Summary
Aquí, describimos un protocolo detallado para el uso de un ensayo reportero basado en luciferasa en un formato de cribado semiautomatizado de alto rendimiento.
Abstract
Cada vez hay más pruebas de que el flujo autofágico alto se relaciona con la progresión tumoral y la resistencia a la terapia contra el cáncer. El ensayo de proteínas individuales de autofagia es un requisito previo para las estrategias terapéuticas dirigidas a esta vía. Se ha demostrado que la inhibición de la proteasa de autofagia ATG4B aumenta la supervivencia general, lo que sugiere que ATG4B podría ser una posible diana farmacológica para el tratamiento del cáncer. Nuestro laboratorio ha desarrollado un ensayo selectivo basado en luciferasa para monitorizar la actividad de ATG4B en células. Para este ensayo, el sustrato de ATG4B, LC3B, se marca en el extremo C-terminal con una luciferasa secretable del copépodo marino Gaussia princeps (GLUC). Este reportero está unido al citoesqueleto de actina, manteniéndolo así en el citoplasma de las células cuando no se separa. La escisión mediada por ATG4B da lugar a la liberación de GLUC por secreción no convencional, que luego puede monitorizarse mediante la recolección de sobrenadantes de cultivos celulares como correlato de la actividad celular de ATG4B. En este trabajo se presenta la adaptación de este ensayo basado en luciferasa al cribado automatizado de alto rendimiento. Describimos el flujo de trabajo y la optimización para un análisis ejemplar de alto rendimiento de la actividad celular de ATG4B.
Introduction
La autofagia es un proceso metabólico conservado que permite a las células mantener la homeostasis intracelular y responder al estrés degradando el contenido celular envejecido, defectuoso o innecesario a través de los lisosomas 1,2,3. En algunas condiciones fisiopatológicas, este proceso actúa como una respuesta celular crucial a la privación de nutrientes y oxígeno, lo que resulta en nutrientes y lípidos reciclados, lo que permite que las células se adapten a sus necesidades metabólicas 2,3,4. La autofagia también se ha identificado como una respuesta al estrés celular relacionada con varias enfermedades, como trastornos neurodegenerativos, infecciones por patógenos y varios tipos de cáncer. La función de la autofagia en el cáncer es compleja y depende del tipo, el estadio y el estado del tumor. Puede suprimir la tumorigénesis a través de la degradación autofágica de las células dañadas, pero también puede promover la supervivencia de los tumores avanzados al mejorar la supervivencia celular durante condiciones estresantes, como la hipoxia, la privación de nutrientes y el daño citotóxico 2,4,5,6.
Varios estudios han demostrado que la inhibición de la autofagia proporciona un beneficio como estrategia contra el cáncer. Así, la inhibición de pasos críticos, como la formación de autofagosomas o su fusión con el lisosoma, podría ser un método eficaz para el control del cáncer 2,4,5,6. Cada vez hay más pruebas que demuestran que ATG4B está implicado en ciertas condiciones patológicas, y ha ganado atención como una posible diana anticancerígena 2,3,4. Por ejemplo, se observó que las células de cáncer colorrectal y las células de cáncer de mama positivas para el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) tenían niveles de expresión de ATG4B significativamente más altos que las células normales adyacentes 2,4. En las células de cáncer de próstata, la inhibición de ATG4B dio lugar a una susceptibilidad específica de la línea celular a la quimioterapia y la radioterapia7. Recientemente, ha surgido evidencia sólida de que el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es particularmente vulnerable a la inhibición de ATG4B. Por ejemplo, en un modelo de ratón modificado genéticamente, se demostró que la pérdida intermitente de la función de ATG4B reduce el crecimiento tumoral de PDAC y aumenta la supervivencia 3,4. En general, ATG4B está altamente sobreexpresado en algunos tipos de cáncer, se relaciona con la progresión del tumor y se relaciona con la resistencia a la terapia contra el cáncer 2,4,8.
Las proteasas de cisteína ATG4 en mamíferos tienen cuatro miembros de la familia, ATG4A-ATG4D. Estas proteínas exhiben cierta selectividad hacia la familia de proteínas LC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 y pueden tener funciones adicionales no relacionadas con su actividad proteasa12,13. Además, ATG4 funciona en la regulación de un nuevo tipo de modificación postraduccional, la ATG8-ilación de proteínas11,12. Si bien ATG4B y su sustrato principal LC3B son los más estudiados, está surgiendo un panorama que sugiere un papel complejo para cada miembro de la subfamilia en la regulación de los procesos autofágicos y no autofágicos. Esto se corrobora aún más por una compleja red de modificaciones postraduccionales que regulan la actividad de ATG4B a través de la fosforilación, acetilación, glicosilación y nitrosilación 9,10,11,12,13.
