Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

יישור נתוני סדרות זמן מסונכרנות באמצעות מודל אפיון אובדן מחזור התא לצורך השוואות בין ניסויים

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65466
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1
1Department of Biology, Duke University, 2Department of Biology, University of Massachusetts, 3Orlando Data Science LLC, 4Department of Computer Science, Duke University

Summary

אחד האתגרים בניתוח ניסויים מסונכרנים בסדרות זמן הוא שהניסויים נבדלים לעתים קרובות זה מזה במשך ההתאוששות מסנכרון ובתקופת מחזור התא. לפיכך, המדידות מניסויים שונים אינן ניתנות לניתוח מצטבר או להשוואה בקלות. במאמר זה אנו מתארים שיטה ליישור ניסויים כדי לאפשר השוואות ספציפיות לפאזה.

Abstract

חקירת מחזור התא תלויה לעתים קרובות בסנכרון אוכלוסיות תאים כדי למדוד פרמטרים שונים בסדרת זמן כאשר התאים חוצים את מחזור התא. עם זאת, גם בתנאים דומים, ניסויים משוכפלים מציגים הבדלים בזמן הדרוש כדי להתאושש מסנכרון ולחצות את מחזור התא, ובכך למנוע השוואות ישירות בכל נקודת זמן. הבעיה של השוואת מדידות דינמיות בין ניסויים מחריפה באוכלוסיות מוטנטיות או בתנאי גידול חלופיים המשפיעים על זמן ההתאוששות המסונכרן ו/או על תקופת מחזור התא.

פרסמנו בעבר מודל מתמטי פרמטרי בשם Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) המנטר כיצד אוכלוסיות סינכרוניות של תאים משתחררות מסנכרון ומתקדמות במחזור התא. לאחר מכן ניתן להשתמש בפרמטרים הנלמדים מהמודל כדי להמיר נקודות זמן ניסיוניות מניסויים מסונכרנים בסדרות זמן לסולם זמן מנורמל (נקודות קו חיים). במקום לייצג את הזמן שחלף בדקות מתחילת הניסוי, סולם קו החיים מייצג את ההתקדמות מסנכרון לכניסה למחזור התא ולאחר מכן דרך השלבים של מחזור התא. מכיוון שנקודות עורק החיים תואמות את הפאזה של התא הממוצע באוכלוסייה המסונכרנת, סולם זמן מנורמל זה מאפשר השוואה ישירה בין ניסויים, כולל אלה עם תקופות שונות וזמני התאוששות. יתר על כן, המודל שימש ליישור ניסויים במחזור התא בין מינים שונים (למשל, Saccharomyces cerevisiae ו - Schizosaccharomyces pombe), ובכך מאפשר השוואה ישירה של מדידות מחזור התא, אשר עשוי לחשוף דמיון והבדלים אבולוציוניים.

Introduction

מדידות סדרות זמן המבוצעות על אוכלוסיות מסונכרנות של תאים בזמן שהן מתקדמות במחזור התא היא שיטה סטנדרטית לחקר המנגנונים השולטים בהתקדמות מחזור התא 1,2,3,4,5,6,7,8 . היכולת לערוך השוואות בין ניסויים בסדרות זמן סינכרוני/שחרור חיונית להבנתנו את התהליכים הדינמיים הללו. השימוש בניסויים משוכפלים כדי לאשש ממצאים יכול להגביר את הביטחון ביכולת השחזור של המסקנות. יתר על כן, השוואות בין תנאי הסביבה, בין מוטנטים ואפילו בין מינים יכולים לחשוף תובנות חדשות רבות על ויסות מחזור התא. עם זאת, שונות בין-ניסויית בהתאוששות מסנכרון ובמהירות התקדמות מחזור התא פוגעת ביכולת לבצע השוואות בין נקודת זמן לנקודת זמן בין עותקים משוכפלים או בין ניסויים עם תזמון שונה של מחזור התא. בשל אתגרים אלה, עותקים משוכפלים לעתים קרובות אינם נכללים עבור הסדרה במשרה מלאה (למשל, Spellman et al.4). כאשר אוספים עותקים משוכפלים לכל סדרות הזמן, לא ניתן לנתח את הנתונים במצטבר, אלא משתמשים בשכפול יחיד לניתוח, ומשכפלים אחרים נדחקים לעתים קרובות לנתונים משלימים (למשל, אורלנדו ואחרים). יתר על כן, קשה להשוות בין ניסויים בעלי מאפייני התאוששות או התקדמות שונים של מחזור התא. המדידות של מרווחי זמן קטנים יותר בין אירוע מעניין לבין ציון דרך במחזור התא (לדוגמה, הופעת ניצן, כניסה לשלב S או תחילת אנאפאזה) יכולות לסייע בהפחתת שגיאות אם עוקבים אחר אירועים ציון דרך אלה 1,2,3,9,10,11,12. עם זאת, הבדלים עדינים אך חשובים עשויים להישאר בלתי מזוהים או מוסתרים באמצעות שיטות אד הוק אלה. לבסוף, ניתוחים של תא בודד מאפשרים לנתח את התקדמות מחזור התא מבלי להסתמך על סנכרון או יישור13, אם כי מדידות בקנה מידה גדול במחקרים על תא בודד יכולות להיות מאתגרות ויקרות.

כדי להתגבר על קשיים אלה, פיתחנו את מודל Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) כדי לסייע בניתוח מדידות סדרות זמן שבוצעו על אוכלוסיות מסונכרנות14,15. CLOCCS הוא מודל מתמטי גמיש המתאר את התפלגות התאים המסונכרנים על פני שלבי מחזור התא כשהם משתחררים מסנכרון ומתקדמים במחזור התא. מסגרת תהליך ההסתעפות מאפשרת למודל להסביר את התכונות הא-סימטריות של תאי האם והבת לאחר החלוקה, כפי שנצפה ב-S. cerevisiae, ועדיין להיות שימושית עבור אורגניזמים המתחלקים בביקוע, כגון S. pombe. המודל יכול לקחת קלט ממגוון סוגי מדידה כדי לציין את שלב מחזור התא. הוא יכול לבלוע נתוני פאזות של מחזור התא הניצני, הכוללים מדידות של אחוז התאים הניצנים לאורך זמן, מה שמאפשר להעריך את מספר התאים מחוץ לשלב G114,15 שלא ניצן. המודל יכול גם לבלוע נתונים ציטומטריים זורמים המודדים את תכולת הדנ"א, ובכך לאפשר הערכה של מעברים פורצי דרך מ-G1 ל-S, S ל-G2 ו-M ל-G115. ניתן להשתמש בסמנים מורפולוגיים פלואורסצנטיים גם כדי לזהות את שלב מחזור התא. ניתן להשתמש בתיוג הפלואורסצנטי של טבעות מיוזין, גרעינים וגופי מוטות ציר (SPBs) כדי לקבוע את שלב מחזור התא, ואלה שולבו במודל CLOCCS11; עם זאת, מדידות אלה לא יתוארו בפרוטוקול זה. בנוסף, מדד הספטציה שימש כקלט למידול נתונים מ- S. pombe14. לפיכך, המודל יכול לשמש לניתוח מחזור התא במגוון אורגניזמים וניתן להרחיב אותו עוד יותר.

