Biology

Alignement de données de séries chronologiques synchronisées à l’aide du modèle de synchronisation de perte de cycle cellulaire caractérisant pour les comparaisons entre expériences

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65466

Sophia A. Campione¹, Christina M. Kelliher², David A. Orlando³, Trung Q. Tran⁴, Steven B. Haase¹

¹Department of Biology, Duke University, ²Department of Biology, University of Massachusetts, ³Orlando Data Science LLC, ⁴Department of Computer Science, Duke University

Summary

L’un des défis de l’analyse des expériences de séries chronologiques synchronisées est que les expériences diffèrent souvent par la durée de récupération de la synchronie et la période du cycle cellulaire. Ainsi, les mesures de différentes expériences ne peuvent pas être analysées globalement ou facilement comparées. Ici, nous décrivons une méthode d’alignement des expériences pour permettre des comparaisons spécifiques à la phase.

Abstract

L’étude du cycle cellulaire dépend souvent de la synchronisation des populations cellulaires pour mesurer divers paramètres dans une série chronologique lorsque les cellules traversent le cycle cellulaire. Cependant, même dans des conditions similaires, les expériences de répétition montrent des différences dans le temps nécessaire pour récupérer de la synchronie et traverser le cycle cellulaire, empêchant ainsi les comparaisons directes à chaque point temporel. Le problème de la comparaison des mesures dynamiques entre les expériences est exacerbé dans les populations mutantes ou dans d’autres conditions de croissance qui affectent le temps de récupération synchrone et / ou la période du cycle cellulaire.

Nous avons déjà publié un modèle mathématique paramétrique nommé Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) qui surveille la façon dont les populations synchrones de cellules se libèrent de la synchronie et progressent dans le cycle cellulaire. Les paramètres appris du modèle peuvent ensuite être utilisés pour convertir des points temporels expérimentaux d’expériences de séries chronologiques synchronisées en une échelle de temps normalisée (points de ligne de vie). Plutôt que de représenter le temps écoulé en minutes à partir du début de l’expérience, l’échelle de la ligne de vie représente la progression de la synchronie à l’entrée dans le cycle cellulaire, puis à travers les phases du cycle cellulaire. Étant donné que les points de survie correspondent à la phase de la cellule moyenne au sein de la population synchronisée, cette échelle de temps normalisée permet des comparaisons directes entre les expériences, y compris celles dont les périodes et les temps de récupération varient. En outre, le modèle a été utilisé pour aligner les expériences de cycle cellulaire entre différentes espèces (par exemple, Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe), permettant ainsi une comparaison directe des mesures du cycle cellulaire, ce qui peut révéler des similitudes et des différences évolutives.

Introduction

Les mesures de séries chronologiques effectuées sur des populations synchronisées de cellules au fur et à mesure qu’elles progressent dans le cycle cellulaire constituent une méthode standard pour étudier les mécanismes qui contrôlent la progression du cycle cellulaire 1,2,3,4,5,6,7,8 . La capacité de faire des comparaisons entre les expériences de séries chronologiques de synchronie / libération est essentielle à notre compréhension de ces processus dynamiques. L’utilisation d’expériences répétées pour corroborer les résultats peut accroître la confiance dans la reproductibilité des conclusions. En outre, les comparaisons entre les conditions environnementales, entre les mutants et même entre les espèces peuvent révéler de nombreuses nouvelles connaissances sur la régulation du cycle cellulaire. Cependant, la variabilité interexpérimentale dans la récupération de la synchronie et dans la vitesse de progression du cycle cellulaire nuit à la capacité de faire des comparaisons temporelles point à point entre les répétitions ou entre les expériences avec un calendrier du cycle cellulaire modifié. En raison de ces difficultés, les répétitions ne sont souvent pas incluses pour la série chronologique complète (p. ex., Spellman et ^coll.4). Lorsque des répétitions pour l’ensemble de la série chronologique sont recueillies, les données ne peuvent pas être analysées globalement, mais une seule répétition est utilisée pour l’analyse, et d’autres répétitions sont souvent reléguées à des chiffres supplémentaires (p. ex., Orlando et ^coll.8). En outre, les comparaisons entre les expériences présentant différentes caractéristiques de récupération ou de progression du cycle cellulaire sont difficiles. Les mesures d’intervalles plus petits entre un événement d’intérêt et un point de repère du cycle cellulaire (p. ex., émergence des bourgeons, entrée en phase S ou début de l’anaphase) peuvent aider à réduire les erreurs si ces événements marquants sont suivis 1,2,3,9,10,11,12. Cependant, des différences subtiles mais importantes peuvent rester non détectées ou masquées à l’aide de ces méthodes ad hoc. Enfin, les analyses unicellulaires permettent d’analyser la progression du cycle cellulaire sans recourir à la synchronisation ou à l’alignement¹³, bien que les mesures à grande échelle dans les études unicellulaires puissent être difficiles et coûteuses.

Pour surmonter ces difficultés, nous avons développé le modèle CLOCCS (Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony) pour faciliter l’analyse des mesures de séries chronologiques effectuées sur des populations synchronisées^14,15. CLOCCS est un modèle mathématique flexible qui décrit la distribution des cellules synchronisées à travers les phases du cycle cellulaire lorsqu’elles sont libérées de la synchronie et progressent dans le cycle cellulaire. Le cadre du processus de ramification permet au modèle de tenir compte des qualités asymétriques des cellules mères et filles après division, comme observé chez S. cerevisiae, tout en étant utile pour les organismes qui se divisent par fission, comme S. pombe. Le modèle peut prendre des entrées d’un ensemble diversifié de types de mesure pour spécifier la phase du cycle cellulaire. Il peut ingérer des données de phase du cycle cellulaire bourgeonnant, qui comprennent des mesures du pourcentage de cellules bourgeonnées au fil du temps, ce qui permet d’estimer le nombre de cellules en dehors de la phase G1 non bourgeonnée^14,15. Le modèle peut également ingérer des données cytométriques en flux qui mesurent la teneur en ADN, permettant ainsi d’évaluer les transitions marquantes de G1 à S, S à G2 et de M à G1¹⁵. Des marqueurs morphologiques fluorescents peuvent également être utilisés pour identifier la phase du cycle cellulaire. Le marquage fluorescent des anneaux de myosine, des noyaux et des corps de fuseau (SPB) peut être utilisé pour déterminer la phase du cycle cellulaire, et ceux-ci ont été incorporés dans le modèle CLOCCS¹¹; Toutefois, ces mesures ne seront pas décrites dans le présent protocole. De plus, l’indice de septation a été utilisé comme entrée pour les données de modélisation de S. pombe¹⁴. Ainsi, le modèle peut être utilisé pour les analyses du cycle cellulaire dans une variété d’organismes et peut être étendu davantage.

CLOCCS est un modèle paramétrique qui permet l’inférence bayésienne complète de plusieurs paramètres à partir des données d’entrée (par exemple, pourcentage bourgeonnant, contenu en ADN). Ces paramètres comprennent le temps de récupération de la synchronie, la durée de la période du cycle cellulaire (estimée séparément pour les cellules mères et filles) et la position moyenne du cycle cellulaire des cellules à chaque point temporel. Ces paramètres représentent le comportement de la cellule moyenne dans la population, permettant au chercheur de mapper chaque point temporel à une position du cycle cellulaire exprimée comme un point de ligne de vie. La conversion en points de ligne de vie dépend des paramètres CLOCCS lambda (λ) et mu0 (μ₀)^14,15. Le paramètre λ correspond à la période moyenne du cycle cellulaire des cellules mères. Cependant, en raison du retard^{mère-fille 14,15}^, il ne s’agit pas de la période moyenne du cycle cellulaire de l’ensemble de la population qui comprend à la fois les cellules mère et fille. CLOCCS déduit en outre le paramètre delta (δ), qui correspond au délai mère-fille et, ainsi, permet le calcul de la période moyenne du cycle cellulaire de l’ensemble de la population. Enfin, étant donné que chaque expérience commence après la libération de la synchronisation du cycle cellulaire, le temps nécessaire pour récupérer à partir de la méthode de synchronisation est représenté par le paramètre CLOCCS μ₀. CLOCCS ajuste un modèle aux données de phase du cycle cellulaire d’entrée, puis déduit ces paramètres à l’aide d’un algorithme de Monte-Carlo à chaîne de Markov^14,15. En mappant plusieurs expériences à une échelle de temps de cycle cellulaire commune, des comparaisons directes spécifiques à la phase peuvent être effectuées entre des répétitions ou des expériences où le temps de récupération ou les périodes de cycle cellulaire ne sont pas identiques 8,14,15.

Comme les populations synchronisées perdent leur synchronie à un certain rythme au cours des séries chronologiques^14,15,16,17^, la variabilité du taux de perte de synchronie peut également entraver les comparaisons quantitatives entre les expériences. En identifiant l’emplacement des populations et la variance de leurs répartitions, CLOCCS tient compte des différences dans les taux de perte de synchronie. Cet outil puissant permet des comparaisons spécifiques et détaillées entre les expériences, offrant ainsi la possibilité de faire directement des comparaisons pertinentes non seulement entre les répétitions, mais aussi entre les conditions environnementales, les mutants et même les espèces qui ont un calendrier de cycle cellulaire radicalement différent^14,15.

