Celgebaseerde geneesmiddelenscreening op remmers van autofagie-gerelateerde 4B-cysteïnepeptidase
Summary
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een op luciferase gebaseerde reportertest in een semi-geautomatiseerd screeningsformaat met hoge doorvoer.
Abstract
Er zijn steeds meer aanwijzingen dat een hoge autofagische flux verband houdt met tumorprogressie en resistentie tegen kankertherapie. Het testen van individuele autofagie-eiwitten is een voorwaarde voor therapeutische strategieën die zich op deze route richten. Het is aangetoond dat remming van de autofagieprotease ATG4B de algehele overleving verhoogt, wat suggereert dat ATG4B een potentieel doelwit voor kankertherapie zou kunnen zijn. Ons laboratorium heeft een selectieve test op basis van luciferase ontwikkeld voor het monitoren van ATG4B-activiteit in cellen. Voor deze test wordt het substraat van ATG4B, LC3B, aan de C-terminus gelabeld met een secretabel luciferase van het mariene roeipootkreeftje Gaussia princeps (GLUC). Deze reporter is gekoppeld aan het actine-cytoskelet, waardoor het in het cytoplasma van cellen blijft wanneer het wordt gelost. ATG4B-gemedieerde splitsing resulteert in de afgifte van GLUC door niet-conventionele secretie, die vervolgens kan worden gecontroleerd door supernatanten uit celkweek te oogsten als een correlaat van cellulaire ATG4B-activiteit. Dit artikel presenteert de aanpassing van deze op luciferase gebaseerde test aan geautomatiseerde high-throughput screening. We beschrijven de workflow en optimalisatie voor een voorbeeldige high-throughput analyse van cellulaire ATG4B-activiteit.
Introduction
Autofagie is een geconserveerd metabolisch proces dat cellen in staat stelt intracellulaire homeostase te behouden en op stress te reageren door verouderde, defecte of onnodige cellulaire inhoud af te breken via de lysosomen 1,2,3. Onder sommige pathofysiologische omstandigheden fungeert dit proces als een cruciale cellulaire reactie op nutriënten- en zuurstofgebrek, wat resulteert in gerecyclede voedingsstoffen en lipiden, waardoor de cellen zich kunnen aanpassen aan hun metabolische behoeften 2,3,4. Autofagie is ook geïdentificeerd als een cellulaire stressreactie die verband houdt met verschillende ziekten, zoals neurodegeneratieve aandoeningen, pathogene infectie en verschillende soorten kanker. De functie van autofagie bij kanker is complex en afhankelijk van het type, het stadium en de status van de tumor. Het kan tumorigenese onderdrukken door autofagische afbraak van beschadigde cellen, maar kan ook de overleving van gevorderde tumoren bevorderen door de celoverleving te verbeteren tijdens stressvolle omstandigheden, zoals hypoxie, gebrek aan voedingsstoffen en cytotoxische schade 2,4,5,6.
Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat remming van autofagie een voordeel biedt als strategie tegen kanker. De remming van kritieke stappen, zoals autofagosoomvorming of de fusie ervan met het lysosoom, zou dus een effectieve methode kunnen zijn voor kankerbestrijding 2,4,5,6. Groeiend bewijs heeft aangetoond dat ATG4B betrokken is bij bepaalde pathologische aandoeningen, en het heeft aandacht gekregen als een potentieel antikankerdoelwit 2,3,4. Er werd bijvoorbeeld waargenomen dat colorectale kankercellen en humane epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2)-positieve borstkankercellen significant hogere ATG4B-expressieniveaus hadden dan aangrenzende normale cellen 2,4. In prostaatkankercellen resulteerde remming van ATG4B in een cellijnspecifieke gevoeligheid voor chemotherapie en radiotherapie7. Onlangs zijn er sterke aanwijzingen naar voren gekomen dat ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC) bijzonder kwetsbaar is voor ATG4B-remming. In een genetisch gemanipuleerd muismodel werd bijvoorbeeld aangetoond dat intermitterend verlies van ATG4B-functie de groei van PDAC-tumoren vermindert en de overleving verhoogt 3,4. Over het algemeen komt ATG4B sterk tot overexpressie in sommige kankertypes, is het gerelateerd aan de progressie van de tumor en is het gekoppeld aan resistentie tegen kankertherapie 2,4,8.
