjen på punktet som tilsvarer dødstidspunktet. Bruk mellomromstasten og høyre- eller venstrepilene på tastaturet for å bevege deg gjennom tidsrammene, eller klikk direkte på linjen i ønsket tidsramme.
        MERK: Visualiseringen representerer bevegelsestilstanden til dyr over tid, som et horisontalt søylediagram med x-aksen som markerer tid. Den rosa/lilla seksjonen indikerer tidsperioden hvor objektet beveger seg kraftig, gult indikerer svak bevegelse, rødt indikerer ikke-bevegelige dyr, og grønt indikerer perioden med dødsassosiert ekspansjon. Nematoder viser karakteristiske dødsassosierte morfologiske hendelser: en gradvis kroppskontraksjon som vanligvis oppstår før døden, etterfulgt av en rask kroppsutvidelse under eller umiddelbart etter døden (figur 6B). Ikke-ormobjekter som støv eller skygger viser ikke denne dynamikken i kroppsstørrelse, og følger i stedet vanligvis en lineær, gradvis endring i størrelse og intensitet over tid. Disse forskjellige kroppsstørrelsesdynamikkene gir en rask og grei metode for rask klassifisering og manuell ekskludering.
      3. Avhengig av analysetilnærmingen kan dødstiden betraktes som enten tidspunktet for bevegelsesopphør (starten på den røde linjen i bevegelsesvisualiseringen) eller som tidspunktet for dødsassosiert ekspansjon (den grønne linjen i bevegelsesvisualiseringen). For å kommentere sammentreknings- og ekspansjonshendelser manuelt, høyreklikk på den nederste linjen i ønsket tidsramme.
    3. Noen rudimentære dødelighetsdatavisualiseringer leveres opprinnelig i Worm Browser-klienten. Overlevelseskurver og dødstidsdiagnostikk vises for hver populasjon som er tilstede i storyboardet (figur 7). Se overlevelseskurvene på venstre side og spredningsplottet som sammenligner tiden for kraftig bevegelsesopphør (VMC) med dødstidspunktet for hver enkelt person på høyre side av storyboardet.
      MERK: Det er mulig å gruppere disse resultatene i henhold til forskjellige eksperimentelle parametere etter underinnstilling på bunnlinjen for forhold som spesifikke stammer, skannere eller plater. Individuelle ormer kan velges basert på deres dødstider ved å venstreklikke på individuelle punkter i VMC versus dødstidsplottet.
  4. Skrive dødelighetsdata til disk: LSM produserer dødelighetsdata i form av CSV-filer. Plott de utsendte overlevelseskurvene, og analyser dem på statistisk programvare som R, SAS, STATA eller JMP.
    1. Hvis du vil generere disse filene, velger du eksperimentet i ormesøkingen, velger Datafiler, Dødstider på menyen, og deretter klikker du på Generer dødstider for gjeldende eksperiment. LSM vil generere en utdatafil med eksperimentets overlevelsesdata, som vil bli lagret i resultatkatalogen.
    2. Hvis håndmerknader har blitt utført på dreieboken, vises en melding på ormleseren som spør hvordan man håndterer håndmerknader. Klikk på "Umiddelbart" for å inkludere håndmerknader på den utsendte dødstidsfilen.
      MERK: Dødelighetsdatafiler skrives til resultatkatalogen som er angitt i imageserver.ini-filen. En rekke filer er skrevet, men den mest brukte versjonen er "survival_simple / survival = machine_hand", som inkluderer alle manuelle merknader laget ved hjelp av storyboardet.