Cet article décrit une méthode utilisant CLOCCS pour estimer les paramètres en ajustant les données des expériences de séries chronologiques de synchronie/libération, mapper les données à une échelle de ligne de vie commune, puis effectuer des comparaisons pertinentes entre les répétitions ou les expériences. L’alignement de la ligne de vie permet des comparaisons directes spécifiques à la phase entre ces expériences, ce qui permet l’agrégation et la comparaison des répétitions et de faire des comparaisons plus pertinentes entre les expériences avec différents moments de récupération et périodes de cycle cellulaire.

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Protocol

1. Collecte de données expérimentales et de phase du cycle cellulaire

Synchroniser les cellules par rapport au cycle cellulaire en utilisant la méthode de synchronisation souhaitée (p. ex., élutriation centrifuge telle que décrite dans Leman et al.18 ou arrêt des phéromones d’accouplement tel que décrit dans Rosebrock 19; Leman et al.18 et Rosebrock ¹⁹ incluent également des méthodes pour la libération de la synchronie). Commencer l’échantillonnage tout au long de la série chronologique, en veillant à ce que la série chronologique dure au moins deux cycles cellulaires complets et, de manière optimale, prélever au moins 10 échantillons par cycle cellulaire. À chaque point temporel, prélever un échantillon pour les données de phase du cycle cellulaire (bourgeonnement ou cytométrie en flux) et un échantillon pour les données expérimentales, comme décrit ci-dessous.
Si vous utilisez des données bourgeonnantes comme données de phase du cycle cellulaire, collectez des données sur le bourgeonnement pour l’alignement CLOCCS.
1. Échantillon tout au long de la série chronologique. Pour chaque point temporel, prélever des cellules et les fixer en mélangeant 200 μL de culture cellulaire soniquée avec 200 μL de solution fixatrice, comme décrit dans Leman et ^al.18.
2. Pour le bourgeonnement standard, comptez au moins 200 cellules par point temporel à l’aide d’un microscope optique transmis avec un objectif 40x et un hémocytomètre. Ajouter l’échantillon de cellules de l’étape 1.2.1 à l’hémocytomètre et diluer si la densité empêche le comptage. Notez le nombre de cellules bourgeonnées et non bourgeonnées à chaque point temporel. Calculez le pourcentage de cellules bourgeonnées et tracez pour chaque point temporel d’une courbe bourgeonnante.
  REMARQUE : D’autres méthodes de spécification des informations de phase du cycle cellulaire sont disponibles, mais elles ne sont pas décrites dans ce protocole. Les autres méthodes sont décrites dans le fichier CLOCCS readme et dans un ouvrage précédent¹¹.
Si vous utilisez des données de contenu d’ADN cytométrique en flux comme données de phase du cycle cellulaire, collectez des données de coloration de l’ADN par cytométrie en flux pour l’alignement CLOCCS cytométrique en flux.
1. Échantillon tout au long de la série chronologique. Pour chaque point temporel, collectez des cellules et corrigez-les comme décrit dans Haase et Reed²⁰.
2. Colorer l’ADN et analyser à l’aide d’une analyse cytométrique en flux standard. Un protocole de coloration recommandé pour S. cerevisiae est décrit dans Haase et Reed²⁰.
Recueillir des données omiques associées ou des données expérimentales connexes. Pour les données transcriptomiques standard, recueillir comme décrit dans Leman et ^al.18 et Kelliher et ^al.21,22. Assurez-vous que les données sont associées à des points temporels contenant des données de phase du cycle cellulaire pour permettre l’alignement en aval. Pour un alignement optimal, assurez-vous que des données de phase sont également associées à chaque point temporel contenant des données expérimentales.
REMARQUE : Les données expérimentales peuvent prendre de nombreuses formes. Traditionnellement, nous utilisons la méthode d’alignement décrite pour aligner les expériences transcriptomiques de séries chronologiques. Cependant, tout type de données associées à des points temporels peut être aligné (c.-à-d. protéomique²²).

2. Installation du logiciel requis

Remarque : Cette section suppose que Conda, Java 19 et Git sont déjà installés (Table of Materials).

Téléchargez le référentiel CLOCCS_alignment en entrant la commande suivante dans le terminal:
git clone git clone https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Créez un environnement Conda à l’aide du fichier conda_req.yml en entrant la commande suivante dans le terminal dans le dossier où le référentiel CLOCCS_alignment a été cloné :
conda env create -f conda_req.yml

3. Utiliser CLOCCS pour paramétrer les expériences

Double-cliquez sur le fichier cloccs_v2023.jar dans le dossier CLOCCS du référentiel CLOCCS_alignment et attendez qu’une interface utilisateur graphique s’ouvre. Cet écran permet de saisir des options pour l’exécution CLOCCS et affiche les résultats une fois exécutés.
Entrez les paramètres généraux.
1. Définissez Sim Anneal, Graver et Itérations en tapant dans les zones de saisie de texte associées. Sim Anneal (recuit simulé) identifie les bonnes valeurs de paramètres de départ, Burn In recherche les modes postérieurs et l’étape finale permet de tirer toutes les inférences postérieures. Des valeurs plus élevées augmentent le temps d’exécution mais augmentent également la précision.
2. Entrez les conditions expérimentales en spécifiant la température en degrés Celsius et la méthode de synchronisation à l’aide de la zone de texte intitulée Température et du menu déroulant Synchro. Méthode, respectivement.
3. Vous pouvez éventuellement configurer les paramètres avancés dans le menu Paramètres avancés. Les paramètres avancés permettent de définir des préalables pour chacun des paramètres (« mu0 », « sigma0 », « sigmav », « lambda », « bud.start », « bud.end »).
  REMARQUE: Vous trouverez plus d’informations concernant les paramètres avancés dans le fichier readme.txt dans le dossier CLOCCS du référentiel CLOCCS_alignment.
Entrez les paramètres à utiliser avec les données naissantes.
1. Choisissez la sélection appropriée dans le menu déroulant Type de modèle . L’option par défaut Bud est pour les informations standard sur le bourgeonnement de la levure bourgeonnante.
  REMARQUE: D’autres options plus avancées existent également dans le menu déroulant: Mutant pour les informations bourgeonnantes pour les mutants qui subissent plusieurs cycles de bourgeonnement sans division, BudSSLSMR pour les informations sur le bourgeonnement et les informations supplémentaires sur le corps du pôle de fuseau et l’anneau de myosine, et BudNucDivNeck pour les informations sur les bourgeons et les informations supplémentaires sur les noyaux de division et de col de bourgeon. Ces options avancées sont décrites dans le fichier CLOCCS readme et dans les travaux précédents^11,14,15.
2. Importez les données à l’aide du panneau Importation de données en tapant dans les zones de saisie de texte ou en téléchargeant un fichier en cliquant sur le bouton Sélectionner un fichier . La première colonne spécifie les points temporels. Les deux colonnes restantes spécifient les données bourgeonnantes et peuvent prendre l’une des options suivantes : le nombre de cellules non bourgeonnées (No Bud), le nombre de cellules bourgeonnées (Budd) ou le nombre total de cellules (Total).
Entrez les paramètres à utiliser avec les données cytométriques en flux. Pour chaque expérience, exécutez l’étape 3.3 ou l’étape 3.4.
REMARQUE: Les données cytométriques en flux et les données bourgeonnantes peuvent être utilisées ensemble. Bien que nous ayons décrit précédemment leur exécution ensemble¹⁵, pour cet outil, ils doivent être exécutés indépendamment puis comparés.
1. Convertissez les fichiers .fcs dans le format d’entrée CLOCCS correct pour la cytométrie en flux en suivant les instructions du fichier supplémentaire 1 (également disponible dans le référentiel CLOCCS_alignment CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt).
2. Sélectionnez la sélection Flux dans le menu déroulant Type de modèle .
3. Importez les données à l’aide du panneau Importation de données. Cliquez sur Sélectionner un fichier, puis sélectionnez le fichier généré à l’étape 3.4.1.
4. Sélectionnez les points temporels pour lesquels un ajustement CLOCCS cytométrique en flux doit être tracé en sélectionnant les points de temps dans la zone Temps d’ajustement .
Une fois que toutes les entrées ont été sélectionnées pour la cytométrie bourgeonnante ou en flux, cliquez sur le bouton Appliquer , puis cliquez sur le bouton Exemple en haut de l’écran.
Affichez la courbe bourgeonnante ou les diagrammes de cytométrie en flux avec les ajustements prévus en sélectionnant l’onglet Ajustements prévus . Cet onglet s’ouvre par défaut immédiatement après l’étape précédente.
Affichez les histogrammes de paramètres pour chaque paramètre en sélectionnant l’onglet Histogrammes des paramètres, puis en sélectionnant le sous-onglet correspondant au paramètre d’intérêt parmi les options suivantes : mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end, etc.
Affichez le tracé du score postérieur en sélectionnant l’onglet Score postérieur .
Affichez les paramètres et modifiez-les davantage en sélectionnant l’onglet Paramètres ; affichez le journal des exécutions précédentes en sélectionnant l’onglet Journal .
Obtenez les paramètres CLOCCS à partir de l’ajustement en sélectionnant l’onglet Paramètres postérieurs . La table résultante aura la forme suivante : chaque ligne se compose d’un paramètre, la dernière ligne étant la ligne postérieure. Les colonnes comprennent le paramètre prédit pour la moyenne, l’intervalle de confiance inférieur de 2,5 %, l’intervalle de confiance supérieur de 97,5 % et le taux d’acceptation.
1. Enregistrer les paramètres utilisés pour l’alignement de chaque expérience : le temps de récupération de la synchronie (μ₀) et la durée moyenne du cycle cellulaire des cellules mères (λ).
2. Calculez la période du cycle cellulaire en calculant la moyenne de la période de la cellule mère (λ) et de la période de la cellule fille (λ + δ), où δ est le délai spécifique à la fille.
  NOTE: Répétez la section 3 avec toutes les expériences à inclure dans les comparaisons.