Se han publicado varios inhibidores conocidos de ATG4B 2,4,14,15. Si bien estos son adecuados como herramientas de investigación, su perfil farmacodinámico, selectividad o potencia aún no los han desarrollado como candidatos preclínicos 4,16. En general, existe una necesidad urgente de identificar compuestos más potentes y selectivos. A menudo, los compuestos son buenos inhibidores bioquímicos de la función de las proteínas, pero su eficacia en los ensayos basados en células es pobre. Existen múltiples ensayos para monitorizar la actividad de ATG4B, incluyendo métodos bioquímicos y ensayos basados en células4. Anteriormente hemos desarrollado un ensayo simple, basado en luminiscencia y de alto rendimiento para monitorear la actividad de ATG4B en las celdas 8,17. Este ensayo utiliza una proteína luciferasa de Gaussia princeps (GLUC) que es estable y activa en el medio extracelular y puede ser liberada induciblemente de las células en respuesta a la actividad proteolítica ATG4B18,19.
En esta construcción reportera, dNGLUC está ligada al citoesqueleto de actina de las células. Se puede introducir un enlazador específico de proteasa entre el anclaje de β-actina y dNGLUC, haciendo que la secreción dependa de la escisión del enlazador. Utilizamos el marco de lectura abierto de longitud completa de LC3B entre β-actina y dNGLUC, para poder monitorizar la escisión de LC3B17,18,19. Aunque el mecanismo de secreción de dNGLUC es poco conocido, es específico para monitorizar la actividad de ATG4B, no depende de la autofagia global como ocurre en las células knockout de ATG5 y está mediado por mecanismos no convencionales que no requieren un péptido señal clásico 4,18,19. Hemos utilizado con éxito este reportero para cribar moléculas pequeñas y bibliotecas de siRNA, y hemos identificado nuevos reguladores de la actividad de ATG4B, como las proteínas quinasasAkt 8. En este trabajo se describe un protocolo detallado para el uso de este reportero de luciferasa en un formato de cribado semiautomático y de alto rendimiento.
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Protocol
NOTA: El proceso de ensayo se describe en la Figura 1. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo.
1. Producción de retrovirus
NOTA: El plásmido que codifica la ActinaLC3dNGLUC es pMOWS-ActinLC3dNGLUC20. Utilice un número bajo de células para la producción de virus de alto título (idealmente menos de P20).
- Cultivo HEK293T células en medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) a 37 °C en una incubadora humidificada, con una atmósfera de 5% de CO2 hasta que estén 80%-90% confluentes antes de la siembra para la transfección.
- El día antes de la transfección, siembre las células en una placa de 6 pocillos a una densidad de 1 × 106 células/pocillo en 2 mL/pocillo de medio de crecimiento completo. Incubar la placa durante la noche en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de CO2.
NOTA: Siga las instrucciones del fabricante si utiliza un reactivo de transfección a base de liposomas. Este protocolo describe el uso de un reactivo no liposomal. Antes de comenzar la transfección, deje que el reactivo de transfección de ADN, el ADN y los medios se equilibren a temperatura ambiente (~15 min). - Para cada transfección, añadir 200 μL de medio libre de suero a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. En cada tubo, añadir las siguientes cantidades de plásmidos: 1.000 ng de pMOWS-ActinLC3dNGLUC; 900 ng de GagPol; 100 ng de VSV-G.
NOTA: La cantidad de plásmidos y el volumen de medios indicados aquí son para una placa de 12 pocillos. Si utiliza un tipo de placa diferente, ajuste el volumen del medio y las cantidades de plásmido para alcanzar la concentración final de 5 ng/μL de plásmido de transferencia, 4,5 ng/μL de plásmido de empaquetamiento y 0,5 ng/μL de plásmido de envoltura. Utilice cualquier plásmido de empaquetamiento que contenga genes que expresen gag y pol, y cualquier plásmido de envoltura que contenga el gen que expresa VSV-G. - Vortex el vial de reactivo de transfección de ADN durante 30 s. Pipetear 4 μL del reactivo de transfección directamente en el medio que contiene el ADN diluido. Mezcle suavemente inclinando suavemente el tubo.
NOTA: No toque las paredes de los tubos de plástico con las puntas. No pipetee hacia arriba y hacia abajo ni haga vórtices. - Incubar la reacción durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Mientras incuba la reacción, retire el medio viejo de la placa de 6 pocillos y reemplácelo con 2 ml/pocillo de medio fresco sin suero.
- Agregue cada complejo de transfección a cada pocillo gota a gota.
- Agite o agite suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme en toda la superficie del pocillo.
- Incubar la placa durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de CO2.
- Después de 24 h, reemplace el medio viejo por medio completo fresco (2 mL/pocillo) y devuelva las células a la incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de CO2 durante 72 h.
