本文介绍了一种基于荧光素酶的报告基因检测方法的详细实验方案，该方法采用半自动化、高通量筛选模式。
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本文内容
摘要
摘要
越来越多的证据表明，高水平的自噬流与肿瘤进展及癌症治疗耐药性相关。检测单个自噬蛋白是针对该通路开发治疗策略的前提。抑制自噬蛋白酶ATG4B已被证明可延长总体生存期，提示ATG4B可能是癌症治疗的一个潜在药物靶点。本实验室已开发出一种基于荧光素酶的特异性检测方法，用于监测细胞中ATG4B的活性。在该检测中，ATG4B的底物LC3B在其C末端融合了海洋桡足类Gaussia princeps来源的一种可分泌荧光素酶（GLUC）。该报告分子与肌动蛋白细胞骨架相连，因此在未被切割时保留在细胞质中。ATG4B介导的切割会导致GLUC通过非经典分泌途径释放，随后可通过收集细胞培养上清液来检测其含量，从而反映细胞内ATG4B的活性。本文介绍了将这种基于荧光素酶的检测方法应用于自动化高通量筛选的技术改进。我们详细描述了用于典型高通量分析细胞ATG4B活性的工作流程及优化条件。
引言
自噬是一种保守的代谢过程，细胞通过溶酶体降解衰老、受损或不必要的细胞成分，从而维持细胞内稳态并应对各种应激via的溶酶体途径1,2,3。在某些病理生理条件下，该过程作为细胞应对营养和氧气缺乏的关键应答机制，通过回收营养物质和脂质，使细胞能够适应其代谢需求2,3,4。自噬还被确认为与多种疾病相关的细胞应激反应，包括神经退行性疾病、病原体感染以及多种癌症。自噬在癌症中的作用复杂，取决于肿瘤的类型、发展阶段和状态：它可通过自噬性降解受损细胞来抑制肿瘤发生，但在缺氧、营养缺乏和细胞毒性损伤等应激条件下，也可通过增强细胞存活能力促进晚期肿瘤的生存2,4,5,6。
多项研究表明，抑制自噬作为一种抗癌策略具....
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方案
注意：实验流程如图1所示。有关本方案中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息，请参见材料表。
1. 逆转录病毒的制备
注意：编码 ActinLC3dNGLUC 的质粒为 pMOWS-ActinLC3dNGLUC20。为获得高滴度病毒，应使用低代次细胞（理想情况下低于 P20）。
- 在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293T细胞，于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养，直至细胞融合度达到80%–90%后再进行转染接种。
- 转染前一天，将细胞以每孔1 × 106个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL完全培养基。将培养板置于含5% CO2的湿化培养箱中过夜培养。
注意：若使用基于脂质体的转染试剂，请遵循制造商说明书。本方案描述的是非脂质体类转染试剂的使用方法。开始转染前，将DNA转染试剂、DNA和培养基平衡至室温（约15分钟）。 - 每项转染实验中，向1.5 mL微量离心管中加入200 µL无血清培养基。在每根管中加入以下量的质粒：1,0....
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结果
在之前的一项研究中8，我们成功应用该检测方法筛选了小分子和siRNA文库，并鉴定了ATG4B的新调控因子。本文中，我们描述了该荧光素酶报告系统的实验方案及其在半自动化、高通量筛选模式下的代表性结果。图8展示了细胞核计数与发光信号原始数据分析的示例。图8A描绘了一次典型的发光检测结果：第1列显示了DMSO处理组的基础发光信号，第24列显示了加入10 µM ATG4B抑制剂FMK9A后的发光信号。同一块板的细胞核计数结果见图8B。每个化合物的原始数值均以中性对照组的平均值进行归一化处理，以获得ATG4B活性百分比和细胞存活率（图9A、B）。如预期所示，大多数化合物对ATG4B活性无显著影响，表现为接近阴性对照（DMSO—第1列）基础发光水平的数值。高通量筛选的质量评估指标Z'因子通过公式（1.......
