Summary
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para o uso de um ensaio de repórter baseado em luciferase em um formato de triagem semi-automatizado e de alto rendimento.
Abstract
Evidências crescentes têm mostrado que o alto fluxo autofágico está relacionado à progressão tumoral e à resistência à terapia do câncer. A dosagem de proteínas individuais de autofagia é um pré-requisito para estratégias terapêuticas direcionadas a essa via. Demonstrou-se que a inibição da protease autofágica ATG4B aumenta a sobrevida global, sugerindo que a ATG4B pode ser um potencial alvo de drogas para a terapia do câncer. Nosso laboratório desenvolveu um ensaio seletivo baseado em luciferase para monitorar a atividade de ATG4B em células. Para este ensaio, o substrato de ATG4B, LC3B, é marcado no término C com uma luciferase secretável do copépode marinho Gaussia princeps (GLUC). Este repórter está ligado ao citoesqueleto da actina, mantendo-o assim no citoplasma das células quando tido. A clivagem mediada por ATG4B resulta na liberação de GLUC por secreção não convencional, que pode ser monitorada pela coleta de sobrenadantes de cultura celular como um correlato da atividade celular de ATG4B. Este artigo apresenta a adaptação deste ensaio baseado em luciferase para triagem automatizada de alto rendimento. Descrevemos o fluxo de trabalho e a otimização para uma análise exemplar de alto rendimento da atividade ATG4B celular.
Introduction
A autofagia é um processo metabólico conservado que permite às células manter a homeostase intracelular e responder ao estresse degradando conteúdos celulares envelhecidos, defeituosos ou desnecessários através dos lisossomos 1,2,3. Em algumas condições fisiopatológicas, esse processo atua como uma resposta celular crucial à privação de nutrientes e oxigênio, resultando em nutrientes e lipídios reciclados, permitindo que as células se adaptem às suas necessidades metabólicas 2,3,4. A autofagia também tem sido identificada como uma resposta celular ao estresse relacionada a diversas doenças, como doenças neurodegenerativas, infecção por patógenos e vários tipos de câncer. A função da autofagia no câncer é complexa e dependente do tipo, estágio e status do tumor. Pode suprimir a tumorigênese por degradação autofágica das células lesadas, mas também pode promover a sobrevivência de tumores avançados por melhorar a sobrevivência celular durante condições estressantes, como hipóxia, privação de nutrientes e dano citotóxico2,4,5,6.
Vários estudos têm demonstrado que a inibição da autofagia proporciona um benefício como estratégia antineoplásica. Assim, a inibição de etapas críticas, como a formação do autofagossomo ou sua fusão com o lisossomo, poderia ser um método eficaz para o controle do câncer2,4,5,6. Evidências crescentes têm mostrado que a ATG4B está envolvida em certas condições patológicas, e tem ganhado atenção como um potencial alvo anticâncer2,3,4. Por exemplo, observou-se que células de câncer colorretal e células de câncer de mama positivas para receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) apresentaram níveis de expressão de ATG4B significativamente mais elevados do que células normais adjacentes 2,4. Em células de câncer de próstata, a inibição da ATG4B resultou em suscetibilidade específica de linhagem celular à quimioterapia e radioterapia7. Recentemente, surgiram fortes evidências de que o adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é particularmente vulnerável à inibição da ATG4B. Por exemplo, em um modelo de camundongo geneticamente modificado, demonstrou-se que a perda intermitente da função ATG4B reduz o crescimento tumoral de ADP e aumenta a sobrevida 3,4. Em geral, a ATG4B é altamente superexpressa em alguns tipos de câncer, está relacionada à progressão do tumor e está ligada à resistência à terapia do câncer 2,4,8.
As ATG4 cisteína proteases em mamíferos possuem quatro membros da família, ATG4A-ATG4D. Essas proteínas exibem alguma seletividade alvo para a família de proteínas LC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 e podem ter funções adicionais não ligadas à sua atividade proteásica12,13. Além disso, a ATG4 atua na regulação de um novo tipo de modificação pós-traducional, a ATG8-ilação de proteínas11,12. Embora a ATG4B e seu principal substrato LC3B sejam os mais estudados, um quadro está emergindo que sugere um papel complexo para cada membro da subfamília na regulação de processos autofágicos e não autofágicos. Isso é corroborado por uma complexa rede de modificações pós-traducionais que regulam a atividade da ATG4B via fosforilação, acetilação, glicosilação e nitrosilação 9,10,11,12,13.
