Summary
Здесь мы опишем подробный протокол использования репортерного анализа на основе люциферазы в полуавтоматическом формате скрининга с высокой пропускной способностью.
Abstract
Появляется все больше доказательств того, что высокий аутофагический поток связан с прогрессированием опухоли и резистентностью к терапии рака. Анализ отдельных белков аутофагии является необходимым условием для терапевтических стратегий, нацеленных на этот путь. Было показано, что ингибирование протеазы аутофагии ATG4B увеличивает общую выживаемость, что позволяет предположить, что ATG4B может быть потенциальной мишенью для терапии рака. Наша лаборатория разработала селективный анализ на основе люциферазы для мониторинга активности ATG4B в клетках. Для этого анализа субстрат ATG4B, LC3B, помечается на С-конце секретируемой люциферазой морского веслоногого рачка Gaussia princeps (GLUC). Этот репортер связан с актиновым цитоскелетом, таким образом, удерживая его в цитоплазме клеток при расщеплении. ATG4B-опосредованное расщепление приводит к высвобождению GLUC путем нетрадиционной секреции, которую затем можно контролировать путем забора надосадочной жидкости из клеточной культуры в качестве коррелята клеточной активности ATG4B. В данной статье представлена адаптация этого анализа на основе люциферазы к автоматизированному высокопроизводительному скринингу. Описан рабочий процесс и оптимизация для примерного высокопроизводительного анализа клеточной активности ATG4B.
Introduction
Аутофагия — это консервативный метаболический процесс, который позволяет клеткам поддерживать внутриклеточный гомеостаз и реагировать на стресс путем разложения старого, дефектного или ненужного клеточного содержимого через лизосомы 1,2,3. При некоторых патофизиологических условиях этот процесс действует как важнейшая клеточная реакция на недостаток питательных веществ и кислорода, что приводит к рециркуляции питательных веществ и липидов, позволяя клеткам адаптироваться к своим метаболическим потребностям 2,3,4. Аутофагия также была идентифицирована как клеточная стрессовая реакция, связанная с несколькими заболеваниями, такими как нейродегенеративные расстройства, патогенные инфекции и различные виды рака. Функция аутофагии при раке сложна и зависит от типа, стадии и состояния опухоли. Он может подавлять опухолегенез путем аутофагической деградации поврежденных клеток, но также может способствовать выживанию прогрессирующих опухолей, улучшая выживаемость клеток во время стрессовых условий, таких как гипоксия, недостаток питательных веществ и цитотоксическое повреждение 2,4,5,6.
Несколько исследований показали, что ингибирование аутофагии обеспечивает преимущества в качестве противоопухолевой стратегии. Таким образом, ингибирование критических этапов, таких как образование аутофагосом или его слияние с лизосомой, может быть эффективным методом борьбы с раком 2,4,5,6. Растущее количество доказательств показало, что ATG4B участвует в определенных патологических состояниях, и он привлек внимание как потенциальная противораковая мишень 2,3,4. Например, было замечено, что клетки колоректального рака и рецептор эпидермального фактора роста человека 2 (HER2)-положительные клетки рака молочной железы имели значительно более высокие уровни экспрессии ATG4B, чем соседние нормальные клетки 2,4. В клетках рака предстательной железы ингибирование ATG4B приводило к специфической для клеточной линии восприимчивости к химиотерапии и лучевой терапии7. В последнее время появились убедительные доказательства того, что протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) особенно уязвима к ингибированию ATG4B. Например, на генетически модифицированной мышиной модели было показано, что периодическая потеря функции ATG4B снижает рост опухоли PDAC и увеличивает выживаемость 3,4. В целом, ATG4B имеет высокую гиперэкспрессию при некоторых типах рака, связан с прогрессированием опухоли и связан с резистентностью к терапии рака 2,4,8.
Цистеиновые протеазы ATG4 у млекопитающих имеют четыре члена семейства, ATG4A-ATG4D. Эти белки проявляют некоторую целевую селективность по отношению к семейству белковLC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 и могут иметь дополнительные функции, не связанные с их протеазной активностью 12,13. Кроме того, ATG4 функционирует в регуляции нового типа посттрансляционной модификации — ATG8-илирования белков11,12. В то время как ATG4B и его основной субстрат LC3B являются наиболее широко изученными, вырисовывается картина, которая предполагает сложную роль каждого члена подсемейства в регуляции аутофагических и неаутофагических процессов. Это также подтверждается сложной сетью посттрансляционных модификаций, которые регулируют активность ATG4B посредством фосфорилирования, ацетилирования, гликозилирования и нитрозилирования 9,10,11,12,13.
