Summary
ここでは、ルシフェラーゼベースのレポーターアッセイを半自動のハイスループットスクリーニングフォーマットで使用するための詳細なプロトコルについて説明します。
Abstract
高いオートファジーフラックスが腫瘍の進行やがん治療抵抗性に関連していることを示す証拠が増えています。個々のオートファジータンパク質のアッセイは、この経路を標的とする治療戦略の前提条件です。オートファジープロテアーゼATG4Bの阻害は全生存期間を延長することが示されており、ATG4Bががん治療の創薬標的となる可能性が示唆されています。当研究室では、細胞内のATG4B活性をモニタリングするための選択的ルシフェラーゼベースのアッセイを開発しました。このアッセイでは、ATG4Bの基質であるLC3Bを、海産カイアシ類Gaussia princeps(GLUC)由来の分泌可能なルシフェラーゼでC末端にタグ付けします。このレポーターはアクチン細胞骨格と結合しているため、アクチンを切断しても細胞の細胞質に留まります。ATG4Bを介した切断により、従来とは異なる分泌によってGLUCが放出され、細胞のATG4B活性の相関関係として細胞培養から上清を採取することで監視できます。このホワイトペーパーでは、このルシフェラーゼベースのアッセイを自動ハイスループットスクリーニングに応用する方法を紹介します。細胞ATG4B活性の例示的なハイスループット解析のためのワークフローと最適化について説明します。
Introduction
オートファジーは、細胞が細胞内の恒常性を維持し、リソソームを介して老化した、欠陥のある、または不要な細胞内容物を分解することによってストレスに応答できるようにする保存された代謝プロセスです1,2,3。いくつかの病態生理学的条件下では、このプロセスは栄養素と酸素の欠乏に対する重要な細胞応答として機能し、栄養素と脂質がリサイクルされ、細胞が代謝ニーズに適応することを可能にします2,3,4。オートファジーは、神経変性疾患、病原体感染、各種がんなど、いくつかの疾患に関連する細胞ストレス応答としても確認されています。がんにおけるオートファジーの機能は複雑で、腫瘍の種類、病期、状態によって異なります。損傷した細胞のオートファジー分解によって腫瘍形成を抑制することができますが、低酸素、栄養欠乏、細胞傷害性損傷などのストレスの多い条件下での細胞生存を改善することにより、進行性腫瘍の生存を促進することもできます2,4,5,6。
いくつかの研究は、オートファジー阻害が抗がん戦略として有益であることを示しました。したがって、オートファゴソームの形成やリソソームとの融合などの重要なステップの阻害は、がん制御の効果的な方法である可能性があります2,4,5,6。ATG4Bが特定の病態に関与していることが次々と明らかになってきており、抗がん剤の標的として注目されています2,3,4。例えば、大腸がん細胞とヒト上皮成長因子受容体2(HER2)陽性乳がん細胞は、隣接する正常細胞よりもATG4B発現レベルが有意に高いことが観察されました2,4。前立腺癌細胞では、ATG4Bの阻害により、細胞株特異的に化学療法および放射線療法に対する感受性が生じた7。最近、膵管腺癌(PDAC)がATG4B阻害に対して特に脆弱であるという強力な証拠が浮上しています。例えば、遺伝子改変マウスモデルでは、ATG4B機能が断続的に失われると、PDAC腫瘍の増殖が抑制され、生存率が向上することが示されました3,4。全体として、ATG4Bは一部のがん種で高度に過剰発現しており、腫瘍の進行に関連し、がん治療抵抗性に関連しています2,4,8。
哺乳類のATG4システインプロテアーゼには、ATG4A-ATG4Dの4つのファミリーメンバーがあります。これらのタンパク質は、タンパク質のLC3 / GABARAP(ATG8)ファミリーに対していくつかの標的選択性を示し9,10,11、プロテアーゼ活性に関連しない追加の機能を有する可能性があります12,13。さらに、ATG4は、新しいタイプの翻訳後修飾であるタンパク質のATG8-イル化を調節する機能も備えています11,12。ATG4Bとその主要な基質であるLC3Bは最も広く研究されていますが、オートファジープロセスと非オートファジープロセスの制御における各サブファミリーメンバーの複雑な役割を示唆する図式が浮上しています。このことは、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、およびニトロシル化を介してATG4B活性を調節する翻訳後修飾の複雑なネットワークによってさらに裏付けられています9,10,11,12,13。
