Summary
在这里，我们描述了在半自动、高通量筛选形式中使用基于荧光素酶的报告基因测定的详细方案。
Abstract
越来越多的证据表明，高自噬通量与肿瘤进展和癌症治疗耐药性有关。测定单个自噬蛋白是针对该途径的治疗策略的先决条件。抑制自噬蛋白酶ATG4B已被证明可以增加总生存期，这表明ATG4B可能是癌症治疗的潜在药物靶点。我们的实验室开发了一种基于荧光素酶的选择性检测方法，用于监测细胞中的ATG4B活性。对于该测定，ATG4B 的底物 LC3B 在 C 末端用来自海洋桡足类 Gaussia princeps （GLUC） 的可分泌荧光素酶标记。该报告基因与肌动蛋白细胞骨架相连，因此在未解脱时将其保留在细胞的细胞质中。ATG4B 介导的裂解导致非常规分泌释放 GLUC，然后可以通过从细胞培养物中收获上清液作为细胞 ATG4B 活性的相关性来监测。本文介绍了这种基于荧光素酶的检测方法对自动化高通量筛选的适应。我们描述了细胞ATG4B活性的示例性高通量分析的工作流程和优化。
Introduction
自噬是一种保守的代谢过程，它允许细胞保持细胞内稳态，并通过溶酶体降解老化、有缺陷或不必要的细胞内容物来应对压力 1,2,3。在某些病理生理条件下，该过程是细胞对营养和缺氧的关键反应，导致循环的营养物质和脂质，使细胞能够适应其代谢需求2,3,4。自噬也被确定为与多种疾病相关的细胞应激反应，例如神经退行性疾病、病原体感染和各种类型的癌症。自噬在癌症中的功能很复杂，取决于肿瘤的类型、分期和状态。它可以通过受损细胞的自噬降解来抑制肿瘤发生，但也可以通过在缺氧、营养剥夺和细胞毒性损伤等应激条件下提高细胞存活率来促进晚期肿瘤的存活 2,4,5,6。
几项研究表明，自噬抑制作为一种抗癌策略是有益的。因此，抑制关键步骤，如自噬体形成或其与溶酶体的融合，可能是控制癌症的有效方法2,4,5,6。越来越多的证据表明，ATG4B 参与某些病理状况，并且它作为潜在的抗癌靶点而受到关注 2,3,4。例如，观察到结直肠癌细胞和人表皮生长因子受体 2 （HER2） 阳性乳腺癌细胞的 ATG4B 表达水平明显高于邻近的正常细胞 2,4。在前列腺癌细胞中，ATG4B 的抑制导致细胞系对化疗和放疗的特异性易感性7。最近，有强有力的证据表明胰腺导管腺癌 （PDAC） 特别容易受到 ATG4B 抑制的影响。例如，在基因工程小鼠模型中，研究表明 ATG4B 功能的间歇性丧失会减少 PDAC 肿瘤生长并增加生存率 3,4。总体而言，ATG4B 在某些癌症类型中高度过表达，与肿瘤进展有关，并与癌症治疗耐药性有关 2,4,8。
哺乳动物中的 ATG4 半胱氨酸蛋白酶有四个家族成员，ATG4A-ATG4D。这些蛋白对 LC3/GABARAP （ATG8） 蛋白家族 9,10,11 表现出一定的靶向选择性，并且可能具有与其蛋白酶活性无关的其他功能12,13。此外，ATG4 还调节一种新型的翻译后修饰，即蛋白质的 ATG8 基化11,12。虽然ATG4B及其主要底物LC3B是研究最广泛的，但正在出现一张图片，表明每个亚家族成员在调节自噬和非自噬过程中都具有复杂的作用。通过磷酸化、乙酰化、糖基化和亚硝基化调节 ATG4B 活性的翻译后修饰复杂网络进一步证实了这一点 9,10,11,12,13。
几种已知的ATG4B抑制剂已发表2,4,14,15。虽然这些适合作为研究工具，但它们的药效学特征、选择性或效力尚未阻止它们作为临床前候选药物的开发4,16。总体而言，迫切需要确定更有效和更具选择性的化合物。通常，这些化合物是蛋白质功能的良好生化抑制剂，但它们在基于细胞的测定中的功效很差。有多种检测方法可以监测 ATG4B 活性，包括生化方法和基于细胞的检测4。我们之前开发了一种简单的、基于发光的高通量测定法，用于监测细胞中的 ATG4B 活性 8,17。该测定利用来自高斯 （GLUC） 的荧光素酶蛋白，该蛋白在细胞外环境中稳定且具有活性，并且可以响应 ATG4B 蛋白水解活性从细胞中诱导释放18,19。
