Summary
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'uso di un saggio reporter basato sulla luciferasi in un formato di screening semi-automatizzato ad alto rendimento.
Abstract
Prove crescenti hanno dimostrato che un elevato flusso autofagico è correlato alla progressione del tumore e alla resistenza alla terapia antitumorale. Il dosaggio delle singole proteine dell'autofagia è un prerequisito per le strategie terapeutiche mirate a questo percorso. È stato dimostrato che l'inibizione della proteasi autofagica ATG4B aumenta la sopravvivenza globale, suggerendo che ATG4B potrebbe essere un potenziale bersaglio farmacologico per la terapia del cancro. Il nostro laboratorio ha sviluppato un saggio selettivo basato sulla luciferasi per il monitoraggio dell'attività di ATG4B nelle cellule. Per questo saggio, il substrato di ATG4B, LC3B, è marcato all'estremità C con una luciferasi secretabile dal copepode marino Gaussia princeps (GLUC). Questo reporter è collegato al citoscheletro di actina, mantenendolo così nel citoplasma delle cellule quando non è disponibile. La scissione mediata da ATG4B provoca il rilascio di GLUC da parte di secrezioni non convenzionali, che possono quindi essere monitorate raccogliendo surnatanti da colture cellulari come correlato dell'attività cellulare di ATG4B. Questo articolo presenta l'adattamento di questo test basato sulla luciferasi allo screening automatizzato ad alto rendimento. Descriviamo il flusso di lavoro e l'ottimizzazione per un'analisi esemplare ad alto rendimento dell'attività cellulare ATG4B.
Introduction
L'autofagia è un processo metabolico conservato che consente alle cellule di mantenere l'omeostasi intracellulare e rispondere allo stress degradando il contenuto cellulare invecchiato, difettoso o non necessario attraverso i lisosomi 1,2,3. In alcune condizioni fisiopatologiche, questo processo agisce come una risposta cellulare cruciale alla privazione di nutrienti e ossigeno, con conseguente riciclaggio di nutrienti e lipidi, consentendo alle cellule di adattarsi alle loro esigenze metaboliche 2,3,4. L'autofagia è stata anche identificata come una risposta cellulare allo stress correlata a diverse malattie, come disturbi neurodegenerativi, infezioni da agenti patogeni e vari tipi di cancro. La funzione dell'autofagia nel cancro è complessa e dipende dal tipo, dallo stadio e dallo stato del tumore. Può sopprimere la tumorigenesi attraverso la degradazione autofagica delle cellule danneggiate, ma può anche promuovere la sopravvivenza dei tumori avanzati migliorando la sopravvivenza cellulare durante condizioni di stress, come l'ipossia, la privazione di nutrienti e il danno citotossico 2,4,5,6.
Diversi studi hanno dimostrato che l'inibizione dell'autofagia fornisce un beneficio come strategia antitumorale. Pertanto, l'inibizione di passaggi critici, come la formazione di un autofagosoma o la sua fusione con il lisosoma, potrebbe essere un metodo efficace per il controllo del cancro 2,4,5,6. Prove crescenti hanno dimostrato che ATG4B è coinvolto in alcune condizioni patologiche e ha guadagnato attenzione come potenziale bersaglio antitumorale 2,3,4. Ad esempio, è stato osservato che le cellule tumorali del colon-retto e le cellule di carcinoma mammario positive al recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2) avevano livelli di espressione di ATG4B significativamente più elevati rispetto alle cellule normali adiacenti 2,4. Nelle cellule di carcinoma prostatico, l'inibizione di ATG4B ha determinato una suscettibilità specifica della linea cellulare alla chemioterapia e alla radioterapia7. Recentemente, è emersa una forte evidenza che l'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è particolarmente vulnerabile all'inibizione di ATG4B. Ad esempio, in un modello murino geneticamente modificato, è stato dimostrato che la perdita intermittente della funzione di ATG4B riduce la crescita del tumore PDAC e aumenta la sopravvivenza 3,4. Nel complesso, ATG4B è altamente sovraespresso in alcuni tipi di cancro, è correlato alla progressione del tumore ed è legato alla resistenza alla terapia antitumorale 2,4,8.
Le proteasi della cisteina ATG4 nei mammiferi hanno quattro membri della famiglia, ATG4A-ATG4D. Queste proteine mostrano una certa selettività verso la famiglia di proteineLC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 e possono avere funzioni aggiuntive non legate alla loro attività proteasica 12,13. Inoltre, ATG4 ha la funzione di regolare un nuovo tipo di modificazione post-traduzionale, l'ATG8-ilazione delle proteine11,12. Mentre ATG4B e il suo substrato principale LC3B sono i più studiati, sta emergendo un quadro che suggerisce un ruolo complesso per ciascun membro della sottofamiglia nella regolazione dei processi autofagici e non autofagici. Ciò è ulteriormente corroborato da una complessa rete di modificazioni post-traduzionali che regolano l'attività di ATG4B attraverso la fosforilazione, l'acetilazione, la glicosilazione e la nitrosilazione 9,10,11,12,13.