    3. Analyser dødelighetsdataene i den statistiske programvaren du velger.

Figure 5
Figur 5: Animal storyboard på Worm Browser. (A) Alle stasjonære ormer vises i kronologisk rekkefølge etter maskinannotert dødstid. For å navigere i storyboardet, trykk på knappene nederst til høyre, og (C) lagre merknadene ofte. (D) Bildene med en ikke-grå bakgrunn viser to ormedødshendelser (tidlig død som grønn, senere død som rød), som enten kan oppstå når to ormer dør nær hverandre, eller når døde ormer flyttes av en forbipasserende orm og dermed oppdages som døde to ganger. (E) En rød tag i nedre hjørne av et bilde identifiserer ormer med en oppdaget dødstid; (F) en grønn tag indikerer hvor et objekt ikke ble liggende stille lenge nok til å registrere en dødstid. (G) Flere ormer i samme ramme kan flagges ved å trykke på skift og venstreklikke. (H) Objekter uten ormer utelates fra analysen ved å høyreklikke. (I) Eksploderte ormer sensureres fra analysen ved å klikke på det tilsvarende bildet (et merknadsvindu åpnes) og trykke på skift og høyreklikke til en "dyr eksploderte" -melding vises. En skalalinje på 0,5 mm og etiketter legges over skjermbildet til et ormleservindu. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Undersøke objekter og angi dødstider i ormeleseren. Venstreklikk på et hvilket som helst objekt på Worm Browser storyboard åpner et nytt grensesnitt og lar brukeren inspisere objektets bevegelsesdynamikk. På høyre side vises (A) bevegelsespoengsummen, som kvantifiserer objektbevegelsen; Dette beregnes av endringen i pikselintensitet mellom påfølgende observasjoner. I tillegg, på høyre side, (B) vises endringen i den totale objektintensiteten, noe som kvantifiserer endringer i objektstørrelsen. På venstre side viser den øvre linjen (C) maskinens estimat av dødstiden, mens den nederste linjen er (D) menneskelig håndmerknad. Ved å klikke på et hvilket som helst punkt på stolpene og trykke på mellomromstasten, kan brukeren bevege seg gjennom tidsrammene der ormen er avbildet. På disse stolpene representerer rosa tiden brukt i kraftig bevegelse, rød representerer tiden brukt i døden, og gul er alt i mellom. Tiden brukt i ekspansjon og sammentrekning etter dødstiden er vist i grønt. Etiketter legges oppå skjermbildet av et ormeleservindu. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Statistikk over befolkningssammendrag i ormenettleseren. Populasjonsstatistikk for skannerenheten "obiwan", med et plott av overlevelsen (venstre panel) og et spredningsplott av den kraftige bevegelsesopphørstiden (VMC) versus dødstiden (høyre panel). De plottede er detaljer om (A) en tilstand, hentet fra (B) en skanner oppnådd ved først å velge (C) overlevelsesgrupperingen etter belastning. (D) De firkantede formene i spredningsplottet viser de håndkommenterte hendelsene, mens (E) de sirkulære formene skildrer de maskinkommenterte hendelsene. (F) By-hand annotasjon er ofte nødvendig for dødshendelser som oppstår tidlig eller (G) de der tidspunktet for kraftig bevegelsesopphørstid sammenfaller med dødstiden. Etiketter legges oppå skjermbildet av et ormeleservindu. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eksperimentell reproduserbarhet i levetidsanalyser er utfordrende og krever både tett kontrollerte eksperimentelle forhold og store populasjoner for å oppnå tilstrekkelig statistisk oppløsning 4,36. LSM er unikt egnet for kartlegging av store populasjoner av dyr i et konstant miljø med høy temporal oppløsning. For å demonstrere evnen til LSM, markere de avgjørende analysetrinnene og hjelpe forskere til å prioritere sin arbeidsinnsats, presenterer vi en delmengde av data fra et optimalt, tidligere publisert eksperiment23. På grunn av dette eksperimentets natur som en dose-respons-analyse, var det nødvendig med et betydelig antall dyr for pålitelig påvisning av levetidsendringer. For hånd vil dette eksperimentet kreve en intens tidsforpliktelse fra flere forskere eller, hvis det skaleres ned, føre til underpowered resultater. Datasettet målte kvantitative endringer i levetid etter fjerning av RNA-polymerase II (b) subenhetsgenet (RPB-2), som kreves for messenger RNA-transkripsjon. Bruk av det auxininduserbare systemet37 i C. elegans, det endogene lokuset til RPB-2 ble merket med en avfettsekvens for å betinget ubiquitylate og nedbryte RPB-2 ved bruk av forskjellige konsentrasjoner av auxin (α-naftaleneddiksyre). Eksperimentet ble utført på AMP100 [rpb-2 (cer135); eft-3p::TIR-1] med cer135 tilsvarende den CRISPR-innsatte AID-taggen rpb-2::GFPΔpiRNA::AID::3xFLAG23. De eksperimentelle forholdene var ved en temperatur på 20 °C og ved bruk av UV-inaktivert NEC937 (OP50 ΔuvrA; KanR)38E. Coli. Hermafroditter ble sterilisert ved å overføre nematoder i slutten av L4-stadiet til plater inneholdende 5-fluor-2-deoksyuridin (FUdR). Nematoder ble overført i løpet av dag 2 av voksen alder til plater med forskjellige konsentrasjoner av auxin. I den opprinnelige studien viste forfatterne at i nærvær av auxin forkortet RPB-2-nedbrytning levetiden på en doseavhengig måte23. 