いくつかの既知のATG4B阻害剤が発表されています2,4,14,15。これらは研究ツールとして適していますが、その薬力学的プロファイル、選択性、または効力は、前臨床候補としての開発をまだ排除しています4,16。全体として、より強力で選択的な化合物を同定することが急務となっています。多くの場合、これらの化合物はタンパク質機能の優れた生化学的阻害剤ですが、細胞ベースのアッセイにおける有効性は低いです。ATG4B活性をモニターするためのアッセイには、生化学的方法や細胞ベースのアッセイなど、複数のアッセイがあります4。我々は以前、細胞内のATG4B活性をモニタリングするためのシンプルな発光ベースのハイスループットアッセイを開発した8,17。このアッセイは、細胞外環境で安定して活性であり、ATG4Bタンパク質分解活性に応答して細胞から誘導的に放出できるGaussia princeps(GLUC)由来のルシフェラーゼタンパク質を利用します18,19。
このレポーターコンストラクトでは、dNGLUCは細胞のアクチン細胞骨格に結合しています。プロテアーゼ特異的リンカーは、β-アクチンアンカーとdNGLUCの間に導入され、分泌物がリンカーの切断に依存するようになります。LC3Bの切断をモニターするために、β-アクチンとdNGLUCの間のLC3Bの全長オープンリーディングフレームを使用しました17,18,19。dNGLUCの分泌機構はよくわかっていませんが、ATG4B活性のモニタリングに特異的であり、ATG5ノックアウト細胞で発生するオートファジー全体に依存せず、古典的なシグナルペプチドを必要としない非従来型のメカニズムによって媒介されます4,18,19。このレポーターを使用して低分子やsiRNAライブラリーをスクリーニングすることに成功し、Aktプロテインキナーゼ8などのATG4B活性の新規制御因子を同定しました。この論文では、このルシフェラーゼレポーターを半自動のハイスループットスクリーニングフォーマットで使用するための詳細なプロトコルについて説明します。
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Protocol
注:アッセイプロセスの概要を 図1に示します。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関連する詳細については、 材料表 を参照してください。
1. レトロウイルス産生
注:ActinLC3dNGLUCをコードするプラスミドはpMOWS-ActinLC3dNGLUC20です。高力価のウイルス産生には、継代数の少ない細胞を使用します(理想的にはP20未満)。
- 10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で細胞をHEK293T 37°Cで加湿インキュベーターで培養し、5%CO2 の雰囲気下で80%〜90%コンフルエントになるまで培養してから、トランスフェクション用に播種します。
- トランスフェクションの前日に、細胞を1×106 細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートに播種し、2 mL/ウェルの完全増殖培地に入れます。プレートを加湿インキュベーターで5%CO2の雰囲気で一晩インキュベートします。
注:リポソームベースのトランスフェクション試薬を使用する場合は、製造元の指示に従ってください。このプロトコルは非liposomal-based試薬の使用を記述する。トランスフェクションを開始する前に、DNAトランスフェクション試薬、DNA、培地を室温(~15分)まで平衡化させます。 - トランスフェクションごとに、200 μLの無血清培地を1.5 mLの微量遠心チューブに加えます。各チューブに、以下の量のプラスミドを添加します:1,000 ngのpMOWS-ActinLC3dNGLUC;900 ngのGagPol;100 ng の VSV-G。
注:ここに記載されているプラスミドの量と培地の容量は、12ウェルプレートの場合です。別のプレートタイプを使用する場合は、転写プラスミド5 ng/μL、パッキングプラスミド4.5 ng/μL、エンベローププラスミド0.5 ng/μLの最終濃度になるように培地容量とプラスミド量を調整します。gagおよびpol発現遺伝子を含むパッキングプラスミド、およびVSV-G発現遺伝子を含むエンベローププラスミドを使用してください。 - DNAトランスフェクション試薬バイアルを30秒間ボルテックスします。トランスフェクション試薬4 μLを希釈したDNAを含む培地に直接ピペットで移します。チューブをそっと傾けて穏やかに混ぜます。
注意: 先端でプラスチックチューブの壁に触れないでください。ピペットで上下させたり、ボルテックスしたりしないでください。 - 反応液を室温で15分間インキュベートします。
- 反応液をインキュベートしながら、6ウェルプレートから古い培地を取り除き、2 mL/ウェルの新鮮な無血清培地と交換します。
- 各トランスフェクション複合体を各ウェルに滴下します。
- プレートを静かに振ったり渦巻いたりして、ウェル表面全体に均一に分布するようにします。
- プレートを5%CO2の雰囲気の加湿インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします。