4. Conversion des points temporels en points de ligne de vie à l’aide des fonctions de conversion Python et des paramètres CLOCCS

Remarque : La conversion entre les points de temps et les points de ligne de vie nécessite deux formules de conversion²¹. Une implémentation Python pour la conversion et la visualisation des données est disponible dans le référentiel CLOCCS_alignment et décrite ci-dessous.

Activez l’environnement Conda en entrant la commande suivante dans le terminal: conda activate CLOCCS_alignment
Ouvrez un bloc-notes Python interactif en tapant la commande suivante dans le terminal : jupyter notebook
Créez un bloc-notes Python dans le dossier souhaité.
REMARQUE : un exemple de bloc-notes a été inclus pour illustrer l’utilisation standard et peut être trouvé dans Alignment/JOVE_example.ipynb dans le référentiel d’alignement CLOCCS_.
Importez le fichier Python contenant les fonctions d’alignement en exécutant la commande suivante dans la première cellule :
%exécuter path_to_repo/cloccs_alignment/Alignement/utilitaires.py
1. Remplacez le chemin d’accès au référentiel CLOCCS_alignment par path_to_repo.
Si vous utilisez des données bourgeonnantes comme données de phase du cycle de cellule, importez une trame de données contenant le pourcentage de bourgeonnement à chaque point temporel en exécutant la commande suivante dans une nouvelle cellule :
budding_df = pd.read_csv(« path_to_folder/budding_filename.tsv », sep ="\t », index_col=0)
1. Remplacez le chemin d’accès et le nom de fichier appropriés. Si le fichier est un fichier .csv, supprimez sep ="\t »
Si vous utilisez des données bourgeonnantes comme données de phase du cycle cellulaire, alignez les données bourgeonnantes sur une échelle de temps de point de vie en entrant la fonction suivante dans une nouvelle cellule :
aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, points de temps, param_mu0, param_lambda)
1. Pour les points de temps, remplacez une liste des points de temps par l’index de la trame de données budding_df.
2. Pour param_mu0 et param_lambda, remplacez l’expérience par les paramètres appris de l’exécution CLOCCS naissante dans la section 3.
Si vous utilisez des données de cytométrie en flux, importez les données de cytométrie en flux en exécutant la commande suivante dans une nouvelle cellule :
flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
1. Par flow_input_folder, remplacez le chemin d’accès approprié au dossier contenant les fichiers .fcs de cytométrie en flux.
Si vous utilisez des données de cytométrie en flux, générez une table de conversion entre les points temporels et les points de ligne de vie pour chaque expérience en tapant la commande suivante dans une nouvelle cellule :
flow_converter = convert_tp_to_ll(points de temps, param_mu0, param_lambda)
1. Pour les points temporels, remplacez une liste des points temporels des données de cytométrie en flux.
2. Pour param_mu0 et param_lambda, remplacez l’expérience par les paramètres appris de la cytométrie en flux CLOCCS exécutée dans la section 3.
Importez la trame de données contenant les données expérimentales dans le bloc-notes en exécutant la commande suivante dans une nouvelle cellule :
data_df = pd.read_csv(« path_to_folder/exp_data_filename.tsv », sep ="\t », index_col=0)
1. Remplacez le chemin d’accès et le nom de fichier appropriés. Si le fichier est un fichier .csv, supprimez sep ="\t ».
  Remarque : Cela peut être fait pour n’importe quelle donnée tabulaire. Les données expérimentales doivent simplement avoir les points temporels comme colonnes ou index de la trame de données. Des exemples de données peuvent être trouvés dans le référentiel CLOCCS_alignment.
Alignez les données expérimentales sur une échelle de temps de ligne de vie en entrant la fonction suivante dans une nouvelle cellule :
lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, timepoints, param_mu0, param_lambda, interpolate, lowerll, upperll)
1. Pour les points de temps, remplacez une liste des points de temps comme index ou les colonnes du data_df expérimental de l’étape précédente.
2. Pour param_mu0 et param_lambda, remplacer les valeurs obtenues à la section 3 à partir de CLOCCS.
  Remarque : Les paramètres peuvent provenir de n’importe quelle exécution CLOCCS effectuée sur l’un des types de données de phase de cycle de cellule acceptés.
3. Si vous le souhaitez, remplacez interpolate par True ou False, ou laissez vide (la valeur par défaut est False).
  Remarque : Lorsque la valeur False est attribuée, les données ne sont pas interpolées. Lorsque la valeur True est attribuée, les points de ligne de vie sont arrondis et interpolés pour remplir les valeurs entre les points de ligne de vie, de sorte qu’il y ait un point par entier dans la plage des points de ligne de vie. Cela permet une meilleure comparaison entre les ensembles de données.
4. Vous pouvez également remplacer lowerll et upperll par des valeurs None ou entières.
  Remarque : Lorsque défini sur Aucun, tous les points de ligne de vie après interpolation sont conservés. Lorsque des entiers sont fournis, cela tronque les données de sorte que les points de ligne de vie vont de la ligne inférieure à la partie supérieure. Cela permet de comparer les ensembles de données avec un lowerll ou un upperll différent.
Téléchargez le jeu de données aligné sur la ligne de vie en entrant la commande suivante dans une nouvelle cellule : lifeline_aligned_df.to_csv(« path_to_desired_location/name_of_file.tsv », sep = « \t »)
Répétez les étapes 4.5-4.11 avec toutes les expériences à inclure dans les comparaisons.

5. Comparaison des courbes bourgeonnantes et des données de cytométrie en flux

Tracez les courbes bourgeonnantes avant l’alignement à l’aide de la fonction utilitaires Python en entrant la commande suivante dans une nouvelle cellule :
plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, titre = str_title)
1. Remplacez le tracé par une liste contenant les trames de données de toutes les courbes bourgeonnantes souhaitées pour list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2, bud_df3].
2. Remplacez la légende par une liste d’étiquettes [Expérience 1, Expérience 2, Mutant] leg_list si vous le souhaitez. Si ce n’est pas le cas, excluez ou remplacez Aucun.
3. Remplacez le temps par str_type.
4. Remplacez un titre de chaîne Comparaison des courbes bourgeonnantes par str_title si vous le souhaitez. Si ce n’est pas le cas, remplacez Aucun ou excluez.
Tracez les courbes bourgeonnantes après l’alignement à l’aide de la fonction utilitaires Python en suivant les instructions de l’étape 5.1, mais avec une liste de courbes bourgeonnantes alignées substituées à list_of_budding_curves et avec une ligne de vie pour point_type au lieu du temps.
Pour tracer les données de cytométrie en flux, tracez les données associées à partir des fichiers .fcs aux points de ligne de vie correspondants à l’aide du convertisseur généré à l’étape 4.8.
Convertissez les points de ligne de vie en phase de cycle cellulaire à l’aide de la table de conversion (Tableau 1).
REMARQUE: Cela peut également être tracé en suivant les instructions de l’étape 5.1, mais avec une phase pour point_type au lieu de temps.