在该报告基因构建体中，dNGLUC与细胞的肌动蛋白细胞骨架相连。蛋白酶特异性接头可以在β-肌动蛋白锚和 dNGLUC 之间引入，使分泌依赖于接头的切割。我们使用 β-肌动蛋白和 dNGLUC 之间的 LC3B 的全长开放阅读框，以便能够监测 LC3B 切割17、18、19。尽管 dNGLUC 的分泌机制知之甚少，但它对监测 ATG4B 活性具有特异性，不像 ATG5 敲除细胞中那样依赖于整体自噬，并且由不需要经典信号肽的非常规机制介导 4,18,19。我们已经成功地使用这种报告基因筛选了小分子和siRNA文库，并鉴定了ATG4B活性的新型调节因子，如Akt蛋白激酶8。本文描述了在半自动、高通量筛选形式中使用该荧光素酶报告基因的详细方案。
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Protocol
注：测定过程如图 1所示。有关本协议中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息，请参阅 材料表 。
1. 逆转录病毒生产
注：编码ActinLC3dNGLUC的质粒是pMOWS-ActinLC3dNGLUC20。使用低传代数的细胞来生产高滴度病毒（理想情况下小于 P20）。
- 在37°C下，在5%CO2 气氛中，在补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P / S）的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中培养HEK293T细胞，直到它们在80%-90%汇合后接种进行转染。
- 转染前一天，将细胞以 1 × 10个细胞/ 孔的密度接种到 6 孔板中，溶于 2 mL/孔的完全生长培养基中。将板在气氛为5%CO2的加湿培养箱中孵育过夜。
注：如果使用基于脂质体的转染试剂，请遵循制造商的说明。该方案描述了使用非脂质体试剂。在开始转染之前，让 DNA 转染试剂、DNA 和培养基平衡至室温（~15 分钟）。 - 对于每次转染，向 1.5 mL 微量离心管中加入 200 μL 无血清培养基。在每个试管中，加入以下量的质粒：1,000ng pMOWS-ActinLC3dNGLUC;900 ng GagPol;100 ng VSV-G。
注：此处列出的质粒量和培养基体积适用于12孔板。如果使用不同的板类型，调整培养基体积和质粒量，以达到 5 ng/μL 转印质粒、4.5 ng/μL 包装质粒和 0.5 ng/μL 包膜质粒的最终浓度。使用任何含有gag和pol表达基因的包装质粒，以及任何含有VSV-G表达基因的包膜质粒。 - 涡旋DNA转染试剂瓶30秒。将 4 μL 转染试剂直接移液到含有稀释 DNA 的培养基中。轻轻倾斜试管，轻轻混合。
注意： 请勿用尖端接触塑料管壁。不要上下移液或涡旋。 - 将反应在室温下孵育15分钟。
- 孵育反应时，从 6 孔板中取出旧培养基，并用 2 mL/孔新鲜无血清培养基代替。
- 以逐滴方式将每种转染复合物添加到每个孔中。
- 轻轻摇晃或旋转板，以确保在整个孔表面均匀分布。
- 将板在37°C下在具有5%CO2气氛的加湿培养箱中孵育过夜。
- 24小时后，用新鲜的完全培养基（2mL /孔）替换旧培养基，并将细胞放回加湿的培养箱中，在5%CO2 的气氛下放置72小时。
- 72小时后，在50mL锥形管中收获上清液，并在4°C下以4,000× g 离心10分钟以除去死细胞和碎片。为了进一步纯化，使用一个大的 60 mL 注射器使上清液通过 0.20 μm 过滤器。立即制备300μL的一次性等分试样并储存在-80°C。
注意： 避免冻融循环以保持最大的产品活性。
2. 逆转录病毒转导
- 在转导细胞的前一天，将靶细胞以中等密度（PANC1,1×10,5个细胞/孔）接种在12孔板中，在补充有10%FBS和1%P / S的1mL /孔培养基中，将板在37°C下在5%CO2气氛的潮湿培养箱中孵育过夜。
注意：必须提前确定最佳细胞密度，因为不同的细胞类型具有不同的附着能力。理想情况下，使用细胞密度来获得 40%-50% 的汇合度。 - 从-80°C冰箱中取出冷冻的逆转录病毒等分试样，并在每次使用前在冰上解冻。