Her demonstrerer vi bidraget som datavalidering og annotering etter eksperimentet gir til den endelige overlevelseskurven (figur 8). I de siste trinnene av bildeanalyse i Worm Browser storyboard, sammenlignet vi rå overlevelseskurver produsert før storyboard annotasjon til overlevelseskurver produsert etter manuell utelukkelse av ikke-orm objekter og også til overlevelseskurver produsert etter annotering av både ikke-orm objekter og individuelle dødstider, (figur 8A-C). Vi fant at de første overlevelseskurvene produsert før storyboard-annotasjon (figur 8A) ble forvrengt av feil inkludering av ikke-ormobjekter, noe som var mest tydelig i halene på overlevelseskurvene. Før manuell annotering inkluderte overlevelseskurvene alle objekter oppdaget av maskinen som potensielle ormobjekter, hvorav omtrent halvparten på grunn av den forsettlig høye falske positive raten var ikke-ormeobjekter og måtte utelukkes manuelt (figur 8D). Dette er designet, da algoritmene er kalibrert for å ha en relativt høy falsk-positiv rate for å unngå falske negativer, da det er mye lettere å ekskludere feil inkluderte objekter enn å søke etter og gjenopprette feil ekskluderte objekter. Etter å ha ekskludert ikke-ormobjekter under manuell storyboard-merknad, var de resulterende overlevelseskurvene av mye høyere oppløsning (figur 8B, E), og ytterligere manuell annotering av dødstidene på storyboardet ga endringer på ikke mer enn ~ 4% i estimert gjennomsnittlig levetid. Vi demonstrerer derfor at fjerning av ikke-ormobjekter under bildeanalyserørledningen til LSM er det avgjørende trinnet for å oppnå veloppløste overlevelseskurver.

Figure 8
Figur 8: Effekten av manuell datavalidering på overlevelseskurver. Nedbrytningen av RPB-2 forkorter C. elegans levetid i nærvær av auxin (K-NAA: α-nafladeneddiksyre) på en doseavhengig måte. (A) Overlevelseskurver plottet fra LSM-råproduksjonen etter kvalitetskontroll av platene og uten manuell merknad av ormobjektene på Worm Browser-storyboardet. (B) Overlevelseskurver plottet etter manuell annotering av ormen objekter på storyboard. (C) Overlevelseskurver plottet etter manuell annotering av ormen objekter og død ganger på storyboard. (D) Sammendrag av alle objekter oppdaget av LSM. De sensurerte ormeobjektene inkluderte objekter som ble ekskludert automatisk (for eksempel på grunn av ormer som beveget seg utenfor det skannede området) eller manuelt av eksperimentøren (for eksempel på grunn av ormer som sprengte). (E) Tabellarisk representasjon av estimert gjennomsnittlig levetid etter annotasjon for ormobjekt for hånd (venstre) og tilleggsmerknad for dødstid (høyre). Prosentvis forskjell i gjennomsnittlig levetid mellom nabogrupper med forskjellige auxinkonsentrasjoner og statistisk deteksjonskraft. Alle grafene ble plottet inn på statistikkprogrammet JMP. Dataene for denne figuren ble tilpasset med tillatelse fra Oswal et al.23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ved å bevege seg utover levetiden som et enkelt endepunkt for å studere aldring, vurderte vi atferdsmessig aldring og undersøkte hvilke trinn i den posteksperimentelle bildeanalysen som var mest avgjørende for å måle den. Med fokus på forholdet mellom kraftig bevegelsesslutt (VMC) og levetid, sammenlignet vi LSM-utgangen på forskjellige stadier av bildeanalyse og validering (figur 9A-D). Vi fant at ikke-ormobjekter viste et unikt forhold mellom den tilsynelatende VMC og levetiden, med de to kommentert som forekommer nesten samtidig i hvert objekt (figur 9A). I motsetning til dette sluttet ekte nematoder vanligvis å bevege seg kraftig flere dager før deres dødstid (figur 9A). Denne forskjellen i forholdet mellom VMC og levetid gir et ekstra middel for raskt å identifisere og ekskludere ikke-ormeobjekter.