Vários inibidores conhecidos de ATG4B foram publicados2,4,14,15. Embora sejam adequados como ferramentas de pesquisa, seu perfil farmacodinâmico, seletividade ou potência ainda os impedem de se desenvolver como candidatos pré-clínicos 4,16. Em geral, há uma necessidade urgente de identificar compostos mais potentes e seletivos. Muitas vezes, os compostos são bons inibidores bioquímicos da função proteica, mas sua eficácia em ensaios baseados em células é pobre. Existem vários ensaios para monitorar a atividade de ATG4B, incluindo métodos bioquímicos e ensaios baseados em células4. Desenvolvemos previamente um ensaio simples, baseado em luminescência e de alto rendimento para monitorar a atividade de ATG4B em células 8,17. Este ensaio utiliza uma proteína luciferase de Gaussia princeps (GLUC) que é estável e ativa no meio extracelular e pode ser liberada inducivelmente das células em resposta à atividade proteolítica ATG4B18,19.
Nesta construção do repórter, a dNGLUC está ligada ao citoesqueleto de actina das células. Um ligante protease-específico pode ser introduzido entre a âncora de β-actina e a dNGLUC, tornando a secreção dependente da clivagem do ligante. Utilizou-se o quadro de leitura aberta de comprimento total da CL3B entre β-actina e dNGLUC, para poder monitorar a clivagem da CL3B17,18,19. Embora o mecanismo de secreção da dNGLUC seja pouco compreendido, ele é específico para monitorar a atividade de ATG4B, não depende da autofagia global como ocorre em células knockout de ATG5 e é mediado por mecanismos não convencionais que não requerem um peptídeo sinal clássico 4,18,19. Usamos com sucesso este repórter para selecionar pequenas moléculas e bibliotecas de siRNA, e identificamos novos reguladores da atividade de ATG4B, como as quinases da proteína Akt8. Este artigo descreve um protocolo detalhado para o uso deste repórter de luciferase em um formato de triagem semi-automatizado e de alto rendimento.
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Protocol
NOTA: O processo de ensaio é descrito na Figura 1. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo.
1. Produção de retrovírus
NOTA: O plasmídeo que codifica o ActinLC3dNGLUC é pMOWS-ActinLC3dNGLUC20. Use um número baixo de células para a produção de vírus de alto título (idealmente menor que P20).
- Cultura HEK293T células em meio de águia modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) a 37 °C em estufa umedecida, com atmosfera de 5% de CO2 até que estejam 80%-90% confluentes antes da semeadura para transfecção.
- No dia anterior à transfecção, semear as células em uma placa de 6 poços a uma densidade de 1 × 106 células/poço em 2 mL/poço de meio de crescimento completo. Incubar a placa durante a noite em uma incubadora umidificada com uma atmosfera de 5% de CO2.
NOTA: Siga as instruções do fabricante se estiver usando um reagente de transfecção à base de lipossomal. Este protocolo descreve o uso de um reagente não lipossomal. Antes de iniciar a transfecção, deixe o reagente de transfecção de DNA, o DNA e o meio se equilibrarem à temperatura ambiente (~15 min). - Para cada transfecção, adicionar 200 μL de meio sem soro a 1,5 mL de tubos de microcentrífuga. Em cada tubo, adicionar as seguintes quantidades de plasmídeos: 1.000 ng de pMOWS-ActinLC3dNGLUC; 900 ng de GagPol; 100 ng de VSV-G.
NOTA: A quantidade de plasmídeos e o volume de meios listados aqui são para uma placa de 12 poços. Se usar um tipo de placa diferente, ajuste o volume do meio e as quantidades de plasmídio para atingir a concentração final de 5 ng/μL de plasmídeo de transferência, 4,5 ng/μL de plasmídeo de empacotamento e 0,5 ng/μL de plasmídeo de envelope. Use qualquer plasmídeo de empacotamento que contenha genes que expressem gag e pol e qualquer plasmídeo de envelope que contenha o gene de expressão VSV-G. - Vórtice o frasco de reagente de transfecção de DNA por 30 s. Pipetar 4 μL do reagente de transfecção directamente para o meio que contém o ADN diluído. Misture suavemente inclinando suavemente o tubo.
OBS: Não toque nas paredes dos tubos plásticos com as pontas. Não pipetar para cima e para baixo ou vórtice. - Incubar a reação por 15 min à temperatura ambiente.
- Durante a incubação da reação, remova o meio antigo da placa de 6 poços e substitua-o por 2 mL/poço de meio fresco sem soro.
- Adicione cada complexo de transfecção a cada poço de forma gota a gota.
- Agite ou gire suavemente a placa para garantir uma distribuição uniforme por toda a superfície do poço.