注意：不要重新冷冻未使用的等分试样。 - 在 50 mL 锥形管中，制备终浓度为 8 μg/mL 的病毒上清液和聚凝胺的混合物。
注：后续体积适用于最终体积为 500 μL/孔的 12 孔板的转导。最终的病毒上清液体积可以通过在聚凝胺存在下测试一系列病毒稀释度来估计。根据所需的转基因表达水平和所用容器的大小，可以使用更高或更低的稀释度。 - 从 12 孔板中取出旧培养基，并向每个孔中加入 500 μL 混合物。将细胞与病毒上清液在37°C下在具有5%CO2气氛的潮湿培养箱中孵育过夜。
注意：保留两个孔，其中有完全培养基（无病毒上清液），用作选择的对照。 - 用新鲜的完全生长培养基（1 mL/孔）替换含病毒的培养基。将细胞放回加湿的培养箱中，气氛为5%CO248 小时。
3. 集中种群选择和维护
- 用选择培养基（终浓度为1μg/ mL的完全生长培养基）代替生长培养基。监测细胞的生长，每2-3天更换一次选择培养基。在汇合处，扩充到 6 孔培养皿中，然后扩充到直径为 10 cm 的组织培养皿中。
- 将细胞保持在选择培养基中至少与对照（未转导）细胞完全死亡所需的时间一样长。
注：为了获得成功的结果，建议在开始实验项目之前确定嘌呤霉素的最佳浓度。为此，生成嘌呤霉素杀伤曲线以确定在 3 至 10 天之间杀死未转导细胞所需的最低浓度。 - 一旦细胞在选择培养基中生长，在完全生长培养基上扩增细胞并冷冻实验项目的储备等分试样。
注意：记录传代数，避免使用传代数大于 5 的冷冻种群。在进行检测之前，定期检查支原体污染。理想情况下，在每次测定前使用新鲜细胞批次，以获得荧光素酶的最大信号。 - 将细胞保持在选择培养基中，并在测定前一天接种足够的细胞以达到所需的密度。
4.复合添加
注：Selleckchem 小分子库由大约 4,000 种化合物组成，这些化合物在 50 个 96 孔板中以 10 mM 的储备浓度排列在 50 个 96 孔板中，储备浓度为 10 mM。
- 将 30 μL 化合物分装到与纳米级声学液体分配器兼容的源板的适当孔中。使用 384 孔聚丙烯板（384PP 板）。保持这些板密封并储存在-20°C。
注：此处描述的筛选方案是每天总共 10 个测定板;使用10μM的固定浓度作为最终测定浓度，孵育期为24小时。 - 在室温下解冻化合物库板。
注意： 确保板完全解冻并平衡至室温。整个板的温度梯度可能会影响液体处理。 - 使用纳米级声波液体分配器将 50 nL/孔分配到 384 孔测定板中。
注意： 确保程序中选定的源板和目的板与用于此步骤的板匹配。 - 在电子表格上创建点胶程序。
- 打开软件。
- 打开一个新协议。从“协议”选项卡中，选择以下选项：样品板规格，384PP;样品板类型，384PP_DMSO2;和目的板类型，CellCarrier-384 Ultra PN（图2A）。
- 在“选择列表”下，选择导入选项（图2B）以导入包含分配程序的电子表格（图2C）。
- 选择“运行协议”选项（图2D），验证显示的信息是否正确，然后单击“运行”。
- 在名为“运行状态”的新窗口（图2E）上，单击“开始”，然后按照提示窗口中显示的步骤进行操作（图2F，G）。
5. 细胞接种
- 从细胞培养瓶或细胞培养培养皿中胰蛋白酶消化细胞，并通过添加含FBS的培养基中和胰蛋白酶。
- 将细胞悬液转移到 50 mL 锥形管中，并在室温下以 390 × g 离心 5 分钟。然后，轻轻除去上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 完全生长培养基中。
- 进行细胞计数。
- 在 230 mL 完全培养基中用 4.6 × 107 个细胞制备细胞悬液。
注：该体积和细胞密度适用于 10x 384 孔测定板加上两个 384 孔板的死体积。 - 将 50 μL 细胞悬液分配到 384 孔测定板的每个孔中，在第 4 节中制备。
注意：细胞接种可以手动完成，也可以使用散装分配器完成。 - 将细胞在37°C下在具有5%CO2 气氛的湿润培养箱中孵育24小时。
6. 收获细胞上清液
注意： 此处使用的液体处理机器人平台使用多通道臂执行液体处理，用于 96 个吸头。如果没有可用的液体处理自动化，则可以使用多通道移液器将方案调整为低通量格式。