Figure 9
Figur 9: Effekten av manuell datavalidering på analyse av kraftig bevegelsesavbrudd (VMC). (A) Atferdsmessige aldringsdata uten manuell merknad av ormeobjekter på Worm Browser storyboard, som viser forholdet mellom dødstider og VMC-tider i ikke-ormeobjekter (i svart) versus ormeobjekter (i rødt). (B) Atferdsmessige aldringsdata plottet etter manuell annotering av ormobjekter på storyboardet. (C) Atferdsmessige aldringsdata plottet etter manuell annotering av ormobjekter og dødstider på storyboardet. (D) Tabellarisk representasjon av gjennomsnittlig gjenværende levetid (ARL; hentet fra skjæringspunktet mellom dødsalder og VMC-alder) på tvers av ulike trinn i bildeanalysepipelinen og prosentvis forskjell i ARL mellom ormobjektannotasjon og ytterligere dødstidsannotasjon. (E) Grafisk fremstilling av de estimerte ARLene på tvers av forskjellige trinn i analysen etter bildeoppkjøpet, og deres forhold til ormens levetid (som er avhengig av auxinkonsentrasjonen: α-nafaleneeddiksyre). Spline-tilpasningen ble utført ved hjelp av en kubisk spline-metode. Alle grafene ble plottet inn på statistikkprogrammet JMP. Dataene for denne figuren ble tilpasset med tillatelse fra Oswal et al.23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Vi fant at annotasjon og eksklusjon av ikke-ormobjekter ved hjelp av ormeleseren var tilstrekkelig til å gi et grovt estimat av forholdet mellom VMC og dødstider (figur 9A-C), og rekapitulerte den forventede dynamikken i den fysiologiske nedgangen i nematoder23. For å utforske dette ytterligere, vurderte vi det samme RNA-polymerase II-datasettet og estimerte gjennomsnittlig gjenværende levetid (ARL) etter VMC for hver delpopulasjon som skjæringspunktet for en lineær regresjonsmodell som relaterer levetiden til VMC. For å forstå effekten av datamerknad på ARL, beregnet vi ARL på nytt etter hvert trinn med datamerknad (figur 9E). Vi fant at den manuelle annotasjonen av dødstider i atferdsmessig aldringsanalyse var spesielt viktig i lengre levde ormer, i dette tilfellet de som ble utsatt for de laveste konsentrasjonene av auxin (figur 9D, E). I motsetning til den minimale effekten på overlevelseskurvene, hadde manuell annotering av dødstider en betydelig effekt på det kvantitative forholdet mellom VMC og levetid, og økte estimert ARL, for eksempel ved 0 μM auxin, fra 8,09 dager til 10,42 dager etter dødstidsannotasjon; Dette representerer en ARL-forskjell på 29%. Derfor fant vi at forholdet mellom VMC og dødstider forklart av ARL var mye mer følsomt for annotering av dødstider sammenlignet med målinger av dødstider for levetid alene. Denne følsomheten kan forklares av den relative varigheten av ARL og levetiden; de samme justeringene av dødstiden vil vanligvis være små i forhold til levetiden, men store i forhold til ARL. Dermed vil justeringer av dødstider ha større relativ effekt på ARL sammenlignet med levetiden.