6. Comparaison des données expérimentales

Déterminez la liste des gènes à tracer dans les graphiques linéaires en fonction de l’information de la littérature ou des gènes d’intérêt pour la recherche.
Utilisez les plot_linegraph_comparison fournies dans le fichier d’utilitaires Python pour effectuer des comparaisons de graphiques linéaires sur le bloc de données d’origine, aligné ou aligné et interpolé en tapant la commande suivante dans une nouvelle cellule :
plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, généliste, point_type = str_type, titre = str_title)
1. Substituez une liste des cadres de données des expériences à comparer à list_of_dfs.
  Remarque : Les blocs de données peuvent être désalignés ou alignés ; Toutefois, les point_type correspondantes doivent être saisies à l’étape 6.2.4.
2. Remplacez une liste des titres pour chaque bloc de données dans le même ordre que la liste des blocs de données pour list_for_legend.
3. Substituer une liste des noms de gènes (qui doivent être inclus dans l’index des bases de données) à tracer pour la liste génétique.
4. Remplacez le type de point par str_type. Utilisez la ligne de vie (la valeur par défaut est l’échelle de point de ligne de vie ) ou la phase (l’échelle de ligne de vie de phase du cycle cellulaire) pour les blocs de données alignés à l’étape 6.2.1 ou le temps pour les blocs de données non alignés à l’étape 6.2.1.
5. Remplacez str_title titre de chaîne facultatif.
Déterminez la liste des gènes à inclure dans la carte thermique à l’aide de la littérature ou des algorithmes pour déterminer les gènes les plus périodiques.
REMARQUE : Pour des comparaisons appropriées de cartes thermiques, les données doivent être alignées, interpolées et ajustées en fonction de l’échelle de temps à l’étape 6.2; Il devrait avoir la même valeur de ligne de vie de début et de fin pour chaque expérience.
1. Exécutez des algorithmes de périodicité pour déterminer les gènes périodiques les plus élevés^23,24^, ou utilisez les méthodes alternatives souhaitées pour déterminer la liste des gènes (c.-à-d. les résultats de la littérature).
2. Importez un fichier de liste de gènes .csv ou .tsv dans le bloc-notes à l’aide de la commande suivante dans une nouvelle cellule :
  sort_df =.read_csv(« path_to_folder/sorting_filename.tsv », sep="\t », index_col=0)
3. Remplacez le chemin d’accès et le nom de fichier appropriés. S’il s’agit d’un fichier .csv, supprimez sep="\t ».
Utilisez la fonction fournie plot_heatmap_comparison dans le fichier d’utilitaires Python pour effectuer une comparaison de carte thermique sur le bloc de données aligné, interpolé et aligné en phase en tapant la commande suivante dans une nouvelle cellule :
plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, généliste, titre = str_title)
1. Remplacez une liste des cadres de données alignés des expériences à comparer pour list_of_dfs.
2. Remplacez une liste des titres pour chaque bloc de données dans le même ordre que la liste des blocs de données pour list_for_legend.
3. Substituer une liste des noms de gènes (qui doivent être inclus dans l’index des bases de données) à tracer pour la liste génétique.
4. Remplacez str_title titre de chaîne facultatif.
  REMARQUE: Le premier bloc de données de la liste est celui qui sera utilisé pour ordonner les gènes dans la carte thermique. Les gènes seront ordonnés par maximum dans la première période pour cette trame de données, et le même ordre sera utilisé pour les trames de données suivantes dans la liste.

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Representative Results

Les étapes décrites dans le protocole ci-dessus et dans le flux de travail de la figure 1 ont été appliquées à cinq expériences de séries chronologiques synchronisées à cycle cellulaire pour démontrer deux comparaisons représentatives: entre des répétitions avec différentes méthodes de synchronie (phéromone d’accouplement et élutriation centrifuge¹⁸) et des plates-formes de séquençage (séquençage de l’ARN [séquençage de l’ARN [séquençage de l’ARN] et microréseau), ainsi qu’entre les conditions expérimentales. Plusieurs expériences ont été réalisées avec S. cerevisiae, et des données expérimentales et de phase du cycle cellulaire ont été recueillies pour chaque expérience. Le flux de travail implique l’utilisation de CLOCCS pour paramétrer les différentes expériences de séries chronologiques de synchronie/libération, l’utilisation de ces paramètres pour aligner les expériences sur une échelle de ligne de vie comparable commune, puis l’utilisation de ces expériences alignées pour les deux comparaisons représentatives.

Pour démontrer la comparaison représentative entre les répétitions, nous avons sélectionné trois expériences réalisées avec la même souche et dans les mêmes conditions expérimentales, appelées condition 1. Deux de ces expériences étaient des répliques directes l’une de l’autre, et les deux ont été analysées par analyse de microréseaux et synchronisées par élutriation centrifuge. La troisième expérience a été analysée à l’aide d’une analyse RNA-seq et synchronisée via l’arrêt des phéromones d’accouplement du facteur alpha. Pour démontrer la deuxième comparaison entre des expériences avec différentes périodes de cycle cellulaire, l’expérience de séquençage de l’ARN de la condition 1 (période du cycle cellulaire: 71 min) ci-dessus a été comparée à la condition 2 (période du cycle cellulaire: 82 min) et à la condition 3 (période du cycle cellulaire: 110 min) (tableau 2). Pour chaque expérience, les cellules ont été cultivées dans leurs conditions respectives, synchronisées, libérées, puis échantillonnées au cours de deux périodes de cycle cellulaire ou plus. Les données de cytométrie en bourgeonnement et/ou en flux ont été recueillies pour fournir des informations sur la phase du cycle cellulaire, et des données transcriptomiques de séries chronologiques de microréseaux ou de séquences d’ARN ont été recueillies comme décrit dans Leman et ^coll.18 (tableau supplémentaire S1).

Pour chaque expérience, les données ont pris les formes décrites à la figure 2, qui présente l’expérience de la condition 2 comme exemple de démonstration. Chaque ensemble de données avait une courbe bourgeonnante, ce qui permettait d’inférer la phase du cycle cellulaire. Cette courbe comprenait une valeur en pourcentage bourgeonnant pour chaque point temporel de la série chronologique, qui a ensuite été tracée pour produire une courbe bourgeonnante affichant plusieurs oscillations du cycle cellulaire (Figure 2). Les données de phase du cycle cellulaire ont également pris la forme de données de coloration du contenu de l’ADN cytométrique en flux pour chaque point temporel de la série chronologique. Certains points temporels pour la condition 2 ont été tracés (Figure 2). Les fichiers de cytométrie en flux ont été combinés en une seule table comprenant les cellules de chaque bac de fluorescence logarithmique pour chaque point temporel de saisie dans le CLOCCS à l’aide de la fonction flow_cytometry_CLOCCS_file_from_fcs dans les utilitaires Python. Chaque ensemble de données contenait également des données expérimentales. Dans ce cas, les données étaient des données transcriptomiques, et les données étaient organisées en rangées de gènes, chacun avec une valeur pour l’abondance de l’ARN à chaque point temporel de l’expérience (Figure 2).

Nous avons démontré l’utilisation de CLOCCS et la conversion en points de ligne de vie pour l’ensemble de données RNA-seq de la condition 2; Cependant, le processus était identique pour les autres expériences. Les informations naissantes ont été entrées dans l’algorithme CLOCCS tel que décrit dans la section 3 du protocole et comme le montre la figure 3A. Les valeurs par défaut pour Sim Anneal, Graver dans, Itérations et Paramètres avancés ont été utilisées. Les conditions expérimentales appropriées ont été sélectionnées. Le type de modèle « Bud » a été utilisé pour les données bourgeonnantes. Les ajustements de bourgeonnement CLOCCS qui en ont résulté ont été examinés pour s’assurer que les courbes bourgeonnantes étaient correctement ajustées, comme le démontrent les points de données superposant la courbe d’ajustement correspondante avec une petite bande de confiance de 95 % (figure 3B et figure supplémentaire S1). Les paramètres μ₀ et λ du tableau des paramètres postérieurs (figure 3C) ont été enregistrés pour être utilisés dans l’alignement. Les données de cytométrie en flux pour la condition 2 ont été entrées séparément dans CLOCCS, comme décrit dans la section 3 du protocole. Actuellement, CLOCCS s’attend à ce que les cytomètres en flux produisent des données de 10 bits avec 1 024 canaux; Cependant, les cytomètres de flux modernes peuvent avoir plus de canaux. Étant donné que notre cytomètre en flux produit des données avec plus de 1 024 canaux, les données ont été regroupées dans 1 024 bacs. Avec les données de phase du cycle cellulaire de cytométrie en flux, CLOCCS produit un ajustement CLOCCS pour chaque point temporel sélectionné (Figure 3D et Figure supplémentaire S2) et fournit un tableau des paramètres postérieurs similaire au tableau des paramètres postérieurs bourgeonnant de la Figure 3C. Les paramètres de bourgeonnement que CLOCCS exécute pour chacune des autres expériences sont décrits dans le tableau 2, et les paramètres de la cytométrie en flux exécutée par CLOCCS sont décrits dans le tableau supplémentaire S2.