- 配置实验室自动化工作站的甲板， 如图 3 所示。
- 将一次性 96 吸头堆栈放在位置 P1 上（图 3A）。
注意： 每个 96 吸头堆栈由八个一次性支架组成。当使用多通道臂进行 96 个吸头时，384 孔板分为四个象限。因此，每个吸头堆栈足以将上清液从两个测定板转移到两个空的纯黑色 384 孔板中。每次运行两块板后，需要更换整个吸头组。 - 将测定板放在位置 P2 和 P4 上（图3A）。
- 将空的纯黑色384孔板放在 P3 和 P5 位置（图3A）。
注：这种灵活且功能强大的机器人平台已适用于该测定，并编写了一个特殊程序（图3B）。 - 从位置 P1 获取提示。
- 从位置 P2 的板中吸出 10 μL 上清液，然后转移到位置 P3 的空的纯黑色板中。
注意：吸头应放置在孔内适当的深度，以吸出上清液，而不会干扰孔底部的细胞单层。 - 将吸头放入位置 P6 的废物中（图 3A）。
- 对位置P2上的板的剩余孔重复步骤6.5-6.7，然后重复相同的步骤将上清液从位置P4转移到位置P5。
注意：确保收集上清液并在相应的孔中分配到空的纯黑色板中（图3C，D）。由于分泌的dNGLUC在细胞培养基中非常稳定，因此板可以密封并在4°C下在黑暗中保存长达7天。
7. 荧光素酶测定
注：报告器中使用的 dNGLUC 表现出信号快速衰减的闪光动力学。由于加入底物（腔肠素）后发光衰减迅速，应设置酶标仪测量上清液中的发光信号;将底物注入孔中，几秒钟后读取孔。因此，请使用能够监测发光并配备底物进样器的酶标仪，以确保所有样品的进样和读取步骤之间的时间是均匀的。读板器上使用的设置如图 4 所示。
- 在酸化甲醇（10 μL 3 M HCl 至 1 mL 甲醇）中制备天然腔肠素作为 1 mg/mL 储备溶液。
注意：请遵循当地有关在实验室处理甲醇的健康和安全指南，并避免与皮肤接触。在开始测定之前准备新鲜的工作底物溶液。 - 初始化喷油器泵（图5A）。
- 用去离子水冲洗管道（图5B-D）。
- 用甲醇冲洗管道。
- 冲洗管路时，通过以 1：100 的比例稀释底物来制备工作底物溶液（对于一个 384 孔板，将 220 μL 从底物储备溶液中加入 21.8 mL 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 [PBS] 中）。
- 用基板工作溶液冲洗管道（图5B-D）。
- 将板装入读数器，然后使用 图 4 中描述的设置开始测量。
- 对所有测定板重复步骤7.6-7.7。
- 完成所有测定板后，用甲醇冲洗管道。
- 用去离子水冲洗管道。
注：在此步骤结束时，获得与细胞ATG4B活性相关的原始荧光素酶值。为了对细胞数进行归一化，接下来的步骤是必要的，即通过荧光显微镜计数每个孔中的细胞数。
8. 细胞固定和染色
注意：此步骤可以借助多通道移液器或使用散装分液器手动执行。
- 用4%多聚甲醛（在1x PBS中）固定细胞15分钟。
注意：请遵循当地有关在实验室处理多聚甲醛的健康和安全指南，并避免与皮肤接触。如果可能，请在安全罩中执行此步骤。 - 用1x PBS洗涤三次。
- 用 Hoechst 33342 在 1x PBS 中以 1：5,000 稀释的细胞核染色 15 分钟。
- 用1x PBS洗涤三次。
9. 图像采集
注意： 使用自动显微镜进行图像采集。作为确定细胞数量的图像采集的替代方法，也可以确定细胞内荧光素酶活性。关于是否归一化为细胞数或细胞内荧光素酶活性，有优点和缺点，下面将讨论。我们发现，与确定细胞内荧光素酶值相比，确定细胞数的侵入性较小，并且变异性更低。
- 启动显微镜操作软件（图6）。
- 在 “设置 ”选项卡中，选择正确的预定义板类型。如果未预设板类型，请手动输入板尺寸。
- 通过单击“ 弹出 并加载”选项将板 加载 到显微镜中。
- 然后，选择 20x Air（数值孔径 [NA]：0.4） 物镜。
注意： 确保物 镜环 设置为正确的值，以便对不同的板类型进行正确聚焦。 - 在“通道选择”下，选择“Hoechst 33342”。
