Summary
Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’utilisation d’un test rapporteur à base de luciférase dans un format de criblage semi-automatisé à haut débit.
Abstract
De plus en plus de preuves ont montré qu’un flux autophagique élevé est lié à la progression tumorale et à la résistance au traitement anticancéreux. Le dosage des protéines d’autophagie individuelles est une condition préalable aux stratégies thérapeutiques ciblant cette voie. Il a été démontré que l’inhibition de la protéase de l’autophagie ATG4B augmente la survie globale, ce qui suggère que l’ATG4B pourrait être une cible médicamenteuse potentielle pour le traitement du cancer. Notre laboratoire a mis au point un test sélectif à base de luciférase pour le suivi de l’activité de l’ATG4B dans les cellules. Pour ce test, le substrat d’ATG4B, LC3B, est marqué à l’extrémité C avec une luciférase sécrétée du copépode marin Gaussia princeps (GLUC). Ce rapporteur est lié au cytosquelette d’actine, le maintenant ainsi dans le cytoplasme des cellules lorsqu’il n’est pas clivé. Le clivage médié par l’ATG4B entraîne la libération de GLUC par sécrétion non conventionnelle, qui peut ensuite être surveillée en récoltant des surnageants de culture cellulaire en tant que corrélat de l’activité cellulaire de l’ATG4B. Cet article présente l’adaptation de ce test à base de luciférase au criblage automatisé à haut débit. Nous décrivons le flux de travail et l’optimisation pour une analyse exemplaire à haut débit de l’activité cellulaire ATG4B.
Introduction
L’autophagie est un processus métabolique conservé qui permet aux cellules de maintenir l’homéostasie intracellulaire et de répondre au stress en dégradant le contenu cellulaire vieilli, défectueux ou inutile via les lysosomes 1,2,3. Dans certaines conditions physiopathologiques, ce processus agit comme une réponse cellulaire cruciale à la privation de nutriments et d’oxygène, ce qui se traduit par le recyclage des nutriments et des lipides, permettant aux cellules de s’adapter à leurs besoins métaboliques 2,3,4. L’autophagie a également été identifiée comme une réponse cellulaire au stress liée à plusieurs maladies, telles que les troubles neurodégénératifs, les infections pathogènes et divers types de cancer. La fonction de l’autophagie dans le cancer est complexe et dépend du type, du stade et de l’état de la tumeur. Il peut supprimer la tumorigenèse par dégradation autophagique des cellules endommagées, mais peut également favoriser la survie des tumeurs avancées en améliorant la survie des cellules dans des conditions stressantes, telles que l’hypoxie, la privation de nutriments et les dommages cytotoxiques 2,4,5,6.
Plusieurs études ont montré que l’inhibition de l’autophagie offre un avantage en tant que stratégie anticancéreuse. Ainsi, l’inhibition d’étapes critiques, telles que la formation de l’autophagosome ou sa fusion avec le lysosome, pourrait être une méthode efficace pour le contrôle du cancer 2,4,5,6. De plus en plus de preuves ont montré que l’ATG4B est impliqué dans certaines conditions pathologiques, et il a attiré l’attention en tant que cible anticancéreuse potentielle 2,3,4. Par exemple, il a été observé que les cellules cancéreuses colorectales et les cellules cancéreuses du sein positives pour le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2) avaient des niveaux d’expression d’ATG4B significativement plus élevés que les cellules normales adjacentes 2,4. Dans les cellules cancéreuses de la prostate, l’inhibition de l’ATG4B a entraîné une susceptibilité spécifique de la lignée cellulaire à la chimiothérapie et à la radiothérapie7. Récemment, des preuves solides ont émergé que l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est particulièrement vulnérable à l’inhibition de l’ATG4B. Par exemple, dans un modèle murin génétiquement modifié, il a été démontré que la perte intermittente de la fonction ATG4B réduit la croissance tumorale de la PDAC et augmente la survie 3,4. Dans l’ensemble, l’ATG4B est fortement surexprimé dans certains types de cancer, est lié à la progression de la tumeur et est lié à la résistance au traitement anticancéreux 2,4,8.
Les protéases de cystéine ATG4 chez les mammifères ont quatre membres de la famille, ATG4A-ATG4D. Ces protéines présentent une certaine sélectivité vis-à-vis de la famille des protéines LC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 et peuvent avoir des fonctions supplémentaires non liées à leur activité protéase12,13. De plus, l’ATG4 fonctionne dans la régulation d’un nouveau type de modification post-traductionnelle, l’ATG8-ylation des protéines11,12. Alors que l’ATG4B et son substrat principal LC3B sont les plus étudiés, une image émerge qui suggère un rôle complexe pour chaque membre de la sous-famille dans la régulation des processus autophagiques et non autophagiques. Ceci est en outre corroboré par un réseau complexe de modifications post-traductionnelles qui régulent l’activité de l’ATG4B via la phosphorylation, l’acétylation, la glycosylation et la nitrosylation 9,10,11,12,13.