Les paramètres CLOCCS correspondant à la période du cycle cellulaire des cellules mères (λ) et au temps de récupération (μ₀) ont été utilisés pour l’alignement de la ligne de vie. Il est important de noter que λ ne représente pas nécessairement la période moyenne du cycle cellulaire de la population cellulaire. Dans les cas où les cellules subissent une division complète, il y a un nombre égal de cellules mères et filles, de sorte que la période moyenne du cycle cellulaire est la moyenne entre la période de cycle cellulaire des cellules mères (λ) et la période de cycle cellulaire des cellules filles (λ + δ); Plus précisément, delta (δ) est la durée du délai spécifique à la fille. C’est le calcul que nous avons utilisé pour la période du cycle cellulaire de chaque expérience (tableau 2). Pour chaque expérience, les paramètres correspondants λ et μ₀ ont ensuite été utilisés dans la fonction de conversion, df_conversion_from_parameters, fournie dans le fichier d’utilitaires Python, comme illustré pour la condition 2 (Figure 4A). Pour les courbes bourgeonnantes, les données n’ont pas été interpolées. Cependant, pour les données expérimentales, les ensembles de données alignés sur la ligne de vie ont été rééchantillonnés à l’aide d’interpolation de sorte que chaque point de ligne de vie contienne des données interpolées pour améliorer le traçage. Pour s’assurer que les ensembles de données alignés sur la ligne de vie avaient la même plage de points de ligne de vie, des limites de ligne de vie inférieures et supérieures ont été définies pour tronquer les données à ces points. Ces paramètres lowerll et upperll ont été entrés dans la fonction df_conversion_from_parameters lorsque l’interpolation a été définie sur True. Pour la comparaison de la condition 1, ils ont été fixés à 44 et 270, respectivement, pour tous les ensembles de données, et pour la comparaison entre les conditions environnementales, ils ont été fixés à 50 et 300, respectivement. Un exemple d’utilisation de ces fonctions pour l’alignement et la comparaison peut être vu dans l’exemple de bloc-notes Python JOVE_example.ipynb, et le code utilisé pour générer les figures peut être vu dans le bloc-notes JOVE_Figures.ipynb dans le référentiel CLOCCS_alignment.

Cette conversion des points temporels en points de ligne de vie dépend de deux formules²¹ (Figure 4A) utilisant μ₀ (temps de récupération) et λ (période mère). La première formule, , Equation 1 est la formule de la phase de récupération (Figure 4A). Cette formule est utilisée uniquement pour les points temporels de la phase de récupération, qui comprend les points temporels jusqu’à μ 0 inclus, puisque μ₀ correspond au temps de récupération. Les points temporels sont ensuite convertis en une plage d’échelle de ligne de vie se terminant par 100 points de ligne de vie (tableau 1), marquant la fin de la phase de récupération et le début du premier cycle cellulaire. La phase post-récupération utilise la deuxième formule Equation 2 (Figure 4A), qui convertit chaque point de temps post-récupération ultérieur en un point de ligne de vie après 100. Chaque 100 points de ligne de vie suivants correspond à un nouveau cycle cellulaire, le premier cycle correspondant aux points de ligne de vie 100 à 200, le deuxième cycle correspondant aux points de ligne de vie 200 à 300, et ainsi de suite (tableau 1). La conversion des points temporels en points de ligne de vie est appliquée à chaque jeu de données individuellement à l’aide des paramètres CLOCCS correspondants pour ce jeu de données. Une fois que chaque jeu de données est converti à l’échelle de la ligne de vie, les phases du cycle cellulaire sont alignées, ce qui permet des comparaisons spécifiques aux phases entre les ensembles de données.

Le tableau 3 montre la conversion de points temporels sélectionnés en points de ligne de vie respectifs pour la conversion représentative de l’ensemble de données de la condition 2 à l’aide des paramètres de l’exécution CLOCCS naissante. Les données bourgeonnantes recueillies à partir du séquençage d’ARN de la condition 2 ont été tracées dans une courbe bourgeonnante montrant le pourcentage de bourgeons bourgeonnés au fil du temps pour l’échelle de temps non alignée en minutes (Figure 4B) et l’échelle de temps alignée en points de ligne de vie (Figure 4C) en utilisant la fonction Python plot_budding_curves dans un cahier Python. Les points de la ligne de vie pouvaient être facilement convertis en informations expérimentales et de phase du cycle cellulaire (tableau 1), et la phase de récupération et les cycles de la première à la troisième cellule ont été codés à la main en conséquence (Figure 4B, C). Étant donné que chaque point de ligne de vie correspondait à une phase du cycle cellulaire, les tracés individuels de cytométrie en flux pouvaient être étiquetés via les fonctions Python en utilisant la phase du cycle cellulaire déterminée par l’alignement de la ligne de vie. Ces phases correspondaient aux phases déterminées par analyse cytométrique en flux pour la condition 2. Les données de cytométrie en flux recueillies pour l’ensemble de données de la condition 2 ont été tracées pour des points temporels sélectionnés et étiquetées à l’aide de la phase du cycle cellulaire déterminée à partir de l’alignement de la ligne de vie de cytométrie en flux. Dans chaque cas, les données correspondaient à la phase déterminée par l’alignement (Figure 4D).

Il est important de noter que le niveau d’expression de chaque gène pour chaque échantillon reste le même, mais l’étiquetage des points temporels est modifié de temps en minutes à points de ligne de vie. Cependant, la conversion n’est pas linéaire. La phase de récupération, surlignée en gris, occupe un pourcentage plus élevé du temps expérimental une fois que la conversion en points de vie a été effectuée (Figure 4B,C). L’avantage de l’échelle de ligne de vie est qu’elle permet des informations détaillées sur les phases et des comparaisons de phases entre les expériences. Les informations de phase sont contenues dans les points de ligne de vie, comme décrit ci-dessus et affiché dans le tableau 1. De plus, G1 est contenu dans les 15,5 premiers points de ligne de vie de chaque cycle cellulaire, S dans les 20 points de ligne de vie suivants et G2/M dans les 64,5 points de ligne de vie suivants (tableau 1). Cependant, cela contraint artificiellement le temps de récupération à la même période de chaque cycle cellulaire consécutif, même si la phase de récupération semble très courte dans l’échelle de temps d’origine. Cela n’obscurcit pas les comparaisons, car les phases de chaque expérience sont alignées. Dans la plupart des cas, il est plus pertinent de comparer les données à des points qui se produisent à la même phase expérimentale et biologique plutôt qu’à des points temporels qui se produisent en même temps en minutes.

Une fois que toutes les expériences ont été converties à l’échelle de ligne de vie alignée à l’aide des fonctions Python fournies dans le fichier d’utilitaires Python, elles peuvent être comparées. Ici, nous démontrons deux comparaisons courantes entre les expériences: l’une entre les répétitions d’une expérience similaire sur les plates-formes et les méthodes de synchronisation (Figure 5) et l’autre entre différentes conditions expérimentales avec une durée de période variable (Figure 6 et Figure 7). Comme décrit ci-dessus, la première comparaison porte sur deux réplicas de microréseaux élutriés et une expérience de séquençage d’ARN synchronisé à facteur alpha. Avant l’alignement, les deux réplications de microréseaux présentaient une synchronie et une dynamique du cycle cellulaire similaires, mais la réplication de la condition 1 Microarray 2 semblait légèrement retardée (Figure 5A). La différence la plus frappante a été constatée lors de la comparaison des ensembles de données non alignés; le deuxième cycle de séquençage de l’ARN de la condition 1 semblait aligné sur le premier cycle des deux expériences de microréseaux. La différence n’était probablement pas liée aux différentes plates-formes transcriptomiques, mais plutôt aux différentes méthodes de synchronisation. Les populations cellulaires dans les expériences de microréseaux ont été synchronisées par élutriation centrifuge, tandis que la population pour l’expérience RNA-seq a été synchronisée par un traitement de phéromone d’accouplement. En effet, la synchronisation avec la phéromone d’accouplement a considérablement réduit le temps de récupération par rapport à l’élutriation (Figure 5A et Tableau 2).

Malgré les différences évidentes entre les répétitions lorsqu’elles sont tracées en termes de temps écoulé, après l’alignement de la ligne de vie, les courbes étaient presque identiques et des comparaisons plus détaillées et pertinentes entre les répétitions ont été rendues possibles (Figure 5B). La phase de récupération a été alignée de sorte que chaque expérience a commencé au même point de ligne de vie, et les variations de période ont été normalisées par alignement de la ligne de vie. En raison de l’alignement, les valeurs expérimentales au même point de vie entre les répétitions se sont produites dans la même phase du cycle cellulaire, permettant ainsi de calculer la variance expérimentale entre les répétitions. Les phases de récupération et de cycle cellulaire sont étiquetées à la figure 5B pour fournir des informations supplémentaires sur les phases du cycle cellulaire dans chacune des expériences. Cet alignement de ligne de vie pourrait ensuite être appliqué à l’ensemble de données expérimentales (Figure 5C,D) à l’aide de la fonction Python df_conversion_from_parameters fournie dans le fichier utilitaires, comme décrit ci-dessus.

Dans la figure 5D, les données transcriptomiques ont été alignées et la dynamique d’expression du gène CDC20 a été tracée à l’aide de la fonction Python plot_linegraph_comparison dans un carnet Python. Avant l’alignement, il semblait que la première expression de pic des expériences de microréseaux s’alignait sur le deuxième pic de l’expérience RNA-seq (Figure 5C); cependant, après alignement, les premiers pics du cycle cellulaire de chaque ensemble de données se sont alignés correctement (Figure 5D). De plus, la largeur des pics des expériences semblait différer entre l’ensemble de données RNA-seq et les ensembles de données de microréseaux, mais après alignement, la largeur du pic était plus alignée (Figure 5C,D).