De ATG4-cysteïneproteasen bij zoogdieren hebben vier familieleden, ATG4A-ATG4D. Deze eiwitten vertonen enige doelselectiviteit in de richting van de LC3/GABARAP (ATG8)-familie van eiwitten 9,10,11 en kunnen aanvullende functies hebben die geen verband houden met hun protease-activiteit12,13. Bovendien functioneert ATG4 bij het reguleren van een nieuw type posttranslationele modificatie, de ATG8-ylering van eiwitten11,12. Hoewel ATG4B en zijn belangrijkste substraat LC3B het meest bestudeerd zijn, ontstaat er een beeld dat wijst op een complexe rol voor elk lid van de subfamilie in de regulatie van autofagische en niet-autofagische processen. Dit wordt verder bevestigd door een complex netwerk van posttranslationele modificaties die de ATG4B-activiteit reguleren via fosforylering, acetylering, glycosylering en nitrosylering 9,10,11,12,13.
Er zijn verschillende bekende ATG4B-remmers gepubliceerd 2,4,14,15. Hoewel deze geschikt zijn als onderzoeksinstrumenten, hebben hun farmacodynamische profiel, selectiviteit of potentie ze tot nu toe uitgesloten van ontwikkeling als preklinische kandidaten 4,16. Over het algemeen is er een dringende behoefte om krachtigere en selectievere verbindingen te identificeren. Vaak zijn de verbindingen goede biochemische remmers van de eiwitfunctie, maar hun werkzaamheid in celgebaseerde tests is slecht. Er zijn meerdere testen om de ATG4B-activiteit te monitoren, waaronder biochemische methoden en celgebaseerde testen4. We hebben eerder een eenvoudige, op luminescentie gebaseerde, high-throughput assay ontwikkeld voor het monitoren van ATG4B-activiteit in cellen 8,17. Deze test maakt gebruik van een luciferase-eiwit van Gaussia princeps (GLUC) dat stabiel en actief is in het extracellulaire milieu en induceerbaar kan worden vrijgegeven uit cellen als reactie op ATG4B proteolytische activiteit18,19.
In deze reporterconstructie is dNGLUC gekoppeld aan het actine-cytoskelet van cellen. Een protease-specifieke linker kan worden geïntroduceerd tussen het β-actine-anker en dNGLUC, waardoor de secretie afhankelijk wordt van de splitsing van de linker. We gebruikten het open leesframe van LC3B over de volledige lengte tussen β-actine en dNGLUC, om LC3B-splitsing 17,18,19 te kunnen volgen. Hoewel het secretiemechanisme van dNGLUC slecht wordt begrepen, is het specifiek voor het monitoren van ATG4B-activiteit, is het niet afhankelijk van algehele autofagie zoals het voorkomt in ATG5-knock-outcellen, en wordt het gemedieerd door niet-conventionele mechanismen die geen klassiek signaalpeptide nodig hebben 4,18,19. We hebben deze reporter met succes gebruikt om kleine moleculen en siRNA-bibliotheken te screenen en hebben nieuwe regulatoren van ATG4B-activiteit geïdentificeerd, zoals de Akt-eiwitkinasen8. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het gebruik van deze luciferase-reporter in een semi-geautomatiseerd screeningsformaat met hoge doorvoer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een celgebaseerde reporter-gen assay voor de identificatie van ATG4B-remmers. De identificatie van primaire treffers is gebaseerd op luciferase-activiteit bij de behandeling van cellen die het volledige open leesframe van LC3B tot expressie brengen tussen β-actine en dNGLUC. Enkele voordelen van deze test zijn dat het gevoelig, zeer kwantitatief en niet-invasief is, omdat het dNGLUC kan detecteren zonder de cellen te lyseren. Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het genereren v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de kernfinanciering van de UK Medical Research Council aan de MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (subsidiereferentie 2018RIF_15), en de UCL Therapeutic Acceleration Support-regeling, ondersteund door financiering van MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Het plasmide dat codeert voor ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) werd verkregen van Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin).
Materials
| 50 µL Disposable Tips – Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al. Targeting ATG4 in cancer therapy. Cancers. 11 (5), 649 (2019).
- Towers, C. G., Thorburn, A. Therapeutic targeting of autophagy. EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).
- Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
- Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. Targeting autophagy in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).
- Kimmelman, A. C., White, E. Autophagy and tumor metabolism. Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).
- Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
- Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
- Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
- Tanida, I., Sou, Y. -. S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
- Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
- Ketteler, R., Tooze, S. A. ATG4: More than a protease. Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).
- Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
- Fernández, &. #. 1. 9. 3. ;. F., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
- Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
- Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
- Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -. W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
- Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).