CLOCCS הוא מודל פרמטרי המאפשר הסקה בייסיאנית מלאה של פרמטרים מרובים מנתוני הקלט (למשל, אחוז ניצנים, תוכן DNA). פרמטרים אלה כוללים את זמן ההתאוששות מסנכרון, אורך תקופת מחזור התא (המוערך בנפרד עבור תאי אם ובת), ואת המיקום הממוצע של מחזור התא של התאים בכל נקודת זמן. פרמטרים אלה מייצגים את התנהגות התא הממוצע באוכלוסייה, ומאפשרים לחוקר למפות בכל נקודת זמן למיקום מחזור התא המתבטא כנקודת עורק חיים. ההמרה לנקודות קו חיים תלויה בפרמטרי CLOCCS lambda (λ) ו- mu0 (μ0)14,15. הפרמטר λ מתאים לתקופת מחזור התא הממוצעת של תאי האם. עם זאת, בשל עיכובאם-בת 14,15, זו אינה תקופת מחזור התא הממוצעת של כלל האוכלוסייה הכוללת הן את תאי האם והן את תאי הבת. CLOCCS גם מסיק את הפרמטר דלתא (δ), המתאים לעיכוב אם-בת, ובכך מאפשר חישוב של תקופת מחזור התא הממוצעת של האוכלוסייה כולה. לבסוף, מכיוון שכל ניסוי מתחיל לאחר שחרור מסנכרון מחזור התא, הזמן הדרוש להתאוששות משיטת הסינכרון מיוצג על ידי הפרמטר CLOCCS μ0. CLOCCS מתאים מודל לנתוני הפאזה של מחזור תא הקלט ולאחר מכן מסיק פרמטרים אלה באמצעות הליכה אקראית שרשרת מרקוב אלגוריתם מונטה קרלו14,15. על ידי מיפוי ניסויים מרובים לסולם זמן משותף של מחזור התא, ניתן לבצע השוואות ישירות ספציפיות לפאזה בין משכפלים או ניסויים שבהם זמן ההתאוששות או תקופות מחזור התא אינם זהים 8,14,15.

מכיוון שאוכלוסיות מסונכרנות מאבדות סנכרון בקצב מסוים במהלך סדרות הזמן14,15,16,17, שונות בקצב אובדן הסנכרון יכולה גם לעכב השוואות כמותיות בין ניסויים. על ידי זיהוי מיקום האוכלוסיות והשונות בהתפלגות שלהן, CLOCCS מסביר הבדלים בשיעורי אובדן הסנכרון. כלי רב עוצמה זה מאפשר השוואות ספציפיות ומפורטות בין ניסויים, ובכך מספק את היכולת לבצע השוואות רלוונטיות ישירות לא רק בין שכפולים אלא גם בין תנאי סביבה, מוטנטים, ואפילו מינים שיש להם תזמון מחזור תא שונה באופן דרמטי14,15.

מאמר זה מתאר שיטה המשתמשת ב- CLOCCS כדי להעריך פרמטרים על-ידי התאמת נתונים מניסויים מסנכרון/שחרור סדרות זמן, מיפוי הנתונים לקנה מידה משותף של קו חיים ולאחר מכן ביצוע השוואות רלוונטיות בין עותקים משוכפלים או ניסויים. יישור קו החיים מאפשר השוואות ישירות ספציפיות לפאזה על פני ניסויים אלה, מה שמאפשר צבירה והשוואה של עותקים משוכפלים וביצוע השוואות רלוונטיות יותר בין ניסויים עם תזמוני התאוששות שונים ותקופות מחזור תאים שונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. איסוף שלב מחזור התא ונתוני ניסוי