- Incubar a placa durante a noite a 37 °C numa estufa humidificada com uma atmosfera de 5% de CO2.
- Após 24 h, substituir o meio velho por meio fresco completo (2 mL/poço) e retornar as células de volta à incubadora umidificada com atmosfera de 5% CO2 por 72 h.
- Após 72 h, colher o sobrenadante em tubo cônico de 50 mL e centrifugar por 10 min a 4.000 × g a 4 °C para remover células mortas e detritos. Para purificação adicional, use uma seringa grande de 60 mL para passar o sobrenadante através de um filtro de 0,20 μm. Preparar imediatamente alíquotas de utilização única de 300 μL e conservar a -80 °C.
NOTA: Evite um ciclo de congelamento-descongelamento para manter a atividade máxima do produto.
2. Transdução retroviral
- No dia anterior à transdução das células, semeie as células-alvo em densidade média (PANC1 a 1 × 10 5 células/poço) em uma placa de 12 poços em 1 mL/poço de meio suplementado com 10% FBS e 1% P/S. Incubar a placa durante a noite a 37 °C em uma incubadora umidificada com uma atmosfera de5 % CO2.
NOTA: A melhor densidade celular tem que ser estabelecida com antecedência, pois diferentes tipos de células têm diferentes habilidades de ligação. O ideal é usar uma densidade celular para obter 40%-50% de confluência. - Retire as alíquotas de retrovírus congeladas do congelador a -80 °C e descongele no gelo antes de cada utilização.
NOTA: Não recongele alíquotas não utilizadas. - Em um tubo cônico de 50 mL, preparar uma mistura de sobrenadante viral e polibreno na concentração final de 8 μg/mL.
NOTA: Os volumes subsequentes aplicam-se à transdução de uma placa de 12 poços contendo um volume final de 500 μL/poço. O volume final do sobrenadante viral pode ser estimado testando-se uma variedade de diluições virais na presença de polibreno. Diluições maiores ou menores podem ser usadas dependendo dos níveis de expressão desejados do transgene e do tamanho do vaso utilizado. - Retire o meio velho da placa de 12 poços e adicione 500 μL da mistura a cada poço. Incubar as células com o sobrenadante viral durante a noite a 37 °C numa incubadora humidificada com uma atmosfera de 5% de CO2.
NOTA: Mantenha dois poços com meio completo (sem sobrenadante viral) para usar como controle para seleção. - Substitua o meio contendo vírus por meio de crescimento completo fresco (1 mL/poço). Colocar as células de volta na incubadora umidificada com uma atmosfera de 5% CO2 por 48 h.
3. Seleção e manutenção da população em conjunto
- Substitua o meio de crescimento pelo meio de seleção (meio de crescimento completo com concentração final de 1 μg/mL de puromicina). Monitorar o crescimento das células e mudar o meio de seleção a cada 2-3 dias. Na confluência, expanda para uma placa de 6 poços e, em seguida, para uma placa de cultura de tecidos de 10 cm de diâmetro.
- Mantenha as células no meio de seleção por pelo menos o tempo necessário para que as células de controle (não transduzidas) morram completamente.
NOTA: Para resultados bem sucedidos, recomenda-se que as concentrações ideais de puromicina sejam determinadas antes de iniciar o projeto experimental. Para isso, gere uma curva de morte de puromicina para determinar a concentração mínima necessária para matar células não transduzidas entre 3 e 10 dias. - Uma vez que as células estão crescendo no meio de seleção, expandir as células em meios de crescimento completos e congelar alíquotas de estoque para o projeto experimental.
NOTA: Registre o número de passagem e evite trabalhar com populações agrupadas de estoque congelado com números de passagem superiores a cinco. Verifique regularmente se há contaminação por micoplasma antes de realizar o ensaio. Idealmente, use um lote de células frescas antes de cada ensaio para obter o sinal máximo de luciferase. - Manter as células em meio de seleção e semear células suficientes para atingir a densidade desejada no dia anterior ao ensaio.
4. Adição de compostos
NOTA: A biblioteca de moléculas pequenas de Selleckchem consiste em aproximadamente 4.000 compostos dispostos em oito linhas e 10 colunas em cinquenta placas de 96 poços a uma concentração de estoque de 10 mM em dimetilsulfóxido (DMSO).
- Alíquota 30 μL de composto no poço apropriado de uma placa fonte compatível com um dispensador de líquido acústico em nanoescala. Use uma placa de polipropileno de 384 poços (placa de 384PP). Manter estas placas seladas e armazenadas a -20 °C.