- 24時間後、古い培地を新しい完全培地(2 mL/ウェル)と交換し、細胞を5%CO2の雰囲気で加湿したインキュベーターに72 時間戻します。
- 72時間後、50 mLのコニカルチューブで上清を回収し、4°C、4,000 × g で10分間遠心分離して、死細胞と破片を除去します。さらに精製するには、60 mLの大きなシリンジを使用して、上清を0.20 μmフィルターに通します。300 μLの単回使用アリコートを直ちに調製し、-80°Cで保存してください。
注意: 製品の活性を最大限に維持するために、凍結融解サイクルは避けてください。
2. レトロウイルスの形質導入
- 細胞を形質導入する前日に、10%FBSおよび1%P/Sを添加した培地の1mL/ウェル中の12ウェルプレートに中密度(PANC1×10 5細胞/ウェル)で標的細胞を播種し、5 %CO2の雰囲気の加湿インキュベーターでプレートを37°Cで一晩インキュベートします。
注:細胞の種類が異なれば接着能力も異なるため、最適な細胞密度を事前に確立する必要があります。理想的には、40%〜50%のコンフルエントさを得るために細胞密度を使用します。 - 凍結レトロウイルスアリコートを-80°Cの冷凍庫から取り出し、氷上で解凍してから使用してください。
注意: 未使用のアリコートを再凍結しないでください。 - 50 mL のコニカルチューブで、ウイルス上清とポリブレンの混合物を最終濃度 8 μg/mL で調製します。
注:後続の容量は、最終容量が 500 μL/ウェルの 12 ウェルプレートの形質導入に適用されます。最終的なウイルス上清量は、ポリブレンの存在下でさまざまなウイルス希釈液をテストすることによって推定できます。より高いまたはより低い希釈液は、導入遺伝子の所望の発現レベルおよび使用される容器のサイズに応じて使用することができる。 - 古い培地を12ウェルプレートから取り出し、各ウェルに500 μLの混合物を加えます。5%CO2の雰囲気で加湿したインキュベーターで、ウイルス上清とともに細胞を37°Cで一晩インキュベートします。
注:完全な培地(ウイルス上清を含まない)を含む 2 つのウェルを保管して、選択のコントロールとして使用します。 - ウイルス含有培地を新しい完全増殖培地(1 mL/ウェル)と交換します。細胞を加湿したインキュベーターに戻し、5%CO2 の雰囲気で48時間加熱します。
3. プールされた個体群の選択と維持
- 増殖培地を選択培地(最終濃度が1 μg/mLのピューロマイシンの完全増殖培地)と交換します。細胞の増殖を監視し、2〜3日ごとに選択培地を交換します。合流点で、6ウェルディッシュに拡張し、次に直径10cmの組織培養ディッシュに拡張します。
- 少なくとも、コントロール(形質導入されていない)細胞が完全に死滅するまでの間、細胞を選択培地に保持します。
注:成功する結果を得るには、実験プロジェクトを開始する前に、ピューロマイシンの最適濃度を決定することをお勧めします。このために、ピューロマイシンの死滅曲線を生成して、3〜10日間で形質導入されていない細胞を殺すために必要な最小濃度を決定します。 - 細胞が選択培地で増殖したら、完全な増殖培地で細胞を拡大し、実験プロジェクトのためにストックアリコートを凍結します。
注:継代番号を記録し、継代番号が5を超える冷凍ストックからプールされた個体群での作業は避けてください。アッセイを行う前に、マイコプラズマの汚染を定期的にチェックしてください。理想的には、ルシフェラーゼの最大シグナルを得るために、各アッセイの前に新鮮な細胞バッチを使用します。 - 細胞を選択培地に維持し、アッセイの前日に目的の密度に達するのに十分な細胞を播種します。
4. 化合物添加
注:Selleckchem 低分子ライブラリーは、ジメチルスルホキシド(DMSO)中のストック濃度 10 mM の 50 個の 96 ウェルプレートに 8 行 10 列に配置された約 4,000 の化合物で構成されています。
- 30 μLの化合物を、ナノスケールの音響液体ディスペンサーに適合するソースプレートの適切なウェルに分注します。384ウェルポリプロピレンプレート(384PPプレート)を使用してください。これらのプレートは密封し、-20°Cで保管してください。
注:ここで説明するスクリーニングプロトコルは、1日あたり合計10枚のアッセイプレート用です。10 μM の固定濃度を最終アッセイ濃度として使用し、24 時間のインキュベーション期間を設けました。 - コンパウンドライブラリープレートを室温で解凍します。
注意: プレートが完全に解凍され、室温に平衡化されていることを確認してください。プレート全体の温度勾配は、液体の取り扱いに影響を与える可能性があります。 - ナノスケールのアコースティックリキッドディスペンサーを使用して、50 nL/ウェルを384ウェルアッセイプレートに分注します。
注意: プログラムで選択したソースプレートと宛先プレートが、この手順で使用したプレートと一致していることを確認してください。 - スプレッドシートで調剤プログラムを作成します。