  1. סנכרן את התאים ביחס למחזור התא באמצעות שיטת הסנכרון הרצויה (למשל, אלוטריטה צנטריפוגלית כמתואר ב- Leman et al.18 או מעצר פרומון הזדווגות כמתואר ברוזברוק 19; הן Leman et al.18 והן Rosebrock 19 כוללים גם שיטות לשחרור מסנכרון). התחל לדגום לאורך כל סדרת הזמן, ודא שסדרת הזמן היא לפחות שתי תקופות מחזור תא מלאות, ובאופן אופטימלי, לאסוף לפחות 10 דגימות לכל מחזור תא. בכל נקודת זמן, אספו דגימה עבור נתוני פאזת מחזור התא (ציטומטריית ניצנים או זרימה) ודגימה עבור נתוני ניסוי, כמתואר להלן.
  2. אם אתה משתמש בנתוני ניצנים כנתוני פאזת מחזור התא, אסוף נתונים על ניצנים עבור יישור CLOCCS.
    1. דגימה לאורך כל סדרת הזמן. עבור כל נקודת זמן, לאסוף תאים, ולתקן אותם על ידי ערבוב 200 μL של תרבית תאים sonicated עם 200 μL של פתרון קיבוע, כפי שמתואר Leman et al.18.
    2. עבור ניצנים סטנדרטיים, לספור לפחות 200 תאים בכל נקודת זמן באמצעות מיקרוסקופ אור משודר עם מטרה 40x והמוציטומטר. הוסף את דגימת התא משלב 1.2.1 להמוציטומטר, ודלל אם הצפיפות מונעת ספירה. רשום את מספר התאים הניצנים והתאים שאינם ניצנים בכל נקודת זמן. חשב את אחוז התאים הניצנים, והתווה עבור כל נקודת זמן בעקומת ניצנים.
      הערה: שיטות אחרות לציון מידע שלב מחזור התא זמינות, אך הן אינן מתוארות בפרוטוקול זה. השיטות האחרות מתוארות בקובץ הקריאה של CLOCCS ובעבודה קודמת11.
  3. אם אתה משתמש בנתוני תוכן DNA ציטומטרי של זרימה כנתוני פאזת מחזור התא, אסוף נתוני צביעת DNA של ציטומטריית זרימה עבור יישור CLOCCS ציטומטרי זרימה.
    1. דגימה לאורך כל סדרת הזמן. עבור כל נקודת זמן, לאסוף תאים, ולתקן אותם כמתואר Haase ו ריד20.
    2. מכתימים את הדנ"א, ומנתחים באמצעות אנליזה ציטומטרית סטנדרטית של זרימה. פרוטוקול צביעה מומלץ עבור S. cerevisiae מתואר ב- Haase and Reed20.
  4. אסוף אומיקה משויכת או נתוני ניסוי קשורים. עבור נתוני תעתיק סטנדרטיים, אסוף כמתואר ב- Leman et al.18 וב- Kelliher et al.21,22. ודא שהנתונים משויכים לנקודות זמן המכילות נתוני פאזות של מחזור התא כדי לאפשר יישור במורד הזרם. ליישור מיטבי, ודא שלכל נקודת זמן המכילה נתוני ניסוי משויכים גם נתוני פאזה.
    הערה: נתוני הניסוי יכולים ללבוש צורות רבות. באופן מסורתי, אנו משתמשים בשיטת היישור המתוארת ליישור ניסויי שעתוק של סדרות זמן. עם זאת, כל סוג של נתונים המשויכים לנקודות זמן יכול להיות מיושר (כלומר, פרוטאומיקה22).

2. התקנת התוכנה הנדרשת

הערה: סעיף זה מניח ש- Conda, Java 19 ו- Git כבר מותקנים (טבלת חומרים).

  1. הורד את מאגר CLOCCS_alignment על ידי הזנת הפקודה הבאה לתוך הטרמינל:
    Git Clone Git Clone https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
  2. צור סביבת Conda באמצעות הקובץ conda_req.yml על-ידי הזנת הפקודה הבאה במסוף בתיקייה שבה שוכפל מאגר CLOCCS_alignment:
    Conda env create -f conda_req.yml

3. שימוש ב-CLOCCS לפרמטרים של הניסויים

  1. לחץ פעמיים על קובץ cloccs_v2023.jar בתיקייה CLOCCS במאגר CLOCCS_alignment והמתן לפתיחת ממשק משתמש גרפי. מסך זה מאפשר אפשרויות קלט עבור הפעלת CLOCCS ומציג את התוצאות לאחר הפעלתן.
  2. הזן את ההגדרות הכלליות.
    1. הגדר Sim Anneal, Burn In ו- Iterations על-ידי הקלדה בתיבות קלט הטקסט המשויכות. Sim Anneal (חישול מדומה) מזהה ערכי פרמטר התחלה טובים, Burn In מחפש מצבים אחוריים, והשלב הסופי מאפשר להסיק את כל המסקנות האחוריות. ערכים גבוהים יותר מגדילים את זמן הריצה אך גם מגדילים את הדיוק.
    2. הזן את תנאי הניסוי על-ידי ציון הטמפרטורה בצלזיוס ושיטת הסינכרון באמצעות תיבת הטקסט שכותרתה טמפרטורה והתפריט הנפתח Synchro. שיטה, בהתאמה.
    3. לחלופין, קבע את תצורת ההגדרות המתקדמות בתפריט הגדרות מתקדמות. ההגדרות המתקדמות מאפשרות להגדיר סדרי עדיפויות עבור כל אחד מהפרמטרים ("mu0", "sigma0", "sigmav", "lambda", "bud.start", "bud.end").
      הערה: מידע נוסף בנוגע להגדרות המתקדמות ניתן למצוא בקובץ readme.txt בתיקייה CLOCCS של מאגר CLOCCS_alignment.
  3. הזן את ההגדרות לשימוש עם נתוני ניצנים.
    1. בחרו בבחירה המתאימה מהתפריט הנפתח 'סוג דגם '. אפשרות ברירת המחדל Bud היא עבור מידע ניצנים סטנדרטי עבור שמרים ניצנים.
      הערה: אפשרויות מתקדמות יותר קיימות גם בתפריט הנפתח: מוטנט למידע על ניצנים עבור מוטנטים שעוברים מחזורי ניצנים מרובים ללא חלוקה, BudSSLSMR למידע על ניצנים ומידע נוסף על גוף מוט ציר וטבעת מיוזין, ו- BudNucDivNeck למידע על ניצנים ומידע נוסף על גרעיני צוואר ניצנים וחלוקה. אפשרויות מתקדמות אלה מתוארות בקובץ הקריאה של CLOCCS ובעבודות קודמות11,14,15.
    2. ייבא את הנתונים באמצעות החלונית Data Import על-ידי הקלדה בתיבות קלט הטקסט או על-ידי העלאת קובץ על-ידי לחיצה על הלחצן Select File . העמודה הראשונה מציינת את נקודות הזמן. שתי העמודות הנותרות מציינות את נתוני ניצן ויכולות לקבל כל אחת מהאפשרויות הבאות: מספר התאים שלא ניצבו (No Bud), מספר התאים הניצנים (Bud) או מספר התאים הכולל (Total).
  4. הזן את ההגדרות לשימוש עם הנתונים הציטומטריים של הזרימה. עבור כל ניסוי, הפעל את שלב 3.3 או שלב 3.4.
    הערה: ניתן להשתמש בנתונים ציטומטריים של זרימה ובנתונים ניצנים יחד. למרות שבעבר תיארנו את הרצתם יחד15, עבור כלי זה, יש להריץ אותם באופן עצמאי ולאחר מכן להשוות.
    1. המר את קבצי ה- .fcs לתבנית הקלט הנכונה של CLOCCS עבור ציטומטריית זרימה על-ידי ביצוע ההוראות בקובץ משלים 1 (נמצא גם במאגר CLOCCS_alignment כ- CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt).
    2. בחרו בבחירת Flow מהתפריט הנפתח Model Type .
    3. יבא את הנתונים באמצעות החלונית Data Import. לחץ על בחר קובץ ובחר את הקובץ שנוצר בשלב 3.4.1.
    4. בחר את נקודות הזמן שעבורן יש להתוות התאמת CLOCCS ציטומטרית של זרימה על-ידי בחירת נקודות הזמן בתיבה Times for Fitting .
  5. לאחר שכל הקלטים נבחרו עבור ציטומטריה ניצנית או זרימה, לחץ על כפתור החל ולאחר מכן לחץ על דוגמה כפתור בחלק העליון של המסך.
  6. הצג את עקומת ניצנים או תרשים ציטומטריית זרימה עם ההתאמות החזויות על-ידי בחירה בכרטיסייה התאמות חזויות . כרטיסייה זו נפתחת כברירת מחדל מיד לאחר השלב הקודם.
  7. הצג את היסטוגרמות הפרמטרים עבור כל פרמטר על ידי בחירה בכרטיסייה היסטוגרמות פרמטרים ולאחר מכן בחירת כרטיסיית המשנה המתאימה לפרמטר המעניין מבין האפשרויות הבאות: mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end וכו '.
  8. הצג את תרשים הניקוד האחורי על-ידי בחירה בכרטיסיה ניקוד אחורי .
  9. הצג את ההגדרות ושנה אותן עוד יותר על-ידי בחירה בכרטיסייה הגדרות ; הצג את יומן הרישום של הריצות הקודמות על-ידי בחירה בכרטיסיה יומן .
  10. השג את פרמטרי CLOCCS מההתאמה על-ידי בחירה בכרטיסייה פרמטרים אחוריים . הטבלה המתקבלת תהיה בעלת הצורה הבאה: כל שורה מורכבת מפרמטר, כאשר השורה האחרונה היא האחורית. העמודות מורכבות מהפרמטר החזוי עבור הממוצע, רווח בר-סמך נמוך ב-2.5%, רווח בר-סמך עליון של 97.5% ושיעור הקבלה.
    1. רשום את הפרמטרים המשמשים ליישור עבור כל ניסוי: זמן ההתאוששות מסנכרון (μ0) ותקופת מחזור התא הממוצעת של תאי האם (λ).
    2. חשב את תקופת מחזור התא על ידי חישוב הממוצע של תקופת תא האם (λ) ותקופת תא הבת (λ + δ), כאשר δ הוא העיכוב הספציפי לבת.
      הערה: חזור על סעיף 3 עם כל הניסויים שייכללו בהשוואות.