Несколько известных ингибиторов ATG4B были опубликованы 2,4,14,15. Несмотря на то, что они пригодны в качестве исследовательских инструментов, их фармакодинамический профиль, селективность или эффективность пока не позволяют разрабатывать их в качестве кандидатов на доклиническую стадию 4,16. В целом, существует острая необходимость в выявлении более мощных и селективных соединений. Часто эти соединения являются хорошими биохимическими ингибиторами функции белка, но их эффективность в клеточных анализах низкая. Существует несколько тестов для мониторинга активности ATG4B, включая биохимические методы и клеточные анализы4. Ранее мы разработали простой, основанный на люминесценции, высокопроизводительный анализ для мониторинга активности ATG4B в клетках 8,17. В этом анализе используется белок люциферазы из Gaussia princeps (GLUC), который стабилен и активен во внеклеточной среде и может быть индуцированно высвобожден из клеток в ответ на протеолитическую активность ATG4B18,19.
В этой репортерной конструкции dNGLUC связан с актиновым цитоскелетом клеток. Между β-актиновым якорем и dNGLUC может быть введен протеаза-специфический линкер, что делает секрецию зависимой от расщепления линкера. Мы использовали полноразмерную открытую рамку считывания LC3B между β-актином и dNGLUC, чтобы иметь возможность контролировать расщепление LC3B17,18,19. Хотя механизм секреции dNGLUC плохо изучен, он специфичен для мониторинга активности ATG4B, не зависит от общей аутофагии, как это происходит в нокаут-клетках ATG5, и опосредован нетрадиционными механизмами, не требующими классического сигнального пептида 4,18,19. Мы успешно использовали этот репортер для скрининга малых молекул и библиотек миРНК, а также идентифицировали новые регуляторы активности ATG4B, такие как протеинкиназыAkt 8. В этой статье описывается подробный протокол использования этого репортера люциферазы в полуавтоматическом формате скрининга с высокой пропускной способностью.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс анализа показан на рисунке 1. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами, реагентами и оборудованием, используемыми в этом протоколе.
1. Производство ретровирусов
ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмидой, кодирующей ActinLC3dNGLUC, является pMOWS-ActinLC3dNGLUC20. Для производства вируса с высоким титром используйте малое число пассажей клеток (в идеале меньше, чем P20).
- Культивирование клеток HEK293T в модифицированной орлиной среде (DMEM) Dulbecco с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина (P/S) при 37 °C во влажном инкубаторе с атмосферой 5%CO2 до их слияния на 80%-90% перед посевом для трансфекции.
- За сутки до трансфекции высевают клетки в 6-луночный планшет с плотностью 1 × 106 клеток/лунку в 2 мл/лунку полной питательной среды. Инкубируют тарелку в течение ночи в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5%СО2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям производителя при использовании реагента для трансфекции на липосомальной основе. Этот протокол описывает использование реагента на нелипосомальной основе. Перед началом трансфекции дайте реагенту для трансфекции ДНК, ДНК и среде уравновеситься до комнатной температуры (~15 мин). - Для каждой трансфекции добавляйте 200 мкл безсывороточной среды в пробирки микроцентрифуги объемом 1,5 мл. В каждую пробирку добавьте следующее количество плазмид: 1 000 нг pMOWS-ActinLC3dNGLUC; 900 нг GagPol; 100 нг VSV-G.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество плазмид и объем среды, указанные здесь, относятся к 12-луночной планшету. При использовании планшета другого типа отрегулируйте объем среды и количество плазмиды для достижения конечной концентрации 5 нг/мкл плазмиды переноса, 4,5 нг/мкл плазмиды упаковки и 0,5 нг/мкл плазмиды оболочки. Используйте любую упаковочную плазмиду, содержащую гены, экспрессирующие gag и pol, и любую плазмиду оболочки, содержащую ген, экспрессирующий VSV-G. - Встряхните флакон с реагентом для трансфекции ДНК в течение 30 с. Пипеткой 4 мкл реагента для трансфекции вводят непосредственно в среду, содержащую разбавленную ДНК. Аккуратно перемешайте, осторожно наклоняя тюбик.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь кончиками к стенкам пластиковых трубок. Не поднимайте и не опускайте пипетки и не вихрите. - Инкубируйте реакцию в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Во время инкубации реакции удалите старую среду из 6-луночного планшета и замените ее 2 мл/лунку свежей среды, не содержащей сыворотки.
- Добавляйте каждый трансфекционный комплекс в каждую лунку по каплям.
- Осторожно встряхните или покрутите пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение по всей поверхности лунки.
- Инкубируют планшет в течение ночи при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5%СО2.
- Через 24 ч старую среду заменить свежей полной средой (2 мл/лунку) и вернуть клетки обратно в увлажненный инкубатор с атмосферой 5%СО2 в течение 72 ч.
- Через 72 ч соберите надосадочную жидкость в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте в течение 10 мин при 4 000 × г при 4 °C для удаления мертвых клеток и мусора. Для дальнейшей очистки используйте большой шприц объемом 60 мл, чтобы пропустить надосадочную жидкость через фильтр 0,20 мкм. Немедленно приготовьте одноразовые аликвоты объемом 300 мкл и храните при температуре -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте цикла замораживания-оттаивания, чтобы поддерживать максимальную активность продукта.
2. Ретровирусная трансдукция
- За день до трансдукции клеток высевают клетки-мишени средней плотности (PANC1 при 1 × 10 5 клеток/лунку) в 12-луночный планшет в 1 мл/лунку среды с добавлением 10% FBS и 1% P/S. Инкубируют планшет в течение ночи при 37 °C в увлажненном инкубаторе с атмосферой5 % CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшая плотность клеток должна быть определена заранее, так как разные типы клеток имеют разную способность к прикреплению. В идеале используйте плотность ячеек для получения 40%-50% слияния. - Извлеките замороженные аликвоты ретровируса из морозильной камеры с температурой -80 °C и разморозьте на льду перед каждым использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не замораживайте повторно неиспользованные аликвоты. - В конической пробирке объемом 50 мл приготовьте смесь вирусной надосадочной жидкости и полибрена в конечной концентрации 8 мкг/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последующие объемы относятся к трансдукции 12-луночного планшета, содержащего конечный объем 500 мкл/лунка. Окончательный объем вирусной надосадочной жидкости может быть оценен путем тестирования ряда вирусных разведений в присутствии полибрена. Можно использовать более высокие или более низкие разведения в зависимости от желаемых уровней экспрессии трансгена и размера используемого сосуда. - Удалите старую среду из 12-луночной пластины и добавьте 500 мкл смеси в каждую лунку. Инкубируют клетки с вирусной надосадочной жидкостью в течение ночи при температуре 37 °C во влажном инкубаторе с атмосферой 5%СО2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите две лунки с полной средой (без вирусной надосадочной жидкости) для использования в качестве контроля для отбора. - Замените вируссодержащую среду свежей полной питательной средой (1 мл/лунку). Поместите клетки обратно в увлажненный инкубатор с атмосферой 5%СО2 на 48 ч.
3. Объединенный отбор и поддержание популяции
- Замените питательную среду селективной средой (полная питательная среда с конечной концентрацией пуромицина 1 мкг/мл). Следите за ростом клеток и меняйте субстратик каждые 2-3 дня. При слиянии расширяют в чашку с 6 лунками, а затем в чашку для культуры тканей диаметром 10 см.
- Держите клетки в селективной среде, по крайней мере, до тех пор, пока контрольные (нетрансдуцированные) клетки полностью не погибнут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения успешных результатов рекомендуется определить оптимальные концентрации пуромицина до начала экспериментального проекта. Для этого постройте кривую убийства пуромицина, чтобы определить минимальную концентрацию, необходимую для уничтожения нетрансдуцированных клеток в период от 3 до 10 дней. - После того, как клетки будут выращены в селекционной среде, разверните клетки на полную питательную среду и заморозьте исходные аликвоты для экспериментального проекта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Запишите номер прохода и избегайте работы с объединенными популяциями из замороженного поголовья с номерами проходов выше пяти. Перед проведением анализа регулярно проверяйте наличие микоплазменного загрязнения. В идеале перед каждым анализом следует использовать свежую партию клеток, чтобы получить максимальный сигнал люциферазы. - Поддерживайте клетки в селективной среде и засейте достаточное количество клеток, чтобы достичь желаемой плотности за день до анализа.
4. Составное сложение
ПРИМЕЧАНИЕ: Библиотека малых молекул Selleckchem состоит примерно из 4000 соединений, расположенных в восемь рядов и 10 столбцов в пятидесяти 96-луночных планшетах с концентрацией 10 мМ в диметилсульфоксиде (ДМСО).
- Эквивалент 30 мкл соединения в соответствующую лунку планшета-источника, совместимого с наноразмерным акустическим дозатором жидкости. Используйте полипропиленовую пластину на 384 лунки (пластина 384PP). Храните эти пластины запечатанными и храните при температуре -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол скрининга, описанный здесь, рассчитан в общей сложности на 10 пробирных планшетов в день; фиксированная концентрация 10 мкМ использовалась в качестве окончательной концентрации анализа вместе с 24-часовым инкубационным периодом. - Разморозьте библиотечные пластины при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что тарелка полностью разморожена и уравновешена до комнатной температуры. Температурный градиент на пластине может повлиять на работу с жидкостью. - Дозируйте 50 нл/лунку в 384-луночный планшет с помощью наноразмерного акустического дозатора жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что выбранные в программе исходные и конечные пластины совпадают с теми, которые использовались для этого шага. - Создайте программу дозирования в электронной таблице.
- Откройте программное обеспечение.
- Откройте новый протокол. На вкладке «Протокол » выберите следующие параметры: Формат образца планшета, 384PP; Тип образца пластины, 384PP_DMSO2; и тип целевой пластины, CellCarrier-384 Ultra PN (Рисунок 2A).
- В разделе Pick List (Список выбора) выберите опцию импорта (рис. 2B), чтобы импортировать электронную таблицу, содержащую программу дозирования (рис. 2C).
- Выберите опцию Run protocol (рисунок 2D), проверьте правильность отображаемой информации и нажмите кнопку Run.
- В новом окне под названием Run status (Состояние выполнения) (рисунок 2E) нажмите Start (Пуск) и следуйте инструкциям, отображаемым в окнах приглашений (Рисунок 2F,G).
5. Посев клеток
- Трипсинизацию клеток из колбы для клеточных культур или чашек Петри для клеточных культур и нейтрализуют трипсин, добавляя ФБС-содержащие среды.
- Переложите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугу при 390 × г на 5 мин при комнатной температуре. Затем осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл полной питательной среды.
- Выполните подсчет ячеек.
- Готовят клеточную суспензию с 4,6 × 107 клеток в 230 мл полной питательной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем и плотность клеток указаны для 10 384-луночных планшетов плюс мертвый объем из двух 384-луночных планшетов. - Дозируют 50 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 384-луночного планшета, приготовленного в разделе 4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Посев клеток можно выполнять как вручную, так и с помощью дозатора сыпучих материалов. - Клетки инкубируют при 37 °С в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5%СО2 в течение 24 ч.
6. Получение клеточной надосадочной жидкости
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая здесь роботизированная платформа для работы с жидкостями выполняет работу с жидкостями с помощью многоканального манипулятора на 96 наконечников. Если автоматизация работы с жидкостями недоступна, протокол можно адаптировать к формату с низкой пропускной способностью с помощью многоканальных пипеток.
- Сконфигурируйте рабочую станцию автоматизации лаборатории, как показано на рисунке 3.
- Поместите одноразовую стопку с 96 наконечниками в положение P1 (Рисунок 3A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая стопка из 96 наконечников состоит из восьми одноразовых стоек. При использовании многоканального манипулятора для 96-луночных наконечников 384-луночный планшет разделен на четыре квадранта. Таким образом, каждой стопки наконечников достаточно для переноса надосадочной жидкости из двух пробирных планшетов в две пустые, сплошные черные 384-луночные планшеты. Весь пакет наконечников необходимо заменять после каждого прогона двух пластин. - Установите пробирные планшеты в положения P2 и P4 (Рисунок 3A).
- Поместите пустые, сплошные черные 384-луночные планшеты в положения P3 и P5 (Рисунок 3A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта гибкая и функциональная роботизированная платформа была адаптирована для этого анализа, и была написана специальная программа (рис. 3B). - Получите подсказки из позиции P1.
- Аспирировать 10 мкл надосадочной жидкости из планшета в положении P2 и перенести в пустую сплошную черную пластину в положении P3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечники должны быть расположены на соответствующей глубине внутри лунок для аспирации надосадочной жидкости, не нарушая монослой клеток на дне лунки. - Опустите наконечники в отходы в положение P6 (Рисунок 3A).
- Повторите шаги 6.5-6.7 для остальных лунок пластины в положении Р2, а затем повторите те же действия для перевода надосадочной жидкости из положения Р4 в положение Р5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно соберите надосадочную жидкость и распределите ее по соответствующим лункам в пустую сплошную черную пластину (Рисунок 3C, D). Поскольку секретируемый dNGLUC очень стабилен в среде клеточной культуры, планшеты можно запечатать и хранить до 7 дней при 4 °C в темноте.
7. Люциферазный анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: dNGLUC, используемый в репортере, демонстрирует кинетику вспышки с быстрым затуханием сигнала. Из-за быстрого затухания люминесценции после добавления субстрата (целентеразина) планшетный ридер должен быть настроен на измерение сигнала люминесценции в надосадочной жидкости; Закачивайте субстрат в лунку и считывайте ее через несколько секунд. По этой причине используйте планшетный считыватель, способный контролировать люминесценцию и оснащенный инжектором подложки, чтобы гарантировать, что время между этапами впрыска и считывания будет одинаковым для всех образцов. Настройки, используемые на считывателе пластин, можно найти на рисунке 4.
- Готовят нативный коэлентеразин в виде исходного раствора 1 мг/мл в подкисленном метаноле (от 10 мкл 3 М HCl до 1 мл метанола).
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте местным рекомендациям по охране труда и технике безопасности при обращении с метанолом в лаборатории и избегайте контакта с кожей. Перед началом анализа приготовьте свежий рабочий раствор субстрата. - Инициализируйте инжекторный насос (Рисунок 5A).
- Промойте трубку деионизированной водой (Рисунок 5B-D).
- Промойте трубку метанолом.
- При промывке трубки приготовьте рабочий раствор субстрата, разбавив субстрат 1:100 (для одной 384-луночной планшета добавьте 220 мкл из исходного раствора субстрата в 21,8 мл 1x фосфатно-солевого буфера [PBS]).
- Промойте насосно-компрессорные трубки рабочим раствором субстрата (рисунок 5B-D).
- Загрузите пластину в считыватель и запустите измерение, используя настройки, описанные на рисунке 4.
- Повторите шаги 7.6-7.7 для всех пробирных планшетов.
- После того, как все пробирные планшеты будут готовы, промойте трубки метанолом.
- Промойте трубку деионизированной водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: В конце этого шага получаются необработанные значения люциферазы, которые коррелируют с клеточной активностью ATG4B. Для нормализации до номеров клеток необходимы следующие шаги, подсчет количества клеток в каждой лунке с помощью флуоресцентной микроскопии.
8. Фиксация и окрашивание клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно выполнить вручную с помощью многоканальной пипетки или с помощью дозатора для сыпучих материалов.
- Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом (в 1x PBS) в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте местным рекомендациям по охране труда и технике безопасности при обращении с параформальдегидом в лаборатории и избегайте контакта с кожей. По возможности выполняйте этот шаг в защитном кожухе. - Постирайте три раза с 1 x PBS.
- Окрасьте ядра препаратом Hoechst 33342, разбавленным 1:5 000 в 1x PBS, в течение 15 минут.
- Постирайте три раза с 1 x PBS.
9. Получение изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте получение изображения с помощью автоматизированного микроскопа. В качестве альтернативы получению изображений для определения количества клеток также может быть определена внутриклеточная активность люциферазы. Существуют преимущества и недостатки в отношении того, нормализуется ли количество клеток или внутриклеточная активность люциферазы, что обсуждается ниже. Мы обнаружили, что определение количества клеток является менее инвазивным и приводит к меньшей вариабельности, чем определение внутриклеточных значений люциферазы.
- Запустите операционное программное обеспечение микроскопа (рисунок 6).
- На вкладке "Настройка " выберите правильный стандартный тип пластины. Если тип пластины не задан, введите размеры пластины вручную.
- Загрузите планшет в микроскоп, нажав на опцию «Извлечь и загрузить ».
- Затем выберите объектив 20x Air (числовая апертура [NA]: 0,4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что воротник объектива установлен на правильное значение, что обеспечивает правильную фокусировку на различных типах пластин. - В разделе «Выбор канала» выберите Hoechst 33342.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки канала по времени, мощности и высоте должны быть оптимизированы в соответствии с типом используемой пластины. - В окне "Определить компоновку" выберите все лунки из пластины и четыре поля из колодки.
- В разделе «Онлайн-задания» выберите соответствующую папку для передачи данных в аналитическое программное обеспечение.
10. Анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Любое программное обеспечение для анализа изображений может быть использовано для сегментации и подсчета клеточных ядер по полученным изображениям. Здесь мы опишем шаги по использованию специального онлайн-программного обеспечения, совместимого с несколькими файлами автоматических микроскопов.
- Запустите программное обеспечение для анализа изображений.
- Перейдите на вкладку Image Analysis , чтобы начать сегментацию изображения (рисунок 7A).
- На вкладке Input Image нажмите на знак + , чтобы добавить новый стандартный блок (рисунок 7A).
- В списке выберите опцию Find Nuclei (рисунок 7A) и выберите Hoechst 33342 в качестве опции канала (рисунок 7B).
- Визуально осмотрите сегментированные объекты на изображении и выберите наиболее точный метод сегментации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента мы использовали метод C (рис. 7C). Каждый вариант метода имеет подкатегории, которые можно настроить для получения наилучшей сегментации. - Затем перейдите на вкладку Define Results (рисунок 7C) и выберите Standard Output в качестве опции Method .