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讨论
本方案描述了一种基于细胞的报告基因检测方法，用于鉴定ATG4B抑制剂。初筛阳性结果的确定依据是检测在β-肌动蛋白与dNGLUC之间表达LC3B全长开放阅读框的细胞经处理后产生的荧光素酶活性。该检测方法具有若干优势：灵敏度高、定量性强且为非侵入性，因其可在不裂解细胞的情况下检测dNGLUC。本文提供了构建稳定细胞系及进行初筛的详细实验方案。该方案中包含若干关键步骤。
首先，本方案中使用的PANC1细胞系具有较高的转染效率和较强的增殖能力。该筛选方法也可使用其他细胞系进行，但不同细胞系之间的转导效率可能存在差异。其次，应避免使用冻存传代次数超过五代的稳定细胞群体，因为报告基因的表达水平可能随时间推移而下降。第三，每次实验前应使用新鲜的细胞批次，以确保在不同实验中获得最大且一致的荧光素酶信号。第四，在接种细胞时，无论是手动操作还是使用批量分液器，细胞悬液都必须持续搅拌，以保证整个培养板中细胞密度均匀。第五，在收集孔中上清液时，移液吸头应置于孔内适当深度，以便吸出上清液的同时不扰动培养孔底部的细胞单层。最后，底物工作液应在实验当天配制。腔肠素对光极为敏感且易被氧化，已有文献报道其在配制后会.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得了英国医学研究理事会（MRC）对MRC-UCL大学单位资助项目（项目编号MC_U12266B）、MRC痴呆平台资助项目（英国项目编号MR/M02492X/1）、胰腺癌英国基金会（Pancreatic Cancer UK，资助编号2018RIF_15）以及UCL治疗加速支持计划的资助，其中UCL治疗加速支持计划的资金来源于MRC“概念验证信心”2020年UCL项目（MC/PC/19054）。编码ActinLC3dNGLUC的质粒（pMOWS-ActinLC3dNGLUC）由Robin Ketteler博士（柏林医学院人类医学系）提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 µL 一次性吸头 - 无滤芯、纯净、嵌套式 8 层堆叠（被动堆叠） | Tecan | 30038609 | 一次性 96 吸头架 |
| BioTek MultiFlo | BioTek | 批量分液器 | |
| 腔肠素 | 圣克鲁兹生物技术公司（Santa Cruz Biotechnology） | sc-205904 | 底物 |
| Columbus 图像分析软件 | 珀金埃尔默（Perkin Elmer） | 版本 2.9.1 | 图像分析软件 |
| DPBS (1x) | 吉布科（Gibco） | 14190-144 | |
| 适用于 Echo 的 384 孔聚丙烯微孔板，透明，非无菌 | 贝克曼库尔特（Beckman Coulter） | 001-14555 | 384PP 板 |
| EnVision II | 珀金埃尔默（Perkin Elmer） | 发光微孔板读板仪 | |
| Express pick 药物库（96 孔）-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 孔板 | Greiner Bio-One | 781076 | 实心黑色 384 孔板 |
| Harmony 成像软件 | 珀金埃尔默（Perkin Elmer） | 版本 5.1 | 成像软件 |
| Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物 - 水中 10 mg/mL 溶液 | 赛默飞世尔科技（ThermoFisher） | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 系列，配备 Echo Cherry Pick 软件 | Labcyte/贝克曼库尔特（Beckman Coulter） | 纳升级声波液体移液系统 | |
| Milli-Q 水 | 去离子水 | ||
| Opera Phenix 高内涵筛选系统 | 珀金埃尔默（Perkin Elmer） | 自动化显微镜 | |
| 4% 多聚甲醛 PBS 溶液 | 圣克鲁兹生物技术公司（Santa Cruz Biotechnology） | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384 孔板，黑色，光学透明平底，组织培养处理，带盖 | 珀金埃尔默（Perkin Elmer） | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | 由 Robin Ketteler 博士（柏林医学科学学院人类医学系）提供 | ||
| Polybrene 感染/转染试剂 | 默克（Merck） | TR-1003-G | polybrene |
| 嘌呤霉素二盐酸盐，98%，赛默飞世尔化学品（Thermo Scientific Chemicals） | 赛默飞世尔科技（ThermoFisher） | J61278.ME | 嘌呤霉素 |
| Tecan Freedom EVO 200 机器人 | Tecan | 液体处理机器人平台 | |
| X-tremeGENE HP DNA 转染试剂，罗氏（Roche） | 默克（Merck） | 6366244001 | DNA 转染试剂 |
参考文献
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al. Targeting ATG4 in cancer therapy. Cancers. 11 (5), 649(2019).
- Towers, C. G., Thorburn, A. <....
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重印与许可