Diversi inibitori noti di ATG4B sono stati pubblicati 2,4,14,15. Sebbene questi siano adatti come strumenti di ricerca, il loro profilo farmacodinamico, la loro selettività o la loro potenza hanno ancora precluso loro lo sviluppo come candidati preclinici 4,16. Nel complesso, c'è un urgente bisogno di identificare composti più potenti e selettivi. Spesso, i composti sono buoni inibitori biochimici della funzione proteica, ma la loro efficacia nei saggi basati su cellule è scarsa. Esistono diversi saggi per monitorare l'attività di ATG4B, inclusi metodi biochimici e saggi basati su cellule4. In precedenza abbiamo sviluppato un semplice saggio ad alto rendimento basato sulla luminescenza per il monitoraggio dell'attività di ATG4B nelle cellule 8,17. Questo test utilizza una proteina luciferasi di Gaussia princeps (GLUC) che è stabile e attiva nell'ambiente extracellulare e può essere rilasciata inducibilmente dalle cellule in risposta all'attività proteolitica di ATG4B18,19.
In questo costrutto reporter, dNGLUC è legato al citoscheletro di actina delle cellule. Un linker specifico per la proteasi può essere introdotto tra l'ancora β-actina e dNGLUC, trasformando la secrezione dipendente dalla scissione del linker. Abbiamo utilizzato il frame di lettura aperto a tutta lunghezza di LC3B tra β-actina e dNGLUC, per essere in grado di monitorare il clivaggioLC3B 17,18,19. Sebbene il meccanismo di secrezione di dNGLUC sia poco compreso, è specifico per il monitoraggio dell'attività di ATG4B, non dipende dall'autofagia complessiva come si verifica nelle cellule knockout ATG5 ed è mediato da meccanismi non convenzionali che non richiedono un peptide segnaleclassico 4,18,19. Abbiamo utilizzato con successo questo reporter per lo screening di piccole molecole e librerie di siRNA e abbiamo identificato nuovi regolatori dell'attività di ATG4B, come le chinasi proteiche Akt8. Questo documento descrive un protocollo dettagliato per l'uso di questo reporter luciferasi in un formato di screening semi-automatizzato ad alto rendimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Il processo di analisi è descritto nella Figura 1. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e le attrezzature utilizzati in questo protocollo.
1. Produzione di retrovirus
NOTA: Il plasmide che codifica per ActinLC3dNGLUC è pMOWS-ActinLC3dNGLUC20. Utilizzare un numero di cellule a basso passaggio per la produzione di virus ad alto titolo (idealmente inferiore a P20).
- Coltura HEK293T cellule in terreno di coltura modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (P/S) a 37 °C in un incubatore umidificato, con un'atmosfera del 5% di CO2 fino a quando non sono confluenti all'80%-90% prima della semina per la trasfezione.
- Il giorno prima della trasfezione, seminare le cellule in una piastra da 6 pozzetti con una densità di 1 × 106 cellule/pozzetto in 2 ml/pozzetto di terreno di crescita completo. Incubare la piastra per una notte in un'incubatrice umidificata con un'atmosfera del 5% di CO2 .
NOTA: Seguire le istruzioni del produttore se si utilizza un reagente di trasfezione a base liposomiale. Questo protocollo descrive l'uso di un reagente non a base liposomiale. Prima di iniziare la trasfezione, lasciare che il reagente di trasfezione del DNA, il DNA e il terreno si equilibrino a temperatura ambiente (~15 min). - Per ogni trasfezione, aggiungere 200 μL di terreno privo di siero a provette per microcentrifuga da 1,5 mL. In ogni provetta, aggiungere le seguenti quantità di plasmidi: 1.000 ng di pMOWS-ActinLC3dNGLUC; 900 ng di GagPol; 100 ng di VSV-G.
NOTA: La quantità di plasmidi e il volume dei terreni qui elencati si riferiscono a una piastra a 12 pozzetti. Se si utilizza un tipo di piastra diverso, regolare il volume del terreno e le quantità di plasmide per raggiungere la concentrazione finale di 5 ng/μL di plasmide di trasferimento, 4,5 ng/μL di plasmide di impacchettamento e 0,5 ng/μL di plasmide dell'involucro. Utilizzare qualsiasi plasmide di impacchettamento che contenga geni che esprimono gag e pol e qualsiasi plasmide di envelope che contenga il gene che esprime VSV-G. - Vorticare la fiala di reagente per la trasfezione del DNA per 30 s. Pipettare 4 μL del reagente di trasfezione direttamente nel terreno contenente il DNA diluito. Mescolare delicatamente inclinando delicatamente il tubo.
NOTA: Non toccare le pareti dei tubi di plastica con le punte. Non pipetta su e giù o vortice. - Incubare la reazione per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Durante l'incubazione della reazione, rimuovere il vecchio terreno dalla piastra a 6 pozzetti e sostituirlo con 2 ml/pozzetto di terreno fresco privo di siero.
- Aggiungere ogni complesso di trasfezione a ciascun pozzetto in modo goccia a goccia.
- Scuotere o agitare delicatamente la piastra per garantire una distribuzione uniforme su tutta la superficie del pozzo.
- Incubare la piastra per una notte a 37 °C in un incubatore umidificato con un'atmosfera di 5% di CO2 .