注意： 时间、功率和高度的通道设置必须根据所使用的板类型进行优化。 - 在 “定义布局”（Define Layout） 上，从孔中选择所有孔，从孔中选择四个字段。
- 在 “联机作业”中，选择相应的文件夹以将数据传输到分析软件。
10. 图像分析
注：任何图像分析软件都可用于从采集的图像中分割和计数细胞核。在这里，我们描述了使用与多个自动显微镜文件兼容的特定在线软件的步骤。
- 启动图像分析软件。
- 转到“图像 分析 ”选项卡以开始图像分割（图7A）。
- 在 Input Image 选项卡中，单击 + 号以添加新的构建块（图 7A）。
- 从列表中选择 “查找原子核 ”选项（图7A），然后选择“ Hoechst 33342 ”作为 通道 选项（图7B）。
- 目视检查图像上的分割对象，选择最准确的分割方法。
注意：对于此实验，我们使用了方法C（图7C）。每个方法选项都有子类别，可以调整这些子类别以获得最佳分割。 - 然后，单击 “定义结果 ”选项卡（图7C）并选择“ 标准输出 ”作为 “方法 ”选项。
- 从子类别中，选择 对象核数 和 对象计数 （图7C）。
- 使用“将分析保存到磁盘”或 “将 分析保存 到数据库”选项保存分析 管道。
- 在 “批量 分析”选项卡下，从树中选择要分析的数据。
- 在 “方法”下，选择在步骤 10.8 中保存的分析管道。
注： 也可以从参考软件外部上传脚本文件或上传保存到数据库的现有分析。 - 单击 “运行 分析”开始分析（图7D）。在此工作流程结束时，将生成两个数据集：来自上清液的原始荧光素酶值和每个孔中的细胞数。使用两者来归一化每个细胞的荧光素酶值。
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Representative Results
在之前的出版物8 中，我们成功地使用该测定法筛选了小分子和 siRNA 文库，并鉴定了 ATG4B 的新调节因子。在这里，我们以半自动、高通量筛选的形式描述了该荧光素酶报告基因的方案和代表性结果。图 8 显示了细胞核和发光的原始数据分析示例。发光测量的典型结果如图8A所示。在第 1 列中可以看到来自 DMSO 的基础发光信号，在第 24 列中存在 10 μM ATG4B 抑制剂 FMK9A 的情况下。同一板的细胞核计数结果如图8B所示。将每种化合物的原始值归一化为中性对照平均值，以获得ATG4B活性和细胞存活的百分比（图9A，B）。正如预期的那样，大多数化合物对ATG4B活性没有影响，如接近阴性对照（DMSO - 第1列）的基础发光值所示。Z'因子是高通量筛选的质量指标，使用公式（1）计算：
Z' = 1 - （3 × 
） （1）
其中 STDpos 是阳性对照 （FMK9a） 的标准偏差，STDneg 是阴性对照 （DMSO） 的标准偏差，AVGpos 是阳性对照的平均值，AVGneg 是阴性对照的平均值。
为了选择命中，我们使用归一化值来计算一个比率，该比率用作鉴定ATG4B抑制剂的临界值。通过将每种化合物的ATG4B活性除以其细胞活力来计算该比率。我们认为比率>1表示可能的ATG4B激活剂，比率<1表示可能的ATG4B抑制剂（图9C）。我们选择了所有比率值与阳性对照FMK9A相似的化合物，并排除了具有细胞毒性的化合物。
在本次筛选中，我们挑选了 53 种 ATG4B 抑制剂来确认和评估其活性和毒性。这些化合物以 10 种浓度作为 100 μM 至 195 nM 的双重稀释度进行测试。以浓度响应方式处理的细胞能够拟合定量数据并计算 EC50 值。抑制剂的相对毒性通过细胞活力数据进行量化。综上所述，这些结果表明，这种方法能够识别ATG4B调制器。