NOTA: O protocolo de triagem descrito aqui é para um total de 10 placas de ensaio por dia; uma concentração fixa de 10 μM foi usada como concentração final do ensaio juntamente com um período de incubação de 24 horas. - Descongele as placas de biblioteca compostas à temperatura ambiente.
NOTA: Certifique-se de que a placa está completamente descongelada e equilibrada à temperatura ambiente. Um gradiente de temperatura ao longo da placa pode afetar o manuseio de líquidos. - Distribua 50 nL/poço em uma placa de ensaio de 384 poços usando um dispensador de líquido acústico em nanoescala.
NOTA: Verifique se as placas de origem e destino selecionadas no programa correspondem às usadas para esta etapa. - Crie um programa de dispensação em uma planilha.
- Abra o software.
- Abra um novo protocolo. Na guia Protocolo , selecione as seguintes opções: Formato de placa de amostra, 384PP; Tipo de placa de amostra, 384PP_DMSO2; e Tipo placa de destino, CellCarrier-384 Ultra PN (Figura 2A).
- Em Pick List, selecione a opção de importação (Figura 2B) para importar a planilha que contém o programa de distribuição (Figura 2C).
- Selecione a opção Executar protocolo (Figura 2D), verifique se as informações exibidas estão corretas e clique em Executar.
- Na nova janela chamada Status de execução (Figura 2E), clique em Iniciar e siga as etapas exibidas nas janelas de prompt (Figura 2F,G).
5. Semeadura celular
- Tripsinizar as células de um frasco de cultura celular ou placas de Petri de cultura celular e neutralizar a tripsina adicionando meios contendo FBS.
- Transferir a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mL e centrifugar a 390 × g por 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, remova suavemente o sobrenadante e ressuspenda o pellet de células em 10 mL de meio de crescimento completo.
- Execute a contagem de células.
- Preparar a suspensão celular com 4,6 × 107 células em 230 mL de meio de cultura completo.
NOTA: Este volume e densidade celular é para placas de ensaio de 10x 384 poços mais um volume morto de duas placas de 384 poços. - Distribuir 50 μL de suspensão celular em cada poço de uma placa de ensaio de 384 poços, preparada na secção 4.
NOTA: A semeadura de células pode ser feita manualmente ou usando um dispensador a granel. - Incubar as células a 37 °C em estufa umidificada com atmosfera de 5% CO2 durante 24 horas.
6. Colheita do sobrenadante celular
NOTA: A plataforma robótica de manuseio de líquidos usada aqui executa o manuseio de líquidos com um braço multicanal para 96 pontas. Se nenhuma automação de manuseio de líquidos estiver disponível, o protocolo pode ser adaptado para o formato de baixo rendimento usando pipetas multicanal.
- Configure o deck da estação de trabalho de automação de laboratório, conforme mostrado na Figura 3.
- Coloque a pilha descartável de 96 pontas na posição P1 (Figura 3A).
NOTA: Cada pilha de 96 pontas é formada por oito racks descartáveis. Ao usar um braço multicanal para 96 pontas, a placa de 384 poços é dividida em quatro quadrantes. Assim, cada pilha de ponta é suficiente para transferir o sobrenadante de duas placas de ensaio em duas placas vazias, pretas sólidas, de 384 poços. Toda a pilha de pontas precisa ser substituída após cada corrida de duas placas. - Colocar as placas de ensaio nas posições P2 e P4 (Figura 3A).
- Coloque as placas vazias, pretas sólidas, de 384 poços nas posições P3 e P5 (Figura 3A).
NOTA: Esta plataforma robótica flexível e capaz foi adaptada para este ensaio e um programa especial foi escrito (Figura 3B). - Obtenha as dicas da posição P1.
- Aspirar 10 μL de sobrenadante da placa na posição P2 e transferir para a placa vazia de cor preta sólida na posição P3.
OBS: As pontas devem ser posicionadas em profundidade adequada dentro dos poços para aspirar o sobrenadante sem perturbar a monocamada celular no fundo do poço. - Solte as pontas no lixo na posição P6 (Figura 3A).
- Repita os passos 6.5-6.7 para os poços restantes da placa na posição P2 e, em seguida, repita os mesmos passos para transferir o sobrenadante da posição P4 para a posição P5.
NOTA: Certifique-se de coletar o sobrenadante e distribuir nos poços correspondentes na placa preta sólida vazia (Figura 3C,D). Como o dNGLUC secretado é muito estável em meio de cultura celular, as placas podem ser seladas e mantidas por até 7 dias a 4 °C no escuro.