4. המרה של נקודות זמן לנקודות קו חיים באמצעות פונקציות ההמרה של Python והפרמטרים CLOCCS

הערה: המרה בין נקודות זמן ונקודות קו חיים דורשת שתי נוסחאות המרה21. יישום Python להמרה והדמיית נתונים זמין בריפו CLOCCS_alignment ומתואר להלן.

  1. הפעל את סביבת Conda על ידי הזנת הפקודה הבאה לתוך המסוף: Conda הפעל CLOCCS_alignment
  2. פתח מחברת Python אינטראקטיבית על ידי הקלדת הפקודה הבאה בטרמינל: Jupyter notebook
  3. צור מחברת Python חדשה בתיקייה הרצויה.
    הערה: מחברת לדוגמה נכללה כדי להדגים שימוש סטנדרטי וניתן למצוא אותה ב- Alignment/JOVE_example.ipynb במאגר יישור CLOCCS_.
  4. ייבא את קובץ Python המכיל את פונקציות היישור על-ידי הפעלת הפקודה הבאה בתא הראשון:
    %הפעל path_to_repo/cloccs_alignment/יישור/כלי שירות.py
    1. החלף את הדרך לריפו CLOCCS_alignment path_to_repo.
  5. אם אתה משתמש בנתוני ניצנים כנתוני פאזת מחזור התא, יבא מסגרת נתונים המכילה את אחוז הניצנים בכל נקודת זמן על-ידי הפעלת הפקודה הבאה בתא חדש:
    budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. החלף את נתיב הקובץ ואת שם הקובץ המתאימים. אם הקובץ הוא קובץ .csv, הסר sep ="\t"
  6. אם אתה משתמש בנתוני ניצנים כנתוני פאזת מחזור התא, יישר את הנתונים הניצנים לסולם זמן של נקודת חיים על-ידי הזנת הפונקציה הבאה לתא חדש:
    aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, נקודות זמן, param_mu0, param_lambda)
    1. עבור נקודות זמן, החלף רשימה של נקודות הזמן באינדקס של מסגרת הנתונים budding_df.
    2. עבור param_mu0 ו- param_lambda, החליפו את הפרמטרים הנלמדים מניצני CLOCCS לרוץ בסעיף 3 עבור הניסוי.
  7. אם אתה משתמש בנתוני ציטומטריה של זרימה, יבא את נתוני הציטומטריה של זרימה על-ידי הפעלת הפקודה הבאה בתא חדש:
    flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
    1. עבור flow_input_folder, החלף את הנתיב המתאים לתיקייה הכוללת את קובצי .fcs של ציטומטריית זרימה.
  8. אם אתה משתמש בנתוני ציטומטריה של זרימה, צור טבלת המרות בין נקודות הזמן ונקודות קו החיים עבור כל ניסוי על-ידי הקלדת הפקודה הבאה בתא חדש:
    flow_converter = convert_tp_to_ll(נקודות זמן, param_mu0, param_lambda)
    1. עבור נקודות זמן, החלף רשימה של נקודות הזמן מנתוני ציטומטריית הזרימה.
    2. עבור param_mu0 ו- param_lambda, החלף את הפרמטרים הנלמדים מ- CLOCCS של ציטומטריית זרימה המופעלים בסעיף 3 עבור הניסוי.
  9. יבא את מסגרת הנתונים המכילה את הנתונים הניסיוניים למחברת על-ידי הפעלת הפקודה הבאה בתא חדש:
    data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. החלף את נתיב הקובץ ואת שם הקובץ המתאימים. אם הקובץ הוא קובץ .csv, הסר sep ="\t".
      הערה: ניתן לעשות זאת עבור כל הנתונים הטבלאיים. נתוני הניסוי חייבים פשוט לכלול את נקודות הזמן כעמודות או כאינדקס של מסגרת הנתונים. נתונים לדוגמה ניתן למצוא במאגר CLOCCS_alignment.
  10. יישר את נתוני הניסוי לסולם זמן של נקודת חיים על-ידי הזנת הפונקציה הבאה לתא חדש:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, נקודות זמן, param_mu0, param_lambda, אינטרפולציה, תחתון, עליון)
    1. עבור נקודות זמן, החלף רשימה של נקודות הזמן כאינדקס או בעמודות של data_df הניסוי מהשלב הקודם.
    2. עבור param_mu0 ו- param_lambda, החלף את הערכים המתקבלים בסעיף 3 מ- CLOCCS.
      הערה: הפרמטרים יכולים להגיע מכל הפעלת CLOCCS המבוצעת בכל אחד מסוגי הנתונים המקובלים של שלב מחזור התא.
    3. לחלופין, החלף אינטרפולציה ב- True או False, או השאר ריק (ברירת המחדל היא False).
      הערה: כאשר הנתונים מוגדרים כ - False, הנתונים לא יעברו אינטרפולציה. כאשר הן מוגדרות כ - True, נקודות קו החיים יעוגלו ויעברו אינטרפולציה כדי למלא את הערכים בין נקודות קו החיים, כך שתהיה נקודה למספר שלם בטווח נקודות קו החיים. הדבר מאפשר השוואה טובה יותר בין מערכי נתונים.
    4. לחלופין, החלף את lowerll ו - upperll בערכים ללא או מספרים שלמים.
      הערה: כאשר ההגדרה מוגדרת כללא, כל נקודות קו החיים לאחר אינטרפולציה נשמרות. כאשר מספרים שלמים מסופקים, פעולה זו חותכת את הנתונים כך שנקודות קו החיים נעות בין התחתון לעליון. הדבר מאפשר השוואה בין ערכות נתונים עם תחתון או עליון שונה.
  11. הורד את ערכת הנתונים המיושרת לקו החיים על-ידי הזנת הפקודה הבאה לתא חדש: lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
  12. חזור על שלבים 4.5-4.11 עם כל הניסויים שייכללו בהשוואות.