Tilleggsfil 1: Strukturen til eksperimentplanfilen for Lifespan Machine. Forsøksplanen består av tre deler. Først inkluderes den grunnleggende informasjonen om eksperimentet, for eksempel navn og fangstspesifikasjon. Fra denne delen må vanligvis bare navnet på eksperimentet endres for hvert nytt eksperiment. Den andre delen av dokumentet genereres ved å eksportere skanneområder fra ormeleseren og angir den fysiske plasseringen av skanneområdene for hver skanner ("asuna", "bulma", "moskva", "rio", "yuno" og "yuki" i dette eksemplet). Disse erstattes for hvert nye eksperiment og kopieres fra TXT-filene som genereres for hver skanner individuelt i trinn 4.1.2.3. Den tredje delen av dokumentet gir informasjon om varigheten av eksperimentet, som også bør endres for hvert nytt eksperiment, og fangstfrekvensen. Enheten skanner hvert definerte område, ett om gangen, med bestemte intervaller i løpet av hele eksperimentet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her gir vi en detaljert, tilgjengelig protokoll for å utføre et eksperiment med den nyeste versjonen av Lifespan Machine. Vi har vist at det kritiske trinnet for å oppnå veloppløste overlevelseskurver er manuell utelukkelse av ikke-ormobjekter under opptak etter bildeopptak. Manuell dødstidsannotering har liten effekt på overlevelseskurvenes generelle form, og viser at helautomatisk dødstidsestimering er effektivt selv uten manuell annotering (figur 8). Tvert imot krever oppkjøpet av høykvalitets atferdsmessige aldringsdata mer forsiktig annotering av dødstider, spesielt hos langlivede individer (figur 9). Derfor vil tiden som kreves for hånd storyboard annotasjon til slutt avhenge av det spesifikke resultatet som måles. Samlet sett finner vi at når man arbeider med LSM, er forskerens innsats mest avgjørende under det eksperimentelle oppsettet og i mindre grad under analysen etter bildeoppkjøpet. Til slutt fremhever vi verdien av automatiserte analyser med høy gjennomstrømning for å produsere svært oppløste overlevelses- og atferdsaldringsdata, samtidig som vi øker produktiviteten til forskere og støtter eksperimentell reproduserbarhet.

LSM huser nematoder på agarplater, og gjenskaper den klassiske levetidsanalysen i en automatisert sammenheng. Andre verktøy er utviklet for å automatisere måling av levetid i C. elegans ved hjelp av forskjellige metoder for nematodeinneslutning. Disse inkluderer tilnærminger der enkelte nematoder er plassert i faste medier (WorMotel15) eller innenfor en mikrofluidisk enhet (Lifespan-on-a-chip11) eller de som sporer en større populasjon av dyr ved hjelp av mikrofluidikk (WormFarm14). Fordelene med mikrofluidiske plattformer inkluderer muligheten for presis, sanntids miljøkontroll og automatisert fjerning av avkom ved størrelsesekskludering. Imidlertid har de nevnte enhetene så langt ikke vist seg lett skalerbare, da de krever omfattende manuell håndtering og ofte er avhengige av daglig bilde- eller videoopptak utløst av en eksperimentalist. Andre plattformer, som Stress-Chip39, bruker de modifiserte planskannerne designet for LSM for å avbilde tilpassede mikrofluidiske enheter.

I motsetning til andre metoder har LSM omfattende datamerknads- og valideringsfasiliteter, slik at brukerne systematisk kan utføre kvalitetskontrollen som kreves for å samle inn høyoppløselige, presise og nøyaktige levetidsdata i en kontekst med høy gjennomstrømning13. Teknikken er allsidig på grunn av bruken av nåværende agarplatebaserte laboratorieprotokoller og gir en unik fordel for eksperimentell skalerbarhet på grunn av den relativt enkle oppstillingen av store grupper av planskannere. Selv om LSM krever en innledende tidsinvestering for å bygge og drive og trene brukere på den spesialiserte programvaren, balanseres disse kostnadene av den robuste, høye gjennomstrømningsproduksjonen av levetidsdata. Lifespan Machine-klynger på 50 skannere eller mer har blitt distribuert i flere laboratorier, og kjører kontinuerlig i mer enn et tiår40.