- Dopo 24 ore, sostituire il vecchio terreno con terreno fresco completo (2 ml/pozzetto) e riportare le cellule nell'incubatore umidificato con un'atmosfera di CO2 al 5% per 72 ore.
- Dopo 72 ore, raccogliere il surnatante in una provetta conica da 50 mL e centrifugare per 10 minuti a 4.000 × g a 4 °C per rimuovere le cellule morte e i detriti. Per un'ulteriore purificazione, utilizzare una siringa grande da 60 mL per far passare il surnatante attraverso un filtro da 0,20 μm. Preparare immediatamente aliquote monouso da 300 μL e conservare a -80 °C.
NOTA: Evitare un ciclo di gelo-scongelamento per mantenere la massima attività del prodotto.
2. Trasduzione retrovirale
- Il giorno prima della trasduzione delle cellule, seminare le cellule bersaglio a media densità (PANC1 a 1 × 105 cellule/pozzetto) in una piastra a 12 pozzetti in 1 mL/pozzetto di terreno integrato con il 10% di FBS e l'1% di P/S. Incubare la piastra per una notte a 37 °C in un incubatore umidificato con un'atmosfera di 5% di CO2 .
NOTA: La migliore densità cellulare deve essere stabilita in anticipo, poiché diversi tipi di cellule hanno diverse capacità di attaccamento. Idealmente, utilizzare una densità cellulare per ottenere una confluenza del 40%-50%. - Rimuovere le aliquote di retrovirus congelate dal congelatore a -80 °C e scongelarle su ghiaccio prima di ogni utilizzo.
NOTA: Non ricongelare le aliquote inutilizzate. - In una provetta conica da 50 mL, preparare una miscela di surnatante virale e porlorene a una concentrazione finale di 8 μg/mL.
NOTA: I volumi successivi si applicano alla trasduzione di una piastra a 12 pozzetti contenente un volume finale di 500 μL/pozzetto. Il volume finale del surnatante virale può essere stimato testando una serie di diluizioni virali in presenza di pobrene. È possibile utilizzare diluizioni più alte o più basse a seconda dei livelli di espressione desiderati del transgene e delle dimensioni del recipiente utilizzato. - Rimuovere il vecchio terreno dalla piastra a 12 pozzetti e aggiungere 500 μL di miscela a ciascun pozzetto. Incubare le cellule con il surnatante virale per una notte a 37 °C in un incubatore umidificato con un'atmosfera di CO2 al 5%.
NOTA: Conservare due pozzetti con terreno completo (senza surnatante virale) da utilizzare come controllo per la selezione. - Sostituire il terreno contenente il virus con terreno di coltura fresco e completo (1 ml/pozzetto). Rimettere le cellule nell'incubatore umidificato con un'atmosfera di CO2 al 5% per 48 ore.
3. Selezione e mantenimento della popolazione aggregata
- Sostituire il terreno di coltura con un terreno di selezione (terreno di coltura completo con una concentrazione finale di 1 μg/mL di puromicina). Monitorare la crescita delle cellule e cambiare il terreno di selezione ogni 2-3 giorni. Alla confluenza, espandere in una piastra a 6 pozzetti e quindi in una piastra di coltura tissutale di 10 cm di diametro.
- Mantenere le cellule nel terreno di selezione per almeno il tempo necessario alle cellule di controllo (non trasdotte) per morire completamente.
NOTA: Per ottenere risultati positivi, si raccomanda di determinare le concentrazioni ottimali di puromicina prima di iniziare il progetto sperimentale. Per questo, generare una curva di uccisione della puromicina per determinare la concentrazione minima richiesta per uccidere le cellule non trasdotte tra 3 e 10 giorni. - Una volta che le cellule stanno crescendo nel terreno di selezione, espandere le cellule su un terreno di crescita completo e congelare le aliquote di riserva per il progetto sperimentale.
NOTA: Registrare il numero di passaggi ed evitare di lavorare con popolazioni raggruppate da stock congelati con numeri di passaggio superiori a cinque. Controllare regolarmente la presenza di contaminazione da micoplasmi prima di eseguire il test. Idealmente, utilizzare un lotto di cellule fresche prima di ogni test per ottenere il massimo segnale di luciferasi. - Mantenere le cellule nel terreno di selezione e seminare un numero sufficiente di cellule per raggiungere la densità desiderata il giorno prima del test.
4. Aggiunta di composti
NOTA: La libreria di piccole molecole di Selleckchem è costituita da circa 4.000 composti disposti in otto file e 10 colonne in cinquanta piastre da 96 pozzetti a una concentrazione di 10 mM in dimetilsolfossido (DMSO).
- Aliquotare 30 μL di composto nell'apposito pozzetto di una piastra sorgente compatibile con un erogatore di liquidi acustici su scala nanometrica. Utilizzare una piastra in polipropilene a 384 pozzetti (piastra 384PP). Conservare queste piastre sigillate e conservate a -20 °C.
NOTA: Il protocollo di screening qui descritto è per un totale di 10 piastre di analisi al giorno; una concentrazione fissa di 10 μM è stata utilizzata come concentrazione finale del saggio insieme a un periodo di incubazione di 24 ore. - Scongelare le piastre della libreria composta a temperatura ambiente.