5. השוואת עקומות ניצנים ונתוני ציטומטריית זרימה

  1. התווה את עקומות הניצנים לפני היישור באמצעות פונקציית כלי השירות Python על-ידי הזנת הפקודה הבאה לתא חדש:
    plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, title = str_title)
    1. החלף רשימה הכוללת את מסגרות הנתונים של כל עקומות הניצנים הרצויות להתוויית list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2, bud_df3].
    2. החלף רשימה של תוויות עבור המקרא - [ניסוי 1, ניסוי 2, מוטנט] עבור leg_list אם תרצה. אם לא, אל תכלול או תחליף ללא.
    3. החלף זמן str_type.
    4. החלף כותרת מחרוזת עקומות ניצני השוואה ב- str_title אם תרצה בכך. אם לא, החלף ללא, או אל תכלול.
  2. התווה את עקומות הניצנים לאחר היישור באמצעות פונקציית כלי השירות Python על-ידי ביצוע ההוראות בשלב 5.1, אך עם רשימה של עקומות ניצניות מיושרות שהוחלפו ב- list_of_budding_curves ובקו חיים עבור point_type במקום זמן.
  3. כדי להתוות את נתוני הציטומטריה של הזרימה, התווה את הנתונים המשויכים מקבצי .fcs בנקודות קו החיים המתאימות באמצעות הממיר שנוצר בשלב 4.8.
  4. המר את נקודות קו החיים לשלב מחזור התא באמצעות טבלת הממיר (טבלה 1).
    הערה: ניתן גם להתוות זאת על-ידי ביצוע ההוראות בשלב 5.1, אך עם שלב עבור point_type במקום זמן.

6. השוואת נתוני הניסוי

  1. לקבוע את רשימת הגנים שיש לשרטט בגרפים הקוויים בהתבסס על מידע ספרותי או על הגנים המעניינים את המחקר.
  2. השתמש plot_linegraph_comparison שסופקו בקובץ כלי השירות של Python כדי לבצע השוואות בין תרשימי קו במסגרת הנתונים המקורית, המיושרת או המיושרת והאינטרפולציה על-ידי הקלדת הפקודה הבאה בתא חדש:
    plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, point_type = str_type, title = str_title)
    1. החלף רשימה של מסגרות הנתונים של הניסויים שיש להשוות עבור list_of_dfs.
      הערה: מסגרות הנתונים יכולות להיות לא מיושרות או מיושרות; עם זאת, יש להזין את point_type המתאים בשלב 6.2.4.
    2. החלף רשימה של הכותרות לכל מסגרת נתונים באותו סדר כמו רשימת מסגרות הנתונים עבור list_for_legend.
    3. החלף רשימה של שמות הגנים (שיש לכלול באינדקס של מסגרות הנתונים) כדי להתוות עבור גנליסט.
    4. החלף את סוג הנקודה ב- str_type. השתמש בקו חיים (ברירת המחדל היא קנה מידה של נקודת קו חיים) או בפאזה (קנה המידה של קו החיים של שלב מחזור התא) עבור מסגרות הנתונים המיושרות בשלב 6.2.1 או בזמן עבור מסגרות הנתונים הלא מיושרות בשלב 6.2.1.
    5. החלף כותרת מחרוזת אופציונלית ב- str_title.
  3. קבע את רשימת הגנים שייכללו במפת החום באמצעות הספרות או האלגוריתמים כדי לקבוע את הגנים המחזוריים המובילים.
    הערה: לצורך השוואות נכונות של מפת חום, הנתונים צריכים להיות מיושרים, אינטרפולציה ומותאמים לציר הזמן בשלב 6.2; זה צריך להיות אותו ערך קו חיים התחלה וסיום עבור כל ניסוי.
    1. הפעל אלגוריתמים מחזוריים כדי לקבוע את הגנים המחזוריים המובילים23,24, או השתמש בשיטות החלופיות הרצויות כדי לקבוע את רשימת הגנים (כלומר, תוצאות ספרות).
    2. יבא קובץ רשימת גנים .csv או .tsv למחברת באמצעות הפקודה הבאה בתא חדש:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
    3. החלף את נתיב הקובץ ואת שם הקובץ המתאימים. אם הקובץ הוא קובץ .csv, הסר sep="\t".
  4. השתמש בפונקציה שסופקה plot_heatmap_comparison בקובץ כלי השירות של Python כדי לבצע השוואת מפת חום במסגרת הנתונים המיושרת, האינטרפולציה ומיושרת הפאזה על-ידי הקלדת הפקודה הבאה בתא חדש:
    plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, title = str_title)
    1. החלף רשימה של מסגרות הנתונים המיושרות של הניסויים להשוואה עבור list_of_dfs.
    2. החלף רשימה של הכותרות לכל מסגרת נתונים באותו סדר כמו רשימת מסגרות הנתונים עבור list_for_legend.
    3. החלף רשימה של שמות הגנים (שיש לכלול באינדקס של מסגרות הנתונים) כדי להתוות עבור גנליסט.
    4. החלף כותרת מחרוזת אופציונלית ב- str_title.
      הערה: מסגרת הנתונים הראשונה ברשימה היא זו שתשמש לסידור הגנים במפת החום. הגנים יהיו מסודרים לפי המקסימום בתקופה הראשונה עבור אותה מסגרת נתונים, ואותו סדר ישמש למסגרות הנתונים הבאות ברשימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השלבים המתוארים בפרוטוקול לעיל ובזרימת העבודה באיור 1 יושמו על חמישה ניסויים מסונכרנים בסדרות זמן של מחזור התא כדי להדגים שתי השוואות מייצגות: בין שכפולים בשיטות סינכרוניות שונות (פרומון הזדווגות ואלוטריציה צנטריפוגלית18) לבין פלטפורמות ריצוף (ריצוף RNA [RNA-seq] ומיקרו-מערך), כמו גם על פני תנאי ניסוי. ניסויים מרובים בוצעו עם S. cerevisiae, ונאספו נתונים בשלב מחזור התא ובניסוי עבור כל ניסוי. זרימת העבודה כוללת שימוש ב- CLOCCS כדי ליצור פרמטרים לניסויים השונים של סדרות זמן סינכרוני/שחרור, שימוש בפרמטרים אלה כדי ליישר את הניסויים לסולם קווי חיים משותף בר השוואה, ולאחר מכן שימוש בניסויים מיושרים אלה עבור שתי ההשוואות המייצגות.