7. Ensaio de Luciferase
NOTA: O dNGLUC usado no repórter exibe cinética de flash com rápido decaimento do sinal. Devido ao rápido decaimento da luminescência após a adição de substrato (celenterazina), o leitor de placas deve ser ajustado para medir o sinal de luminescência nos sobrenadantes; Injete o substrato em um poço e leia bem depois de alguns segundos. Por esta razão, use um leitor de placas que seja capaz de monitorar a luminescência e equipado com um injetor de substrato para garantir que o tempo entre as etapas de injeção e leitura seja uniforme para todas as amostras. As configurações utilizadas no leitor de placas podem ser encontradas na Figura 4.
- Preparar celenterazina nativa como uma solução-mãe de 1 mg/mL em metanol acidificado (10 μL de HCl 3 M a 1 mL de metanol).
NOTA: Siga as orientações locais de saúde e segurança em relação ao manuseio do metanol no laboratório e evite o contato com a pele. Preparar a solução de substrato de trabalho fresco antes de iniciar o ensaio. - Inicialize a bomba injetora (Figura 5A).
- Enxaguar a tubulação com água deionizada (Figura 5B-D).
- Enxágue a tubulação com metanol.
- Ao enxaguar a tubulação, prepare a solução do substrato de trabalho diluindo o substrato 1:100 (para uma placa de 384 poços, adicione 220 μL da solução-estoque do substrato em 21,8 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x [PBS]).
- Enxaguar a tubulação com a solução de trabalho do substrato (Figura 5B-D).
- Coloque a placa no leitor e inicie a medição usando as configurações descritas na Figura 4.
- Repita as etapas 7.6-7.7 para todas as placas de ensaio.
- Uma vez terminadas as placas de ensaio, enxágue a tubulação com metanol.
- Enxágue a tubulação com água deionizada.
NOTA: No final desta etapa, são obtidos valores brutos de luciferase que são correlativos à atividade celular de ATG4B. Para a normalização para números de células, os próximos passos são necessários contando o número de células em cada poço por microscopia de fluorescência.
8. Fixação e coloração celular
NOTA: Esta etapa pode ser executada manualmente com o auxílio de uma pipeta multicanal ou usando um dispensador a granel.
- Fixar as células com paraformaldeído a 4% (em PBS 1x) por 15 min.
OBS: Siga as orientações locais de saúde e segurança quanto ao manuseio do paraformaldeído no laboratório e evite o contato com a pele. Execute esta etapa em uma capa de segurança, se possível. - Lave três vezes com 1x PBS.
- Manchar os núcleos com Hoechst 33342 diluído 1:5.000 em 1x PBS por 15 min.
- Lave três vezes com 1x PBS.
9. Aquisição de imagens
OBS: Realizar aquisição de imagens utilizando microscópio automatizado. Como alternativa à aquisição de imagens para determinar o número de células, a atividade da luciferase intracelular também pode ser determinada. Existem vantagens e desvantagens em relação à normalização do número de células ou da atividade da luciferase intracelular, que é discutida a seguir. Descobrimos que a determinação do número de células é menos invasiva e resulta em menor variabilidade do que a determinação dos valores de luciferase intracelular.
- Inicie o software de operação do microscópio (Figura 6).
- Na guia Configuração , escolha o tipo de placa predefinido correto. Se o tipo de chapa não estiver predefinido, insira as dimensões da chapa manualmente.
- Coloque a placa no microscópio clicando na opção Ejetar e carregar .
- Em seguida, escolha a objetiva 20x Air (abertura numérica [NA]: 0,4 ).
NOTA: Certifique-se de que o colar objetivo esteja ajustado para o valor correto, permitindo o foco adequado com diferentes tipos de placa. - Em Seleção de canal, escolha Hoechst 33342.
NOTA: As configurações de canal para tempo, potência e altura devem ser otimizadas de acordo com o tipo de placa usada. - Em Definir layout, selecione todos os poços da placa e quatro campos do poço.
- Em Trabalhos Online, selecione a pasta correspondente para transferir os dados para o software de análise.
10. Análise das imagens
NOTA: Qualquer software de análise de imagem pode ser usado para segmentar e contar núcleos celulares a partir das imagens adquiridas. Aqui, descrevemos as etapas para usar um software on-line específico que seja compatível com vários arquivos de microscópios automatizados.
- Inicie o software de análise de imagens.
- Vá para a guia Análise de imagem para iniciar a segmentação da imagem (Figura 7A).
- Na guia Imagem de entrada , clique no sinal + para adicionar um novo bloco de construção (Figura 7A).