NOTA: Assicurarsi che la piastra sia completamente scongelata e bilanciata a temperatura ambiente. Un gradiente di temperatura attraverso la piastra può influire sulla manipolazione dei liquidi. - Erogare 50 nL/pozzetto in una piastra di analisi da 384 pozzetti utilizzando un dosatore di liquidi acustici su scala nanometrica.
NOTA: Assicurarsi che le piastre di origine e di destinazione selezionate nel programma corrispondano a quelle utilizzate per questo passaggio. - Creare un programma di erogazione su un foglio di calcolo.
- Aprire il software.
- Aprire un nuovo protocollo. Dalla scheda Protocollo , selezionare le seguenti opzioni: Formato piastra campione, 384PP; Tipo di piastra campione, 384PP_DMSO2; e tipo di piastra di destinazione, CellCarrier-384 Ultra PN (Figura 2A).
- In Elenco di prelievo, selezionare l'opzione di importazione (Figura 2B) per importare il foglio di calcolo contenente il programma di erogazione (Figura 2C).
- Selezionare l'opzione Esegui protocollo (Figura 2D), verificare che le informazioni visualizzate siano corrette e fare clic su Esegui.
- Nella nuova finestra denominata Stato esecuzione (Figura 2E), fare clic su Start e seguire i passaggi visualizzati nelle finestre di richiesta (Figura 2F,G).
5. Semina cellulare
- Tripsinizzare le cellule da un pallone di coltura cellulare o da piastre di Petri per colture cellulari e neutralizzare la tripsina aggiungendo terreni contenenti FBS.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 390 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere delicatamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno di coltura completo.
- Eseguire il conteggio delle cellule.
- Preparare la sospensione cellulare con 4,6 × 107 cellule in 230 mL di terreno di coltura completo.
NOTA: Questo volume e densità cellulare si riferisce a 10 piastre per saggi da 384 pozzetti più un volume morto di due piastre a 384 pozzetti. - Erogare 50 μL di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra di analisi a 384 pozzetti, preparata nella sezione 4.
NOTA: La semina delle cellule può essere eseguita manualmente o utilizzando un dosatore per prodotti sfusi. - Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato con un'atmosfera di CO2 al 5% per 24 ore.
6. Prelievo del surnatante cellulare
NOTA: La piattaforma robotica per la manipolazione dei liquidi qui utilizzata esegue la manipolazione dei liquidi con un braccio multicanale per 96 punte. Se non è disponibile un'automazione per la gestione dei liquidi, il protocollo può essere adattato al formato a bassa produttività utilizzando pipette multicanale.
- Configurare il piano di lavoro per l'automazione di laboratorio come mostrato nella Figura 3.
- Posizionare la pila monouso a 96 punte in posizione P1 (Figura 3A).
NOTA: Ogni pila di 96 punte è formata da otto rack usa e getta. Quando si utilizza un braccio multicanale per 96 punte, la piastra a 384 pozzetti è divisa in quattro quadranti. Pertanto, ogni pila di puntali è sufficiente per trasferire il surnatante da due piastre di analisi in due piastre vuote, di colore nero solido, da 384 pozzetti. L'intera pila di puntali deve essere sostituita dopo ogni corsa di due piastre. - Posizionare le piastre del saggio nelle posizioni P2 e P4 (Figura 3A).
- Posizionare le piastre vuote, di colore nero, a 384 pozzetti, nelle posizioni P3 e P5 (Figura 3A).
NOTA: Questa piattaforma robotica flessibile e capace è stata adattata per questo test ed è stato scritto un programma speciale (Figura 3B). - Prendi le punte dalla posizione P1.
- Aspirare 10 μL di surnatante dalla piastra in posizione P2 e trasferirli nella piastra vuota di colore nero pieno in posizione P3.
NOTA: I puntali devono essere posizionati ad una profondità appropriata all'interno dei pozzetti per aspirare il surnatante senza disturbare il monostrato cellulare sul fondo del pozzetto. - Far cadere i puntali nei rifiuti nella posizione P6 (Figura 3A).
- Ripetere i passaggi 6.5-6.7 per i restanti pozzetti della piastra in posizione P2, quindi ripetere gli stessi passaggi per trasferire il surnatante dalla posizione P4 alla posizione P5.
NOTA: Assicurarsi di raccogliere il surnatante e di erogarlo sui pozzetti corrispondenti nella piastra vuota di colore nero solido (Figura 3C,D). Poiché il dNGLUC secreto è molto stabile nel terreno di coltura cellulare, le piastre possono essere sigillate e conservate fino a 7 giorni a 4 °C al buio.
7. Saggio della luciferasi
NOTA: Il dNGLUC utilizzato nel reporter mostra una cinetica flash con un rapido decadimento del segnale. A causa del rapido decadimento della luminescenza dopo l'aggiunta del substrato (celenterazina), il lettore di piastre deve essere impostato per misurare il segnale di luminescenza nei surnatanti; Iniettare il substrato in un pozzetto e leggerlo bene dopo pochi secondi. Per questo motivo, utilizzare un lettore di piastre in grado di monitorare la luminescenza e dotato di un iniettore di substrato per garantire che il tempo tra le fasi di iniezione e lettura sia uniforme per tutti i campioni. Le impostazioni utilizzate sul lettore di piastre sono riportate nella Figura 4.