- ソフトウェアを開きます。
- 新しいプロトコルを開きます。[プロトコル]タブから、次のオプションを選択します:サンプルプレートフォーマット、384PP;サンプルプレートタイプ、384PP_DMSO2;デスティネーションプレートタイプ、CellCarrier-384 Ultra PN(図2A)。
- [Pick List]で、インポートオプション(図2B)を選択して、ディスペンスプログラムを含むスプレッドシートをインポートします(図2C)。
- [ Run protocol ](実行プロトコル)オプション(図2D)を選択し、表示された情報が正しいかどうかを確認して、[Run]( 実行)をクリックします。
- [Run status](実行ステータス)という新しいウィンドウ(図2E)で、[Start](スタート)をクリックし、プロンプトウィンドウ(図2F、G)に表示される手順に従います。
5. 細胞播種
- 細胞培養フラスコまたは細胞培養ペトリ皿から細胞をトリプシン化し、FBS含有培地を添加してトリプシンを中和します。
- 細胞懸濁液を50 mLのコニカルチューブに移し、390 × g で室温で5分間遠心分離します。次に、上清を静かに除去し、細胞ペレットを10 mLの完全増殖培地に再懸濁します。
- 細胞カウントを実行します。
- 230 mLの完全培地に4.6 × 107 個の細胞を入れた細胞懸濁液を調製します。
注:この容量と細胞密度は、10 x 384 ウェルアッセイプレートと 2 枚のデッドボリュームの 384 ウェルプレートを対象としています。 - セクション 4 で調製した 384 ウェルアッセイプレートの各ウェルに 50 μL の細胞懸濁液を分注します。
注:細胞の播種は、手動またはバルクディスペンサーを使用して行うことができます。 - 細胞を37°Cの加湿インキュベーターで5%CO2 の雰囲気で24時間インキュベートします。
6. 細胞上清の採取
注:ここで使用されているリキッドハンドリングロボットプラットフォームは、96チップのマルチチャンネルアームでリキッドハンドリングを行います。リキッドハンドリングの自動化が利用できない場合は、マルチチャンネルピペットを使用してプロトコルをロースループットフォーマットに適合させることができます。
- ラボ・オートメーション・ワークステーションのデッキを 図3に示すように構成します。
- ディスポーザブル 96 チップスタックを位置 P1 に置きます(図 3A)。
メモ: 各 96 チップスタックは、8 つの使い捨てラックで構成されています。96チップにマルチチャンネルアームを使用する場合、384ウェルプレートは4つの象限に分割されます。したがって、各チップスタックは、上清を2つのアッセイプレートから2つの空の黒色の固体384ウェルプレートに移すのに十分です。チップスタック全体は、2枚のプレートを実行するたびに交換する必要があります。 - アッセイプレートを P2 および P4 の位置に置きます(図3A)。
- 空の黒一色の 384 ウェルプレートを位置 P3 と P5 に配置します(図 3A)。
注:この柔軟で有能なロボットプラットフォームは、このアッセイに適合し、特別なプログラムが作成されました(図3B)。 - ポジション P1 からヒントを取得します。
- ポジション P2 のプレートから上清10 μLを吸引し、ポジション P3の空の黒色固体プレートに移します。
注:チップは、ウェルの底にある細胞単層を乱すことなく上清を吸引するために、ウェル内の適切な深さに配置する必要があります。 - チップを廃棄中の位置 P6 に落とします(図3A)。
- 位置P2のプレートの残りのウェルについて手順6.5〜6.7を繰り返し、次に同じ手順を繰り返して上清を位置P4から位置P5に移します。
注意: 必ず上清を回収し、対応するウェルで空の黒一色のプレートに分注してください(図3C、D)。分泌されたdNGLUCは細胞培養培地中で非常に安定しているため、プレートを密封し、暗所で4°Cで最大7日間保存することができます。
7. ルシフェラーゼアッセイ
注:レポーターで使用されているdNGLUCは、急速な信号減衰を伴うフラッシュキネティクスを示します。基質(セレンテラジン)を添加した後は発光が急速に減衰するため、上清の発光信号を測定するようにプレートリーダーを設定する必要があります。基板をウェルに注入し、数秒後にそれをよく読み取ります。このため、発光をモニタリングでき、基質インジェクターを備えたプレートリーダーを使用して、注入ステップと読み取りステップの間の時間がすべてのサンプルで均一になるようにします。プレートリーダーで使用される設定を 図4に示します。
- 天然のセレンテラジンを酸性メタノール(10 μLの3 M HClと1 mLのメタノール)に1 mg/mLのストック溶液として調製します。