כדי להדגים את ההשוואה המייצגת בין העתקים, בחרנו שלושה ניסויים שבוצעו עם אותו זן ובאותם תנאי ניסוי, הנקראים תנאי 1. שניים מהניסויים הללו היו העתקים ישירים זה של זה, ושניהם נותחו באמצעות ניתוח מיקרו-מערך וסנכרנו באמצעות המחשה צנטריפוגלית. הניסוי השלישי נותח באמצעות ניתוח RNA-seq וסונכרן באמצעות דום פרומון של גורם אלפא. כדי להדגים את ההשוואה השנייה בין ניסויים עם תקופות מחזור תאים משתנות, ניסוי Condition 1 RNA-seq (משך מחזור התא: 71 דקות) מלמעלה הושווה לתנאי 2 (תקופת מחזור התא: 82 דקות), ולתנאי 3 (תקופת מחזור התא: 110 דקות) (טבלה 2). עבור כל ניסוי, התאים גודלו בתנאים המתאימים להם, סונכרנו, שוחררו ולאחר מכן נדגמו במשך שתי תקופות מחזור תאים או יותר. נתוני הציטומטריה של ניצנים ו/או זרימה נאספו כדי לספק מידע על שלב מחזור התא, ונתוני שעתוק מסדרות זמן של מיקרו-מערך או RNA-seq נאספו כמתואר ב-Leman et al.18 (טבלה משלימה S1).

עבור כל ניסוי, הנתונים לקחו את הצורות המתוארות באיור 2, אשר מציג את ניסוי תנאי 2 כדוגמה להדגמה. לכל מערך נתונים הייתה עקומת ניצנים, שאפשרה להסיק את שלב מחזור התא. עקומה זו כללה ערך באחוזים ניצנים עבור כל נקודת זמן בסדרת הזמן, אשר לאחר מכן תוכננה לייצר עקומת ניצנים המציגה תנודות מרובות במחזור התא (איור 2). נתוני הפאזה של מחזור התא לבשו גם צורה של נתוני צביעת תוכן DNA ציטומטרי עבור כל נקודת זמן בסדרת הזמן. נקודות זמן נבחרות עבור תנאי 2 שורטטו (איור 2). קובצי ציטומטריית הזרימה שולבו לטבלה אחת הכוללת את התאים בכל סל פלואורסצנטי של יומן עבור כל נקודת זמן להזנה ל- CLOCCS באמצעות פונקציית flow_cytometry_CLOCCS_file_from_fcs בכלי השירות Python. כל מערך נתונים הכיל גם נתונים ניסיוניים. במקרה הזה, הנתונים היו נתוני שעתוק, והנתונים אורגנו בשורות של גנים, שלכל אחד מהם היה ערך עבור שפע הרנ"א בכל נקודת זמן בניסוי (איור 2).

הדגמנו את השימוש ב-CLOCCS ואת ההמרה לנקודות עורק חיים עבור מערך הנתונים של Condition 2 RNA-seq; עם זאת, התהליך היה זהה גם לניסויים האחרים. המידע המתפתח הוזן לאלגוריתם CLOCCS כמתואר בסעיף 3 של הפרוטוקול וכפי שמוצג באיור 3A. נעשה שימוש בערכי ברירת המחדל עבור Sim Anneal, Burn In, Iterations, והגדרות מתקדמות. נבחרו תנאי הניסוי המתאימים. סוג המודל של "ניצן" שימש לנתוני ניצנים. התאמות ניצני CLOCCS שהתקבלו נצפו כדי לוודא שעקומות הניצנים התאימו כראוי, כפי שהודגם על-ידי נקודות הנתונים שכיסו את עקומת ההתאמה המתאימה עם רצועת ביטחון קטנה של 95% (איור 3B ואיור משלים S1). הפרמטרים μ0 ו-λ מטבלת הפרמטרים האחוריים (איור 3C) תועדו לשימוש ביישור. נתוני ציטומטריית הזרימה עבור תנאי 2 הוזנו בנפרד לתוך CLOCCS, כמתואר בסעיף 3 של הפרוטוקול. נכון לעכשיו, CLOCCS מצפה שציטומטרים של זרימה יפיקו נתונים של 10 סיביות עם 1,024 ערוצים; עם זאת, ציטומטרים זרימה מודרניים יכולים להיות יותר ערוצים. מכיוון שציטומטר הזרימה שלנו מייצר נתונים עם יותר מ-1,024 ערוצים, הנתונים אוגדו ל-1,024 פחים. בעזרת נתוני פאזות של מחזור תאי ציטומטריה של זרימה, CLOCCS מייצרת CLOCCS המתאימה לכל נקודת זמן שנבחרה (איור 3D ואיור משלים S2) ומספקת טבלת פרמטרים אחוריים בדומה לטבלת הפרמטרים האחוריים הניצנים באיור 3C. הפרמטרים לניצנים ש-CLOCCS מריץ עבור כל אחד מהניסויים האחרים מתוארים בטבלה 2, והפרמטרים עבור ציטומטריית הזרימה ש-CLOCCS מפעילה מתוארים בטבלה משלימה S2.