- Preparare la celenterazina nativa come soluzione madre da 1 mg/mL in metanolo acidificato (10 μL di HCl 3 M in 1 mL di metanolo).
NOTA: Seguire le linee guida locali per la salute e la sicurezza relative alla manipolazione del metanolo in laboratorio ed evitare il contatto con la pelle. Preparare la soluzione di substrato di lavoro fresco prima di iniziare il saggio. - Inizializzare la pompa iniettore (Figura 5A).
- Sciacquare il tubo con acqua deionizzata (Figura 5B-D).
- Sciacquare il tubo con metanolo.
- Durante il risciacquo del tubo, preparare la soluzione di substrato di lavoro diluendo il substrato 1:100 (per una piastra da 384 pozzetti, aggiungere 220 μL dalla soluzione madre del substrato in 21,8 mL di soluzione salina tamponata con fosfato [PBS]).
- Sciacquare il tubo con la soluzione di lavoro del substrato (Figura 5B-D).
- Caricare la piastra nel lettore e avviare la misurazione utilizzando le impostazioni descritte nella Figura 4.
- Ripetere i passaggi 7.6-7.7 per tutte le piastre del saggio.
- Una volta terminate tutte le piastre del saggio, sciacquare il tubo con metanolo.
- Sciacquare il tubo con acqua deionizzata.
NOTA: Al termine di questo passaggio si ottengono valori grezzi di luciferasi che sono correlati all'attività cellulare di ATG4B. Per la normalizzazione del numero di cellule, i passaggi successivi sono necessari contando il numero di cellule in ciascun pozzetto mediante microscopia a fluorescenza.
8. Fissazione e colorazione delle cellule
NOTA: Questo passaggio può essere eseguito manualmente con l'ausilio di una pipetta multicanale o utilizzando un dosatore per prodotti sfusi.
- Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% (in 1x PBS) per 15 minuti.
NOTA: Seguire le linee guida locali in materia di salute e sicurezza relative alla manipolazione della paraformaldeide in laboratorio ed evitare il contatto con la pelle. Eseguire questo passaggio in una cappa di sicurezza, se possibile. - Lavare tre volte con 1x PBS.
- Colorare i nuclei con Hoechst 33342 diluito 1:5.000 in 1x PBS per 15 min.
- Lavare tre volte con 1x PBS.
9. Acquisizione dell'immagine
NOTA: Eseguire l'acquisizione delle immagini utilizzando un microscopio automatico. In alternativa all'acquisizione di immagini per determinare il numero di cellule, è possibile determinare anche l'attività della luciferasi intracellulare. Ci sono vantaggi e svantaggi per quanto riguarda la normalizzazione del numero di cellule o dell'attività intracellulare della luciferasi, che viene discussa di seguito. Scopriamo che la determinazione del numero di cellule è meno invasiva e si traduce in una minore variabilità rispetto alla determinazione dei valori di luciferasi intracellulare.
- Avviate il software operativo del microscopio (Figura 6).
- Nella scheda Impostazione , scegliere il tipo di piastra predefinito corretto. Se il tipo di piastra non è preimpostato, immettere manualmente le dimensioni della piastra.
- Caricare la piastra nel microscopio facendo clic sull'opzione Espelli e carica.
- Quindi, scegli l'obiettivo 20x Air (apertura numerica [NA]: 0.4).
NOTA: Assicurarsi che il collare dell'obiettivo sia impostato sul valore corretto, consentendo una corretta messa a fuoco con diversi tipi di piastra. - In Selezione canale, scegliere Hoechst 33342.
NOTA: Le impostazioni del canale per il tempo, la potenza e l'altezza devono essere ottimizzate in base al tipo di piastra utilizzato. - In Definisci layout, selezionare tutti i pozzetti dalla piastra e quattro campi dal pozzetto.
- In Lavori online, selezionare la cartella corrispondente per trasferire i dati al software di analisi.
10. Analisi delle immagini
NOTA: Qualsiasi software di analisi delle immagini può essere utilizzato per segmentare e contare i nuclei cellulari dalle immagini acquisite. In questo articolo descriviamo i passaggi per utilizzare un software online specifico compatibile con più file di microscopi automatici.
- Avviare il software di analisi delle immagini.
- Passare alla scheda Analisi immagine per avviare la segmentazione dell'immagine (Figura 7A).
- Nella scheda Immagine di input , fare clic sul segno + per aggiungere un nuovo blocco predefinito (Figura 7A).
- Dall'elenco, selezionare l'opzione Trova nuclei (Figura 7A) e selezionare Hoechst 33342 come opzione del canale (Figura 7B).
- Ispeziona visivamente gli oggetti segmentati sull'immagine e seleziona il metodo di segmentazione più accurato.
NOTA: Per questo esperimento, abbiamo utilizzato il metodo C (Figura 7C). Ogni opzione del metodo ha sottocategorie che possono essere regolate per ottenere la migliore segmentazione possibile. - Quindi, fare clic sulla scheda Definisci risultati (Figura 7C) e selezionare Output standard come opzione Metodo .