LSM har begrensninger. Dyr er plassert i skannere under automatisert innsamling av overlevelsesdata, og begrenser dermed forskernes evne til å utføre eksperimentelle inngrep samtidig med observasjon og krever enten sterilisering av dyrene eller starter eksperimenter etter nematodenes reproduktive fase. Endringer i temperatur er et sjeldent unntak fra begrensningen på inngrep, da omgivelsestemperaturen kan moduleres uten å måtte åpne skannerne og få tilgang til dyrene. I tilfeller der praktiske inngrep må påføres nematoder midt i livet, er en vanlig løsning å utsette oppstart av automatisert observasjon til etter at nødvendig håndtering av dyrene er utført. I tillegg er det en iboende variasjon i plasseringen av plater i og på tvers av skannerne. Disse kan være gjenstand for små, lokale forskjeller i miljøforhold (som i temperatur, lys, ventilasjon, etc.), som kan påvirke C. Elegans levetid19. Denne miljøpåvirkningen kan kvantifiseres videre og studeres ved hjelp av akselererte feiltidsregresjonsmodeller41. En måte å redusere denne effekten på er ganske enkelt å skalere antall plater og skannere for å oppnå en streng måling uavhengig av miljøsvingninger. Vanligvis er plater av samme tilstand tilfeldig fordelt innenfor hver skanner, og populasjonsstørrelser større enn 500 individer per tilstand og på tvers av skannere har vist statistisk robuste overlevelsesestimater31.

Samlet sett tillater LSM høy nøyaktighet og stor befolkningsinnsamling av overlevelses- og atferdsmessige aldringsdata, og kan gjøre det mulig å utføre tidligere umulige skjermer på en kvantitativ måte. På denne måten bidrar LSM til et stort teknisk fremskritt for den standardiserte samlingen av overlevelseskurver og gir et nytt rammeverk for den koblede studien av levetid og atferdsmessig aldring i nematoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Julian Ceron og Jeremy Vicencio (IDIBELL Barcelona) for å produsere rpb-2 (cer135) allelet. Dette prosjektet ble finansiert av Det europeiske forskningsrådet (ERC) under EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram (Grant Agreement No. 852201), det spanske departementet for økonomi, industri og konkurranseevne (MEIC) til EMBL-partnerskapet, Centro de Excelencia Severo Ochoa (CEX2020-001049-S, MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033), CERCA-programmet / Generalitat de Catalunya, MEIC Excelencia-prisen BFU2017-88615-P, og en pris fra Glenn Foundation for Medical Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Naphtaleneacetic  acid (Auxin) Sigma N0640 Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR) Sigma F0503 27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria
Glass cleaner Kristal-M QB-KRISTAL-M125ml
Hydrophobic anti-fog glass treatment Rain-X Scheibenreiniger  C. 059140
Rubber matt Local crafstman Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock
Scanner glass Local hardware supplier 9" x 11.5" inch glass sheet
Scanner plates Life Sciences 351006 50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish
USB Reference Thermometer USB Brando ULIFE055500  For calibrating temperature of scanners

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harman, D. The aging process: Major risk factor for disease and death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5360-5363 (1991).
  2. Vaupel, J. W. Biodemography of human ageing. Nature. 464 (7288), 536-542 (2010).
  3. Mair, W., Goymer, P., Pletcher, S. D., Partridge, L. Demography of dietary restriction and death in Drosophila. Science. 301 (5640), 1731-1733 (2003).
  4. Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational analysis of lifespan experiment reproducibility. Frontiers in Genetics. 8, 92 (2017).
  5. Lucanic, M., et al. Impact of genetic background and experimental reproducibility on identifying chemical compounds with robust longevity effects. Nature Communications. 8 (1), 14256 (2017).
  6. Banse, S. A., et al. Automated lifespan determination across Caenorhabditis strains and species reveals assay-specific effects of chemical interventions. Geroscience. 41 (6), 945-960 (2019).
  7. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  8. Kirkwood, T. B., et al. What accounts for the wide variation in life span of genetically identical organisms reared in a constant environment. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (3), 439-443 (2005).
  9. Stroustrup, N., et al. The temporal scaling of Caenorhabditis elegans ageing. Nature. 530 (7588), 103-107 (2016).
  10. Hamilton, B., et al. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes & Development. 19 (13), 1544-1555 (2005).
  11. Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nature Genetics. 33 (1), 40-48 (2003).
  12. Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The replica set method: A high-throughput approach to quantitatively measure Caenorhabditis elegans lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819 (2018).
  13. Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  14. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  15. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. Elife. 6, 26652 (2017).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Kerr, R. A., Roux, A. E., Goudeau, J. F., Kenyon, C. The C. elegans observatory: High-throughput exploration of behavioral aging. Frontiers in Aging. 3, 932696 (2022).