פרמטרי CLOCCS המתאימים לתקופת מחזור התא של תאי האם (λ) ולזמן ההתאוששות (μ0) שימשו ליישור קו החיים. חשוב לציין כי λ אינו מייצג בהכרח את תקופת מחזור התא הממוצעת של אוכלוסיית התא. במקרים בהם התאים עוברים חלוקה מלאה, יש מספר שווה של תאי אם ובת, ולכן תקופת מחזור התא הממוצעת היא הממוצע בין תקופת מחזור התא של תאי האם (λ) לבין תקופת מחזור התא של תאי הבת (λ + δ); באופן ספציפי, דלתא (δ) הוא משך העיכוב הספציפי לבת. זהו החישוב שבו השתמשנו עבור תקופת מחזור התא עבור כל ניסוי (טבלה 2). עבור כל ניסוי, הפרמטרים המתאימים λו-μ 0 שימשו לאחר מכן בפונקציית ההמרה, df_conversion_from_parameters, שסופקה בקובץ כלי השירות של Python, כפי שהודגם עבור תנאי 2 (איור 4A). עבור עקומות ניצנים, הנתונים לא עברו אינטרפולציה. עם זאת, עבור נתונים ניסיוניים, מערכי הנתונים המיושרים לקו החיים נדגמו מחדש באמצעות אינטרפולציה, כך שכל נקודת קו חיים הכילה נתונים שעברו אינטרפולציה לצורך תכנון משופר. כדי להבטיח שלערכות הנתונים המיושרות לקו החיים יהיה טווח זהה של נקודות קו חיים, נקבעו מגבלות קו חיים תחתון ועליון כדי לחתוך את הנתונים בנקודות אלה. פרמטרים אלה של התחתון והעליון הוזנו לפונקציה df_conversion_from_parameters כאשר האינטרפולציה הוגדרה כ - True. עבור ההשוואה של תנאי 1, הם הוגדרו ל-44 ו-270, בהתאמה, עבור כל מערכי הנתונים, ולהשוואה בין תנאים סביבתיים, הם הוגדרו ל-50 ו-300, בהתאמה. דוגמה לשימוש בפונקציות אלה ליישור והשוואה ניתן לראות במחברת Python לדוגמה JOVE_example.ipynb, ואת הקוד המשמש ליצירת האיורים ניתן לראות במחברת JOVE_Figures.ipynb במאגר CLOCCS_alignment.

המרה זו מנקודות זמן לנקודות קו חיים תלויה בשתי נוסחאות21 (איור 4A) המשתמשות μ0 (זמן התאוששות) ו-λ (תקופת אם). הנוסחה הראשונה, , Equation 1היא נוסחת שלב ההתאוששות (איור 4A). נוסחה זו משמשת רק עבור נקודות זמן בשלב ההתאוששות, המורכב מנקודות הזמן עד וכולל 0 μ, מכיוון μ0 מתאים לזמן ההתאוששות. נקודות הזמן מומרות לאחר מכן לטווח סולם של קו חיים המסתיים ב- 100 נקודות קו חיים (טבלה 1), המסמנות את סוף שלב ההתאוששות ואת תחילת מחזור התא הראשון. השלב שלאחר ההתאוששות משתמש בנוסחה Equation 2 השנייה (איור 4A), אשר ממירה כל נקודת זמן עוקבת לאחר ההתאוששות לנקודת עורק חיים לאחר 100. כל 100 נקודות קו חיים עוקבות מתאימות למחזור תא חדש, כאשר המחזור הראשון מתאים לנקודות קו חיים 100 עד 200, המחזור השני מתאים לנקודות קו חיים 200 עד 300, וכן הלאה (טבלה 1). ההמרה מנקודות זמן לנקודות קו חיים מוחלת על כל ערכת נתונים בנפרד באמצעות פרמטרי CLOCCS המתאימים עבור ערכת נתונים זו. לאחר שכל ערכת נתונים מומרת לקנה המידה של קו החיים, שלבי מחזור התא מיושרים, מה שמאפשר השוואה ספציפית לשלב בין ערכות נתונים.

טבלה 3 מציגה את ההמרה של נקודות זמן נבחרות לנקודות קו החיים המתאימות שלהן עבור ההמרה המייצגת של ערכת הנתונים של תנאי 2 באמצעות פרמטרים מריצת CLOCCS הניצנית. נתוני הניצנים שנאספו מ-Condition 2 RNA-seq שורטטו בעקומת ניצנים שמראה את אחוז הניצנים לאורך זמן הן עבור סקאלת הזמן הלא מיושרת בדקות (איור 4B) והן עבור ציר הזמן המיושר בנקודות קו החיים (איור 4C) באמצעות פונקציית Python plot_budding_curves במחברת Python. נקודות קו החיים יכלו להיות מומרים בקלות למידע על פאזות ניסוי ומחזור התא (טבלה 1), ושלב ההתאוששות ומחזורי התא הראשון והשלישי קודדו בצבע ידני בהתאם (איור 4B,C). מאחר שכל נקודת עורק חיים התאימה לשלב מחזור התא, ניתן היה לתייג תרשימי ציטומטריית זרימה בודדים באמצעות פונקציות פייתון באמצעות שלב מחזור התא שנקבע על ידי יישור קו החיים. שלבים אלה תאמו את השלבים שנקבעו באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה עבור תנאי 2. נתוני ציטומטריית הזרימה שנאספו עבור ערכת הנתונים של תנאי 2 הותוו עבור נקודות זמן נבחרות ותויגו באמצעות שלב מחזור התא שנקבע מיישור קו החיים של ציטומטריית הזרימה. בכל אחד מהמקרים, הנתונים תאמו את השלב שנקבע על-ידי היישור (איור 4D).