注意: ラボでのメタノールの取り扱いに関する地域の健康と安全のガイダンスに従い、皮膚との接触を避けてください。アッセイを開始する前に、新鮮な作業基質溶液を調製してください。 - インジェクターポンプを初期化します(図5A)。
- チューブを脱イオン水ですすぎます(図5B-D)。
- チューブをメタノールですすいでください。
- チューブをすすぎながら、基質を 1:100 に希釈して作業基質溶液を調製します(384 ウェルプレート 1 枚の場合、基質原液から 220 μL を 21.8 mL の 1x リン酸緩衝生理食塩水 [PBS] に添加します)。
- チューブを基質作業溶液ですすぎます(図5B-D)。
- プレートをリーダーにセットし、 図4に示す設定を使用して測定を開始します。
- すべてのアッセイプレートについて、手順7.6〜7.7を繰り返します。
- すべてのアッセイプレートを使い終わったら、チューブをメタノールですすぎます。
- チューブを脱イオン水ですすいでください。
注:このステップの最後に、細胞のATG4B活性と相関する生のルシフェラーゼ値が得られます。細胞数を正規化するには、蛍光顕微鏡法で各ウェルの細胞数をカウントする次のステップが必要です。
8. 細胞の固定と染色
注意: このステップは、マルチチャンネルピペットを使用して手動で実行するか、バルクディスペンサーを使用して実行できます。
- 細胞を4%パラホルムアルデヒド(1x PBS中)で15分間固定します。
注意: ラボでのパラホルムアルデヒドの取り扱いに関する地域の健康と安全のガイダンスに従い、皮膚との接触を避けてください。可能であれば、安全フードでこの手順を実行してください。 - 1x PBSで3回洗浄します。
- 1:5,000に希釈したHoechst 33342で1x PBSで15分間核を染色します。
- 1x PBSで3回洗浄します。
9. 画像取得
注:自動顕微鏡を使用して画像取得を実行します。細胞数を決定するための画像取得の代替として、細胞内のルシフェラーゼ活性も決定できます。細胞数と細胞内ルシフェラーゼ活性のどちらを正常化するかについては、後述するように長所と短所があります。細胞数の決定は、細胞内ルシフェラーゼ値の決定よりも侵襲性が低く、変動性が低いことがわかりました。
- 顕微鏡のオペレーティングソフトウェアを起動します(図6)。
- [ 設定 ]タブで、正しい定義済みのプレート タイプを選択します。プレートタイプが事前設定されていない場合は、プレート寸法を手動で入力します。
- Eject and Loadオプションをクリックして、プレートを顕微鏡にロードします。
- 次に、 20x Air(開口数[NA]:0.4) 対物レンズを選択します。
注意: 対物レンズ カラー が正しい値に設定され、さまざまなプレートタイプで適切な焦点を合わせることができることを確認してください。 - [Channel Selection] で [Hoechst 33342] を選択します。
注意: 時間、電力、および高さのチャネル設定は、使用するプレートの種類に応じて最適化する必要があります。 - [レイアウトの定義]で、プレートからすべてのウェルを選択し、ウェルから 4 つのフィールドを選択します。
- [オンラインジョブ]で、対応するフォルダを選択して、データを解析ソフトウェアに転送します。
10. 画像解析
注:任意の画像解析ソフトウェアを使用して、取得した画像から細胞核をセグメント化してカウントできます。ここでは、複数の自動顕微鏡ファイルと互換性のある特定のオンラインソフトウェアを使用する手順について説明します。
- 画像解析ソフトウェアを起動します。
- [画像解析]タブに移動して、 画像 のセグメンテーションを開始します(図7A)。
- [ Input Image ] タブで、[ + ] 記号をクリックして新しいビルディング ブロックを追加します(図 7A)。
- リストから[Find Nuclei]オプション(図7A)を選択し、チャンネルオプションとしてHoechst 33342を選択します(図7B)。
- 画像上のセグメント化されたオブジェクトを目視で検査し、最も正確なセグメンテーション方法を選択します。
注:この実験では、方法C(図7C)を使用しました。各方法オプションには、可能な限り最適なセグメンテーションが得られるように調整できるサブカテゴリがあります。 - 次に、「Define Results」タブ(図7C)をクリックし、「Method」オプションとして「Standard Output」を選択します。
- サブカテゴリから、[ Nuclei-number of objects ]と[ Object count ]を選択します(図7C)。
- 「分析 をディスク に保存」または「 分析をデータベースに保存 」オプションを使用して、分析パイプラインを保存します。
- 「 バッチ分析 」タブで、分析するデータをツリーから選択します。
- [方法]で、手順 10.8 で保存した解析パイプラインを選択します。