Plusieurs inhibiteurs connus de l’ATG4B ont été publiés 2,4,14,15. Bien qu’ils conviennent comme outils de recherche, leur profil pharmacodynamique, leur sélectivité ou leur puissance les ont encore empêchés de se développer en tant que candidats précliniques 4,16. Dans l’ensemble, il est urgent d’identifier des composés plus puissants et plus sélectifs. Souvent, les composés sont de bons inhibiteurs biochimiques de la fonction des protéines, mais leur efficacité dans les tests cellulaires est médiocre. Il existe plusieurs tests pour surveiller l’activité de l’ATG4B, y compris des méthodes biochimiques et des tests cellulaires4. Nous avons précédemment développé un test simple, basé sur la luminescence et à haut débit, pour surveiller l’activité de l’ATG4B dans les cellules 8,17. Ce test utilise une protéine luciférase de Gaussia princeps (GLUC) qui est stable et active dans le milieu extracellulaire et peut être libérée de manière inductive par les cellules en réponse à l’activité protéolytique ATG4B18,19.
Dans cette construction rapporteure, dNGLUC est lié au cytosquelette d’actine des cellules. Un agent de liaison spécifique de la protéase peut être introduit entre l’ancre β-actine et le dNGLUC, ce qui rend la sécrétion dépendante du clivage du liant. Nous avons utilisé le cadre de lecture ouvert sur toute la longueur de la LC3B entre la β-actine et le dNGLUC, afin de pouvoir surveiller le clivage de la LC3B17,18,19. Bien que le mécanisme de sécrétion de dNGLUC soit mal compris, il est spécifique pour le suivi de l’activité de l’ATG4B, ne dépend pas de l’autophagie globale telle qu’elle se produit dans les cellules knock-out de l’ATG5, et est médié par des mécanismes non conventionnels qui ne nécessitent pas de peptide signal classique 4,18,19. Nous avons utilisé avec succès ce rapporteur pour cribler de petites molécules et des banques de siRNA, et avons identifié de nouveaux régulateurs de l’activité de l’ATG4B, tels que les protéines kinasesAkt 8. Cet article décrit un protocole détaillé pour l’utilisation de ce rapporteur de luciférase dans un format de criblage semi-automatisé à haut débit.
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Protocol
REMARQUE : Le processus d’analyse est décrit à la figure 1. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole.
1. Production de rétrovirus
NOTE : Le plasmide codant pour l’ActinLC3dNGLUC est pMOWS-ActinLC3dNGLUC20. Utilisez un nombre de cellules à faible passage pour la production de virus à titre élevé (idéalement inférieur à P20).
- Cultiver des cellules HEK293T dans le milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco, complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S) à 37 °C dans un incubateur humidifié, avec une atmosphère de 5 % de CO2 jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 80 % à 90 % avant d’être ensemencées pour la transfection.
- La veille de la transfection, ensemencer les cellules dans une plaque à 6 puits à une densité de 1 × 106 cellules/puits dans 2 mL/puits de milieu de culture complet. Incuber la plaque pendant une nuit dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO2.
REMARQUE : Suivez les instructions du fabricant si vous utilisez un réactif de transfection à base liposomale. Ce protocole décrit l’utilisation d’un réactif non liposomal. Avant de commencer la transfection, laissez le réactif de transfection d’ADN, l’ADN et le milieu s’équilibrer à température ambiante (~15 min). - Pour chaque transfection, ajouter 200 μL de milieu sans sérum dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Dans chaque tube, ajouter les quantités suivantes de plasmides : 1 000 ng de pMOWS-ActinLC3dNGLUC ; 900 ng de GagPol ; 100 ng de VSV-G.
REMARQUE : La quantité de plasmides et le volume de milieux indiqués ici sont pour une plaque à 12 puits. Si vous utilisez un autre type de plaque, ajustez le volume du milieu et les quantités de plasmide pour atteindre la concentration finale de 5 ng/μL de plasmide de transfert, 4,5 ng/μL de plasmide d’emballage et 0,5 ng/μL de plasmide d’enveloppe. Utilisez n’importe quel plasmide d’emballage qui contient des gènes exprimant Gag et Pol, et tout plasmide d’enveloppe qui contient le gène exprimant VSV-G. - Vortex le flacon de réactif de transfection d’ADN pendant 30 s. Pipeter 4 μL du réactif de transfection directement dans le milieu contenant l’ADN dilué. Mélangez délicatement en basculant doucement le tube.
REMARQUE : Ne touchez pas les parois des tubes en plastique avec les embouts. Ne pas pipeter de haut en bas ou de vortex. - Incuber la réaction pendant 15 min à température ambiante.
- Pendant l’incubation de la réaction, retirez l’ancien milieu de la plaque à 6 puits et remplacez-le par 2 mL/puits de milieu frais sans sérum.
- Ajouter chaque complexe de transfection à chaque puits de manière goutte à goutte.
- Secouez ou faites tourner doucement la plaque pour assurer une répartition uniforme sur toute la surface du puits.
- Incuber la plaque pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO2.
- Après 24 h, remplacer l’ancien milieu par un milieu complet frais (2 mL/puits) et remettre les cellules dans l’incubateur humidifié avec une atmosphère de 5 % de CO2 pendant 72 h.
- Après 72 h, récolter le surnageant dans un tube conique de 50 mL et centrifuger pendant 10 min à 4 000 × g à 4 °C pour éliminer les cellules mortes et les débris. Pour une purification plus poussée, utilisez une grande seringue de 60 ml pour faire passer le surnageant à travers un filtre de 0,20 μm. Préparer immédiatement des aliquotes à usage unique de 300 μL et les conserver à -80 °C.
REMARQUE : Évitez un cycle de gel-dégel pour maintenir une activité maximale du produit.
2. Transduction rétrovirale
- La veille de la transduction des cellules, ensemencer les cellules cibles à densité moyenne (PANC1 à 1 × 10 5 cellules/puits) dans une plaque de 12 puits dans 1 mL/puits de milieu supplémenté en 10 % de FBS et 1 % de P/S. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de5 % de CO2.
REMARQUE : La meilleure densité cellulaire doit être établie à l’avance, car différents types de cellules ont des capacités de fixation différentes. Idéalement, utilisez une densité cellulaire pour obtenir une confluence de 40 % à 50 %. - Retirer les aliquotes de rétrovirus congelées du congélateur à -80 °C et les décongeler sur glace avant chaque utilisation.
REMARQUE : Ne pas recongeler les aliquotes inutilisées. - Dans un tube conique de 50 mL, préparer un mélange de surnageant viral et de polybrène à une concentration finale de 8 μg/mL.
NOTA : Les volumes suivants s’appliquent à la transduction d’une plaque à 12 puits contenant un volume final de 500 μL/puits. Le volume final du surnageant viral peut être estimé en testant une gamme de dilutions virales en présence de polybrène. Des dilutions plus ou moins élevées peuvent être utilisées en fonction des niveaux d’expression souhaités du transgène et de la taille du vaisseau utilisé. - Retirez l’ancien milieu de la plaque à 12 puits et ajoutez 500 μL du mélange dans chaque puits. Incuber les cellules avec le surnageant viral pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO2.
REMARQUE : Conservez deux puits avec un milieu complet (pas de surnageant viral) pour les utiliser comme témoin de la sélection. - Remplacer le milieu contenant le virus par un milieu de culture complet frais (1 ml/puits). Replacer les cellules dans l’incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO2 pendant 48 h.
3. Sélection et maintien de la population groupée
- Remplacer le milieu de culture par un milieu de sélection (milieu de culture complet avec une concentration finale de 1 μg/mL de puromycine). Surveillez la croissance des cellules et changez le milieu de sélection tous les 2-3 jours. À la confluence, étendez-le dans une boîte à 6 puits, puis dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm de diamètre.
- Conservez les cellules dans le milieu de sélection au moins aussi longtemps qu’il le faut pour que les cellules témoins (non transduites) meurent complètement.
REMARQUE : Pour obtenir de bons résultats, il est recommandé de déterminer les concentrations optimales de puromycine avant de lancer le projet expérimental. Pour cela, générez une courbe de destruction de la puromycine afin de déterminer la concentration minimale requise pour tuer les cellules non transduites entre 3 et 10 jours. - Une fois que les cellules se développent dans le milieu de sélection, étendre les cellules sur un milieu de culture complet et congeler les aliquotes pour le projet expérimental.
NOTA : Noter le numéro de passage et éviter de travailler avec des populations regroupées provenant de stocks congelés dont le numéro de passage est supérieur à cinq. Vérifiez régulièrement la contamination par les mycoplasmes avant d’effectuer le test. Idéalement, utilisez un lot de cellules fraîches avant chaque test pour obtenir le signal maximal de luciférase. - Maintenir les cellules dans un milieu de sélection et ensemencer suffisamment de cellules pour atteindre la densité désirée la veille de l’essai.
4. Addition de composés
REMARQUE : La bibliothèque de petites molécules de Selleckchem se compose d’environ 4 000 composés disposés en huit rangées et 10 colonnes dans cinquante plaques de 96 puits à une concentration de 10 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Aliquote 30 μL de composé dans le puits approprié d’une plaque source compatible avec un distributeur de liquide acoustique à l’échelle nanométrique. Utilisez une plaque en polypropylène à 384 puits (plaque 384PP). Conservez ces plaques scellées et stockées à -20 °C.
REMARQUE : Le protocole de dépistage décrit ici est pour un total de 10 plaques d’analyse par jour ; une concentration fixe de 10 μM a été utilisée comme concentration finale ainsi qu’une période d’incubation de 24 h. - Décongeler les plaques de la bibliothèque composée à température ambiante.
REMARQUE : Assurez-vous que la plaque est complètement décongelée et équilibrée à température ambiante. Un gradient de température à travers la plaque peut affecter la manipulation des liquides. - Distribuer 50 nL/puits dans une plaque d’analyse de 384 puits à l’aide d’un distributeur de liquide acoustique à l’échelle nanométrique.