- Na lista, selecione a opção Find Nuclei (Figura 7A) e selecione Hoechst 33342 como a opção de canal (Figura 7B).
- Inspecione visualmente os objetos segmentados na imagem e selecione o método de segmentação mais preciso.
OBS: Para este experimento, utilizou-se o método C (Figura 7C). Cada opção de método possui subcategorias que podem ser ajustadas para obter a melhor segmentação possível. - Em seguida, clique na guia Define Results (Figura 7C) e selecione Standard Output como a opção Method .
- Na subcategoria, selecione Número de núcleos de objetos e Contagem de objetos (Figura 7C).
- Salve o pipeline de análise usando a opção Salvar análise em disco ou Salvar análise em banco de dados .
- Na guia Análise de lote , selecione os dados a serem analisados na árvore.
- Em Método, selecione o pipeline de análise salvo na etapa 10.8.
Observação : também é possível carregar um arquivo de script de fora do software referenciado ou carregar uma análise existente salva no banco de dados. - Clique em Executar análise para iniciar a análise (Figura 7D). No final desse fluxo de trabalho, dois conjuntos de dados são gerados: valores brutos de luciferase dos sobrenadantes e o número de célula em cada poço. Use ambos para normalizar o valor de luciferase por célula.
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Representative Results
Em uma publicação anterior8, usamos com sucesso este ensaio para selecionar pequenas bibliotecas de moléculas e siRNA e identificamos novos reguladores de ATG4B. Aqui, descrevemos o protocolo e os resultados representativos deste repórter de luciferase em um formato de triagem semi-automatizado e de alto rendimento. A Figura 8 mostra um exemplo da análise dos dados brutos tanto para os núcleos celulares quanto para a luminescência. Um resultado típico de uma medição de luminescência é mostrado na Figura 8A. O sinal de luminescência basal do DMSO pode ser visto na coluna 1, e na presença de 10 μM do inibidor de ATG4B FMK9A na coluna 24. O resultado da contagem de núcleos da mesma placa pode ser visto na Figura 8B. Os valores brutos de cada composto foram normalizados para valores médios de controle neutros para obter a porcentagem de atividade de ATG4B e sobrevivência celular (Figura 9A,B). Como esperado, a maioria dos compostos não teve efeito sobre a atividade de ATG4B, como indicado por valores próximos à luminescência basal do controle negativo (DMSO - coluna 1). O fator Z', que é um índice de qualidade para triagem de alto rendimento, foi calculado usando a equação (1):
Z' = 1 - (3 × 
) (1)
Onde STDpos é o desvio padrão do controle positivo (FMK9a), STDneg é o desvio padrão do controle negativo (DMSO), AVGpos é a média do controle positivo e AVGneg é a média do controle negativo.
Para a seleção dos acertos, foram utilizados os valores normalizados para o cálculo de uma razão a ser utilizada como ponto de corte para a identificação dos inibidores da ATG4B. A razão foi calculada dividindo-se a atividade ATG4B de cada composto pela sua viabilidade celular. Consideramos que as razões >1 indicaram possíveis ativadores de ATG4B e as razões <1 indicaram possíveis inibidores de ATG4B (Figura 9C). Foram selecionados todos os compostos com valores de razão semelhantes ao controle positivo FMK9A e excluídos os compostos citotóxicos.
Nesta tela, escolhemos a dedo 53 inibidores de ATG4B para confirmar e avaliar sua atividade e toxicidade. Os compostos foram testados em 10 concentrações em diluições duplas variando de 100 μM a 195 nM. As células tratadas de forma concentrada permitiram ajustar os dados quantificados e calcular os valores de EC50 . A toxicidade relativa dos inibidores foi quantificada por dados de viabilidade celular. Em conjunto, esses resultados mostraram que essa abordagem permite a identificação de moduladores da ATG4B.