  18. Javer, A., Ripoll-Sánchez, L., Brown, A. E. Powerful and interpretable behavioural features for quantitative phenotyping of Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1758), 20170375 (2018).
  19. Miller, H., et al. Genetic interaction with temperature is an important determinant of nematode longevity. Aging Cell. 16 (6), 1425-1429 (2017).
  20. Bansal, A., Zhu, L. J., Yen, K., Tissenbaum, H. A. Uncoupling lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans longevity mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E277-E286 (2015).
  21. Huang, C., Xiong, C., Kornfeld, K. Measurements of age-related changes of physiological processes that predict lifespan of Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (21), 8084-8089 (2004).
  22. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  23. Oswal, N., Martin, O. M., Stroustrup, S., Bruckner, M. A. M., Stroustrup, N. A hierarchical process model links behavioral aging and lifespan in C. elegans. PLoS Computational Biology. 18 (9), 1010415 (2022).
  24. Sen, I., et al. DAF-16/FOXO requires protein phosphatase 4 to initiate transcription of stress resistance and longevity promoting genes. Nature Communications. 11 (1), 138 (2020).
  25. Schiffer, J. A., et al. et al.Caenorhabditis elegans processes sensory information to choose between freeloading and self-defense strategies. Elife. 9, 56186 (2020).
  26. Bazopoulou, D., et al. Developmental ROS individualizes organismal stress resistance and lifespan. Nature. 576 (7786), 301-305 (2019).
  27. Guerrero-Rubio, M. A., Hernández-García, S., García-Carmona, F., Gandía-Herrero, F. Extension of life-span using a RNAi model and in vivo antioxidant effect of Opuntia fruit extracts and pure betalains in Caenorhabditis elegans. Food Chemistry. 274, 840-847 (2019).
  28. Janssens, G. E., et al. Transcriptomics-based screening identifies pharmacological inhibition of Hsp90 as a means to defer aging. Cell Reports. 27 (2), 467-480 (2019).
  29. Kasimatis, K. R., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Phillips, P. C. Auxin-mediated sterility induction system for longevity and mating studies in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (8), 2655-2662 (2018).
  30. Lin, X. -X., et al. DAF-16/FOXO and HLH-30/TFEB function as combinatorial transcription factors to promote stress resistance and longevity. Nature Communications. 9 (1), 4400 (2018).
  31. Stroustrup, N., et al. The temporal scaling of Caenorhabditis elegans ageing. Nature. 530 (7588), 103-107 (2016).
  32. Byerly, L., Cassada, R., Russell, R. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
  33. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  34. Wilkinson, D. S., Taylor, R. C., Dillin, A. Analysis of aging in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 107, 353-381 (2012).
  35. Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental Gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
  36. Lithgow, G. J., Driscoll, M., Phillips, P. A long journey to reproducible results. Nature. 548 (7668), 387-388 (2017).
  37. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
  38. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2010).
  39. Banse, S. A., Blue, B. W., Robinson, K. J., Jarrett, C. M., Phillips, P. C. The Stress-Chip: A microfluidic platform for stress analysis in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 14 (5), e0216283 (2019).
  40. Banse, S. A., et al. Automated lifespan determination across Caenorhabditis strains and species reveals assay-specific effects of chemical interventions. Geroscience. 41 (6), 945-960 (2019).
  41. Swindell, W. R. Accelerated failure time models provide a useful statistical framework for aging research. Experimental Gerontology. 44 (3), 190-200 (2009).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 203 Levetid atferdsmessig aldring aldring Caenorhabditis elegans automatiserte levetidsmetoder Lifespan Machine kraftig bevegelsesopphør helsespenn overlevelsesanalyser mikroskopi med høy gjennomstrømning bildeanalyse maskinlæring
Atferdsmessige aldrings- og levetidsanalyser med høy gjennomstrømning ved bruk av levetidsmaskinen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Del Carmen-Fabregat, A., Sedlackova, … More

Del Carmen-Fabregat, A., Sedlackova, L., Oswal, N., Stroustrup, N. High-Throughput Behavioral Aging and Lifespan Assays Using the Lifespan Machine. J. Vis. Exp. (203), e65462, doi:10.3791/65462 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter