Summary
여기에서는 반자동 고처리량 스크리닝 형식으로 루시페라아제 기반 리포터 분석을 사용하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
높은 자가포식 플럭스가 종양 진행 및 암 치료 내성과 관련이 있다는 증거가 늘어나고 있습니다. 개별 자가포식 단백질을 분석하는 것은 이 경로를 표적으로 하는 치료 전략의 전제 조건입니다. 자가포식 프로테아제 ATG4B의 억제는 전체 생존율을 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 ATG4B가 암 치료의 잠재적인 약물 표적이 될 수 있음을 시사합니다. 우리 실험실은 세포에서 ATG4B 활성을 모니터링하기 위한 선택적 루시페라아제 기반 분석을 개발했습니다. 이 분석을 위해 ATG4B, LC3B의 기질은 해양 요각류 Gaussia princeps(GLUC)의 비밀 루시페라아제로 C-말단에 태그됩니다. 이 리포터는 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)에 연결되어 있어, 세포가 없어졌을 때 세포의 세포질에 보관되어 있다. ATG4B 매개 절단은 비전통적 분비에 의해 GLUC의 방출을 초래하며, 세포 ATG4B 활성의 상관 관계로서 세포 배양에서 상층액을 수확하여 모니터링할 수 있습니다. 이 논문은 이 루시페라아제 기반 분석법을 자동화된 고처리량 스크리닝에 적용하는 방법을 제시합니다. 세포 ATG4B 활성의 모범적인 고처리량 분석을 위한 워크플로우 및 최적화에 대해 설명합니다.
Introduction
자가포식은 세포가 세포 내 항상성을 유지하고 리소좀 1,2,3을 통해 노화되거나 결함이 있거나 불필요한 세포 내용물을 분해하여 스트레스에 반응할 수 있도록 하는 보존된 대사 과정입니다. 일부 병태생리학적 조건에서 이 과정은 영양소 및 산소 결핍에 대한 중요한 세포 반응으로 작용하여 재활용된 영양소와 지질을 생성하여 세포가 대사 요구에 적응할 수 있도록 합니다 2,3,4. 자가포식은 또한 신경퇴행성 질환, 병원체 감염 및 다양한 유형의 암과 같은 여러 질병과 관련된 세포 스트레스 반응으로 확인되었습니다. 암에서 자가포식의 기능은 복잡하며 종양의 유형, 병기 및 상태에 따라 달라집니다. 손상된 세포의 자가포식 분해를 통해 종양 형성을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 저산소증, 영양 결핍 및 세포독성 손상과 같은 스트레스 조건에서 세포 생존을 개선하여 진행성 종양의 생존을 촉진할 수 있습니다 2,4,5,6.
여러 연구에 따르면 자가포식 억제는 항암 전략으로 이점을 제공합니다. 따라서, 자가포식체 형성 또는 리소좀과의 융합과 같은 중요한 단계의 억제는 암 조절을 위한 효과적인 방법이 될 수 있다 2,4,5,6. ATG4B가 특정 병리학적 상태에 관여한다는 증거가 늘어나고 있으며, 잠재적인 항암 표적 2,3,4로 주목받고 있습니다. 예를 들어, 대장암 세포와 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2) 양성 유방암 세포는 인접한 정상 세포보다 ATG4B 발현 수준이 유의하게 높은 것으로 관찰되었습니다 2,4. 전립선암 세포에서 ATG4B의 억제는 화학요법 및 방사선요법에 대한 세포주 특이적 감수성을 초래했다7. 최근 췌관 선암(PDAC)이 ATG4B 억제에 특히 취약하다는 강력한 증거가 나타났습니다. 예를 들어, 유전자 조작 마우스 모델에서 ATG4B 기능의 간헐적 손실은 PDAC 종양 성장을 감소시키고 생존을 증가시키는 것으로 나타났습니다 3,4. 전반적으로, ATG4B는 일부 암 유형에서 매우 과발현되고, 종양의 진행과 관련이 있으며, 암 치료 내성과 관련이 있다 2,4,8.
포유류의 ATG4 시스테인 프로테아제에는 ATG4A-ATG4D의 4가지 가족 구성원이 있습니다. 이들 단백질은 단백질 9,10,11의 LC3/GABARAP (ATG8) 계열에 대해 일부 표적 선택성을 나타내며 이들의 프로테아제 활성과 연결되지 않은 추가 기능을 가질 수 있다12,13. 또한, ATG4는 새로운 유형의 번역 후 변형, 단백질11,12의 ATG8-ylation을 조절하는 기능을 합니다. ATG4B와 그 주요 기질 LC3B가 가장 널리 연구되고 있지만, 자가포식 및 비자가포식 과정의 조절에서 각 아과 구성원에 대한 복잡한 역할을 시사하는 그림이 나타나고 있습니다. 이는 인산화(phosphorylation), 아세틸화(acetylation), 글리코실화(glycosylation) 및 니트로실화(nitrosylation) 9,10,11,12,13을 통해 ATG4B 활성을 조절하는 번역 후 변형(post-translational modification)의 복잡한 네트워크에 의해 더욱 확증된다.
여러 가지 알려진 ATG4B 억제제가발표되었습니다 2,4,14,15. 이들은 연구 도구로 적합하지만 약력학적 프로파일, 선택성 또는 효능으로 인해 아직 전임상 후보 물질로 개발되지 못했습니다 4,16. 전반적으로, 더 강력하고 선택적인 화합물을 식별하는 것이 시급합니다. 종종 화합물은 단백질 기능의 우수한 생화학적 억제제이지만 세포 기반 분석에서는 효능이 좋지 않습니다. ATG4B 활성을 모니터링하기 위한 여러 분석법이 있으며, 여기에는 생화학적 방법과 세포 기반 분석법이포함된다 4. 우리는 이전에 세포 8,17에서 ATG4B 활성을 모니터링하기 위한 간단한 발광 기반 고처리량 분석을 개발했습니다. 이 분석법은 세포외 환경에서 안정적이고 활성이 높으며 ATG4B 단백질 분해 활성에 반응하여 세포에서 유도적으로 방출될 수 있는 가우시아 프린셉스(GLUC)의 루시페라아제 단백질을 사용합니다18,19.
이 리포터 구조에서 dNGLUC는 세포의 액틴 세포골격에 연결되어 있습니다. 프로테아제 특이적 링커는 β-actin anchor와 dNGLUC 사이에 도입될 수 있으며, 링커의 절단에 따라 분비물을 전환할 수 있습니다. LC3B 절단17,18,19를 모니터링할 수 있도록 β-actin과 dNGLUC 사이에 있는 LC3B의 전체 길이 개방 판독 프레임을 사용했습니다. dNGLUC의 분비 메커니즘은 잘 알려져 있지 않지만 ATG4B 활성을 모니터링하는 데 특이적이며 ATG5 녹아웃 세포에서 발생하기 때문에 전체 자가포식에 의존하지 않으며 고전적인 신호 펩타이드 4,18,19를 필요로 하지 않는 비전통적인 메커니즘에 의해 매개됩니다. 우리는 이 리포터를 사용하여 저분자 및 siRNA 라이브러리를 성공적으로 스크리닝했으며 Akt 단백질 키나아제8과 같은 ATG4B 활성의 새로운 조절자를 식별했습니다. 이 논문은 이 루시페라아제 리포터를 반자동, 고처리량 스크리닝 형식으로 사용하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.
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Protocol
참고: 분석 프로세스는 그림 1에 요약되어 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 장비와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 레트로바이러스 생산
참고: ActinLC3dNGLUC를 인코딩하는 플라스미드는 pMOWS-ActinLC3dNGLUC20입니다. 높은 titer 바이러스 생산을 위해 적은 수의 세포를 사용합니다(이상적으로는 P20 미만).
- 형질주입을 위해 파종하기 전에 80%-90%가 합류할 때까지 5%CO2 의 분위기에서 37°C에서 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 보충된 Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 세포를 배HEK293T양합니다.
- transfection 전날, 세포를 1 × 10 6 세포/웰의 2mL/웰 밀도로6 웰 플레이트에 시드합니다. 5 % CO2 분위기의 가습 인큐베이터에서 플레이트를 밤새 배양합니다.
알림: 리포솜 기반 transfection 시약을 사용하는 경우 제조업체의 지침을 따르십시오. 이 프로토콜은 비리포솜 기반 시약의 사용에 대해 설명합니다. transfection을 시작하기 전에 DNA transfection 시약, DNA 및 배지가 실온(~15분)과 평형을 이루도록 합니다. - 각 transfection에 대해 200μL의 무혈청 배지를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 각 튜브에 다음과 같은 양의 플라스미드를 추가합니다: 1,000 ng의 pMOWS-ActinLC3dNGLUC; 900ng의 GagPol; 100ng의 VSV-G.
참고: 여기에 나열된 플라스미드의 양과 배지의 양은 12-well plate에 대한 것입니다. 다른 플레이트 타입을 사용하는 경우, 배지 부피와 플라스미드 양을 조절하여 최종 농도인 5 ng/μL의 transfer plasmid, 4.5 ng/μL의 packing plasmid, 0.5 ng/μL의 envelope plasmid에 도달합니다. gag- 및 pol-발현 유전자를 포함하는 패킹 플라스미드와 VSV-G 발현 유전자를 포함하는 envelope plasmid를 사용합니다. - DNA transfection 시약 바이알을 30초 동안 소용돌이칩니다. transfection 시약 4μL를 희석된 DNA가 들어 있는 배지에 직접 피펫팅합니다. 튜브를 부드럽게 기울여 부드럽게 섞습니다.
알림: 팁으로 플라스틱 튜브의 벽을 만지지 마십시오. 위아래로 피펫팅하거나 소용돌이치지 마십시오. - 실온에서 15분 동안 반응을 배양합니다.
- 반응을 배양하는 동안 6웰 플레이트에서 기존 배지를 제거하고 2mL/웰의 새로운 무혈청 배지로 교체합니다.
- 각 transfection complex를 각 웰에 적하 방식으로 추가합니다.
- 전체 웰 표면에 고르게 분포되도록 플레이트를 부드럽게 흔들거나 휘젓습니다.
- 5 % CO 2 분위기의 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 밤새 플레이트를 배양합니다.
- 24시간 후 기존 배지를 새로운 완전 배지(2mL/웰)로 교체하고 세포를 72시간 동안 5% CO2 분위기의 가습 인큐베이터로 되돌립니다.
- 72시간 후 50mL 원뿔형 튜브에서 상층액을 수확하고 4°C에서 4,000× g 으로 10분 동안 원심분리하여 죽은 세포와 부스러기를 제거합니다. 추가 정제를 위해 대형 60mL 주사기를 사용하여 상층액을 0.20μm 필터에 통과시킵니다. 즉시 300μL의 일회용 부분 표본을 준비하고 -80°C에서 보관합니다.
알림: 최대 제품 활동을 유지하기 위해 동결-해동 주기를 피하십시오.
2. 레트로바이러스 형질도입
- 세포를 형질도입하기 전날, 10% FBS 및 1% P/S가 보충된 1mL/웰의 배지에 있는 12웰 플레이트에 중간 밀도(1 × 105 세포/웰에서 PANC1)로 표적 세포를 시드합니다.
알림: 세포 유형에 따라 부착 능력이 다르기 때문에 최상의 세포 밀도를 미리 설정해야 합니다. 이상적으로는 세포 밀도를 사용하여 40%-50% 밀도를 얻습니다. - -80°C 냉동실에서 냉동된 레트로바이러스 부분 표본을 제거하고 매번 사용하기 전에 얼음에서 해동하십시오.
알림: 사용하지 않은 부분 표본을 다시 얼리지 마십시오. - 50mL 원뿔형 튜브에 바이러스 상청액과 폴리브렌의 혼합물을 최종 농도 8μg/mL로 준비합니다.
참고: 후속 부피는 500μL/웰의 최종 부피를 포함하는 12웰 플레이트의 transduction에 적용됩니다. 최종 바이러스 상층액 부피는 폴리브렌이 있는 상태에서 다양한 바이러스 희석액을 테스트하여 추정할 수 있습니다. 더 높거나 더 낮은 희석액은 전이유전자의 원하는 발현 수준 및 사용되는 용기의 크기에 따라 사용될 수 있다. - 12웰 플레이트에서 기존 배지를 제거하고 혼합물 500μL를 각 웰에 추가합니다. 5 % CO 2 분위기의 가습 된 인큐베이터에서 37 ° C에서 밤새 바이러스 상청액으로 세포를 배양합니다.
알림: 선택을 위한 대조군으로 사용하기 위해 완전한 배지(바이러스 상층액 없음)가 있는 두 개의 웰을 보관하십시오. - 바이러스 함유 배지를 신선한 완전 성장 배지(1mL/웰)로 교체합니다. 세포를 5 % CO2 분위기의 가습 인큐베이터에 48 시간 동안 다시 놓습니다.
3. 공동 인구 선택 및 유지
- 성장 배지를 선택 배지(최종 농도가 1μg/mL puromycin인 완전 성장 배지)로 교체합니다. 세포의 성장을 모니터링하고 2-3일마다 선택 배지를 교체합니다. 합류 지점에서 6웰 접시로 확장한 다음 직경 10cm의 조직 배양 접시로 확장합니다.
- 적어도 대조군(형질도입되지 않은) 세포가 완전히 죽는 데 걸리는 시간 동안 세포를 선택 배지에 보관합니다.
참고: 성공적인 결과를 얻으려면 실험 프로젝트를 시작하기 전에 최적의 퓨로마이신 농도를 결정하는 것이 좋습니다. 이를 위해 3일에서 10일 사이에 형질도입되지 않은 세포를 죽이는 데 필요한 최소 농도를 결정하기 위해 puromycin kill curve를 생성합니다. - 세포가 선택 배지에서 성장하면 완전한 성장 배지에서 세포를 확장하고 실험 프로젝트를 위해 재고 부분 표본을 동결합니다.
알림: 통로 번호를 기록하고 통로 번호가 5보다 높은 냉동 재고에서 풀링된 모집단으로 작업하지 마십시오. 분석을 수행하기 전에 마이코플라스마 오염 여부를 정기적으로 확인하십시오. 이상적으로는 루시페라아제의 최대 신호를 얻기 위해 각 분석 전에 새로운 세포 배치를 사용하는 것이 좋습니다. - 세포를 선택 배지에 유지하고 분석 전날 원하는 밀도에 도달할 수 있도록 충분한 세포를 파종합니다.
4. 화합물 첨가
참고: Selleckchem 소분자 라이브러리는 디메틸설폭사이드(DMSO)의 스톡 농도가 10mM인 50개의 96웰 플레이트에 8개의 행과 10개의 컬럼으로 배열된 약 4,000개의 화합물로 구성되어 있습니다.
- 30μL의 화합물을 나노 크기의 음향 액체 디스펜서와 호환되는 소스 플레이트의 적절한 웰에 분취합니다. 384웰 폴리프로필렌 플레이트(384PP 플레이트)를 사용합니다. 이 플레이트를 밀봉하고 -20°C에서 보관하십시오.
참고: 여기에 설명된 스크리닝 프로토콜은 하루에 총 10개의 분석 플레이트에 대한 것입니다. 10μM의 고정 농도를 24시간 배양 기간과 함께 최종 분석 농도로 사용했습니다. - 복합 라이브러리 플레이트를 실온에서 해동합니다.
알림: 플레이트가 완전히 해동되고 실온과 평형을 이루는지 확인하십시오. 플레이트 전체의 온도 구배는 액체 취급에 영향을 미칠 수 있습니다. - 나노 크기의 음향 액체 디스펜서를 사용하여 50nL/웰을 384웰 분석 플레이트에 분주합니다.
알림: 프로그램에서 선택한 소스 및 대상 플레이트가 이 단계에 사용된 플레이트와 일치하는지 확인하십시오. - 스프레드시트에서 디스펜싱 프로그램을 만듭니다.
- 소프트웨어를 엽니다.
- 새 프로토콜을 엽니다. 프로토콜 탭에서 다음 옵션을 선택합니다. 샘플 플레이트 형식, 384PP; 샘플 플레이트 유형, 384PP_DMSO2; 및 대상 플레이트 유형, CellCarrier-384 Ultra PN (그림 2A).
- 선택 목록에서 가져오기 옵션(그림 2B)을 선택하여 디스펜싱 프로그램이 포함된 스프레드시트를 가져옵니다(그림 2C).
- Run protocol(실행 프로토콜) 옵션(그림 2D)을 선택하고 표시된 정보가 올바른지 확인한 다음 Run(실행)을 클릭합니다.
- Run status(실행 상태)라는 새 창(그림 2E)에서 Start(시작)를 클릭하고 프롬프트 창(그림 2F,G)에 표시된 단계를 따릅니다.
5. 세포 파종
- 세포 배양 플라스크 또는 세포 배양 페트리 접시에서 세포를 트립신화하고 FBS 함유 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다.
- 셀 현탁액을 50mL 코니컬 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 390× g 으로 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 부드럽게 제거하고 세포 펠릿을 10mL의 완전한 성장 배지에 재현탁시킵니다.
- 셀 카운팅을 수행합니다.
- 230mL의 완전한 배양 배지에 4.6 × 107 세포로 세포 현탁액을 준비합니다.
참고: 이 부피 및 세포 밀도는 10x 384웰 분석 플레이트와 2개의 384웰 플레이트의 데드 부피에 대한 것입니다. - 섹션 4에서 준비한 384웰 분석 플레이트의 각 웰에 50μL의 세포 현탁액을 분주합니다.
알림: 세포 파종은 수동으로 또는 벌크 디스펜서를 사용하여 수행할 수 있습니다. - 37°C에서 5%CO2 분위기의 가습 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
6. 세포 상층액 수확
알림: 여기에 사용된 액체 처리 로봇 플랫폼은 96팁용 다중 채널 암으로 액체 처리를 수행합니다. 액체 취급 자동화를 사용할 수 없는 경우, 멀티채널 피펫을 사용하여 프로토콜을 저처리량 형식으로 조정할 수 있습니다.
- 그림 3과 같이 실험실 자동화 워크스테이션의 데크를 구성합니다.
- 일회용 96팁 스택을 P1 위치에 놓습니다(그림 3A).
참고: 각 96팁 스택은 8개의 일회용 랙으로 구성됩니다. 96-팁에 멀티채널 암을 사용할 때 384웰 플레이트는 4개의 사분면으로 나뉩니다. 따라서 각 팁 스택은 2개의 분석 플레이트에서 2개의 빈 솔리드 블랙 384웰 플레이트로 상층액을 이송하기에 충분합니다. 전체 팁 스택은 두 개의 플레이트를 실행할 때마다 교체해야 합니다. - 분석 플레이트를 P2 및 P4 위치에 놓습니다(그림 3A).
- 비어 있는 검은색 솔리드 384웰 플레이트를 P3 및 P5 위치에 놓습니다(그림 3A).
참고: 이 유연하고 유능한 로봇 플랫폼은 이 분석에 맞게 조정되었으며 특수 프로그램이 작성되었습니다(그림 3B). - 위치 P1에서 팁을 가져옵니다.
- 위치 P2 의 플레이트에서 상층액 10μL를 흡입하고 위치 P3의 빈 검은색 솔리드 플레이트로 옮깁니다.
알림: 팁은 웰 바닥의 세포 단층을 방해하지 않고 상층액을 흡입할 수 있도록 웰 내부의 적절한 깊이에 위치해야 합니다. - 팁을 P6 위치에 버리십시오(그림 3A).
- 위치 P6.5에 있는 플레이트의 나머지 웰에 대해 6.7-2단계를 반복한 다음 동일한 단계를 반복하여 상층액을 위치 P4에서 위치 P5로 옮깁니다.
알림: 상층액을 수집하고 해당 웰에서 비어 있는 검은색 솔리드 플레이트에 분배해야 합니다(그림 3C,D). 분비된 dNGLUC는 세포 배양 배지에서 매우 안정적이기 때문에 플레이트를 밀봉하고 어두운 곳에서 4°C에서 최대 7일 동안 보관할 수 있습니다.
7. 루시페라아제 분석
알림: 리포터에 사용된 dNGLUC는 빠른 신호 감쇠와 함께 플래시 역학을 나타냅니다. 기판(코엘렌테라진)을 첨가한 후 발광이 급격히 감소하기 때문에 플레이트 판독기는 상층액의 발광 신호를 측정하도록 설정해야 합니다. 기질을 웰에 주입하고 몇 초 후에 웰을 읽으십시오. 이러한 이유로, 발광을 모니터링할 수 있고 기판 주입기가 장착된 플레이트 리더를 사용하여 주입과 판독 단계 사이의 시간이 모든 샘플에 대해 균일하도록 합니다. 플레이트 리더에 사용되는 설정은 그림 4에서 찾을 수 있습니다.
- 산성화된 메탄올(10μL의 3M HCl 내지 1mL의 메탄올)에 1mg/mL 원액으로서 천연 코엘렌테라진을 준비한다.
알림: 실험실에서 메탄올 취급에 관한 현지 건강 및 안전 지침을 따르고 피부와의 접촉을 피하십시오. 분석을 시작하기 전에 새로운 작업 기질 용액을 준비합니다. - 인젝터 펌프를 초기화합니다(그림 5A).
- 튜브를 탈이온수로 헹굽니다(그림 5B-D).
- 튜브를 메탄올로 헹굽니다.
- 튜브를 헹구는 동안 기판을 1:100으로 희석하여 작업 기판 용액을 준비합니다(384웰 플레이트 1개의 경우 기판 스톡 용액에서 220μL를 1x 인산염 완충 식염수[PBS] 21.8mL에 추가).
- 기판 작업 용액으로 튜브를 헹굽니다(그림 5B-D).
- 플레이트를 리더에 로드하고 그림 4에 설명된 설정을 사용하여 측정을 시작합니다.
- 모든 분석 플레이트에 대해 7.6-7.7단계를 반복합니다.
- 모든 분석 플레이트가 완료되면 튜브를 메탄올로 헹굽니다.
- 탈이온수로 튜브를 헹굽니다.
참고: 이 단계가 끝나면 세포 ATG4B 활성과 상관 관계가 있는 원시 루시페라아제 값이 얻어집니다. 세포 수를 정규화하려면 형광 현미경으로 각 웰의 세포 수를 계산하여 다음 단계가 필요합니다.
8. 세포 고정 및 염색
참고: 이 단계는 멀티채널 피펫을 사용하거나 벌크 디스펜서를 사용하여 수동으로 수행할 수 있습니다.
- 4% 파라포름알데히드(1x PBS)로 세포를 15분 동안 고정합니다.
알림: 실험실에서 파라포름알데히드 취급에 관한 현지 건강 및 안전 지침을 따르고 피부와의 접촉을 피하십시오. 가능하면 안전 후드에서 이 단계를 수행하십시오. - 1x PBS로 세 번 세척하십시오.
- 15분 동안 1x PBS에서 1:5,000으로 희석한 Hoechst 33342로 핵을 염색합니다.
- 1x PBS로 세 번 세척하십시오.
9. 이미지 취득
참고: 자동 현미경을 사용하여 이미지 획득을 수행합니다. 세포 수를 결정하기 위한 이미지 획득의 대안으로, 세포 내 루시페라아제 활성도 측정할 수 있습니다. 세포 수 또는 세포 내 루시페라아제 활성으로 정규화되는지 여부와 관련하여 장점과 단점이 있으며, 이에 대해서는 아래에서 설명합니다. 세포 수를 측정하는 것이 세포 내 루시페라아제 값을 측정하는 것보다 덜 침습적이고 변동성이 낮다는 것을 발견했습니다.
- 현미경 작동 소프트웨어를 시작합니다(그림 6).
- 설정 탭에서 올바른 사전 정의된 플레이트 유형을 선택합니다. 플레이트 유형이 사전 설정되지 않은 경우 플레이트 치수를 수동으로 입력합니다.
- Eject and Load 옵션을 클릭하여 플레이트를 현미경에 로드합니다.
- 그런 다음 20x 공기(개구수[NA]: 0.4) 대물렌즈를 선택합니다.
알림: 대물렌즈 칼라 가 올바른 값으로 설정되어 있는지 확인하여 다양한 플레이트 유형에 적절한 초점을 맞출 수 있습니다. - 채널 선택에서 Hoechst 33342를 선택합니다.
알림: 시간, 전력 및 높이에 대한 채널 설정은 사용하는 플레이트 유형에 따라 최적화되어야 합니다. - 레이아웃 정의(Define Layout)에서 플레이트의 모든 웰을 선택하고 웰에서 4개의 필드를 선택합니다.
- 온라인 작업에서 해당 폴더를 선택하여 데이터를 분석 소프트웨어로 전송합니다.
10. 이미지 분석
참고: 모든 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지에서 세포핵을 분할하고 계수할 수 있습니다. 여기에서는 여러 자동 현미경 파일과 호환되는 특정 온라인 소프트웨어를 사용하는 단계를 설명합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 실행합니다.
- Image Analysis(이미지 분석) 탭으로 이동하여 이미지 분할을 시작합니다(그림 7A).
- 입력 이미지 탭에서 + 기호를 클릭하여 새 빌딩 블록을 추가합니다(그림 7A).
- 목록에서 Find Nuclei 옵션(그림 7A)을 선택하고 채널 옵션으로 Hoechst 33342를 선택합니다(그림 7B).
- 영상에서 분할된 객체를 육안으로 검사하고 가장 정확한 분할 방법을 선택합니다.
참고: 이 실험에서는 방법 C를 사용했습니다(그림 7C). 각 방법 옵션에는 가능한 최상의 분할을 얻기 위해 조정할 수 있는 하위 범주가 있습니다. - 그런 다음 Define Results 탭(그림 7C)을 클릭하고 Method 옵션으로 Standard Output을 선택합니다.
- 하위 범주에서 Nuclei-number of objects 및 Object count 를 선택합니다(그림 7C).
- 디스크에 분석 저장(Save analysis to Disk) 또는 데이터베이스에 분석 저장(Save analysis to Database) 옵션을 사용하여 분석 파이프라인을 저장합니다.
- 배치 분석 탭의 트리에서 분석 할 데이터를 선택합니다.
- 방법(Method)에서 10.8단계에서 저장한 분석 파이프라인을 선택합니다.
참고: 참조된 소프트웨어 외부에서 스크립트 파일을 업로드하거나 데이터베이스에 저장된 기존 분석을 업로드할 수도 있습니다. - Run Analysis(분석 실행)를 클릭하여 분석을 시작합니다(그림 7D). 이 워크플로우가 끝나면 상층액의 원시 루시페라아제 값과 각 웰의 세포 수라는 두 개의 데이터 세트가 생성됩니다. 둘 다 사용하여 셀당 루시페라아제 값을 정규화합니다.
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Representative Results
이전 간행물8에서 이 분석을 사용하여 저분자 및 siRNA 라이브러리를 스크리닝하고 ATG4B의 새로운 조절자를 식별하는 데 성공했습니다. 여기에서는 이 루시페라아제 리포터의 프로토콜과 대표 결과를 반자동 고처리량 스크리닝 형식으로 설명합니다. 그림 8은 세포핵과 발광에 대한 원시 데이터 분석의 예를 보여줍니다. 발광 측정의 일반적인 결과는 그림 8A에 나와 있습니다. DMSO의 기저 발광 신호는 컬럼 1에서 볼 수 있으며, 컬럼 24에서 ATG4B 억제제 FMK9A의 10μM이 있는 경우 볼 수 있습니다. 동일한 플레이트의 핵 수 결과는 그림 8B에서 볼 수 있습니다. 각 화합물에 대한 원시 값을 중성 대조군 평균값으로 정규화하여 ATG4B 활성 및 세포 생존율의 백분율을 얻었습니다(그림 9A,B). 예상대로, 대부분의 화합물은 음성 대조군의 기초 발광에 가까운 값으로 표시된 바와 같이 ATG4B 활성에 영향을 미치지 않았습니다(DMSO - 열 1). 고처리량 스크리닝을 위한 품질 지수인 Z' 계수는 방정식 (1)을 사용하여 계산되었습니다.
Z' = 1 - (3 × 
) (1)
여기서 STDpos는 양성 대조군(FMK9a)의 표준편차이고, STDneg는 음성 대조군(DMSO)의 표준편차이며, AVGpos는 양성 대조군의 평균이고, AVGneg는 음성 대조군의 평균입니다.
적중을 선택하기 위해 정규화된 값을 사용하여 ATG4B 억제제 식별을 위한 컷오프 값으로 사용할 비율을 계산했습니다. 비율은 각 화합물의 ATG4B 활성을 세포 생존율로 나누어 계산했습니다. 비율 >1은 가능한 ATG4B 활성제를, 비율 <1은 가능한 ATG4B 억제제를 나타낸다고 생각했다(그림 9C). 양성 대조군 FMK9A와 유사한 비율 값을 가진 모든 화합물을 선택하고 세포독성이 있는 화합물은 제외했습니다.
이 화면에서는 53개의 ATG4B 억제제를 선별하여 활성과 독성을 확인하고 평가했습니다. 화합물은 100μM에서 195nM 범위의 2중 희석액으로 10가지 농도에서 테스트되었습니다. 농도 반응 방식으로 처리된 세포는 정량화된 데이터를 피팅하고 EC50 값을 계산할 수 있었습니다. 억제제의 상대적 독성은 세포 생존율 데이터에 의해 정량화되었습니다. 종합하면, 이러한 결과는 이 접근 방식이 ATG4B 변조기를 식별할 수 있음을 보여주었습니다.
그림 1: 분석 워크플로우. 이 실험은 안정적인 세포주 생성, 화합물 스크리닝, 루시페라아제 측정, 이미지 획득 및 데이터 분석부터 시작하여 안정적인 세포주 생성 및 고처리량 분석 워크플로우를 위한 타임라인을 자세히 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 액체 처리기 설정에 대한 단계별 지침 . (ᅡ) 프로토콜 탭 설정. (1) 샘플 플레이트 형식 및 유형을 선택합니다. (2) 대상 플레이트 유형을 선택합니다. (B) 피킹 리스트 탭. (1) 가져오기 옵션을 사용하여 스프레드시트를 가져옵니다. (C) 피킹 목록 가져오기 프롬프트 창. (1) 가져올 파라미터를 선택합니다. (2) [가져오기 ]를 클릭하여 결론을 내립니다. (D) 실행 중인 프로토콜. (1) Run 아이콘을 클릭합니다. (2) 실행 옵션을 표시하고 프로토콜 실행을 시작하는 프롬프트 창. (E) 실행 상태 탭. (1) 프로토콜을 시작합니다. (F) 소스 플레이트를 로드하기 위한 프롬프트 창. (G) 대상 플레이트를 로드하기 위한 프롬프트 창. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 액체 처리 로봇의 구성. (A) Tecan 데크의 구성. (1층) 50μL 일회용 팁 스택의 위치입니다. (P2, P4) 분석 플레이트의 위치. (P3, P5) 비어 있는 검은색 솔리드 384웰 플레이트의 위치. (6층) 사용한 팁을 폐기하는 위치입니다. (B) 분석 스크립트의 스크린샷. (C) MAC96 흡입 세부 정보의 스크린샷. (1) 흡인 액체 등급을 선택합니다. (2) 흡인에 대한 부피를 입력합니다. (3) 흡인을 위한 웰 위치를 선택합니다. (D) MAC96 분배 세부 사항의 스크린샷. (1) 분주액 등급을 선택합니다. (2) 분주할 부피를 입력합니다. (3) 디스펜싱을 위해 동일한 웰 위치를 선택합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 발광 플레이트 리더 설정 스크린샷 . (ᅡ) 측정 설정 탭. (1) 조리개를 선택합니다. (2) 거리, 시간, 보정 계수를 선택합니다. (B) 프로토콜 일반 설정. (1) 플레이트 타입을 선택합니다. (2) 측정 모드를 선택합니다. (3) 분석 플레이트의 개수를 선택합니다. (C) 토출 측정 설정. (1) 측정값을 선택합니다. (2) 측정 시간을 설정합니다. (3) 펌프, 토출 속도, 용량을 선택합니다. (4) 분배 순서와 플레이트 반복을 정의합니다. (D) 웰 선택 탭. (1) 측정할 웰을 선택합니다. (2) 측정 프로토콜을 시작합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 발광 플레이트 리더의 디스펜서 제어 스크린샷 . (ᅡ) 초기화 탭. (1) 펌프를 선택합니다. (2) 펌프를 시작합니다. (B) 헹굼 프로토콜 옵션. (1) 헹굼 옵션을 선택합니다. (2) 다음을 클릭하여 설정으로 이동합니다. (C) 헹굼 탭 설정 옵션. (1) 펌프를 선택합니다. (2) 팁 마운트를 선택합니다. (3) 다음을 클릭하면 다음 탭으로 이동합니다. (D) 헹굼을 시작하기 위한 탭입니다. (1) 시작 을 클릭하여 헹굼 프로토콜을 시작합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 자동화된 High-Content Microscope 이미징 소프트웨어의 스크린샷. 이미지 획득에 사용되는 설정의 세부 정보입니다. (1) Setup 탭. (2) 플레이트 타입을 선택합니다. (3) Eject 를 선택하여 플레이트를 현미경에 로드합니다. (4) 대물렌즈를 선택합니다. (5) 채널을 추가합니다. (6) Columbus 소프트웨어로 데이터를 전송할 폴더를 선택합니다. (7) 웰을 선택합니다. (8) 필드를 선택합니다. (9) Run experiment 탭을 클릭하여 이미지 획득을 시작합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 온라인 소프트웨어의 이미지 분석. (ᅡ) 이미지 분석 탭. (1) + 를 클릭하여 빌딩 블록을 추가합니다. (2) Find Nuclei 옵션을 선택합니다. (B) 핵 설정을 찾습니다 . (1) 채널을 선택합니다. (2) 세분화 방법을 선택합니다. (C) 결과 정의 탭. (1) 표준 출력을 선택합니다. (2) 결과로 표시할 옵션을 선택합니다. (D) 이미지 분석. (1) Batch Analysis 탭에서 (2) 측정값을 선택합니다. (3) 분석 방법을 선택합니다. (4) 이미지 분석을 시작합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 루시페라아제 측정 및 핵 수의 대표 이미지. (A) 숫자와 색상으로 표시되는 384웰 분석 플레이트의 루시페라아제 상대 강도 값. (B) 이미지 분석 결과. (1) 물체의 핵 수의 히트맵. (2) 각 웰에 대한 결과를 표시하는 테이블. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 데이터 정규화 후의 대표적인 결과. (A) 데이터 정규화 후 동일한 플레이트 내의 음성 대조군(DMSO) 웰의 ATG4B 활성을 의미하는 대표적인 ATG4B 활성 백분율. 활성제는 빨간색으로, 억제제는 파란색으로 표시되며, 흰색은 활성에 큰 변화가 없음을 나타냅니다. 네거티브 대조군(DMSO)은 열 1에 있고 포지티브 대조군(FMK9A)은 열 24에 있습니다. (B) 동일한 플레이트 내 음성 대조군(DMSO) 웰의 세포 수를 의미하는 데이터 정규화 후의 대표 세포 생존율 백분율. 증식은 녹색으로, 독성은 빨간색으로 표시되며, 노란색은 세포 생존력에 큰 변화가 없음을 나타냅니다. 네거티브 대조군(DMSO)은 열 1에 있고 포지티브 대조군(FMK9A)은 열 24에 있습니다. (C) 비율 값에 따른 화합물의 분포. 각 점은 하나의 화합물을 나타냅니다. 비율은 ATG4B 활성을 세포 생존율로 나누어 계산하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 ATG4B 억제제의 식별을 위한 세포 기반 리포터 유전자 분석을 설명합니다. 1차 히트의 식별은 β-actin과 dNGLUC 사이에서 LC3B의 전체 길이 개방 판독 프레임을 발현하는 세포 처리에 따른 루시페라아제 활성을 기반으로 합니다. 이 분석법의 몇 가지 장점은 세포를 용해하지 않고 dNGLUC를 검출할 수 있기 때문에 민감하고 정량이 많으며 비침습적이라는 것입니다. 이 논문은 안정적인 세포주와 1차 스크리닝을 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.