注: 参照されているソフトウェアの外部からスクリプト ファイルをアップロードしたり、データベースに保存されている既存の分析をアップロードしたりすることもできます。 - Run Analysis をクリックして解析を開始します(図7D)。このワークフローの最後に、上清からの生のルシフェラーゼ値と各ウェルの細胞番号の 2 つのデータセットが生成されます。両方を使用して、セルごとのルシフェラーゼ値を正規化します。
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Representative Results
以前の論文8では、このアッセイを使用して低分子およびsiRNAライブラリーをスクリーニングし、ATG4Bの新規制御因子を同定することに成功しました。ここでは、このルシフェラーゼレポーターのプロトコールと代表的な結果を、半自動のハイスループットスクリーニングフォーマットで説明します。 図8 は、細胞核と発光の両方の生データ解析の例を示しています。ルミネッセンス測定の典型的な結果を 図8Aに示します。DMSO からの基底発光シグナルはカラム 1 に、カラム 24 には 10 μM の ATG4B 阻害剤 FMK9A の存在下で見られます。同じプレートからの核カウントの結果を 図8Bに示します。各化合物の生値を中性対照の平均値に正規化して、ATG4B活性と細胞生存率のパーセンテージを取得しました(図9A、B)。予想通り、ほとんどの化合物はATG4B活性に影響を及ぼさず、ネガティブコントロール(DMSO - 1列目)の基底発光に近い値で示されました。ハイスループットスクリーニングの品質指標であるZ'係数は、式(1)を用いて計算した。
Z' = 1 - (3 × 
) (1)
ここで、STDposはポジティブコントロール(FMK9a)の標準偏差、STDnegはネガティブコントロール(DMSO)の標準偏差、AVGposはポジティブコントロールの平均、AVGnegはネガティブコントロールの平均です。
ヒット数を選択するために、正規化された値を使用して、ATG4B阻害剤の同定のためのカットオフ値として使用される比率を計算しました。この比率は、各化合物のATG4B活性を細胞生存率で割って計算しました。比率>1はATG4B活性化因子の可能性を示し、比率<1はATG4B阻害剤の可能性を示していると考えました(図9C)。ポジティブコントロールFMK9Aと類似した比率値を持つすべての化合物を選択し、細胞毒性のある化合物を除外した。
このスクリーニングでは、53種類のATG4B阻害剤を厳選し、その活性と毒性を確認および評価しました。化合物は、100 μM から 195 nM の範囲の 2 倍希釈液として 10 濃度で試験しました。濃縮応答法で処理した細胞は、定量データに適合し、EC50 値を計算することができました。阻害剤の相対毒性は、細胞生存率データによって定量化されました。これらの結果を総合すると、このアプローチによりATG4B変調器の同定が可能であることが示されました。
図1:アッセイのワークフロー。 この実験では、安定細胞株の作製、化合物のスクリーニング、ルシフェラーゼの測定、画像取得、データ解析から始まる、安定した細胞株の作製とハイスループットアッセイのワークフローのタイムラインを詳細に説明しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:リキッドハンドラーのセットアップに関するステップバイステップの説明 。 (A) プロトコル タブの設定。(1)サンプルプレートの形式と種類を選択します。(2) 仕向地のプレートタイプを選択します。(B) ピックリスト タブ。 (1)インポートオプションを使用してスプレッドシートを インポート します。(C) Import Pick List プロンプトウィンドウ。(1) インポートするパラメータを選択します。(2) 「 インポート 」をクリックして終了します。(D)実行プロトコル。(1) 「実行 」アイコンをクリックします。(2)実行オプションを表示し、プロトコルの実行を開始するためのプロンプトウィンドウ。(E) 実行ステータス タブ (1) プロトコルを起動します。(F)ソースプレートをロードするためのプロンプトウィンドウ。(G)宛先プレートをロードするためのプロンプトウィンドウ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:リキッドハンドリングロボットの構成 。 (A)Tecanデッキの構成。(P1)50 μLディスポーザブルチップスタックの位置。(P2、P4)アッセイプレートの位置。(P3、P5)空の黒一色の 384 ウェルプレートの位置。(6ページ)使用済みのチップを廃棄する位置。(B)アッセイスクリプトのスクリーンショット。(C)MAC96吸引器の詳細のスクリーンショット。(1) 吸引液のクラスを選択します。 (2) 吸引する容量を入力します。(3)吸引するウェル位置を選択します。