- Dalla sottocategoria, selezionare Numero di nuclei di oggetti e Numero di oggetti (Figura 7C).
- Salvare la pipeline di analisi utilizzando l'opzione Salva analisi su disco o Salva analisi su database.
- Nella scheda Analisi batch , selezionare i dati da analizzare dalla struttura.
- In Metodo (Method), selezionate la pipeline di analisi salvata nel passaggio 10.8.
NOTA: È anche possibile caricare un file di script dall'esterno del software di riferimento o caricare un'analisi esistente salvata nel database. - Fare clic su Esegui analisi per avviare l'analisi (Figura 7D). Alla fine di questo flusso di lavoro, vengono generati due set di dati: i valori grezzi della luciferasi dai surnatanti e il numero di cellule in ciascun pozzetto. Utilizzare entrambi per normalizzare il valore della luciferasi per cella.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In una precedente pubblicazione8, abbiamo utilizzato con successo questo test per lo screening di piccole molecole e librerie di siRNA e abbiamo identificato nuovi regolatori di ATG4B. Qui, descriviamo il protocollo e i risultati rappresentativi di questo reporter luciferasi in un formato di screening semi-automatizzato e ad alto rendimento. La Figura 8 mostra un esempio di analisi dei dati grezzi sia per i nuclei cellulari che per la luminescenza. Un risultato tipico di una misurazione della luminescenza è illustrato nella Figura 8A. Il segnale di luminescenza basale del DMSO può essere visto nella colonna 1 e in presenza di 10 μM dell'inibitore ATG4B FMK9A nella colonna 24. Il risultato della conta dei nuclei dalla stessa piastra può essere visto nella Figura 8B. I valori grezzi per ciascun composto sono stati normalizzati a valori medi di controllo neutri per ottenere la percentuale di attività di ATG4B e la sopravvivenza cellulare (Figura 9A,B). Come previsto, la maggior parte dei composti non ha avuto alcun effetto sull'attività di ATG4B, come indicato da valori vicini alla luminescenza basale del controllo negativo (DMSO - colonna 1). Il fattore Z', che è un indice di qualità per lo screening ad alto rendimento, è stato calcolato utilizzando l'equazione (1):
Z' = 1 - (3 × 
) (1)
Dove STDpos è la deviazione standard del controllo positivo (FMK9a), STDneg è la deviazione standard del controllo negativo (DMSO), AVGpos è la media del controllo positivo e AVGneg è la media del controllo negativo.
Per selezionare i risultati, abbiamo utilizzato i valori normalizzati per calcolare un rapporto da utilizzare come valore di cut-off per l'identificazione degli inibitori di ATG4B. Il rapporto è stato calcolato dividendo l'attività ATG4B di ciascun composto per la sua vitalità cellulare. Abbiamo considerato che i rapporti >1 indicavano possibili attivatori di ATG4B e i rapporti <1 indicavano possibili inibitori di ATG4B (Figura 9C). Sono stati selezionati tutti i composti con valori di rapporto simili al controllo positivo FMK9A e sono stati esclusi i composti citotossici.
In questa schermata, abbiamo selezionato 53 inibitori di ATG4B per confermare e valutare la loro attività e tossicità. I composti sono stati testati in 10 concentrazioni come diluizioni doppie che vanno da 100 μM a 195 nM. Le cellule trattate in modo concentrazione-risposta hanno permesso di adattare i dati quantificati e di calcolare i valori di EC50 . La tossicità relativa degli inibitori è stata quantificata dai dati di vitalità cellulare. Nel loro insieme, questi risultati hanno dimostrato che questo approccio consente l'identificazione dei modulatori ATG4B.