- Después de 72 h, recolectar el sobrenadante en un tubo cónico de 50 mL y centrifugar durante 10 min a 4.000 × g a 4 °C para eliminar las células muertas y los residuos. Para una mayor purificación, utilice una jeringa grande de 60 ml para pasar el sobrenadante a través de un filtro de 0,20 μm. Preparar inmediatamente alícuotas de un solo uso de 300 μL y conservar a -80 °C.
NOTA: Evite un ciclo de congelación y descongelación para mantener la máxima actividad del producto.
2. Transducción retroviral
- El día antes de la transducción de las células, siembre las células diana a una densidad media (PANC1 a 1 × 10 5 células/pocillo) en una placa de 12 pocillos en 1 mL/pocillo de medio suplementado con 10% de FBS y 1% de P/S. Incubar la placa durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera de5 % de CO2.
NOTA: La mejor densidad celular debe establecerse de antemano, ya que los diferentes tipos de células tienen diferentes capacidades de adhesión. Lo ideal es utilizar una densidad celular para obtener una confluencia del 40%-50%. - Retire las alícuotas de retrovirus congeladas del congelador a -80 °C y descongele con hielo antes de cada uso.
NOTA: No vuelva a congelar las alícuotas no utilizadas. - En un tubo cónico de 50 ml, preparar una mezcla de sobrenadante viral y polibreno a una concentración final de 8 μg/ml.
NOTA: Los volúmenes subsiguientes se aplican a la transducción de una placa de 12 pocillos que contiene un volumen final de 500 μL/pocillo. El volumen final del sobrenadante viral se puede estimar probando un rango de diluciones virales en presencia de polibreno. Se pueden utilizar diluciones más altas o más bajas dependiendo de los niveles de expresión deseados del transgén y del tamaño del vaso utilizado. - Retire el medio viejo de la placa de 12 pocillos y agregue 500 μL de la mezcla a cada pocillo. Incubar las células con el sobrenadante viral durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de CO2.
NOTA: Mantenga dos pocillos con medio completo (sin sobrenadante viral) para usarlos como control para la selección. - Reemplace el medio que contiene virus con un medio de crecimiento completo fresco (1 ml/pocillo). Vuelva a colocar las células en la incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de CO2 durante 48 h.
3. Selección y mantenimiento de la población agrupada
- Sustituya el medio de cultivo por un medio de selección (medio de cultivo completo con una concentración final de 1 μg/ml de puromicina). Controle el crecimiento de las células y cambie el medio de selección cada 2-3 días. En la confluencia, expanda en una placa de 6 pocillos y luego en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm de diámetro.
- Mantenga las células en medio de selección durante al menos el tiempo que tarden las células de control (no transducidas) en morir por completo.
NOTA: Para obtener resultados exitosos, se recomienda que se determinen las concentraciones óptimas de puromicina antes de iniciar el proyecto experimental. Para ello, genere una curva de muerte de puromicina para determinar la concentración mínima requerida para matar las células no transducidas entre 3 y 10 días. - Una vez que las células estén creciendo en el medio de selección, expanda las células en un medio de crecimiento completo y congele las alícuotas de stock para el proyecto experimental.
NOTA: Registre el número de pasaje y evite trabajar con poblaciones agrupadas de poblaciones congeladas con números de pasaje superiores a cinco. Compruebe regularmente si hay contaminación por micoplasma antes de realizar el ensayo. Lo ideal es utilizar un lote de células frescas antes de cada ensayo para obtener la máxima señal de luciferasa. - Mantenga las células en el medio de selección y siembre suficientes células para alcanzar la densidad deseada el día antes del ensayo.
4. Adición de compuestos
NOTA: La biblioteca de moléculas pequeñas de Selleckchem consta de aproximadamente 4.000 compuestos dispuestos en ocho filas y 10 columnas en cincuenta placas de 96 pocillos a una concentración de 10 mM en dimetilsulfóxido (DMSO).
- Alícuota 30 μL de compuesto en el pocillo apropiado de una placa fuente que sea compatible con un dispensador de líquido acústico a nanoescala. Utilice una placa de polipropileno de 384 pocillos (placa de 384PP). Mantenga estas placas selladas y almacenadas a -20 °C.
NOTA: El protocolo de detección descrito aquí es para un total de 10 placas de ensayo por día; se utilizó una concentración fija de 10 μM como concentración final del ensayo junto con un período de incubación de 24 h. - Descongele las placas de la biblioteca compuesta a temperatura ambiente.
NOTA: Asegúrese de que la placa esté completamente descongelada y equilibrada a temperatura ambiente. Un gradiente de temperatura a través de la placa puede afectar el manejo de líquidos. - Dispense 50 nL/pocillo en una placa de ensayo de 384 pocillos utilizando un dispensador de líquido acústico a nanoescala.
