基于细胞的自噬相关 4B 半胱氨酸肽酶抑制剂的药物筛选
Summary
在这里，我们描述了在半自动、高通量筛选形式中使用基于荧光素酶的报告基因测定的详细方案。
Abstract
越来越多的证据表明，高自噬通量与肿瘤进展和癌症治疗耐药性有关。测定单个自噬蛋白是针对该途径的治疗策略的先决条件。抑制自噬蛋白酶ATG4B已被证明可以增加总生存期，这表明ATG4B可能是癌症治疗的潜在药物靶点。我们的实验室开发了一种基于荧光素酶的选择性检测方法，用于监测细胞中的ATG4B活性。对于该测定，ATG4B 的底物 LC3B 在 C 末端用来自海洋桡足类 Gaussia princeps （GLUC） 的可分泌荧光素酶标记。该报告基因与肌动蛋白细胞骨架相连，因此在未解脱时将其保留在细胞的细胞质中。ATG4B 介导的裂解导致非常规分泌释放 GLUC，然后可以通过从细胞培养物中收获上清液作为细胞 ATG4B 活性的相关性来监测。本文介绍了这种基于荧光素酶的检测方法对自动化高通量筛选的适应。我们描述了细胞ATG4B活性的示例性高通量分析的工作流程和优化。
Introduction
自噬是一种保守的代谢过程，它允许细胞保持细胞内稳态，并通过溶酶体降解老化、有缺陷或不必要的细胞内容物来应对压力 1,2,3。在某些病理生理条件下，该过程是细胞对营养和缺氧的关键反应，导致循环的营养物质和脂质，使细胞能够适应其代谢需求2,3,4。自噬也被确定为与多种疾病相关的细胞应激反应，例如神经退行性疾病、病原体感染和各种类型的癌症。自噬在癌症中的功能很复杂，取决于肿瘤的类型、分期和状态。它可以通过受损细胞的自噬降解来抑制肿瘤发生，但也可以通过在缺氧、营养剥夺和细胞毒性损伤等应激条件下提高细胞存活率来促进晚期肿瘤的存活 2,4,5,6。
几项研究表明，自噬抑制作为一种抗癌策略是有益的。因此，抑制关键步骤，如自噬体形成或其与溶酶体的融合，可能是控制癌症的有效方法2,4,5,6。越来越多的证据表明，ATG4B 参与某些病理状况，并且它作为潜在的抗癌靶点而受到关注 2,3,4。例如，观察到结直肠癌细胞和人表皮生长因子受体 2 （HER2） 阳性乳腺癌细胞的 ATG4B 表达水平明显高于邻近的正常细胞 2,4。在前列腺癌细胞中，ATG4B 的抑制导致细胞系对化疗和放疗的特异性易感性7。最近，有强有力的证据表明胰腺导管腺癌 （PDAC） 特别容易受到 ATG4B 抑制的影响。例如，在基因工程小鼠模型中，研究表明 ATG4B 功能的间歇性丧失会减少 PDAC 肿瘤生长并增加生存率 3,4。总体而言，ATG4B 在某些癌症类型中高度过表达，与肿瘤进展有关，并与癌症治疗耐药性有关 2,4,8。
哺乳动物中的 ATG4 半胱氨酸蛋白酶有四个家族成员，ATG4A-ATG4D。这些蛋白对 LC3/GABARAP （ATG8） 蛋白家族 9,10,11 表现出一定的靶向选择性，并且可能具有与其蛋白酶活性无关的其他功能12,13。此外，ATG4 还调节一种新型的翻译后修饰，即蛋白质的 ATG8 基化11,12。虽然ATG4B及其主要底物LC3B是研究最广泛的，但正在出现一张图片，表明每个亚家族成员在调节自噬和非自噬过程中都具有复杂的作用。通过磷酸化、乙酰化、糖基化和亚硝基化调节 ATG4B 活性的翻译后修饰复杂网络进一步证实了这一点 9,10,11,12,13。
几种已知的ATG4B抑制剂已发表2,4,14,15。虽然这些适合作为研究工具，但它们的药效学特征、选择性或效力尚未阻止它们作为临床前候选药物的开发4,16。总体而言，迫切需要确定更有效和更具选择性的化合物。通常，这些化合物是蛋白质功能的良好生化抑制剂，但它们在基于细胞的测定中的功效很差。有多种检测方法可以监测 ATG4B 活性，包括生化方法和基于细胞的检测4。我们之前开发了一种简单的、基于发光的高通量测定法，用于监测细胞中的 ATG4B 活性 8,17。该测定利用来自高斯 （GLUC） 的荧光素酶蛋白，该蛋白在细胞外环境中稳定且具有活性，并且可以响应 ATG4B 蛋白水解活性从细胞中诱导释放18,19。
在该报告基因构建体中，dNGLUC与细胞的肌动蛋白细胞骨架相连。蛋白酶特异性接头可以在β-肌动蛋白锚和 dNGLUC 之间引入，使分泌依赖于接头的切割。我们使用 β-肌动蛋白和 dNGLUC 之间的 LC3B 的全长开放阅读框，以便能够监测 LC3B 切割17、18、19。尽管 dNGLUC 的分泌机制知之甚少，但它对监测 ATG4B 活性具有特异性，不像 ATG5 敲除细胞中那样依赖于整体自噬，并且由不需要经典信号肽的非常规机制介导 4,18,19。我们已经成功地使用这种报告基因筛选了小分子和siRNA文库，并鉴定了ATG4B活性的新型调节因子，如Akt蛋白激酶8。本文描述了在半自动、高通量筛选形式中使用该荧光素酶报告基因的详细方案。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议描述了一种基于细胞的报告基因测定，用于鉴定ATG4B抑制剂。原发性命中的鉴定基于处理表达 β-肌动蛋白和 dNGLUC 之间 LC3B 全长开放阅读框的细胞时的荧光素酶活性。该测定的一些优点是它灵敏、高度定量和非侵入性，因为它可以在不裂解细胞的情况下检测 dNGLUC。本文提出了用于生成稳定细胞系和初步筛选的详细方案。协议中有几个关键步骤。
首先，本文描述的方?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了英国医学研究委员会对 MRC-UCL 大学单位资助参考MC_U12266B、MRC 痴呆症平台资助英国 MR/M02492X/1、英国胰腺癌（资助参考2018RIF_15）和 UCL 治疗加速支持计划的核心资助，并得到了 MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054 的资金支持。编码ActinLC3dNGLUC（pMOWS-ActinLC3dNGLUC）的质粒购自Robin Ketteler博士（柏林医学院人类医学系）。
Materials
| 50 µL Disposable Tips – Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al. Targeting ATG4 in cancer therapy. Cancers. 11 (5), 649 (2019).
- Towers, C. G., Thorburn, A. Therapeutic targeting of autophagy. EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).
- Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
- Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. Targeting autophagy in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).
- Kimmelman, A. C., White, E. Autophagy and tumor metabolism. Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).
- Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
- Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
- Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
- Tanida, I., Sou, Y. -. S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
- Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
- Ketteler, R., Tooze, S. A. ATG4: More than a protease. Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).
- Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
- Fernández, &. #. 1. 9. 3. ;. F., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
- Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
- Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
- Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -. W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
- Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).