먼저, 본 프로토콜은 높은 transfection 효능과 높은 증식 능력을 나타내는 PANC1 세포주를 사용하였다. 이러한 스크리닝 방법은 다른 세포주를 사용하여 수행할 수 있지만, 형질도입 효능은 세포주마다 다를 수 있다. 둘째, 통로 번호가 5보다 높은 냉동 재고에서 안정적인 세포 집단으로 작업하는 것은 시간이 지남에 따라 보고자의 발현 수준이 감소할 수 있으므로 피해야 합니다. 셋째, 각 분석 전에 새로운 세포 배치를 사용하여 다양한 실험 내에서 루시페라아제의 최대하고 일관된 신호를 얻는 것이 중요합니다. 넷째, 수동으로 또는 벌크 디스펜서를 사용하여 세포를 파종할 때 플레이트 전체에 걸쳐 균일한 세포 밀도를 달성하기 위해 세포 현탁액을 지속적으로 교반해야 합니다. 다섯째, 웰에서 상층액을 수확할 때, 웰 바닥의 세포 단층을 방해하지 않고 상층액을 흡인하기 위해 팁을 웰 내부의 적절한 깊이에 배치하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 기판 작업 용액은 분석 당일에 준비되어야 합니다. 코엘렌테라진은 빛에 매우 민감하고 산화될 수 있으며, 준비 후 급격한 기질 붕괴에 대한 보고가 있습니다.
ATG4B 억제 또는 활성화의 결과를 조사하기 위해 많은 세포 기반 분석법을 사용할 수 있지만, ATG4B의 세포 활성을 조사하는 것은 제한적이다4. 이 방법은 비침습적이고, 매우 민감하고, 강력하며, ATG4B 활성에 직접적으로 의존하며, 그 활성으로 인해 dNGLUC가 방출됩니다. 설명된 프로토콜은 간단하며 10x 384웰 플레이트를 스크리닝하는 데 짧은 시간만 필요합니다. 이 방법의 또 다른 장점은 dNGLUC가 매우 안정적이며 혈청으로부터 생체 외에서 측정할 수 있기 때문에 생체 내에서 ATG4B 활성을 모니터링하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.
이 리포터를 사용하여 저분자 및 siRNA 라이브러리를 스크리닝하고 ATG4B 활성의 새로운 조절자를 식별하는 데 성공했지만 이 프로토콜에서 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 설명된 세포 기반 분석은 ATG4B 활성의 변화를 간접적으로 반영하는 리포터 판독에 의존하여 ATG4B 활성의 억제제와 활성화제를 모두 검출할 수 있습니다. 따라서 히트는 특이성과 활성을 검증할 수 있도록 추가 평가를 거쳐야 합니다. 또한, 억제제는 세포 내 LC3의 공간적 분포 또는 다른 자가포식 관련 단백질의 공간적 분포를 조절하는 능력에 대해 추가로 평가되어야 합니다. 둘째, 이 분석법은 취급 및 데이터 분석이 간단하기 때문에 더 작은 규모의 분석으로 쉽게 수정할 수 있지만, 기판 추가 및 후속 발광 측정을 위해서는 어느 정도의 자동화가 필요합니다. 셋째, 분자 수준에서 dNGLUC 방출 메커니즘이 잘 이해되지 않기 때문에 분비 경로의 요소를 방해하는 화합물이 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 마지막으로, 세포 생존율은 세포 내 루시페라아제 활성에 의해서도 결정될 수 있습니다. 세포 수를 측정하는 것이 세포 내 루시페라아제 값을 측정하는 것보다 덜 침습적이고 변동성이 낮다는 것을 알게 되었지만, 세포 수를 측정하는 것은 이미징 장비, 데이터 분석 소프트웨어 및 데이터 저장 측면에서 어려움을 나타내기 때문에 소규모 연구 실험실에서 사용이 제한됩니다. 전반적으로, 개발된 세포 기반 리포터 유전자 분석은 ATG4B 억제제의 식별을 가능하게 합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 MRC-UCL 대학 단위 보조금 Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK(보조금 참조 2018RIF_15) 및 MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054의 자금 지원을 받는 UCL Therapeutic Acceleration Support 계획에 대한 영국 의학 연구 위원회의 핵심 자금 지원을 받았습니다. ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC)를 암호화하는 플라스미드는 Dr. Robin Ketteler (베를린 의과대학 인간 의학과)로부터 수득하였다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
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