图 1：检测工作流程。 该实验详细介绍了稳定细胞系生成和高通量检测工作流程的时间表，从稳定细胞系生成、化合物筛选、荧光素酶测量、图像采集和数据分析开始。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：移液器设置的分步说明 。 （A） 协议 选项卡设置。（1） 选择样品板格式和类型。（2） 选择目标车牌类型。（B） 选择列表 选项卡。 （1） 使用 导入 选项导入电子表格。（C） 导入拣货清单 提示窗口。（1） 选择要导入的参数。（2）点击 进口 结束。（D） 运行协议。（1） 点击 运行 图标。（2） 显示运行选项并启动协议运行的提示窗口。（E） 运行状态 选项卡。 （1） 启动协议。（F） 加载源板的提示窗口。（G） 加载目标板的提示窗口。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：液体处理机器人 的配置。 （A） Tecan甲板的配置。（第1页）50 μL 一次性吸头堆栈的位置。（小二，小四）检测板的位置。（小三，小五）空的纯黑色 384 孔板的位置。（第6页）处理用过的吸头的位置。（B） 检测脚本的屏幕截图。（C） MAC96 吸气细节截图。（1） 选择抽吸液类别。 （2） 输入抽吸体积。（3）选择抽吸孔位。（D） MAC96 分配详细信息的屏幕截图。（1） 选择分配液体类别。 （2） 输入分配体积。（3）选择相同的孔位进行分液。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：发光板读数仪设置的屏幕截图 。 （A） 测量设置 选项卡。 （1） 选择光圈。（2） 选择距离、时间和校正因子。（B） 协议常规设置。（1） 选择板型。（2） 选择测量模式。（3） 选择检测板的数量。（C） 分配测量设置。（1） 选择测量值。（2）设定测量时间。（3） 选择泵、点胶速度和体积。（4）定义分配顺序和印版重复。（D） 选井选项卡。 （1） 选择要测量的孔。（2） 启动测量协议。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：发光酶标仪的分配器控制截图。 （A） 初始化选项卡。 （1） 选择泵。（2） 启动泵。（B） 冲洗方案选项。（1） 选择漂洗选项。（2） 单击下一步移动到设置。（C） 冲洗选项卡设置选项。（1） 选择泵。（2） 选择吸头安装座。（3） 单击“下一步”移动到下一个选项卡。 （D） 选项卡开始冲洗。（1） 单击“开始”以启动冲洗协议。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：自动化高内涵显微镜成像软件的屏幕截图。 用于图像采集的设置的详细信息。（1） 设置 选项卡。 （2） 选择板类型。（3） 选择 弹出 将板加载到显微镜中。（4） 选择目标。（5） 添加频道。（6） 选择要将数据传输到 Columbus 软件的文件夹。（7）选择孔。（8） 选择字段。（9） 单击 “运行实验 ”选项卡以开始图像采集。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：在线软件上的图像 分析。 （A） 图像分析 选项卡。 （1） 单击 + 添加构建块。（2）选择 “查找细胞核 ”选项。（B） 查找 Nuclei 设置。（1） 选择频道。（2） 选择分割方法。（C） 定义结果 选项卡。 （1） 选择 标准输出。（2） 选择要显示为结果的选项。（D） 图像分析。（1） 批量分析 选项卡。 （2） 选择测量。（3）选择分析方法。（4） 开始图像分析。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8：荧光素酶测量和细胞核计数的代表性图像 。 （A） 来自384孔测定板的荧光素酶相对强度值，用数字和颜色表示。（B）图像分析结果。（1）物体原子核数的热图。（2） 显示每个孔结果的表格。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 9：数据归一化后的代表性结果。 （A） 数据归一化后的代表性 ATG4B 活性百分比，以平均同一板内阴性对照 （DMSO） 孔的 ATG4B 活性。活化剂以红色显示，抑制剂以蓝色显示，白色表示活性没有显着变化。阴性对照 （DMSO） 见第 1 列，阳性对照 （FMK9A） 见于 24 列。（B） 数据归一化为同一板内阴性对照 （DMSO） 孔的平均细胞数后的代表性细胞活力百分比。增殖以绿色显示，毒性以红色显示，黄色表示细胞活力没有显着变化。阴性对照 （DMSO） 见第 1 列，阳性对照 （FMK9A） 见于 24 列。（C）按比值分布化合物。每个点代表一种化合物。通过将 ATG4B 活性除以细胞活力来计算该比率。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