REMARQUE : Assurez-vous que les plaques source et de destination sélectionnées dans le programme correspondent à celles utilisées pour cette étape. - Créez un programme de distribution sur une feuille de calcul.
- Ouvrez le logiciel.
- Ouvrez un nouveau protocole. Dans l’onglet Protocole , sélectionnez les options suivantes : Format de la plaque d’échantillonnage, 384PP ; Type de plaque d’échantillonnage, 384PP_DMSO2 ; et Type de plaque de destination, CellCarrier-384 Ultra PN (Figure 2A).
- Sous Liste de sélection, sélectionnez l’option d’importation (Figure 2B) pour importer la feuille de calcul contenant le programme de distribution (Figure 2C).
- Sélectionnez l’option Exécuter le protocole (Figure 2D), vérifiez si les informations affichées sont correctes, puis cliquez sur Exécuter.
- Dans la nouvelle fenêtre intitulée État de l’exécution (Figure 2E), cliquez sur Démarrer et suivez les étapes affichées dans les fenêtres d’invite (Figure 2F,G).
5. Ensemencement cellulaire
- Trypsiniser les cellules à partir d’une fiole de culture cellulaire ou d’une boîte de Pétri de culture cellulaire et neutraliser la trypsine en ajoutant un milieu contenant du FBS.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 mL et centrifuger à 390 × g pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, retirez délicatement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu de culture complet.
- Effectuez le comptage des cellules.
- Préparer la suspension cellulaire avec 4,6 × 107 cellules dans 230 mL de milieu de culture complet.
REMARQUE : Ce volume et cette densité de cellules sont pour 10 plaques d’essai de 384 puits plus un volume mort de deux plaques de 384 puits. - Verser 50 μL de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque d’essai de 384 puits, préparée dans la section 4.
REMARQUE : L’ensemencement des cellules peut être effectué manuellement ou à l’aide d’un distributeur en vrac. - Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO2 pendant 24 h.
6. Récolte du surnageant cellulaire
REMARQUE : La plate-forme robotique de manipulation de liquides utilisée ici effectue la manipulation de liquides avec un bras multicanal pour 96 pointes. Si aucune automatisation de la manipulation des liquides n’est disponible, le protocole peut être adapté au format à faible débit en utilisant des pipettes multicanaux.
- Configurez la plate-forme du poste de travail d’automatisation de laboratoire comme illustré à la figure 3.
- Placez la pile jetable de 96 embouts sur la position P1 (Figure 3A).
REMARQUE : Chaque pile de 96 pointes est formée de huit racks jetables. Lors de l’utilisation d’un bras multicanal pour 96 pointes, la plaque de 384 puits est divisée en quatre quadrants. Ainsi, chaque pile de pointes est suffisante pour transférer le surnageant de deux plaques d’essai dans deux plaques vides, noires pleines, de 384 puits. L’ensemble de la pile de pointes doit être remplacé après chaque série de deux plaques. - Placez les plaques d’essai sur les positions P2 et P4 (Figure 3A).
- Placez les plaques noires pleines de 384 puits sur les positions P3 et P5 (Figure 3A).
NOTE : Cette plate-forme robotique flexible et performante a été adaptée pour ce test et un programme spécial a été rédigé (Figure 3B). - Obtenez les conseils de la position P1.
- Aspirer 10 μL de surnageant de la plaque en position P2 et transférer dans la plaque noire unie vide en position P3.
REMARQUE : Les pointes doivent être positionnées à une profondeur appropriée à l’intérieur des puits pour aspirer le surnageant sans perturber la monocouche cellulaire au fond du puits. - Déposez les embouts dans les déchets en position P6 (Figure 3A).
- Répétez les étapes 6.5 à 6.7 pour les puits restants de la plaque en position P2, puis répétez les mêmes étapes pour transférer le surnageant de la position P4 à la position P5.
REMARQUE : Assurez-vous de recueillir le surnageant et de le distribuer sur les puits correspondants dans la plaque noire unie vide (Figure 3C,D). Comme le dNGLUC sécrété est très stable dans le milieu de culture cellulaire, les plaques peuvent être scellées et conservées jusqu’à 7 jours à 4 °C dans l’obscurité.
7. Test de la luciférase
REMARQUE : Le dNGLUC utilisé dans le rapporteur présente une cinétique de flash avec une décroissance rapide du signal. En raison de la décroissance rapide de la luminescence après l’ajout de substrat (cœlentérazine), le lecteur de plaques doit être réglé pour mesurer le signal de luminescence dans les surnageants ; Injectez le substrat dans un puits et lisez-le bien après quelques secondes. Pour cette raison, utilisez un lecteur de plaques capable de surveiller la luminescence et équipé d’un injecteur de substrat pour vous assurer que le temps entre les étapes d’injection et de lecture sera uniforme pour tous les échantillons. Les réglages utilisés sur le lecteur de plaques sont illustrés à la figure 4.
- Préparer la cœlenérazine native sous forme de solution mère de 1 mg/mL dans du méthanol acidifié (10 μL de HCl 3 M pour 1 mL de méthanol).
REMARQUE : Suivez les directives locales en matière de santé et de sécurité concernant la manipulation du méthanol en laboratoire et évitez tout contact avec la peau. Préparez la solution de substrat de travail fraîche avant de commencer le dosage. - Initialisez la pompe d’injection (Figure 5A).
- Rincez le tube avec de l’eau déminéralisée (Figure 5B-D).
- Rincez le tube avec du méthanol.
- Pendant le rinçage du tube, préparez la solution de substrat de travail en diluant le substrat 1 :100 (pour une plaque de 384 puits, ajoutez 220 μL de la solution mère de substrat dans 21,8 mL de solution saline tamponnée au phosphate 1x [PBS]).
- Rincez le tube avec la solution de travail du substrat (Figure 5B-D).
- Chargez la plaque dans le lecteur et démarrez la mesure à l’aide des paramètres décrits à la Figure 4.
- Répétez les étapes 7.6 à 7.7 pour toutes les plaques d’essai.
- Une fois que vous avez terminé avec toutes les plaques de dosage, rincez le tube avec du méthanol.
- Rincez le tube avec de l’eau déminéralisée.
REMARQUE : À la fin de cette étape, des valeurs brutes de luciférase sont obtenues qui sont corrélatives à l’activité cellulaire de l’ATG4B. Pour normaliser le nombre de cellules, les étapes suivantes sont nécessaires en comptant le nombre de cellules dans chaque puits par microscopie à fluorescence.
8. Fixation et coloration des cellules
REMARQUE : Cette étape peut être effectuée manuellement à l’aide d’une pipette multicanaux ou à l’aide d’un distributeur en vrac.
- Fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde (dans 1x PBS) pendant 15 min.
REMARQUE : Suivez les directives locales en matière de santé et de sécurité concernant la manipulation du paraformaldéhyde en laboratoire et évitez tout contact avec la peau. Effectuez cette étape dans une cagoule de sécurité si possible. - Laver trois fois avec 1x PBS.
- Colorer les noyaux avec Hoechst 33342 dilué 1 :5 000 dans 1x PBS pendant 15 min.
- Laver trois fois avec 1x PBS.
9. Acquisition d’images
REMARQUE : Effectuez l’acquisition d’images à l’aide d’un microscope automatisé. Comme alternative à l’acquisition d’images pour déterminer le nombre de cellules, l’activité intracellulaire de la luciférase peut également être déterminée. Il y a des avantages et des inconvénients à ce que l’on normalise le nombre de cellules ou l’activité intracellulaire de la luciférase, ce qui est discuté ci-dessous. Nous constatons que la détermination du nombre de cellules est moins invasive et entraîne une variabilité plus faible que la détermination des valeurs intracellulaires de la luciférase.
- Lancez le logiciel d’exploitation du microscope (Figure 6).
- Dans l’onglet Configuration , choisissez le type de plaque prédéfini approprié. Si le type de plaque n’est pas prédéfini, saisissez manuellement les dimensions de la plaque.
- Chargez la plaque dans le microscope en cliquant sur l’option Éjecter et charger .
- Ensuite, choisissez l’objectif 20x Air (ouverture numérique [NA] : 0,4).
REMARQUE : Assurez-vous que le collier d’objectif est réglé sur la bonne valeur, ce qui permet une mise au point correcte avec différents types de plaques. - Sous Channel Selection (Sélection du canal), sélectionnez Hoechst 33342.
REMARQUE : Les paramètres de canal pour le temps, la puissance et la hauteur doivent être optimisés en fonction du type de plaque utilisé. - Dans Définir la mise en page, sélectionnez tous les puits de la plaque et quatre champs du puits.
- Sur Online Jobs, sélectionnez le dossier correspondant pour transférer les données vers le logiciel d’analyse.
10. Analyse d’images
REMARQUE : N’importe quel logiciel d’analyse d’images peut être utilisé pour segmenter et compter les noyaux cellulaires à partir des images acquises. Nous décrivons ici les étapes à suivre pour utiliser un logiciel en ligne spécifique compatible avec plusieurs fichiers de microscopes automatisés.
- Lancez le logiciel d’analyse d’images.
- Accédez à l’onglet Image Analysis (Analyse d’image ) pour lancer la segmentation de l’image (Figure 7A).
- Dans l’onglet Image d’entrée , cliquez sur le signe + pour ajouter un nouveau bloc de construction (Figure 7A).
- Dans la liste, sélectionnez l’option Find Nuclei (Rechercher les noyaux) (Figure 7A) et sélectionnez Hoechst 33342 comme option de canal (Figure 7B).
- Inspectez visuellement les objets segmentés sur l’image et sélectionnez la méthode de segmentation la plus précise.
REMARQUE : Pour cette expérience, nous avons utilisé la méthode C (Figure 7C). Chaque option de méthode comporte des sous-catégories qui peuvent être ajustées pour obtenir la meilleure segmentation possible. - Cliquez ensuite sur l’onglet Define Results (Définir les résultats ) (Figure 7C) et sélectionnez l’option Standard Output (Sortie standard ) comme Method (Méthode ).
- Dans la sous-catégorie, sélectionnez Nombre de noyaux d’objets et Nombre d’objets (Figure 7C).
- Enregistrez le pipeline d’analyse à l’aide de l’option Enregistrer l’analyse sur le disque ou Enregistrer l’analyse dans la base de données .
- Sous l’onglet Analyse par lots , sélectionnez les données à analyser dans l’arborescence.
- Sous Méthode, sélectionnez le pipeline d’analyse enregistré à l’étape 10.8.
REMARQUE : Il est également possible de télécharger un fichier de script à partir de l’extérieur du logiciel référencé ou de télécharger une analyse existante enregistrée dans la base de données. - Cliquez sur Run Analysis (Exécuter l’analyse ) pour lancer l’analyse (Figure 7D). À la fin de ce processus, deux jeux de données sont générés : les valeurs brutes de luciférase des surnageants et le nombre de cellules dans chaque puits. Utilisez les deux pour normaliser la valeur de la luciférase par cellule.
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Representative Results
Dans une publication précédente8, nous avons utilisé avec succès ce test pour cribler de petites molécules et des banques de siRNA et identifié de nouveaux régulateurs de l’ATG4B. Nous décrivons ici le protocole et les résultats représentatifs de ce rapporteur de luciférase dans un format de criblage semi-automatisé à haut débit. La figure 8 montre un exemple d’analyse des données brutes pour les noyaux cellulaires et la luminescence. Un résultat typique d’une mesure de luminescence est illustré à la figure 8A. Le signal de luminescence basale du DMSO peut être vu dans la colonne 1, et en présence de 10 μM de l’inhibiteur de l’ATG4B FMK9A dans la colonne 24. Le résultat du nombre de noyaux de la même plaque est visible à la figure 8B. Les valeurs brutes de chaque composé ont été normalisées en valeurs moyennes de contrôle neutres afin d’obtenir le pourcentage d’activité de l’ATG4B et la survie cellulaire (Figure 9A,B). Comme on pouvait s’y attendre, la plupart des composés n’ont eu aucun effet sur l’activité de l’ATG4B, comme l’indiquent les valeurs proches de la luminescence basale du témoin négatif (DMSO - colonne 1). Le facteur Z', qui est un indice de qualité pour le criblage à haut débit, a été calculé à l’aide de l’équation (1) :
Z' = 1 - (3 × 
) (1)
Où STDpos est l’écart-type du témoin positif (FMK9a), STDneg est l’écart-type du témoin négatif (DMSO), AVGpos est la moyenne du témoin positif et AVGneg est la moyenne du témoin négatif.
Pour sélectionner les correspondances, nous avons utilisé les valeurs normalisées pour calculer un ratio à utiliser comme valeur seuil pour l’identification des inhibiteurs de l’ATG4B. Le rapport a été calculé en divisant l’activité ATG4B de chaque composé par sa viabilité cellulaire. Nous avons considéré que les ratios >1 indiquaient des activateurs possibles de l’ATG4B et les rapports <1 indiquaient des inhibiteurs possibles de l’ATG4B (Figure 9C). Nous avons sélectionné tous les composés dont les valeurs de rapport étaient similaires à celles du témoin positif FMK9A et exclu les composés cytotoxiques.
Dans ce crible, nous avons sélectionné 53 inhibiteurs de l’ATG4B pour confirmer et évaluer leur activité et leur toxicité. Les composés ont été testés à 10 concentrations sous forme de dilutions doubles allant de 100 μM à 195 nM. Les cellules traitées en réponse à la concentration ont permis d’ajuster les données quantifiées et de calculer les valeurs EC50 . La toxicité relative des inhibiteurs a été quantifiée par des données de viabilité cellulaire. L’ensemble de ces résultats a montré que cette approche permet d’identifier les modulateurs ATG4B.
Figure 1 : Flux de travail de l’analyse. L’expérience détaille la chronologie de la génération de lignées cellulaires stables et un flux de travail de test à haut débit, en commençant par la génération de lignées cellulaires stables, le criblage de composés, la mesure de la luciférase, l’acquisition d’images et l’analyse des données. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Instructions étape par étape pour la configuration du manipulateur de liquides. (A) Paramètres de l’onglet Protocole. (1) Sélectionnez le format et le type de plaque d’échantillonnage. (2) Sélectionnez le type de plaque de destination. (B) Onglet Liste de sélection. (1) Utilisez l’option d’importation pour importer la feuille de calcul. (C) Fenêtre d’invite d’importation de la liste de sélection. (1) Sélectionnez les paramètres à importer. (2) Cliquez sur Importer pour conclure. (D) Protocole en cours d’exécution. (1) Cliquez sur l’icône Exécuter. (2) Fenêtre d’invite affichant l’option d’exécution et pour démarrer l’exécution du protocole. (E) Onglet État de l’exécution. (1) Démarrez le protocole. (F) Fenêtre d’invite pour le chargement de la plaque source. (G) Fenêtre d’invite pour le chargement de la plaque de destination. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Configuration du robot de manutention des liquides. (A) Configuration du tablier Tecan. (P1) Position pour la pile d’embouts jetables de 50 μL. (P2 et P4) Positions de la plaque d’essai. (P3 et P5) Positions pour les plaques vides, noires fixes, à 384 puits. (P6) Position pour l’élimination des embouts usagés. (B) Capture d’écran du script d’analyse. (C) Capture d’écran des détails de l’aspiration MAC96. (1) Sélectionnez la classe de liquide d’aspiration. (2) Saisissez le volume d’aspiration. (3) Sélectionnez les positions du puits pour l’aspiration. (D) Capture d’écran des détails de la distribution MAC96. (1) Sélectionnez la classe de liquide de distribution. (2) Saisissez le volume de distribution. (3) Sélectionnez les mêmes positions de puits pour la distribution. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Capture d’écran des paramètres du lecteur de plaques de luminescence. (A) Onglet Paramètres de mesure. (1) Sélectionnez l’ouverture. (2) Sélectionnez la distance, le temps et le facteur de correction. (B) Paramètres généraux du protocole. (1) Sélectionnez le type de plaque. (2) Sélectionnez le mode de mesure. (3) Sélectionnez le nombre de plaques d’essai. (C) Distribuer les paramètres de mesure. (1) Sélectionnez la mesure. (2) Réglez l’heure de mesure. (3) Sélectionnez la pompe, la vitesse de distribution et le volume. (4) Définissez l’ordre de distribution et la répétition de la plaque. (D) Onglet Sélection des puits. (1) Sélectionnez les puits à mesurer. (2) Démarrer le protocole de mesure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Capture d’écran de la commande du distributeur du lecteur de plaques de luminescence. (A) Onglet Initialisation. (1) Sélectionnez la pompe. (2) Démarrer la pompe. (B) Option de protocole de rinçage. (1) Sélectionnez l’option de rinçage. (2) Cliquez sur Suivant pour accéder aux paramètres. (C) Options de paramètres de l’onglet Rincez. (1) Sélectionnez la pompe. (2) Sélectionnez le support de pointe. (3) Cliquez sur suivant pour passer à l’onglet suivant. (D) Onglet pour démarrer le rinçage. (1) Cliquez sur démarrer pour lancer le protocole de rinçage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Capture d’écran du logiciel automatisé d’imagerie microscopique à haut contenu. Détails des paramètres utilisés pour l’acquisition d’images. (1) Onglet Configuration. (2) Sélectionnez le type de plaque. (3) Sélectionnez Éjecter pour charger la plaque dans le microscope. (4) Sélectionnez l’objectif. (5) Ajoutez le canal. (6) Sélectionnez le dossier dans lequel transférer les données vers le logiciel Columbus. (7) Sélectionnez les puits. (8) Sélectionnez les champs. (9) Cliquez sur l’onglet Exécuter l’expérience pour lancer l’acquisition d’images. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Analyse d’images sur un logiciel en ligne. (A) Onglet Analyse d’image. (1) Cliquez sur + pour ajouter un bloc de construction. (2) Sélectionnez l’option Rechercher des noyaux. (B) Recherchez les paramètres des noyaux. (1) Sélectionnez le canal. (2) Sélectionnez la méthode de segmentation. (C) Définir l’onglet des résultats. (1) Sélectionnez Sortie standard. (2) Sélectionnez l’option à afficher comme résultat. (D) Analyse d’images. (1) Onglet Analyse par lots. (2) Sélectionnez la mesure. (3) Sélectionnez la méthode d’analyse. (4) Lancez l’analyse de l’image. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Images représentatives des mesures de la luciférase et du nombre de noyaux. (A) Valeurs d’intensité relative de la luciférase à partir d’une plaque d’essai à 384 puits représentées par des chiffres et des couleurs. (B) Résultats de l’analyse d’image. (1) Carte thermique du nombre de noyaux d’objets. (2) Tableau présentant les résultats pour chaque puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Résultats représentatifs après normalisation des données. (A) Pourcentage représentatif de l’activité ATG4B après normalisation des données en moyenne de l’activité ATG4B des puits témoins négatifs (DMSO) à l’intérieur de la même plaque. Les activateurs sont indiqués en rouge et les inhibiteurs en bleu, le blanc n’indiquant aucun changement significatif dans l’activité. Le contrôle négatif (DMSO) se trouve dans la colonne 1 et le contrôle positif (FMK9A) se trouve dans la colonne 24. (B) Pourcentage représentatif de viabilité cellulaire après normalisation des données en nombre moyen de cellules provenant de puits témoins négatifs (DMSO) à l’intérieur de la même plaque. La prolifération est représentée en vert et la toxicité en rouge, le jaune n’indiquant aucun changement significatif dans la viabilité cellulaire. Le contrôle négatif (DMSO) se trouve dans la colonne 1 et le contrôle positif (FMK9A) se trouve dans la colonne 24. (C) Répartition des composés en fonction de la valeur du rapport. Chaque point représente un composé. Le rapport a été calculé en divisant l’activité d’ATG4B par la viabilité cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole décrit un test de gène rapporteur basé sur des cellules pour l’identification d’inhibiteurs de l’ATG4B. L’identification des hits primaires est basée sur l’activité de la luciférase lors du traitement des cellules exprimant le cadre de lecture ouvert sur toute la longueur de la LC3B entre la β-actine et le dNGLUC. Certains avantages de ce test sont qu’il est sensible, hautement quantitatif et non invasif, car il peut détecter le dNGLUC sans lyser les cellules. Cet article présente un protocole détaillé pour la génération d’une lignée cellulaire stable et un criblage primaire. Il y a quelques étapes critiques dans le protocole.
Tout d’abord, le protocole décrit ici a utilisé la lignée cellulaire PANC1, qui présente une grande efficacité de transfection et une grande capacité de prolifération. Cette méthode de criblage peut être réalisée à partir d’autres lignées cellulaires, mais l’efficacité de la transduction peut varier d’une lignée cellulaire à l’autre. Deuxièmement, il faut éviter de travailler avec des populations cellulaires stables provenant de stocks congelés dont le nombre de passages est supérieur à cinq, car les niveaux d’expression du rapporteur peuvent diminuer avec le temps. Troisièmement, il est important d’utiliser un lot de cellules fraîches avant chaque test pour obtenir le signal maximal et cohérent de luciférase dans les différentes expériences. Quatrièmement, lors de l’ensemencement des cellules, soit manuellement, soit à l’aide d’un distributeur en vrac, la suspension cellulaire doit être constamment agitée pour obtenir une densité cellulaire homogène dans toute la plaque. Cinquièmement, lors de la récolte du surnageant dans le puits, il est important que les pointes soient positionnées à une profondeur appropriée à l’intérieur des puits pour aspirer le surnageant sans perturber la monocouche cellulaire au fond du puits. Enfin, la solution de travail du substrat doit être préparée le jour de l’essai. La cœlenérazine est très sensible à la lumière et sujette à l’oxydation, et il y a quelques rapports de décomposition rapide du substrat après la préparation.
Un certain nombre de tests cellulaires sont disponibles pour étudier les conséquences de l’inhibition ou de l’activation de l’ATG4B, mais l’examen de l’activité cellulaire de l’ATG4B reste limité4. Cette méthode est non invasive, très sensible, robuste et dépend directement de l’activité de l’ATG4B, car son activité entraîne la libération de dNGLUC. Le protocole décrit est simple et ne nécessite que peu de temps pour cribler 10 plaques de 384 puits. Un autre avantage de la méthode est qu’elle peut être utilisée pour surveiller l’activité de l’ATG4B in vivo, car le dNGLUC est très stable et peut être mesuré ex vivo à partir du sérum.
Bien que nous ayons utilisé avec succès ce rapporteur pour cribler de petites molécules et des banques de siRNA et identifié de nouveaux régulateurs de l’activité de l’ATG4B, il y a quelques limites à prendre en compte dans ce protocole. Tout d’abord, le test cellulaire décrit repose sur une lecture rapporteur qui reflète indirectement les changements dans l’activité de l’ATG4B, permettant la détection à la fois des inhibiteurs et des activateurs de l’activité de l’ATG4B. Par conséquent, les résultats doivent faire l’objet d’une évaluation plus approfondie afin que leur spécificité et leur activité soient validées. De plus, les inhibiteurs devraient être évalués plus avant dans leur capacité à réguler la distribution spatiale de la LC3 dans les cellules ou celle d’autres protéines liées à l’autophagie. Deuxièmement, bien que ce test puisse facilement être modifié en un test à plus petite échelle en raison de sa manipulation et de son analyse des données simples, il nécessite un certain degré d’automatisation pour l’ajout de substrat et la mesure ultérieure de la luminescence. Troisièmement, parce que le mécanisme de libération de dNGLUC est mal compris au niveau moléculaire, les composés interférant avec des éléments de la voie de sécrétion peuvent affecter les résultats. Enfin, la viabilité cellulaire peut également être déterminée par l’activité intracellulaire de la luciférase. Bien que nous trouvions que la détermination du nombre de cellules est moins invasive et entraîne une variabilité plus faible que la détermination des valeurs de luciférase intracellulaire, la détermination du nombre de cellules limite leur utilisation pour les petits laboratoires de recherche car ils présentent des difficultés en termes d’équipement d’imagerie, de logiciel d’analyse de données et de stockage de données. Dans l’ensemble, le test de gène rapporteur basé sur les cellules permet d’identifier les inhibiteurs de l’ATG4B.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le financement de base du Conseil de la recherche médicale du Royaume-Uni pour la subvention d’unité universitaire MRC-UCL Ref MC_U12266B, la subvention de la plateforme de démence MRC UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (référence de subvention 2018RIF_15) et le programme de soutien à l’accélération thérapeutique de l’UCL, soutenu par le financement de MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Le plasmide codant pour l’ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) a été obtenu auprès du Dr Robin Ketteler (Département de médecine humaine, Faculté de médecine de Berlin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
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