(D)MAC96ディスペンスの詳細のスクリーンショット。(1) 分注液のクラスを選択します。 (2) 分注する量を入力します。(3)分注するウェル位置を同じものを選択します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:ルミネセンスプレートリーダーの設定のスクリーンショット 。 (A) 測定設定 タブ。 (1)絞りを選択します。(2)距離、時間、補正係数を選択します。(B) プロトコルの一般設定。(1) プレートの種類を選択します。(2)測定モードを選択します。(3) アッセイプレートの枚数を選択します。(C)ディスペンス測定設定。(1)測定値を選択します。(2)測定時間を設定します。(3)ポンプ、吐出速度、吐出量を選択します。(4)ディスペンス順序とプレートの繰り返しを定義します。(D)ウェル選択タブ (1)測定するウェルを選択します。(2) 測定プロトコルを開始します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:ルミネセンスプレートリーダーのディスペンサー制御のスクリーンショット 。 (A) 初期化 タブ。 (1)ポンプを選択します。(2)ポンプを開始します。(B)すすぎプロトコルオプション。(1)すすぎオプションを選択します。(2) 「次へ 」をクリックして設定に移動します。(C) すすぎ タブの設定オプション。(1)ポンプを選択します。(2)チップマウントを選択します。(3) 次へ をクリックすると次のタブに移ります。 (D)すすぎを開始するためのタブ。(1) 開始 をクリックして、すすぎプロトコルを開始します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:自動ハイコンテント顕微鏡イメージングソフトウェアのスクリーンショット。 画像取得に使用する設定の詳細。(1) セットアップ タブ (2) プレートタイプを選択します。(3) イジェクト(Eject )を選択し、プレートを顕微鏡にセットします。(4) 目的を選択します。(5) チャンネルを追加します。(6) Columbusソフトウェアにデータを転送するフォルダを選択します。(7)ウェルを選択します。(8) フィールドを選択します。(9) 実験の実行 タブをクリックすると、画像取得が始まります。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:オンラインソフトウェアでの画像解析 。 (A) 画像解析 タブ。 (1) + をクリックしてビルディングブロックを追加します。(2)を選択します 核を見つける オプションを選択します。(B) 核の設定を見つけます 。(1) チャンネルを選択します。(2) セグメンテーション方法を選択します。(C) 結果の定義タブ (1) 標準出力を選択します。(2) 結果として表示するオプションを選択します。(D)画像解析。(1) バッチ解析 タブ (2) 測定値を選択します。(3) 解析方法を選択します。(4)画像解析を開始します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図8:ルシフェラーゼ測定と核数からの代表的な画像 。 (A)384ウェルアッセイプレートのルシフェラーゼ相対強度値を数字と色で表したもの。(B)画像解析結果。(1)天体の原子核数のヒートマップ。(2)各ウェルの結果を示す表。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図9:データの正規化後の代表的な結果 。 (A)同一プレート内のネガティブコントロール(DMSO)ウェルからの ATG4B 活性を示す、データ正規化後の代表的な ATG4B 活性率。活性化剤は赤色、阻害剤は青色で示され、白は活性に有意な変化がないことを示します。ネガティブコントロール(DMSO)は1列目に、ポジティブコントロール(FMK9A)は24列目にあります。(B)同じプレート内のネガティブコントロール(DMSO)ウェルからの平均細胞数に対するデータ正規化後の代表細胞生存率。増殖は緑色、毒性は赤色で示され、黄色は細胞生存率に大きな変化がないことを示します。ネガティブコントロール(DMSO)は1列目に、ポジティブコントロール(FMK9A)は24列目にあります。(C)比率値による化合物の分布。各ドットは 1 つのコンパウンドを表します。この比率は、ATG4B活性を細胞生存率で割って計算した。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルはATG4Bの抑制剤の同一証明のためのセルベースのレポーター遺伝子の試金を記述する。一次ヒットの同定は、β-アクチンとdNGLUCの間のLC3Bの全長オープンリーディングフレームを発現する細胞の処理時のルシフェラーゼ活性に基づいています。このアッセイの利点は、細胞を溶解せずにdNGLUCを検出できるため、感度が高く、定量性が高く、非侵襲的であることです。この論文では、安定した細胞株と一次スクリーニングを生成するための詳細なプロトコルを提示します。プロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。