NOTA: Asegúrese de que las placas de origen y destino seleccionadas en el programa coincidan con las utilizadas para este paso. - Cree un programa de dispensación en una hoja de cálculo.
- Abra el software.
- Abra un nuevo protocolo. En la pestaña Protocolo , seleccione las siguientes opciones: Formato de placa de muestra, 384PP; Tipo de placa de muestra, 384PP_DMSO2; y el tipo de placa de destino, CellCarrier-384 Ultra PN (Figura 2A).
- En Lista de selección, seleccione la opción de importación (Figura 2B) para importar la hoja de cálculo que contiene el programa de dispensación (Figura 2C).
- Seleccione la opción Ejecutar protocolo (Figura 2D), compruebe si la información mostrada es correcta y haga clic en Ejecutar.
- En la nueva ventana llamada Estado de ejecución (Figura 2E), haga clic en Inicio y siga los pasos que se muestran en las ventanas de solicitud (Figura 2F, G).
5. Siembra celular
- Tripsinar las células de un matraz de cultivo celular o de placas de Petri de cultivo celular y neutralizar la tripsina añadiendo medios que contengan FBS.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 ml y centrifugue a 390 × g durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación, retire suavemente el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 10 ml de medio de crecimiento completo.
- Realice el recuento de células.
- Preparar la suspensión celular con 4,6 × 107 células en 230 mL de medio de cultivo completo.
NOTA: Este volumen y densidad celular es para 10 placas de ensayo de 384 pocillos más un volumen muerto de dos placas de 384 pocillos. - Dispense 50 μL de suspensión celular en cada pocillo de una placa de ensayo de 384 pocillos, preparada en la sección 4.
NOTA: La siembra de células se puede realizar manualmente o mediante el uso de un dispensador a granel. - Incubar las células a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de CO2 durante 24 h.
6. Recolección del sobrenadante celular
NOTA: La plataforma robótica de manejo de líquidos utilizada aquí realiza el manejo de líquidos con un brazo multicanal para 96 puntas. Si no se dispone de una automatización para la manipulación de líquidos, el protocolo se puede adaptar a un formato de bajo rendimiento mediante el uso de pipetas multicanal.
- Configure la plataforma de la estación de trabajo de automatización de laboratorio como se muestra en la Figura 3.
- Coloque la pila desechable de 96 puntas en la posición P1 (Figura 3A).
NOTA: Cada pila de 96 puntas está formada por ocho rejillas desechables. Cuando se utiliza un brazo multicanal para 96 puntas, la placa de 384 pocillos se divide en cuatro cuadrantes. Por lo tanto, cada pila de puntas es suficiente para transferir el sobrenadante de dos placas de ensayo a dos placas vacías, de color negro sólido, de 384 pocillos. Toda la pila de puntas debe reemplazarse después de cada ejecución de dos placas. - Coloque las placas de ensayo en las posiciones P2 y P4 (Figura 3A).
- Coloque las placas vacías, de color negro sólido, de 384 pocillos en las posiciones P3 y P5 (Figura 3A).
NOTA: Esta plataforma robótica flexible y capaz ha sido adaptada para este ensayo y se ha escrito un programa especial (Figura 3B). - Obtén las puntas desde la posición P1.
- Aspirar 10 μL de sobrenadante de la placa en la posición P2 y transferir a la placa vacía de color negro sólido en la posición P3.
NOTA: Las puntas deben colocarse a una profundidad adecuada dentro de los pocillos para aspirar el sobrenadante sin alterar la monocapa celular en el fondo del pocillo. - Deje caer las puntas en la posición P6 (Figura 3A).
- Repita los pasos 6.5-6.7 para los pocillos restantes de la placa en la posición P2 y, a continuación, repita los mismos pasos para transferir el sobrenadante de la posición P4 a la posición P5.
NOTA: Asegúrese de recoger el sobrenadante y dispensarlo en los pocillos correspondientes en la placa vacía de color negro sólido (Figura 3C, D). Como el dNGLUC secretado es muy estable en el medio de cultivo celular, las placas pueden sellarse y conservarse hasta 7 días a 4 °C en la oscuridad.
7. Ensayo de luciferasa
NOTA: El dNGLUC utilizado en el reportero exhibe una cinética de destello con un rápido decaimiento de la señal. Debido a la rápida disminución de la luminiscencia después de agregar sustrato (celenterazina), el lector de placas debe configurarse para medir la señal de luminiscencia en los sobrenadantes; Inyecte el sustrato en un pocillo y lea ese pozo después de unos segundos. Por esta razón, utilice un lector de placas que sea capaz de monitorear la luminiscencia y esté equipado con un inyector de sustrato para garantizar que el tiempo entre los pasos de inyección y lectura sea uniforme para todas las muestras. Los ajustes utilizados en el lector de placas se pueden encontrar en la Figura 4.