Figura 1: Flusso di lavoro del saggio. L'esperimento descrive in dettaglio la tempistica per la generazione di linee cellulari stabili e un flusso di lavoro di saggi ad alto rendimento, a partire dalla generazione di linee cellulari stabili, dallo screening dei composti, dalla misurazione della luciferasi, dall'acquisizione delle immagini e dall'analisi dei dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Istruzioni dettagliate per la configurazione del gestore di liquidi . (A) Impostazioni della scheda Protocollo . (1) Selezionare il formato e il tipo della piastra campione. (2) Selezionare il tipo di piastra di destinazione. (B) Scheda Elenco di selezione . (1) Utilizzare l'opzione di importazione per importare il foglio di calcolo. (C) Finestra di richiesta Importa elenco prelievi. (1) Selezionare i parametri da importare. (2) Fare clic su Importa per concludere. (D) Protocollo in esecuzione. (1) Fare clic sull'icona Esegui . (2) Finestra di prompt che visualizza l'opzione di esecuzione e per avviare l'esecuzione del protocollo. (E) Scheda Stato esecuzione . (1) Avviare il protocollo. (F) Finestra di richiesta per il caricamento della piastra di origine. (G) Finestra di richiesta per il caricamento della piastra di destinazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Configurazione del robot per la manipolazione dei liquidi . (A) Configurazione del deck Tecan. (P1) Posizione per la pila di puntali monouso da 50 μL. (P2,P4) Posizioni per la piastra del saggio. (P3,P5) Posizioni per le piastre vuote, di colore nero solido, a 384 pozzetti. (Pag. 6) Posizione per lo smaltimento delle punte usate. (B) Screenshot dello script del saggio. (C) Screenshot dei dettagli dell'aspirato MAC96. (1) Selezionare la classe del liquido di aspirazione. (2) Digitare il volume per l'aspirazione. (3) Selezionare le posizioni del pozzetto per l'aspirazione. (D) Screenshot dei dettagli dell'erogazione MAC96. (1) Selezionare la classe del liquido di erogazione. (2) Digitare il volume per l'erogazione. (3) Selezionare le stesse posizioni del pozzetto per l'erogazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Screenshot delle impostazioni del lettore di piastre a luminescenza . (A) Scheda Impostazioni di misurazione . (1) Selezionare l'apertura. (2) Selezionare la distanza, il tempo e il fattore di correzione. (B) Impostazioni generali del protocollo. (1) Selezionare il tipo di piastra. (2) Selezionare la modalità di misurazione. (3) Selezionare il numero di piastre del saggio. (C) Impostazioni di misurazione dell'erogazione. (1) Selezionare la misurazione. (2) Impostare il tempo di misurazione. (3) Selezionare la pompa, la velocità di erogazione e il volume. (4) Definire l'ordine di erogazione e la ripetizione della piastra. (D) Scheda di selezione del pozzetto. (1) Selezionare i pozzetti per la misurazione. (2) Avviare il protocollo di misurazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Screenshot del controllo dell'erogatore del lettore di piastre a luminescenza . (A) Scheda Inizializzazione . (1) Selezionare la pompa. (2) Avviare la pompa. (B) Opzione protocollo di risciacquo. (1) Selezionare l'opzione di risciacquo. (2) Fare clic su Avanti per passare alle impostazioni. (C) Opzioni delle impostazioni della scheda di risciacquo . (1) Selezionare la pompa. (2) Selezionare il supporto della punta. (3) Fare clic su Avanti per passare alla scheda successiva. (D) Scheda per avviare il risciacquo. (1) Fare clic su Avvia per avviare il protocollo di risciacquo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Screenshot del software di imaging automatizzato per microscopi ad alto contenuto. Dettagli delle impostazioni utilizzate per l'acquisizione delle immagini. (1) Scheda Impostazione . (2) Selezionare il tipo di piastra. (3) Selezionare Espelli per caricare la lastra nel microscopio. (4) Selezionare l'obiettivo. (5) Aggiungere il canale. (6) Selezionare la cartella in cui trasferire i dati al software Columbus. (7) Selezionare i pozzetti. (8) Selezionare i campi. (9) Fare clic sulla scheda Esegui esperimento per avviare l'acquisizione dell'immagine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Analisi delle immagini su un software online. (A) Scheda Analisi delle immagini. (1) Fare clic su + per aggiungere un blocco predefinito. (2) Selezionare l'opzione Trova nuclei. (B) Trova le impostazioni dei nuclei. (1) Selezionare il canale. (2) Selezionare il metodo di segmentazione. (C) Scheda Definisci risultati. (1) Selezionare Uscita standard. (2) Selezionare l'opzione da visualizzare come risultato. (D) Analisi delle immagini. (1) Scheda Analisi batch. (2) Selezionare la misurazione. (3) Selezionare il metodo di analisi. (4) Avviare l'analisi delle immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Immagini rappresentative delle misurazioni della luciferasi e della conta dei nuclei. (A) Valori di intensità relativa della luciferasi da una piastra di saggio a 384 pozzetti rappresentati da numeri e colori. (B) Risultati dell'analisi delle immagini. (1) Mappa di calore del numero di nuclei degli oggetti. (2) Tabella che mostra i risultati per ciascun pozzetto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Risultati rappresentativi dopo la normalizzazione dei dati. (A) Percentuale rappresentativa dell'attività ATG4B dopo la normalizzazione dei dati per l'attività ATG4B media dai pozzetti di controllo negativo (DMSO) all'interno della stessa piastra. Gli attivatori sono mostrati in rosso e gli inibitori in blu, con il bianco che indica che non ci sono cambiamenti significativi nell'attività. Il controllo negativo (DMSO) si trova nella colonna 1 e il controllo positivo (FMK9A) si trova nella colonna 24. (B) Percentuale rappresentativa di vitalità cellulare dopo la normalizzazione dei dati al numero medio di cellule dai pozzetti di controllo negativo (DMSO) all'interno della stessa piastra. La proliferazione è mostrata in verde e la tossicità in rosso, con il giallo che indica che non ci sono cambiamenti significativi nella vitalità cellulare. Il controllo negativo (DMSO) si trova nella colonna 1 e il controllo positivo (FMK9A) si trova nella colonna 24. (C) Distribuzione dei composti in base al valore del rapporto. Ogni punto rappresenta un composto. Il rapporto è stato calcolato dividendo l'attività di ATG4B per la vitalità cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo descrive un saggio basato su cellule reporter-gene per l'identificazione degli inibitori di ATG4B. L'identificazione dei riscontri primari si basa sull'attività della luciferasi durante il trattamento di cellule che esprimono il frame di lettura aperto a lunghezza intera di LC3B tra β-actina e dNGLUC. Alcuni vantaggi di questo test sono che è sensibile, altamente quantitativo e non invasivo, in quanto può rilevare dNGLUC senza lisare le cellule. Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la generazione di una linea cellulare stabile e uno screening primario. Ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo.