まず、ここで説明するプロトコルは、高いトランスフェクション効率と高い増殖能を示すPANC1細胞株を使用しました。このスクリーニング法は、他の細胞株を用いて実施することができるが、形質導入の有効性は細胞株ごとに異なる場合がある。第二に、レポーターの発現レベルが時間の経過とともに低下する可能性があるため、継代数が5を超える凍結ストックからの安定した細胞集団での作業は避けるべきです。第 3 に、各アッセイの前に新鮮な細胞バッチを使用して、さまざまな実験でルシフェラーゼの最大かつ一貫したシグナルを得ることが重要です。第 4 に、手動またはバルクディスペンサーを使用して細胞を播種する場合、細胞懸濁液を絶えず攪拌して、プレート全体で均一な細胞密度を達成する必要があります。第五に、ウェルから上澄み液を採取する場合、ウェル底部の細胞単層を乱すことなく上清を吸引するために、ウェル内の適切な深さに先端を配置することが重要です。最後に、基質作業溶液はアッセイ当日に調製する必要があります。セレンテラジンは非常に感光性が高く、酸化しやすく、調製後に基質が急速に崩壊するという報告もあります。
ATG4Bの阻害または活性化の結果を調べるために、多くの細胞ベースのアッセイが利用可能ですが、ATG4Bの細胞活性を調べることは限られたままです4。この方法は、非侵襲的で、高感度で、頑健であり、その活性がdNGLUCの放出をもたらすため、ATG4B活性に直接依存します。記載されているプロトコールは単純で、10 x 384 ウェルプレートのスクリーニングに短時間しかかかりません。この方法のもう一つの利点は、dNGLUCは非常に安定であり、血清からex vivoで測定できるため、in vivoでのATG4B活性のモニタリングに使用できることです。
このレポーターを使用して低分子およびsiRNAライブラリーをスクリーニングし、ATG4B活性の新規制御因子を同定することに成功しましたが、このプロトコルには考慮すべきいくつかの制限があります。第1に、記載された細胞ベースのアッセイは、ATG4B活性の変化を間接的に反映するレポーター読み出しに依存しており、ATG4B活性の阻害剤と活性化剤の両方の検出を可能にします。したがって、ヒットは、その特異性と活性が検証されるように、さらに評価を受ける必要があります。さらに、阻害剤は、細胞内のLC3または他のオートファジー関連タンパク質の空間分布を調節する能力についてさらに評価する必要があります。第二に、このアッセイは、取り扱いとデータ解析が簡単なため、より小規模なアッセイに簡単に変更できますが、基質の添加とその後の発光測定にはある程度の自動化が必要です。第三に、dNGLUCの放出メカニズムは分子レベルでは十分に理解されていないため、分泌経路の要素に干渉する化合物が結果に影響を与える可能性があります。最後に、細胞生存率は、細胞内ルシフェラーゼ活性によっても決定できます。細胞数の測定は、細胞内ルシフェラーゼ値の決定よりも侵襲性が低く、変動性が低いことがわかりましたが、細胞数の測定は、イメージング機器、データ解析ソフトウェア、およびデータストレージの点で困難であるため、小規模な研究室での使用が制限されます。全体として、開発された細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイにより、ATG4B阻害剤の同定が可能になります。
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Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B、MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1、Pancreatic Cancer UK(助成金参照2018RIF_15)、およびUCL Therapeutic Acceleration Supportスキームへの英国医学研究評議会のコア資金によって支援され、MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054からの資金提供によって支援されました。ActinLC3dNGLUC(pMOWS-ActinLC3dNGLUC)をコードするプラスミドは、Dr. Robin Ketteler(Department of Human Medicine, Medical School Berlin)から入手しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
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