- Preparar celenterazina nativa como solución madre de 1 mg/ml en metanol acidificado (10 μl de HCl 3 M por 1 ml de metanol).
NOTA: Siga las pautas locales de salud y seguridad con respecto a la manipulación de metanol en el laboratorio y evite el contacto con la piel. Prepare la solución de sustrato de trabajo fresca antes de comenzar el ensayo. - Inicialice la bomba inyectora (Figura 5A).
- Enjuague el tubo con agua desionizada (Figura 5B-D).
- Enjuague el tubo con metanol.
- Mientras enjuaga la tubería, prepare la solución de sustrato de trabajo diluyendo el sustrato 1:100 (para una placa de 384 pocillos, agregue 220 μL de la solución madre de sustrato a 21,8 ml de solución salina tamponada con fosfato [PBS]).
- Enjuague el tubo con la solución de trabajo del sustrato (Figura 5B-D).
- Cargue la placa en el lector e inicie la medición utilizando los ajustes descritos en la Figura 4.
- Repita los pasos 7.6-7.7 para todas las placas de ensayo.
- Una vez que haya terminado con todas las placas de ensayo, enjuague el tubo con metanol.
- Enjuague el tubo con agua desionizada.
NOTA: Al final de este paso, se obtienen valores brutos de luciferasa que son correlativos a la actividad celular ATG4B. Para la normalización del número de células, los siguientes pasos son necesarios contando el número de células en cada pocillo mediante microscopía de fluorescencia.
8. Fijación y tinción celular
NOTA: Este paso se puede realizar manualmente con la ayuda de una pipeta multicanal o utilizando un dispensador a granel.
- Fije las células con paraformaldehído al 4% (en 1x PBS) durante 15 min.
NOTA: Siga las pautas locales de salud y seguridad con respecto a la manipulación de paraformaldehído en el laboratorio y evite el contacto con la piel. Realice este paso con una capucha de seguridad si es posible. - Lavar tres veces con 1x PBS.
- Tiñir los núcleos con Hoechst 33342 diluido 1:5.000 en 1x PBS durante 15 min.
- Lavar tres veces con 1x PBS.
9. Adquisición de imágenes
NOTA: Realice la adquisición de imágenes con un microscopio automatizado. Como alternativa a la adquisición de imágenes para determinar el número de células, también se puede determinar la actividad de la luciferasa intracelular. Hay ventajas y desventajas con respecto a si uno se normaliza al número de células o a la actividad de la luciferasa intracelular, que se discute a continuación. Encontramos que la determinación del número de células es menos invasiva y da como resultado una menor variabilidad que la determinación de los valores de luciferasa intracelular.
- Inicie el software operativo del microscopio (Figura 6).
- En la pestaña Configuración , elija el tipo de placa predefinida correcto. Si el tipo de placa no está preestablecido, introduzca las dimensiones de la placa manualmente.
- Cargue la placa en el microscopio haciendo clic en la opción Expulsar y cargar .
- A continuación, elija el objetivo de aire 20x (apertura numérica [NA]: 0,4).
NOTA: Asegúrese de que el collar del objetivo esté ajustado al valor correcto, lo que permite un enfoque adecuado con diferentes tipos de placas. - En Selección de canal, elija Hoechst 33342.
NOTA: Los ajustes de canal para el tiempo, la potencia y la altura deben optimizarse de acuerdo con el tipo de placa utilizada. - En Definir diseño, seleccione todos los pozos de la placa y cuatro campos del pozo.
- En Trabajos en línea, seleccione la carpeta correspondiente para transferir los datos al software de análisis.
10. Análisis de imágenes
NOTA: Se puede utilizar cualquier software de análisis de imágenes para segmentar y contar núcleos celulares a partir de las imágenes adquiridas. A continuación, describimos los pasos para utilizar un software en línea específico que sea compatible con múltiples archivos de microscopios automatizados.
- Inicie el software de análisis de imágenes.
- Vaya a la pestaña Análisis de imagen para iniciar la segmentación de la imagen (Figura 7A).
- En la pestaña Imagen de entrada , haga clic en el signo + para agregar un nuevo bloque de creación (Figura 7A).
- En la lista, seleccione la opción Buscar núcleos (Figura 7A) y seleccione Hoechst 33342 como opción de canal (Figura 7B).
- Inspeccione visualmente los objetos segmentados en la imagen y seleccione el método de segmentación más preciso.
NOTA: Para este experimento, utilizamos el método C (Figura 7C). Cada opción de método tiene subcategorías que se pueden ajustar para obtener la mejor segmentación posible. - A continuación, haga clic en la pestaña Definir resultados (Figura 7C) y seleccione Salida estándar como opción Método .