Figura 1: Fluxo de trabalho de ensaio. O experimento detalha a linha do tempo para a geração de linhagens celulares estáveis e um fluxo de trabalho de ensaio de alto rendimento, começando com a geração de linhagens celulares estáveis, triagem de compostos, medição de luciferase, aquisição de imagens e análise de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Instruções passo a passo para a configuração do manipulador de líquidos . (A) Configurações da guia Protocolo . (1) Selecione o formato e o tipo da placa de amostra. (2) Selecione o tipo de placa de destino. (B) Guia Selecionar lista . (1) Use a opção de importação para importar a planilha. (C) Janela de prompt Importar Lista de Opções . (1) Selecione os parâmetros a serem importados. (2) Clique em Importar para concluir. (D) Protocolo de execução. (1) Clique no ícone Executar . (2) Janela de prompt exibindo a opção de execução e para iniciar a execução do protocolo. (E) Guia Status da execução . (1) Inicie o protocolo. (F) Janela de aviso para carregar a placa de origem. (G) Janela de aviso para carregar a placa de destino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Configuração do robô de manuseio de líquidos . (A) Configuração do deck Tecan. (P1) Posição para a pilha de ponta descartável de 50 μL. (P2,P4) Posições para a placa de ensaio. (P3,P5) Posições para as placas vazias, pretas sólidas, de 384 poços. (Pág. 6) Posição para descarte das pontas utilizadas. (B) Captura de tela do script de ensaio. (C) Captura de tela dos detalhes do aspirado MAC96. (1) Selecione a classe de líquido de aspiração. (2) Digite o volume para aspiração. (3) Selecione as posições do poço para aspiração. (D) Captura de tela dos detalhes da dispensa MAC96. (1) Selecione a classe de líquido dispensador. (2) Digite o volume para dispensação. (3) Selecione as mesmas posições de poço para dispensação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Captura de tela das configurações do leitor de placas de luminescência . (A) Guia Configurações de medição . (1) Selecione a abertura. (2) Selecione a distância, o tempo e o fator de correção. (B) Configurações gerais do protocolo. (1) Selecione o tipo de placa. (2) Selecione o modo de medição. (3) Selecione o número de placas de ensaio. (C) Dispense ajustes de medição. (1) Selecione a medida. (2) Defina o tempo de medição. (3) Selecione a bomba, a velocidade de dosagem e o volume. (4) Defina a ordem de dispensa e a repetição da placa. (D) Guia Seleção de poços (1) Selecione os poços para medição. (2) Iniciar o protocolo de medição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Captura de tela do controle do dispensador do leitor de placas de luminescência . (A) Guia Inicialização . (1) Selecione a bomba. (2) Inicie a bomba. (B) Opção de protocolo de enxágue. (1) Selecione a opção de enxágue. (2) Clique ao lado para ir para as configurações. (C) Opções de configurações da guia Enxágue . (1) Selecione a bomba. (2) Selecione a montagem da ponta. (3) Clique ao lado para ir para a próxima aba (D) Aba para iniciar o enxágue. (1) Clique em iniciar para iniciar o protocolo de enxágue. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Captura de tela do software de imagem de microscópio automatizado de alto conteúdo. Detalhes das configurações usadas para aquisição de imagens. (1) Guia Configuração (2) Selecione o tipo de placa. (3) Selecione Ejetar para carregar a placa no microscópio. (4) Selecione o objetivo. (5) Adicione o canal. (6) Selecione a pasta para transferir dados para o software Columbus. (7) Selecionar poços. (8) Selecione os campos. (9) Clique na guia Executar experimento para iniciar a aquisição de imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Análise de imagens em software on-line. (A) Guia Análise de imagem. (1) Clique em + para adicionar um bloco de construção. (2) Selecione a opção Localizar núcleos. (B) Encontre as configurações dos Núcleos. (1) Selecione o canal. (2) Selecione o método de segmentação. (C) Definir guia de resultados. (1) Selecione Saída padrão. (2) Selecione a opção a ser exibida como resultado. (D) Análise de imagens. (1) Guia Análise de lotes (2) Selecione a medição. (3) Selecione o método de análise. (4) Iniciar a análise de imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Imagens representativas das medidas de luciferase e contagem de núcleos . (A) Valores de intensidade relativa da luciferase de uma placa de ensaio de 384 poços representada por números e cores. (B) Resultados da análise das imagens. (1) Mapa de calor do número de núcleos de objetos. (2) Tabela com os resultados de cada poço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Resultados representativos após a normalização dos dados. (A) Porcentagem representativa de atividade de ATG4B após a normalização dos dados para a atividade média de ATG4B de poços de controle negativo (DMSO) dentro da mesma placa. Os ativadores são mostrados em vermelho e os inibidores em azul, com o branco indicando que não há mudança significativa na atividade. O controle negativo (DMSO) é encontrado na coluna 1 e o controle positivo (FMK9A) é encontrado na coluna 24. (B) Porcentagem representativa de viabilidade celular após normalização dos dados para o número médio de células de poços de controle negativo (DMSO) dentro da mesma placa. A proliferação é mostrada em verde e a toxicidade em vermelho, com o amarelo indicando que não há alteração significativa na viabilidade celular. O controle negativo (DMSO) é encontrado na coluna 1 e o controle positivo (FMK9A) é encontrado na coluna 24. (C) Distribuição dos compostos de acordo com o valor da razão. Cada ponto representa um composto. A razão foi calculada dividindo-se a atividade de ATG4B pela viabilidade celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve um ensaio genético-repórter baseado em células para a identificação de inibidores de ATG4B. A identificação de hits primários é baseada na atividade da luciferase no tratamento de células que expressam o quadro de leitura aberto de comprimento total da LC3B entre β-actina e dNGLUC. Algumas vantagens deste ensaio são que ele é sensível, altamente quantitativo e não invasivo, pois pode detectar dNGLUC sem lisar as células. Este trabalho apresenta um protocolo detalhado para geração de uma linhagem celular estável e uma triagem primária. Há algumas etapas críticas no protocolo.