La deuxième comparaison concerne les expériences dans différentes conditions environnementales avec différentes périodes de cycle cellulaire (Figure 6). Comme décrit ci-dessus, nous avons comparé ici les ensembles de données de S. cerevisiae dans la condition 1 à la condition 2 et à la condition 3, qui correspondent à des périodes de cycle cellulaire de 71, 82 et 110 minutes, respectivement. Ces différences dans la période du cycle cellulaire ont introduit de l’incertitude lors de la comparaison entre les expériences avant l’alignement de phase du cycle cellulaire, comme le montrent les courbes bourgeonnantes non alignées. Les différences de période sont visibles dans les courbes bourgeonnantes non alignées (Figure 6A). Cependant, lorsqu’elles ont été alignées sur le CLOCCS à l’aide de ce protocole, les trois courbes semblaient remarquablement similaires, ce qui a permis de comparer les données expérimentales (Figure 6B).

À l’aide des paramètres CLOCCS de cytométrie en flux, les conditions 1 et 2 ont été alignées sur une échelle de ligne de vie commune, et les histogrammes de teneur en ADN ont été tracés dans la condition 2 et à des points de ligne de vie équivalents dans la condition 1. Les mesures cytométriques en flux de la teneur en ADN à travers les points vitaux ont été comparées (Figure 6C). Comme les mesures de la teneur en ADN n’étaient pas continues et pas facilement interpolables, nous ne pouvions comparer que les points de ligne de vie les plus proches. Les données de phase du cycle cellulaire pour chaque point de ligne de vie comparable n’étaient pas identiques entre les deux conditions (figure 6C), ce qui indique que les ajustements CLOCCS et les paramètres résultants étaient probablement légèrement mal alignés pour la condition 1. Cela était probablement dû au fait que les CLOCCS étaient moins bien adaptés aux données cytométriques en flux pour la condition 1 par rapport à la condition 2 (figure supplémentaire 2). Cependant, l’alignement n’a dévié que dans un échantillon et, par conséquent, permet toujours d’améliorer les comparaisons spécifiques à la phase.

L’alignement de la ligne de vie bourgeonnante a ensuite été appliqué aux données expérimentales pour les expériences de séquençage de l’ARN dans les conditions 1, 2 et 3 (Figure 7) en utilisant les paramètres CLOCCS bourgeonnants dans la fonction df_conversion_from_parameters sur les données expérimentales. Les données transcriptomiques ont été alignées et l’expression génique du gène CDC20 pour chaque série chronologique a été montrée pour les trois expériences. Avant l’alignement, la dynamique des transcriptions de CDC20 ne se chevauchait pas (Figure 7A). Après l’alignement, les premier et deuxième pics de l’expression du gène CDC20 étaient beaucoup plus étroitement alignés pour les trois ensembles de données. Après l’alignement, il est devenu clair que les pics se produisaient dans la même phase du cycle cellulaire, mais les formes des courbes étaient différentes (Figure 7B). La condition 3 avait un premier pic plus faible et plus large par rapport aux deux autres conditions, même après avoir pris en compte les différences dans la période du cycle cellulaire, ce qui suggère que ces différences étaient probablement liées aux conditions expérimentales testées (Figure 7B).

Des comparaisons transcriptomiques à grande échelle pourraient également être faites. Pour ces comparaisons, 278 gènes ont été sélectionnés en exécutant l’algorithme de périodicité JTK_CYCLE²³ sur chaque ensemble de données et en prenant l’intersection des gènes périodiques supérieurs. Cependant, les gènes peuvent être sélectionnés en utilisant n’importe quelle méthode souhaitée ou dans la littérature. Ces gènes ont été tracés dans le même ordre pour les trois conditions à la fois pour les cartes thermiques non alignées (Figure 7C) et alignées (Figure 7D) en utilisant la fonction Python plot_heatmap_comparison dans un carnet Python. Ces cartes thermiques permettent d’effectuer simultanément des centaines de comparaisons au niveau des gènes. Des comparaisons entre des expériences non alignées pourraient être faites concernant le changement dans la dynamique de la courbe, le temps de pointe par rapport aux gènes voisins, et la durée de la période, etc. (Figure 7C). Cependant, des comparaisons détaillées spécifiques à la phase n’ont pas pu être faites parce que les points temporels ne sont pas nécessairement corrélés à la même phase du cycle cellulaire dans toutes les conditions. Bien que les deuxièmes cycles semblaient similaires après l’alignement, les premiers cycles ont été légèrement décalés entre les conditions (figure 7D). Ce changement peut refléter le fait que l’information sur la phase du cycle cellulaire bourgeonnant était de moindre qualité pour la condition 3. Néanmoins, l’alignement des expériences pour les trois conditions a permis une meilleure comparaison spécifique à la phase. Avant l’alignement, il n’était pas clair si le premier pic d’expression dans chaque condition se produirait à la même phase du cycle cellulaire (Figure 7C); cependant, après alignement, les expériences ont pu être comparées d’une manière spécifique à la phase (Figure 7D). Avant l’alignement, les pics de la condition 3 semblaient beaucoup plus larges que dans les deux autres conditions (figure 7C); cependant, après l’alignement, il est devenu évident que les pics de la condition 3 avaient une largeur similaire à celle des autres conditions lorsqu’ils étaient alignés (figure 7D).

Ces résultats représentatifs démontrent le processus d’utilisation de CLOCCS pour aligner les expériences sur une échelle de temps commune. Avant l’alignement, les comparaisons directes de points temporels ne sont souvent pas corrélées à une phase similaire du cycle cellulaire. La conversion du temps expérimental écoulé en minutes en points de ligne de vie qui représentent la phase du cycle cellulaire permet des comparaisons spécifiques à la phase et biologiquement pertinentes entre les expériences au même point du cycle cellulaire.