- En la subcategoría, seleccione Número de núcleos de objetos y Recuento de objetos (Figura 7C).
- Guarde la canalización de análisis mediante la opción Guardar análisis en disco o Guardar análisis en base de datos .
- En la pestaña Análisis por lotes , seleccione los datos que se van a analizar en el árbol.
- En Método, seleccione la canalización de análisis guardada en el paso 10.8.
NOTA: También es posible cargar un archivo de script desde fuera del software al que se hace referencia o cargar un análisis existente guardado en la base de datos. - Haga clic en Ejecutar análisis para iniciar el análisis (Figura 7D). Al final de este flujo de trabajo, se generan dos conjuntos de datos: los valores brutos de luciferasa de los sobrenadantes y el número de celdas en cada pocillo. Utilice ambos para normalizar el valor de luciferasa por célula.
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Representative Results
En una publicación anterior8, utilizamos con éxito este ensayo para cribar bibliotecas de moléculas pequeñas y siRNA e identificamos nuevos reguladores de ATG4B. A continuación, describimos el protocolo y los resultados representativos de este reportero de luciferasa en un formato de cribado semiautomatizado y de alto rendimiento. La Figura 8 muestra un ejemplo del análisis de datos brutos tanto para los núcleos celulares como para la luminiscencia. Un resultado típico de una medición de luminiscencia se muestra en la Figura 8A. La señal de luminiscencia basal del DMSO se puede ver en la columna 1, y en presencia de 10 μM del inhibidor de ATG4B FMK9A en la columna 24. El resultado del recuento de núcleos de la misma placa se puede ver en la Figura 8B. Los valores brutos de cada compuesto se normalizaron a valores medios de control neutros para obtener el porcentaje de actividad de ATG4B y la supervivencia celular (Figura 9A,B). Como era de esperar, la mayoría de los compuestos no tuvieron ningún efecto sobre la actividad de ATG4B, como lo indican los valores cercanos a la luminiscencia basal del control negativo (DMSO - columna 1). El factor Z', que es un índice de calidad para el cribado de alto rendimiento, se calculó mediante la ecuación (1):
Z' = 1 - (3 × 
) (1)
Donde STDpos es la desviación estándar del control positivo (FMK9a), STDneg es la desviación estándar del control negativo (DMSO), AVGpos es el promedio del control positivo y AVGneg es el promedio del control negativo.
Para seleccionar los aciertos, se utilizaron los valores normalizados para calcular una relación que se utilizará como valor de corte para la identificación de los inhibidores de ATG4B. La relación se calculó dividiendo la actividad ATG4B de cada compuesto por su viabilidad celular. Se consideró que los ratios >1 indicaban posibles activadores de ATG4B y los ratios <1 indicaban posibles inhibidores de ATG4B (Figura 9C). Se seleccionaron todos los compuestos con valores de relación similares al control positivo FMK9A y se excluyeron los compuestos que eran citotóxicos.
En este análisis, seleccionamos 53 inhibidores de ATG4B para confirmar y evaluar su actividad y toxicidad. Los compuestos se probaron en 10 concentraciones como diluciones dobles que iban de 100 μM a 195 nM. Las células tratadas de forma concentrativa permitieron ajustar los datos cuantificados y calcular los valores de CE50 . La toxicidad relativa de los inhibidores se cuantificó mediante datos de viabilidad celular. En conjunto, estos resultados mostraron que este enfoque permite la identificación de moduladores ATG4B.