- В подкатегории выберите Nuclei-number of objects и Object count (рисунок 7C).
- Сохраните конвейер анализа с помощью параметра Сохранить анализ на диск или Сохранить анализ в базе данных .
- На вкладке Пакетный анализ выберите данные для анализа из дерева.
- В разделе Метод выберите конвейер анализа, сохраненный на шаге 10.8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно загрузить файл скрипта из-за пределов указанного программного обеспечения или загрузить существующий анализ, сохраненный в базе данных. - Нажмите кнопку Run Analysis , чтобы начать анализ (рисунок 7D). В конце этого рабочего процесса генерируются два набора данных: необработанные значения люциферазы из надосадочной жидкости и номер ячейки в каждой лунке. Используйте оба для нормализации значения люциферазы на клетку.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В предыдущей публикации8 мы успешно использовали этот анализ для скрининга библиотек малых молекул и миРНК и идентифицировали новые регуляторы ATG4B. Здесь мы опишем протокол и репрезентативные результаты этого репортера люциферазы в полуавтоматическом формате скрининга с высокой пропускной способностью. На рисунке 8 показан пример анализа исходных данных как для клеточных ядер, так и для люминесценции. Типичный результат измерения люминесценции изображен на рисунке 8А. Сигнал базальной люминесценции от ДМСО можно увидеть в столбце 1, а в присутствии 10 мкМ ингибитора ATG4B FMK9A в столбце 24. Результат подсчета ядер на той же пластине можно увидеть на рисунке 8B. Исходные значения для каждого соединения были нормализованы до нейтральных контрольных средних значений для получения процента активности ATG4B и выживаемости клеток (рис. 9A,B). Как и ожидалось, большинство соединений не оказывали влияния на активность ATG4B, о чем свидетельствуют значения, близкие к базальной люминесценции из отрицательного контроля (ДМСО - столбец 1). Z'-фактор, являющийся показателем качества высокопроизводительного грохочения, рассчитывали по формуле (1):
Z' = 1 - (3 × 
) (1)
Где STDpos — стандартное отклонение положительного контроля (FMK9a), STDneg — стандартное отклонение отрицательного контроля (DMSO), AVGpos — среднее положительное отклонение положительного контроля, а AVGneg — среднее значение отрицательного контроля.
Для отбора попаданий мы использовали нормализованные значения для вычисления соотношения, которое будет использоваться в качестве порогового значения для идентификации ингибиторов ATG4B. Соотношение рассчитывали путем деления активности ATG4B каждого соединения на жизнеспособность его клеток. Мы посчитали, что соотношения >1 указывают на возможные активаторы ATG4B, а соотношения <1 указывают на возможные ингибиторы ATG4B (рис. 9C). Мы отобрали все соединения со значениями соотношения, близкими к положительному контролю FMK9A, и исключили соединения, которые были цитотоксичными.
На этом экране мы отобрали 53 ингибитора ATG4B, чтобы подтвердить и оценить их активность и токсичность. Соединения были испытаны в 10 концентрациях в виде двукратных разведений в диапазоне от 100 мкМ до 195 нМ. Клетки, обработанные в режиме реакции на концентрацию, позволили подогнать количественные данные и рассчитать значения EC50 . Относительная токсичность ингибиторов количественно оценивалась по данным жизнеспособности клеток. В совокупности эти результаты показали, что такой подход позволяет идентифицировать модуляторы ATG4B.