Figure 1 : Vue d’ensemble du flux de travail d’alignement de ligne de vie CLOCCS. Le flux de travail expérimental pour l’alignement de deux exemples de jeux de données à l’aide de CLOCCS, suivi de comparaisons représentatives entre les jeux de données. Les principales étapes du protocole sont illustrées : la collecte de données expérimentales et de phase du cycle cellulaire non alignées pour chacun des jeux de données (étape 1), l’utilisation de CLOCCS pour le paramétrage de chaque jeu de données (étape 2 et étape 3), l’alignement des ensembles de données sur une ligne de vie commune (étape 4), et enfin, la comparaison de la phase du cycle cellulaire et de la dynamique expérimentale (étape 5 et étape 6). Les données de phase du cycle cellulaire non alignées sont entrées dans CLOCCS pour fournir des paramètres appris, qui sont ensuite utilisés pour l’alignement sur une échelle de ligne de vie commune. Ces ensembles de données alignés sont ensuite comparés. Abréviation : CLOCCS = Caractérisation de la perte de synchronisation du cycle cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Format de la phase du cycle cellulaire et données expérimentales requises pour le flux de travail. Les données requises pour le flux de travail se composent de deux composants principaux: les données de phase du cycle cellulaire et les données expérimentales du cycle cellulaire. Les données de phase du cycle cellulaire peuvent consister en des données sur le bourgeonnement du cycle cellulaire ou des données sur la teneur en ADN cytométrique en flux pour chaque point temporel de la série chronologique. Les données expérimentales peuvent prendre de nombreuses formes, mais dans ce cas, il s’agit de données transcriptomiques, qui consistent en des données d’expression génique pour chaque gène pour chaque point temporel de la série chronologique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Exemple de résultats de l’exécution de CLOCCS sur un ensemble de données du cycle cellulaire de S. cerevisiae. (A) Une capture d’écran de l’interface utilisateur graphique CLOCCS avec les valeurs d’entrée et les paramètres fournis pour les données bourgeonnantes de la condition 2. Les heures, le nombre de cellules non bourgeonnées et le nombre de cellules bourgeonnées sont saisis, ainsi que le type de modèle, les itérations et les conditions, etc. (B) Une capture d’écran de l’ajustement bourgeonnant CLOCCS résultant pour la condition 2 sous l’onglet « Ajustement prévu » des résultats. Chaque point de données est associé à une barre d’erreur d’échantillonnage correspondant aux intervalles de confiance des proportions binomiales à 95 % des données (pour chaque point temporel, au moins 200 cellules ont été comptées [entre 204 et 295 cellules]). La courbe d’ajustement bourgeonnant qui en résulte montre la bande de confiance pour l’intervalle de confiance à 95 % de l’ajustement CLOCCS en violet. (C) Une capture d’écran du tableau « Paramètres postérieurs » résultant pour l’exécution CLOCCS bourgeonnante de la condition 2 comprenant les paramètres CLOCCS à la moyenne, l’intervalle de confiance de 2,5 % et l’intervalle de confiance à 97,5 %. Les taux postérieurs et d’acceptation sont également indiqués. (D) Une capture d’écran de la cytométrie en flux CLOCCS convient à la condition 2 à 70 min et 150 min. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Exemple du processus de conversion de points temporels en points de ligne de vie alignés pour l’ensemble de données de la condition 2. (A) Les formules de conversion utilisées pour convertir des points temporels en points de ligne de vie. Une capture d’écran des fonctions Python dans le bloc-notes Python pour la conversion et le tracé des courbes bourgeonnantes. (B) La courbe bourgeonnante de la condition 2 non alignée montrant le pourcentage de bourgeonnement pour chaque point temporel en minutes. Les phases du cycle cellulaire et de la récupération sont mises en évidence comme suit: récupération (gris), premier cycle cellulaire (bleu), deuxième cycle cellulaire (magenta) et troisième cycle cellulaire (saumon). (C) La courbe bourgeonnante alignée de la condition 2 montrant les mêmes pourcentages de bourgeonnement, mais tracée sur l’échelle alignée sur la ligne de vie. Les phases de cycle cellulaire et de récupération sont mises en évidence comme dans le panneau C. (D) Les diagrammes de cytométrie en flux alignés pour certains points temporels de la condition 2 correspondant à des phases distinctes du cycle cellulaire basées sur l’échelle de la ligne de vie : le début de G1, le début de la phase S, le début de G2/M et la fin de G2/M. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Résultats représentatifs pour la comparaison des expériences de répétition de la condition 1 alignées et non alignées. La comparaison de la condition 1 se réplique : Condition 1 RNA-seq (bleu), Condition 1 microarray 1 (violet) et Condition 1 microarray 2 (gris). (A) La courbe de bourgeonnement non alignée pour les ensembles de données de la condition 1. (B) La courbe bourgeonnante alignée pour les ensembles de données de la condition 1. Les points de ligne de vie ont été convertis en phase de cycle cellulaire et sont codés par couleur sous l’axe des x. (C) L’expression génique non alignée d’un gène représentatif, CDC20, pour les ensembles de données de la condition 1. (D) L’expression génique alignée d’un gène représentatif, CDC20, pour les ensembles de données de la condition 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Résultats représentatifs pour la comparaison des données de phase du cycle cellulaire alignées et non alignées entre des expériences avec des périodes variables. Comparaison des données de phase du cycle cellulaire pour les ensembles de données avec trois conditions environnementales différentes et, par conséquent, trois périodes de cycle cellulaire différentes: Condition 1 RNA-seq (période de cycle cellulaire: 71 min), Condition 2 RNA-seq (période de cycle cellulaire: 82 min) et Condition 3 RNA-seq (période de cycle cellulaire: 110 min). (A) La courbe bourgeonnante non alignée pour les ensembles de données. (B) La courbe bourgeonnante alignée pour les ensembles de données. (C) Les histogrammes de teneur en ADN cytométrique en flux pour la condition 2 (rangée du haut) par rapport aux points de ligne de vie équivalents dans la condition 1 (rangée du bas). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Résultats représentatifs pour la comparaison des données transcriptomiques alignées et non alignées entre des expériences de différentes périodes. Comparaison des données transcriptomiques associées aux ensembles de données de la figure 6 : Condition 1 RNA-seq, Condition 2 et Condition 3. (A) L’expression génique non alignée d’un gène représentatif, CDC20, pour les ensembles de données de séquençage d’ARN de la condition 1, de la condition 2 et de la condition 3. (B) L’expression génique alignée de CDC20 pour les ensembles de données. (C) La carte thermique non alignée des gènes périodiques du cycle cellulaire supérieur dans le même ordre pour chaque ensemble de données. (D) Les cartes thermiques alignées sur la ligne de vie des mêmes gènes périodiques du cycle cellulaire du panel C dans le même ordre. Les lignes violettes pointillées correspondent aux points de la ligne de vie 100 et 200. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Conversion de phase du point de vie au cycle cellulaire. Clé de conversion entre l’échelle du point de la ligne de vie et la phase correspondante de l’expérience. Les points de ligne de vie 0-100 correspondent à la récupération de la synchronie. Chaque 100 points de ligne de vie suivants correspond à un nouveau cycle cellulaire, les 15,5 premiers points de ligne de vie correspondant à G1, les 20 suivants correspondant à la phase S et les points de ligne de vie restants correspondant à G2 / M. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Paramètres CLOCCS bourgeonnants. Les paramètres CLOCCS bourgeonnants « lambda » et « mu0 » résultants pour chaque expérience à partir des résultats représentatifs. De plus, le délai spécifique à la fille « Delta » et la période de cycle cellulaire calculée sont indiqués pour chaque expérience. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Tableau de conversion montrant la conversion entre les points temporels en minutes et leurs points de ligne de vie respectifs correspondants pour la condition 2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure supplémentaire S1 : Le bourgeonnement CLOCCS convient aux conditions 1 et 3. Capture d’écran de l’ajustement bourgeonnant CLOCCS résultant pour (A) les données de bourgeonnement de séquençage de l’ARN de la condition 1, (B) les données de bourgeonnement de la condition 1 microarray 1, (C) les données de bourgeonnement de la condition 1 microarray 2 et pour (D) les données bourgeonnantes de la condition 3. L’ajustement bourgeonnant CLOCCS pour la condition 2 peut être vu à la figure 3B. La fourchette de confiance à 95 % et les barres d’erreur d’échantillonnage sont décrites dans la documentation CLOCCS^14,15 et à la figure 3. Pour chaque point temporel de chaque série chronologique, environ 200 cellules ont été comptées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : La cytométrie en flux CLOCCS convient aux conditions 1 et 2. Capture d’écran de la cytométrie en flux CLOCCS correspond aux échantillons illustrés à la figure 6C pour la condition 2 (rangée du haut : A-D) et la condition 1 (rangée du bas : E, F). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S3 : Sensibilité de l’alignement aux variations des paramètres CLOCCS. Comparaison de l’alignement de l’ensemble de données RNA-Seq de la condition 1 en utilisant les variations (A-C) des paramètres CLOCCS λ et μ0 dans l’intervalle de confiance de l’ajustement CLOCCS et (D, E) avec de grandes variations des paramètres. Comparaison entre la valeur moyenne et les valeurs de confiance de 2,5 % et 97,5 % produites dans le tableau des paramètres par CLOCCS pour (A) le paramètre μ0, (B) le paramètre λ et (C) pour les paramètres μ0 et λ. (D) Comparaison entre l’alignement utilisant la valeur moyenne de μ0 et les grandes variations du paramètre μ0 (200 % à 0,25 % de μ0). (E) Comparaison entre l’alignement utilisant la valeur moyenne de λ et les grandes variations du paramètre λ (200 % à 0,25 % de λ). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S1 : Description de la collecte de données pour chaque expérience. Pour chaque expérience, ce tableau fournit une description des données bourgeonnantes, des données de cytométrie en flux, des données transcriptomiques et de la méthode de synchronisation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S2 : Paramètres CLOCCS des exécutions CLOCCS cytométriques en flux. Les paramètres CLOCCS « mu0 » et « lambda » pour la cytométrie en flux de la condition 1 et de la condition 2 exécutées par CLOCCS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Instructions pour la conversion des données cytométriques en flux au format d’entrée CLOCCS. Pour l’utilisation de CLOCCS avec des données de cytométrie en flux, un format d’entrée spécifique est requis. Ce fichier fournit des instructions plus détaillées concernant l’étape de protocole 3.4.1 pour expliquer comment utiliser les fonctions de l’utilitaire Python pour effectuer cette conversion. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Cet article présente une méthode permettant d’évaluer plus précisément et quantitativement les données provenant d’expériences de séries chronologiques sur des populations synchronisées de cellules. La méthode utilise les paramètres appris de CLOCCS, un modèle d’inférence bayésien qui utilise des données de phase du cycle cellulaire d’entrée, telles que les données bourgeonnantes et les données de contenu d’ADN cytométrique en flux, pour paramétrer chaque expérience^14,15. CLOCCS utilise les données de phase du cycle cellulaire d’entrée pour déduire les paramètres de chaque expérience, qui sont ensuite utilisés pour l’alignement sur une échelle de ligne de vie commune. La conversion de plusieurs expériences de séries chronologiques de synchronie/libération en une seule échelle de temps alignée sur la ligne de vie permet des comparaisons pertinentes et spécifiques à la phase entre les expériences et l’agrégation de plusieurs expériences répliquées, qui étaient auparavant difficiles ou impossibles.

Les étapes critiques de ce protocole comprennent la collecte des données, l’exécution de CLOCCS, l’alignement des jeux de données et la comparaison entre les jeux de données. Tout d’abord, les données doivent être recueillies pour être utilisées dans ce protocole. Les données doivent comprendre à la fois des données expérimentales - contenant des informations concernant la question d’intérêt (c.-à-d. données transcriptomiques, données sur l’expression génique, données protéomiques) - et des données sur la phase du cycle cellulaire - contenant des informations sur la phase du cycle cellulaire (c.-à-d. données bourgeonnements, données sur la teneur en ADN cytométrique en flux). Ensuite, les données de phase du cycle cellulaire peuvent être utilisées dans CLOCCS pour recueillir les informations de paramètres pour chaque expérience. Les paramètres μ₀ (durée de la phase de récupération) et λ (période du cycle de la cellule mère) sont utilisés pour convertir les points de temps en points de ligne de vie. L’alignement des points de ligne de vie permet de comparer directement les séries chronologiques alignées.