Primeiro, o protocolo aqui descrito utilizou a linhagem celular PANC1, que apresenta alta eficácia de transfecção e alta capacidade de proliferação. Este método de triagem pode ser realizado usando outras linhagens celulares, mas a eficácia da transdução pode variar de uma linhagem celular para outra. Em segundo lugar, deve-se evitar trabalhar com populações de células estáveis de estoque congelado com números de passagem superiores a cinco, pois os níveis de expressão do repórter podem diminuir com o tempo. Em terceiro lugar, é importante usar um novo lote de células antes de cada ensaio para obter o sinal máximo e consistente de luciferase dentro de diferentes experimentos. Quarto, ao semear as células, manualmente ou usando um dispensador a granel, a suspensão celular precisa ser constantemente agitada para alcançar uma densidade celular homogênea em toda a placa. Em quinto lugar, ao colher o sobrenadante do poço, é importante que as pontas sejam posicionadas em uma profundidade adequada dentro dos poços para aspirar o sobrenadante sem perturbar a monocamada celular no fundo do poço. Finalmente, a solução de trabalho do substrato deve ser preparada no dia do ensaio. A celenterazina é muito sensível à luz e sujeita à oxidação, e há alguns relatos de rápido decaimento do substrato após a preparação.
Vários ensaios baseados em células estão disponíveis para investigar a consequência da inibição ou ativação da ATG4B, mas examinar a atividade celular da ATG4B permanece limitado4. Esse método é não invasivo, altamente sensível, robusto e diretamente dependente da atividade do ATG4B, pois sua atividade resulta na liberação de dNGLUC. O protocolo descrito é simples e requer pouco tempo para triagem de placas de 10x 384 poços. Outra vantagem do método é que ele pode ser usado para monitorar a atividade de ATG4B in vivo, uma vez que a dNGLUC é altamente estável e pode ser medida ex vivo a partir do soro.
Embora tenhamos usado com sucesso este repórter para selecionar pequenas bibliotecas de moléculas e siRNA e identificar novos reguladores da atividade ATG4B, há algumas limitações a serem consideradas neste protocolo. Primeiro, o ensaio baseado em células descrito baseia-se em uma leitura do repórter que reflete indiretamente as mudanças na atividade de ATG4B, permitindo a detecção de inibidores e ativadores da atividade de ATG4B. Portanto, os acertos devem passar por nova avaliação para que sua especificidade e atividade sejam validadas. Além disso, os inibidores devem ser avaliados em sua capacidade de regular a distribuição espacial da CL3 nas células ou de outras proteínas relacionadas à autofagia. Em segundo lugar, embora este ensaio possa ser facilmente modificado para um ensaio de menor escala devido ao seu manuseio simples e análise de dados, ele requer um grau de automação para adição de substrato e subsequente medição de luminescência. Terceiro, como o mecanismo de liberação de dNGLUC é pouco compreendido em nível molecular, compostos interferindo com elementos da via de secreção podem afetar os resultados. Finalmente, a viabilidade celular também pode ser determinada pela atividade da luciferase intracelular. Embora consideremos que a determinação do número de células é menos invasiva e resulta em menor variabilidade do que a determinação dos valores de luciferase intracelular, a determinação do número de células limita seu uso para laboratórios de pesquisa menores, pois apresentam dificuldades em termos de equipamentos de imagem, software de análise de dados e armazenamento de dados. Em geral, o ensaio desenvolvido do gene repórter baseado em células permite a identificação de inibidores de ATG4B.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento principal do Conselho de Pesquisa Médica do Reino Unido para o MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (referência de concessão 2018RIF_15), e o esquema de Apoio à Aceleração Terapêutica da UCL, apoiado pelo financiamento do MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. O plasmídeo que codifica o ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) foi obtido do Dr. Robin Ketteler (Departamento de Medicina Humana, Faculdade de Medicina de Berlim).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
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