Рисунок 1: Рабочий процесс анализа. В эксперименте подробно описаны сроки создания стабильной клеточной линии и высокопроизводительный рабочий процесс анализа, начиная с генерации стабильной клеточной линии, скрининга соединений, измерения люциферазы, получения изображений и анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пошаговая инструкция по настройке манипулятора жидкостью. (A) Настройки вкладки «Протокол ». (1) Выберите формат и тип пластины для образца. (2) Выберите тип целевой пластины. (B) Вкладка «Список выбора ». (1) Используйте опцию импорта для импорта электронной таблицы. (C) Окно запроса импорта списка комплектации . (1) Выберите параметры для импорта. (2) Нажмите кнопку Импорт для завершения. (D) Протокол запуска. (1) Нажмите на значок «Выполнить ». (2) Окно запроса, отображающее опцию запуска и запуска протокола. (E) Вкладка «Состояние выполнения ». (1) Запустите протокол. (F) Окно запроса на загрузку исходной пластины. (G) Окно запроса на загрузку целевой таблички. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Конфигурация робота для работы с жидкостями . (A) Конфигурация деки Tecan. (П1) Положение для стека одноразовых наконечников объемом 50 мкл. (П2,П4) Позиции для пробирной пластины. (П3,П5) Позиции для пустых, сплошных черных 384-луночных планшетов. (П6) Положение для утилизации использованных наконечников. (Б) Скриншот сценария анализа. (C) Скриншот деталей аспиратора MAC96. (1) Выберите класс аспирационной жидкости. (2) Введите объем для аспирации. (3) Выберите положение скважины для аспирации. (D) Снимок экрана с деталями дозирования MAC96. (1) Выберите класс дозируемой жидкости. (2) Введите объем для дозирования. (3) Выберите одинаковые положения лунок для дозирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Скриншот настроек считывателя люминесцентных пластин . (A) Вкладка «Настройки измерения ». (1) Выберите диафрагму. (2) Выберите расстояние, время и поправочный коэффициент. (B) Общие настройки протокола. (1) Выберите тип пластины. (2) Выберите режим измерения. (3) Выберите количество пробирных планшетов. (C) Настройки измерения дозирования. (1) Выберите измерение. (2) Установите время измерения. (3) Выберите насос, скорость дозирования и объем. (4) Определите порядок дозирования и повторение пластины. (D) Вкладка «Выбор скважины». (1) Выберите скважины для измерения. (2) Запустите протокол измерения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Скриншот управления дозатором считывателя люминесцентных пластин . (A) Вкладка «Инициализация ». (1) Выберите насос. (2) Запустите насос. (B) Опция протокола полоскания. (1) Выберите опцию полоскания. (2) Нажмите «Далее », чтобы перейти к настройкам. (C) Параметры настроек вкладки «Полоскание ». (1) Выберите насос. (2) Выберите крепление наконечника. (3) Нажмите «Далее », чтобы перейти на следующую вкладку. (D) Вкладка для начала ополаскивания. (1) Нажмите « Пуск », чтобы запустить протокол промывки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Снимок экрана автоматизированного программного обеспечения для обработки изображений с высоким содержанием микроскопа. Подробные сведения о настройках, используемых для получения изображений. (1) Вкладка «Настройка ». (2) Выберите тип пластины. (3) Выберите Извлечь , чтобы загрузить планшет в микроскоп. (4) Выберите цель. (5) Добавьте канал. (6) Выберите папку для передачи данных в программное обеспечение Columbus. (7) Выберите колодцы. (8) Выберите поля. (9) Перейдите на вкладку Запустить эксперимент , чтобы начать получение изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Анализ изображений в онлайн-программном обеспечении. (A) Вкладка «Анализ изображений». (1) Нажмите +, чтобы добавить строительный блок. (2) Выберите опцию «Найти ядра». (B) Найдите настройки Nuclei. (1) Выберите канал. (2) Выберите метод сегментации. (C) Вкладка «Определить результаты». (1) Выберите «Стандартный вывод». (2) Выберите параметр, который будет отображаться в качестве результата. (D) Анализ изображений. (1) Вкладка «Пакетный анализ». (2) Выберите измерение. (3) Выберите метод анализа. (4) Запустите анализ изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Репрезентативные изображения, полученные в результате измерений люциферазы и подсчета ядер. (A) Значения относительной интенсивности люциферазы с 384-луночной пробирной пластины, представленные цифрами и цветами. (Б) Результаты анализа изображений. (1) Тепловая карта количества ядер объектов. (2) Таблица, отображающая результаты по каждой скважине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Репрезентативные результаты после нормализации данных. (A) Репрезентативный процент активности ATG4B после нормализации данных в соответствии со средней активностью ATG4B из скважин с отрицательным контролем (ДМСО) в пределах той же пластины. Активаторы показаны красным цветом, а ингибиторы — синим, при этом белый цвет указывает на отсутствие существенных изменений активности. Отрицательный контроль (ДМСО) находится в столбце 1, а положительный контроль (FMK9A) — в столбце 24. (B) Репрезентативный процент жизнеспособности клеток после нормализации данных до среднего числа клеток из отрицательных контрольных лунок (ДМСО) в пределах одной и той же пластины. Пролиферация показана зеленым цветом, а токсичность — красным, при этом желтый цвет указывает на отсутствие существенных изменений в жизнеспособности клеток. Отрицательный контроль (ДМСО) находится в столбце 1, а положительный контроль (FMK9A) — в столбце 24. (C) Распределение соединений в соответствии со значением соотношения. Каждая точка представляет одно соединение. Соотношение рассчитывали путем деления активности ATG4B на жизнеспособность клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает клеточный анализ репортерных генов для идентификации ингибиторов ATG4B. Идентификация первичных попаданий основана на активности люциферазы при обработке клеток, экспрессирующих полноразмерную открытую рамку считывания LC3B между β-актином и dNGLUC. Некоторые преимущества этого анализа заключаются в том, что он является чувствительным, высококоличественным и неинвазивным, поскольку он может обнаруживать dNGLUC без лизиса клеток. В данной работе представлен подробный протокол генерации стабильной клеточной линии и первичного скрининга. В протоколе есть несколько важных шагов.