Figura 1: Flujo de trabajo del ensayo. El experimento detalla el cronograma para la generación de líneas celulares estables y un flujo de trabajo de ensayos de alto rendimiento, comenzando con la generación de líneas celulares estables, el cribado de compuestos, la medición de luciferasa, la adquisición de imágenes y el análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Instrucciones paso a paso para la configuración del manipulador de líquidos . (A) Configuración de la pestaña Protocolo . (1) Seleccione el formato y el tipo de placa de muestra. (2) Seleccione el tipo de placa de destino. (B) Pestaña Lista de selección . (1) Utilice la opción de importación para importar la hoja de cálculo. (C) Ventana de solicitud de importación de lista de selección . (1) Seleccione los parámetros que desea importar. (2) Haga clic en Importar para concluir. (D) Protocolo de ejecución. (1) Haga clic en el icono Ejecutar . (2) Ventana de aviso que muestra la opción de ejecución y para iniciar la ejecución del protocolo. (E) Pestaña Estado de ejecución . (1) Inicie el protocolo. (F) Ventana de aviso para cargar la placa de origen. (G) Ventana de aviso para cargar la placa de destino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Configuración del robot de manipulación de líquidos . (A) Configuración de la cubierta Tecan. (P1) Posición para la pila de puntas desechables de 50 μL. (P2, P4) Posiciones de la placa de ensayo. (P3, P5) Posiciones para las placas vacías, de color negro sólido, de 384 pocillos. (P6) Posición para desechar las puntas usadas. (B) Captura de pantalla del guión del ensayo. (C) Captura de pantalla de los detalles del aspirado MAC96. (1) Seleccione la clase de líquido de aspiración. (2) Escriba el volumen para la aspiración. (3) Seleccione las posiciones de los pozos para la aspiración. (D) Captura de pantalla de los detalles de la dispensación MAC96. (1) Seleccione la clase de líquido dispensador. (2) Escriba el volumen para dispensar. (3) Seleccione las mismas posiciones de pocillos para la dispensación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Captura de pantalla de la configuración del lector de placas de luminiscencia . (A) Pestaña de ajustes de medición . (1) Seleccione la apertura. (2) Seleccione la distancia, el tiempo y el factor de corrección. (B) Configuración general del protocolo. (1) Seleccione el tipo de placa. (2) Seleccione el modo de medición. (3) Seleccione el número de placas de ensayo. (C) Ajustes de medición de dispensación. (1) Seleccione la medida. (2) Ajuste el tiempo de medición. (3) Seleccione la bomba, la velocidad de dispensación y el volumen. (4) Defina el orden de dispensación y la repetición de placas. (D) Pestaña de selección de pozos. (1) Seleccione los pocillos para la medición. (2) Inicie el protocolo de medición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Captura de pantalla del control del dispensador del lector de placas de luminiscencia . (A) Pestaña de inicialización . (1) Seleccione la bomba. (2) Encienda la bomba. (B) Opción de protocolo de enjuague. (1) Seleccione la opción de enjuague. (2) Haga clic en siguiente para ir a la configuración. (C) Opciones de configuración de la pestaña Enjuagar . (1) Seleccione la bomba. (2) Seleccione el soporte de la punta. (3) Haga clic en siguiente para pasar a la siguiente pestaña. (D) Pestaña para iniciar el enjuague. (1) Haga clic en iniciar para iniciar el protocolo de enjuague. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Captura de pantalla del software automatizado de imágenes de microscopio de alto contenido. Detalles de la configuración utilizada para la adquisición de imágenes. (1) Pestaña Configuración . (2) Seleccione el tipo de placa. (3) Seleccione Expulsar para cargar la placa en el microscopio. (4) Seleccione el objetivo. (5) Agregue el canal. (6) Seleccione la carpeta para transferir los datos al software Columbus. (7) Seleccionar pozos. (8) Seleccione los campos. (9) Haga clic en la pestaña Ejecutar experimento para iniciar la adquisición de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Análisis de imágenes en software en línea. (A) Pestaña Análisis de imágenes . (1) Haga clic en + para agregar un bloque de construcción. (2) Seleccione la opción Buscar núcleos . (B) Buscar la configuración de los núcleos . (1) Seleccione el canal. (2) Seleccione el método de segmentación. (C) Defina la pestaña de resultados. (1) Seleccione Salida estándar. (2) Seleccione la opción que se mostrará como resultado. (D) Análisis de imágenes. (1) Ficha Análisis de lotes . (2) Seleccione la medida. (3) Seleccione el método de análisis. (4) Inicie el análisis de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Imágenes representativas de las mediciones de luciferasa y recuento de núcleos. (A) Valores de intensidad relativa de luciferasa de una placa de ensayo de 384 pocillos representados por números y colores. (B) Resultados del análisis de imágenes. (1) Mapa de calor del número de núcleos de objetos. (2) Tabla que muestra los resultados de cada pozo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Resultados representativos después de la normalización de los datos. (A) Porcentaje representativo de actividad de ATG4B después de la normalización de los datos a la actividad media de ATG4B de pocillos de control negativo (DMSO) dentro de la misma placa. Los activadores se muestran en rojo y los inhibidores en azul, y el blanco indica que no hay cambios significativos en la actividad. El control negativo (DMSO) se encuentra en la columna 1 y el control positivo (FMK9A) se encuentra en la columna 24. (B) Porcentaje representativo de viabilidad celular después de la normalización de los datos al número medio de células de pocillos de control negativo (DMSO) dentro de la misma placa. La proliferación se muestra en verde y la toxicidad en rojo, donde el amarillo indica que no hay cambios significativos en la viabilidad celular. El control negativo (DMSO) se encuentra en la columna 1 y el control positivo (FMK9A) se encuentra en la columna 24. (C) Distribución de los compuestos según el valor de la relación. Cada punto representa un compuesto. La relación se calculó dividiendo la actividad de ATG4B por la viabilidad celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe un ensayo de genes reporteros basado en células para la identificación de inhibidores de ATG4B. La identificación de los aciertos primarios se basa en la actividad de la luciferasa en el tratamiento de las células que expresan el marco de lectura abierto de longitud completa de LC3B entre la β-actina y el dNGLUC. Algunas ventajas de este ensayo son que es sensible, altamente cuantitativo y no invasivo, ya que puede detectar dNGLUC sin lisar las células. En este trabajo se presenta un protocolo detallado para generar una línea celular estable y un cribado primario. Hay algunos pasos críticos en el protocolo.