该协议描述了一种基于细胞的报告基因测定，用于鉴定ATG4B抑制剂。原发性命中的鉴定基于处理表达 β-肌动蛋白和 dNGLUC 之间 LC3B 全长开放阅读框的细胞时的荧光素酶活性。该测定的一些优点是它灵敏、高度定量和非侵入性，因为它可以在不裂解细胞的情况下检测 dNGLUC。本文提出了用于生成稳定细胞系和初步筛选的详细方案。协议中有几个关键步骤。
首先，本文描述的方案使用了PANC1细胞系，该细胞系具有高转染功效和高增殖能力。这种筛选方法可以使用其他细胞系进行，但转导功效可能因细胞系而异。其次，应避免使用传代数大于5的冷冻储备液中的稳定细胞群，因为报告基因的表达水平可能会随着时间的推移而降低。第三，重要的是在每次测定前使用新鲜的细胞批次，以便在不同的实验中获得最大和一致的荧光素酶信号。第四，当手动或使用散装分配器接种细胞时，需要不断搅拌细胞悬液，以在整个板中实现均匀的细胞密度。第五，从孔中收获上清液时，重要的是将吸头放置在孔内适当的深度，以吸出上清液，而不会干扰孔底部的细胞单层。最后，底物工作溶液应在测定当天制备。腔肠素对光敏感性很强，容易氧化，并且有一些制备后底物快速衰减的报道。
许多基于细胞的检测可用于研究 ATG4B 抑制或激活的后果，但检查 ATG4B 的细胞活性仍然有限4。该方法是无创的、高灵敏度的、稳健的，并且直接依赖于 ATG4B 活性，因为它的活性导致 dNGLUC 的释放。所描述的方案很简单，只需要很短的时间即可筛选10x 384孔板。该方法的另一个优点是它可用于监测 体内的ATG4B活性，因为dNGLUC高度稳定，可以从血清 中体外 测量。
尽管我们已经成功地使用该报告基因筛选了小分子和siRNA文库，并确定了ATG4B活性的新型调节因子，但该协议中仍需考虑一些局限性。首先，所述基于细胞的测定依赖于间接反映ATG4B活性变化的报告基因读数，从而能够检测ATG4B活性的抑制剂和激活剂。因此，应进一步评估这些命中，以验证其特异性和活性。此外，应进一步评估抑制剂调节LC3在细胞中或其他自噬相关蛋白的空间分布的能力。其次，尽管由于其简单的处理和数据分析，该检测可以很容易地修改为较小规模的检测，但它需要一定程度的自动化来添加底物和随后的发光测量。第三，由于在分子水平上对dNGLUC释放的机制知之甚少，干扰分泌途径元素的化合物可能会影响结果。最后，细胞活力也可以通过细胞内荧光素酶活性来确定。尽管我们发现确定细胞数量比确定细胞内荧光素酶值的侵入性更小，并且变异性更低，但确定细胞数量限制了它们在小型研究实验室中的使用，因为它们在成像设备、数据分析软件和数据存储方面存在困难。总体而言，开发的基于细胞的报告基因检测能够鉴定 ATG4B 抑制剂。
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Disclosures
作者没有要披露的利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了英国医学研究委员会对 MRC-UCL 大学单位资助参考MC_U12266B、MRC 痴呆症平台资助英国 MR/M02492X/1、英国胰腺癌（资助参考2018RIF_15）和 UCL 治疗加速支持计划的核心资助，并得到了 MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054 的资金支持。编码ActinLC3dNGLUC（pMOWS-ActinLC3dNGLUC）的质粒购自Robin Ketteler博士（柏林医学院人类医学系）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
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