Во-первых, в протоколе, описанном здесь, использовалась клеточная линия PANC1, которая обладает высокой эффективностью трансфекции и высокой способностью к пролиферации. Этот метод скрининга может быть выполнен с использованием других клеточных линий, но эффективность трансдукции может варьироваться от одной клеточной линии к другой. Во-вторых, следует избегать работы со стабильными клеточными популяциями из замороженных популяций с числом пассажа выше пяти, так как уровни экспрессии репортера могут со временем снижаться. В-третьих, важно использовать свежую партию клеток перед каждым анализом, чтобы получить максимальный и последовательный сигнал люциферазы в разных экспериментах. В-четвертых, при засеивании клеток, вручную или с помощью дозатора сыпучих материалов, суспензию клеток необходимо постоянно перемешивать для достижения однородной плотности клеток по всей пластине. В-пятых, при заборе надосадочной жидкости из лунки важно, чтобы наконечники располагались на соответствующей глубине внутри лунок для аспирации надосадочной жидкости, не нарушая монослой клеток на дне лунки. Наконец, рабочий раствор субстрата должен быть приготовлен в день анализа. Целетестазин очень чувствителен к свету и подвержен окислению, и есть некоторые сообщения о быстром распаде субстрата после приготовления.
Существует ряд клеточных анализов для изучения последствий ингибирования или активации ATG4B, но изучение клеточной активности ATG4Bостается ограниченным. Этот метод является неинвазивным, высокочувствительным, надежным и напрямую зависит от активности ATG4B, так как его активность приводит к высвобождению dNGLUC. Описанный протокол прост и требует всего лишь короткого времени для скрининга 10 384-луночных планшетов. Еще одним преимуществом метода является то, что его можно использовать для мониторинга активности ATG4B in vivo, поскольку dNGLUC обладает высокой стабильностью и может быть измерен ex vivo по сыворотке крови.
Несмотря на то, что мы успешно использовали этот репортер для скрининга библиотек малых молекул и миРНК и идентифицировали новые регуляторы активности ATG4B, в этом протоколе необходимо учитывать несколько ограничений. Во-первых, описанный клеточный анализ опирается на репортерное считывание, которое косвенно отражает изменения активности ATG4B, позволяя обнаруживать как ингибиторы, так и активаторы активности ATG4B. Поэтому хиты должны пройти дальнейшую оценку, чтобы подтвердить их специфичность и активность. Кроме того, ингибиторы должны быть дополнительно оценены с точки зрения их способности регулировать пространственное распределение LC3 в клетках или других белков, связанных с аутофагией. Во-вторых, несмотря на то, что этот анализ может быть легко модифицирован в менее масштабный анализ из-за простоты обработки и анализа данных, он требует определенной степени автоматизации для добавления подложки и последующего измерения люминесценции. В-третьих, поскольку механизм высвобождения dNGLUC плохо изучен на молекулярном уровне, соединения, интерферирующие с элементами пути секреции, могут влиять на результаты. Наконец, жизнеспособность клеток также может быть определена внутриклеточной активностью люциферазы. Хотя мы обнаружили, что определение количества клеток является менее инвазивным и приводит к меньшей вариабельности, чем определение внутриклеточных значений люциферазы, определение количества клеток ограничивает их использование в небольших исследовательских лабораториях, поскольку они представляют трудности с точки зрения оборудования для визуализации, программного обеспечения для анализа данных и хранения данных. В целом, разработанный клеточный анализ репортерных генов позволяет идентифицировать ингибиторы ATG4B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана основным финансированием Совета по медицинским исследованиям Великобритании в рамках гранта MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, гранта MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (ссылка на грант 2018RIF_15) и схемы поддержки терапевтического ускорения UCL при финансовой поддержке MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Плазмида, кодирующая ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC), была получена у доктора Робина Кеттелера (Robin Ketteler) (Факультет медицины человека, Берлинская медицинская школа).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al.
- Towers, C. G., Thorburn, A.
- Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
- Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A.
- Kimmelman, A. C., White, E.
- Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
- Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
- Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
- Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
- Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
- Ketteler, R., Tooze, S. A.
- Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
- Fernández, ÁF., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
- Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
- Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
- Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
- Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).