L’une des limites de la méthode est qu’un alignement correct dépend de l’identification d’un bon ajustement aux données. L’obtention du meilleur ajustement CLOCCS repose sur la qualité des données de phase du cycle cellulaire et l’utilisation des paramètres d’entrée corrects pour l’expérience dans CLOCCS. L’ajustement aux données de phase du cycle cellulaire détermine la précision des paramètres appris et, par conséquent, a un impact considérable sur la précision de l’alignement, car cela dépend de l’utilisation de ces paramètres. Étant donné que de vastes changements dans les paramètres affecteraient grandement l’alignement, les changements restent minimes dans l’intervalle de confiance fourni dans la sortie CLOCCS (figure supplémentaire S3). Il est important de noter que cette sensibilité aux variations des paramètres est également ce qui permet l’alignement entre les ensembles de données avec un calendrier de cycle cellulaire variable.

La précision de l’ajustement CLOCCS peut être déterminée à l’aide de la courbe d’ajustement CLOCCS résultante et des barres d’erreur et de la bande d’erreur correspondantes (Figure 3B, D, Figure supplémentaire S1 et Figure supplémentaire S2). L’onglet CLOCCS fit affiche les points de données d’origine, ainsi que la courbe d’ajustement CLOCCS avec la bande de confiance correspondant à l’intervalle de confiance de l’ajustement CLOCCS et les barres d’erreur correspondant à l’intervalle de confiance de proportion binomiale à 95% des données, puisque les comptes sont supposés être des variables aléatoires binomiales indépendantes¹⁴. Par exemple, les barres de confiance sur les données bourgeonnantes mesurent la confiance dans la proportion de cellules bourgeonnées pour un échantillon donné.

Une méthode pour déterminer la qualité de l’ajustement CLOCCS consiste à déterminer si les barres d’erreur des données chevauchent la bande d’intervalle de confiance de l’ajustement CLOCCS. Une autre indication est l’ampleur de la fourchette de confiance à 95% de l’ajustement CLOCCS. En général, la largeur de la bande diminue avec une qualité d’ajustement accrue. Une indication d’un mauvais alignement est si la phase de cycle cellulaire des données originales ne correspond pas à la phase de cycle cellulaire déduite de l’alignement. Chaque alignement peut être vérifié deux fois en confirmant que, pour chaque point temporel, la phase indiquée par les données d’information de phase du cycle cellulaire correspond à la phase du cycle cellulaire assignée par l’alignement.

Un mauvais ajustement CLOCCS ou un mauvais alignement pourrait être le résultat de données de phase de cycle cellulaire de mauvaise qualité. Les données bourgeonnantes de haute qualité auront un pourcentage de bourgeonnements très faible immédiatement après l’arrestation et un pourcentage de bourgeonnements très élevé au premier pic. Les pics et les creux suivants perdront leur synchronie, mais devraient être distincts et régulièrement espacés. Étant donné que les points de ligne de vie représentent la phase moyenne du cycle cellulaire de la population, une mauvaise synchronisation peut également entraver un alignement correct. Les données de haute qualité sur la teneur en ADN cytométrique en flux auront des pics distincts de 1C et 2C pour chaque point temporel correspondant à la phase appropriée du cycle cellulaire. De plus, l’insuffisance des données de phase du cycle cellulaire entraîne des problèmes d’identifiabilité des paramètres. Dans le cas de données suffisantes, les paramètres peuvent être déduits et ne changent pas substantiellement entre les exécutions de CLOCCS. Cependant, les paramètres décrits dans ce protocole (lambda, delta, mu0) ne peuvent pas être démêlés lorsque les données de phase du cycle cellulaire ne contiennent qu’un seul cycle cellulaire complet. Pour permettre une meilleure estimation des paramètres, des données suffisantes et bien construites sur le cycle cellulaire devraient être utilisées pour les CLOCCS fits^14,15. De plus, le modèle CLOCCS utilise des informations antérieures telles que décrites dans Orlando et ^al.15, mais ces informations peuvent être ajustées pour mieux s’adapter aux conditions expérimentales utilisées.

Si la qualité des données de phase du cycle cellulaire est bonne, le réajustement des paramètres CLOCCS peut aider à produire un ajustement plus précis. Par exemple, le nombre d’itérations sélectionnées pourrait être augmenté pour améliorer la précision. Confirmer que la méthode de synchronisation correcte a été sélectionnée dans CLOCCS peut également être utile, car l’arrêt du facteur alpha est associé à un temps de récupération plus court par rapport à l’élutriation.

Cette méthode est également limitée en termes de types de données de phase du cycle cellulaire actuellement pris en charge. Cependant, CLOCCS est flexible et peut être adapté pour prendre en charge d’autres types de données. Par exemple, CLOCCS a déjà été adapté pour prendre en charge le marquage fluorescent du cycle cellulaire des corps de fuseau, des anneaux de myosine et des noyaux¹¹ pour une utilisation comme identificateurs de phase du cycle cellulaire. De plus, l’utilisation de CLOCCS avec des espèces autres que S. cerevisiae a été rendue possible. CLOCCS accepte les indices de septation comme marqueur de la phase du cycle cellulaire chez S. pombe¹⁴, ainsi que les données de contenu de l’ADN cytométrique en flux, qui sont facilement collectables pour de nombreuses espèces¹⁵. Cela permet de comparer des données expérimentales à la même phase du cycle cellulaire pour deux espèces complètement différentes et peut donner un aperçu des changements dans le cycle cellulaire au cours de l’évolution.

Bien que seules les formes prises en charge de données de phase du cycle cellulaire puissent être utilisées avec cette méthode d’alignement de ligne de vie, cette méthode est indépendante du type de données expérimentales de séries chronologiques utilisées. Dans ce protocole, nous avons démontré son utilisation dans l’alignement de l’expression génique d’un gène individuel, ainsi que des données transcriptomiques de séries chronologiques pour des centaines de gènes en tandem. Nous avons montré que cette méthode peut être utilisée pour comparer entre les plates-formes et, par conséquent, faire des comparaisons entre les ensembles de données RNA-seq et les ensembles de données de microréseaux pris dans des conditions similaires. Nous avons également montré que cette méthode peut être utilisée pour aligner des ensembles de données avec différentes méthodes de synchronisation en comparant un ensemble de données élutrié (Condition 1 Microarray) avec un ensemble de données arrêté par facteur alpha (Condition 1 RNA-seq). Auparavant, CLOCCS a également été utilisé pour aligner des données transcriptomiques et protéomiques de séries chronologiques à l’aide de données de phase du cycle cellulaire^{bourgeonnant 22}, ce qui a permis des comparaisons directes entre la dynamique de l’ARNm et la dynamique de la protéine correspondante. CLOCCS a également été utilisé pour aligner les données de séries chronologiques entre les espèces, par exemple pour l’alignement entre S. cerevisiae et S. pombe¹⁴ et entre le premier cycle de S. cerevisiae et la levure pathogène Cryptococcus neoformans²¹. Enfin, l’alignement CLOCCS est actuellement spécifique aux données de séries chronologiques de cycles cellulaires et n’a pas encore été adapté pour être utilisé avec d’autres types de processus rythmiques. Un domaine où cela serait particulièrement intéressant est celui des rythmes circadiens, où le temps circadien (CT) est conventionnellement utilisé pour aligner les expériences, bien que sa mise en œuvre ne soit pas appliquée de manière cohérente. Un autre domaine d’intérêt est l’étude des rythmes de développement, tels que ceux du parasite du paludisme. Par exemple, l’alignement des souches de Plasmodium falciparum avec différentes périodes, tel que décrit dans Smith et ^al.25, permettrait des comparaisons plus détaillées entre les souches. L’alignement de ces processus périodiques à des fins de comparaison permettrait de mieux comprendre ces importantes fonctions biologiques rythmiques. Ces types de comparaisons de cycles cellulaires ont été rendus possibles par l’utilisation de CLOCCS pour l’alignement de la ligne de vie, comme décrit dans ce protocole.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

S. Campione et S. Haase ont bénéficié d’un financement de la National Science Foundation (DMS-1839288) et des National Institutes of Health (5R01GM126555). De plus, les auteurs aimeraient remercier Huarui Zhou (Duke University) pour ses commentaires sur le manuscrit et pour les tests bêta du protocole. Nous remercions également Francis Motta (Florida Atlantic University) et Joshua Robinson pour leur aide avec le code Java.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x PBS			For Fixative Solution. Described in Leman 2014.
4% formaldehyde			For Fixative Solution.
100% Ethanol			For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002.
CLOCCS			https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow Cytometer			For flow cytometry protocol.
Git			https://git-scm.com/
Java 19			https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
Microscope			For counting cells and buds.
Miniconda			https://docs.conda.io/en/latest/
Protease solution			For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
RNAse A solution			For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	For flow cytometry staining. Described in Haase 2002.
Tris			pH 7.5

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References

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Biology

Alignement de données de séries chronologiques synchronisées à l’aide du modèle de synchronisation de perte de cycle cellulaire caractérisant pour les comparaisons entre expériences

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Protocol

Representative Results

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Materials

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