En primer lugar, el protocolo aquí descrito utilizó la línea celular PANC1, que presenta una alta eficacia de transfección y una alta capacidad de proliferación. Este método de cribado se puede realizar utilizando otras líneas celulares, pero la eficacia de la transducción puede variar de una línea celular a otra. En segundo lugar, se debe evitar trabajar con poblaciones celulares estables de stock congelado con un número de paso superior a cinco, ya que los niveles de expresión del reportero pueden disminuir con el tiempo. En tercer lugar, es importante utilizar un lote de células frescas antes de cada ensayo para obtener la señal máxima y consistente de luciferasa dentro de diferentes experimentos. En cuarto lugar, al sembrar las células, ya sea manualmente o mediante el uso de un dispensador a granel, la suspensión celular debe agitarse constantemente para lograr una densidad celular homogénea en toda la placa. Quinto, al cosechar el sobrenadante del pozo, es importante que las puntas se coloquen a una profundidad adecuada dentro de los pozos para aspirar el sobrenadante sin perturbar la monocapa celular en el fondo del pozo. Finalmente, la solución de trabajo del sustrato debe prepararse el día del ensayo. La celenterazina es muy sensible a la luz y está sujeta a oxidación, y hay algunos informes de rápida descomposición del sustrato después de la preparación.
Se dispone de una serie de ensayos basados en células para investigar las consecuencias de la inhibición o activación de ATG4B, pero el examen de la actividad celular de ATG4B sigue siendo limitado4. Este método no es invasivo, es altamente sensible, robusto y depende directamente de la actividad de ATG4B, ya que su actividad da lugar a la liberación de dNGLUC. El protocolo descrito es simple y requiere poco tiempo para examinar 10 placas de 384 pocillos. Otra ventaja del método es que se puede utilizar para monitorizar la actividad de ATG4B in vivo, ya que el dNGLUC es muy estable y puede medirse ex vivo a partir del suero.
Aunque hemos utilizado con éxito este reportero para examinar bibliotecas de moléculas pequeñas y siRNA e identificado nuevos reguladores de la actividad de ATG4B, existen algunas limitaciones a considerar en este protocolo. En primer lugar, el ensayo basado en células descrito se basa en una lectura de reportero que refleja indirectamente los cambios en la actividad de ATG4B, lo que permite la detección tanto de inhibidores como de activadores de la actividad de ATG4B. Por lo tanto, las respuestas positivas deben someterse a una evaluación adicional para validar su especificidad y actividad. Además, los inhibidores deben evaluarse más a fondo en su capacidad para regular la distribución espacial de LC3 en las células o la de otras proteínas relacionadas con la autofagia. En segundo lugar, aunque este ensayo puede modificarse fácilmente a un ensayo a menor escala debido a su sencillo manejo y análisis de datos, requiere un grado de automatización para la adición de sustrato y la posterior medición de la luminiscencia. En tercer lugar, debido a que el mecanismo de liberación de dNGLUC es poco conocido a nivel molecular, los compuestos que interfieren con elementos de la vía de secreción pueden afectar los resultados. Por último, la viabilidad celular también puede determinarse por la actividad de la luciferasa intracelular. Aunque encontramos que la determinación del número de células es menos invasiva y da como resultado una menor variabilidad que la determinación de los valores de luciferasa intracelular, la determinación del número de células limita su uso para laboratorios de investigación más pequeños, ya que presentan dificultades en términos de equipos de imágenes, software de análisis de datos y almacenamiento de datos. En general, el ensayo de genes reporteros basado en células desarrollado permite la identificación de inhibidores de ATG4B.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de la financiación básica del Consejo de Investigación Médica del Reino Unido para la Subvención de la Unidad Universitaria MRC-UCL Ref MC_U12266B, la Subvención de la Plataforma de Demencia del MRC del Reino Unido MR/M02492X/1, el Cáncer de Páncreas del Reino Unido (referencia de la subvención 2018RIF_15) y el programa de Apoyo a la Aceleración Terapéutica de la UCL, con el apoyo de la financiación de MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. El plásmido que codifica la ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) se obtuvo del Dr. Robin Ketteler (Departamento de Medicina Humana, Facultad de Medicina de Berlín).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
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