In primo luogo, il protocollo qui descritto ha utilizzato la linea cellulare PANC1, che presenta un'elevata efficacia di trasfezione e un'elevata capacità di proliferazione. Questo metodo di screening può essere eseguito utilizzando altre linee cellulari, ma l'efficacia della trasduzione può variare da una linea cellulare all'altra. In secondo luogo, si dovrebbe evitare di lavorare con popolazioni cellulari stabili da stock congelati con numeri di passaggio superiori a cinque, poiché i livelli di espressione del reporter potrebbero diminuire nel tempo. In terzo luogo, è importante utilizzare un lotto di cellule fresche prima di ogni test per ottenere il segnale massimo e coerente di luciferasi all'interno di diversi esperimenti. In quarto luogo, quando si seminano le cellule, manualmente o utilizzando un dosatore di massa, la sospensione cellulare deve essere costantemente agitata per ottenere una densità cellulare omogenea in tutta la piastra. In quinto luogo, quando si preleva il surnatante dal pozzo, è importante che le punte siano posizionate a una profondità appropriata all'interno dei pozzetti per aspirare il surnatante senza disturbare il monostrato cellulare sul fondo del pozzo. Infine, la soluzione di lavoro del substrato deve essere preparata il giorno del test. La celenterazina è molto sensibile alla luce e soggetta a ossidazione, e ci sono alcune segnalazioni di rapido decadimento del substrato dopo la preparazione.
Sono disponibili numerosi saggi basati su cellule per studiare le conseguenze dell'inibizione o dell'attivazione di ATG4B, ma l'esame dell'attività cellulare di ATG4B rimane limitato4. Questo metodo non è invasivo, altamente sensibile, robusto e dipende direttamente dall'attività di ATG4B, poiché la sua attività provoca il rilascio di dNGLUC. Il protocollo descritto è semplice e richiede solo un breve periodo di tempo per lo screening di 10 piastre a 384 pozzetti. Un altro vantaggio del metodo è che può essere utilizzato per monitorare l'attività di ATG4B in vivo, poiché il dNGLUC è altamente stabile e può essere misurato ex vivo dal siero.
Sebbene abbiamo utilizzato con successo questo reporter per lo screening di piccole molecole e librerie di siRNA e abbiamo identificato nuovi regolatori dell'attività di ATG4B, ci sono alcune limitazioni da considerare in questo protocollo. In primo luogo, il test basato su cellule descritto si basa su una lettura del reporter che riflette indirettamente i cambiamenti nell'attività di ATG4B, consentendo il rilevamento sia di inibitori che di attivatori dell'attività di ATG4B. Pertanto, i riscontri positivi dovrebbero essere sottoposti a un'ulteriore valutazione in modo da convalidarne la specificità e l'attività. Inoltre, gli inibitori dovrebbero essere ulteriormente valutati nella loro capacità di regolare la distribuzione spaziale di LC3 nelle cellule o quella di altre proteine correlate all'autofagia. In secondo luogo, sebbene questo test possa essere facilmente modificato in un saggio su scala ridotta grazie alla sua semplice gestione e analisi dei dati, richiede un certo grado di automazione per l'aggiunta del substrato e la successiva misurazione della luminescenza. In terzo luogo, poiché il meccanismo di rilascio di dNGLUC è scarsamente compreso a livello molecolare, i composti che interferiscono con gli elementi della via di secrezione possono influenzare i risultati. Infine, la vitalità cellulare può essere determinata anche dall'attività intracellulare della luciferasi. Sebbene la determinazione del numero di cellule sia meno invasiva e si traduca in una variabilità inferiore rispetto alla determinazione dei valori di luciferasi intracellulare, la determinazione del numero di cellule limita il loro uso per i laboratori di ricerca più piccoli in quanto presentano difficoltà in termini di apparecchiature di imaging, software di analisi dei dati e archiviazione dei dati. Nel complesso, il test reporter-gene basato su cellule sviluppato consente l'identificazione degli inibitori di ATG4B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento di base del Medical Research Council del Regno Unito per la sovvenzione dell'unità universitaria MRC-UCL Ref MC_U12266B, dalla sovvenzione della piattaforma MRC Dementia UK MR/M02492X/1, dal cancro al pancreas nel Regno Unito (riferimento della sovvenzione 2018RIF_15) e dal programma di supporto all'accelerazione terapeutica dell'UCL, supportato dal finanziamento di MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Il plasmide che codifica per l'ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) è stato ottenuto dal Dr. Robin Ketteler (Dipartimento di Medicina Umana, Facoltà di Medicina di Berlino).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al.
- Towers, C. G., Thorburn, A.
- Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
- Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A.
- Kimmelman, A. C., White, E.
- Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
- Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
- Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
- Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
- Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
- Ketteler, R., Tooze, S. A.
- Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
- Fernández, ÁF., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
- Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
- Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
- Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
- Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).