חשוב לציין כי רמת הביטוי של כל גן עבור כל דגימה נשארת זהה, אך התיוג של נקודות הזמן משתנה מזמן בדקות לנקודות קו חיים. עם זאת, ההמרה אינה ליניארית. שלב ההתאוששות, המסומן באפור, תופס אחוז גבוה יותר מזמן הניסוי לאחר ביצוע ההמרה לנקודות הצלה (איור 4B,C). היתרון של סולם קו החיים הוא שהוא מאפשר מידע מפורט על פאזה והשוואות פאזה בין ניסויים. מידע הפאזה כלול בנקודות קו החיים, כמתואר לעיל ומוצג בטבלה 1. יתר על כן, G1 כלול ב-15.5 נקודות קו החיים הראשונות של כל מחזור תא, S ב-20 נקודות קו החיים הבאות, ו-G2/M ב-64.5 נקודות קו החיים הבאות (טבלה 1). עם זאת, זה מגביל באופן מלאכותי את זמן ההתאוששות לאותו טווח זמן של כל מחזור תא רצוף, גם אם שלב ההתאוששות נראה קצר מאוד בסקאלת נקודות הזמן המקורית. זה לא מטשטש את ההשוואות, כי השלבים של כל ניסוי מיושרים. ברוב המקרים, רלוונטי יותר להשוות את הנתונים בנקודות המתרחשות באותו שלב ניסויי וביולוגי ולא בנקודות זמן המתרחשות באותו זמן בדקות.

לאחר שכל הניסויים הומרו לסולם קו החיים המיושר באמצעות פונקציות Python שסופקו בקובץ כלי השירות של Python, ניתן להשוות ביניהם. כאן אנו מדגימים שתי השוואות נפוצות בין ניסויים: אחת בין העתקים של ניסוי דומה בין פלטפורמות ושיטות סנכרון (איור 5) ואחת בין תנאי ניסוי שונים עם אורך תקופה משתנה (איור 6 ואיור 7). כפי שתואר לעיל, ההשוואה הראשונה היא בין שני משוכפלים של מיקרו-מערך וניסוי RNA-seq מסונכרן אחד של גורם אלפא. לפני היישור, שני המיקרו-מערך המשוכפלים הראו סינכרוניזציה ודינמיקה דומות של מחזור התא, אולם השכפול של תנאי 1 Microarray 2 נראה מעט מעוכב (איור 5A). ההבדל הבולט ביותר נמצא כאשר משווים בין מערכי הנתונים הבלתי מיושרים; המחזור השני של תנאי 1 RNA-seq נראה מיושר עם המחזור הראשון של שני ניסויי המיקרו-מערך. סביר להניח שההבדל לא היה קשור לפלטפורמות התמלול השונות אלא לשיטות הסנכרון השונות. אוכלוסיות התאים בניסויי המיקרו-מערך סונכרנה על ידי אלוטריזציה צנטריפוגלית, בעוד שאוכלוסיית ניסוי ה-RNA-seq סונכרנה על ידי טיפול בפרומון הזדווגות. ואכן, סנכרון עם פרומון הזדווגות הפחית באופן משמעותי את זמן ההחלמה בהשוואה להזדווגות (איור 5A וטבלה 2).

למרות ההבדלים הברורים בין העותקים המשוכפלים כאשר הם משורטטים במונחים של הזמן שחלף, לאחר יישור קו החיים, העקומות היו כמעט זהות, והתאפשרו השוואות מפורטות ורלוונטיות יותר בין עותקים משוכפלים (איור 5B). שלב ההתאוששות היה מיושר כך שכל ניסוי החל באותה נקודת קו חיים, והווריאציות בתקופה נורמלו על ידי יישור קו החיים. בשל היישור, ערכי הניסוי באותה נקודת עורק חיים על פני העתקים התרחשו באותו שלב מחזור התא, ובכך אפשרו חישובים של השונות הניסויית בין שכפולים. שלבי ההתאוששות ומחזור התא מסומנים באיור 5B כדי לספק מידע נוסף על שלבי מחזור התא בכל אחד מהניסויים. לאחר מכן ניתן להחיל את יישור קו החיים הזה על מערך הנתונים הניסיוני (איור 5C,D) באמצעות הפונקציה Python df_conversion_from_parameters שסופקה בקובץ כלי השירות, כמתואר לעיל.

באיור 5D, נתוני השעתוק היו מיושרים, ודינמיקת הביטוי של הגן CDC20 שורטטה באמצעות הפונקציה plot_linegraph_comparison Python במחברת Python. לפני היישור נראה היה כאילו ביטוי השיא הראשון של ניסויי המיקרו-מערך תואם לשיא השני של ניסוי ה-RNA-seq (איור 5C); אולם לאחר היישור, שיאי מחזור התא הראשונים של כל מערך נתונים מיושרים כראוי (איור 5D). יתר על כן, רוחב השיא של הניסויים נראה שונה בין מערך הנתונים RNA-seq לבין מערכי הנתונים של המיקרו-מערך, אולם לאחר היישור, רוחב השיא היה מיושר יותר (איור 5C,D).

ההשוואה השנייה היא בין ניסויים בתנאי סביבה שונים עם תקופות מחזור תאים שונות (איור 6). כפי שתואר לעיל, כאן, השווינו את מערכי הנתונים של S. cerevisiae במצב 1 לתנאי 2 ובמצב 3, המתאימים לתקופות מחזור תא של 71, 82 ו-110 דקות, בהתאמה. הבדלים אלה בתקופת מחזור התא יצרו חוסר ודאות בהשוואה בין ניסויים לפני יישור פאזות מחזור התא, כפי שניתן לראות בעקומות הניצנים הבלתי מיושרות. הבדלי התקופות נראים בעקומות הניצנים הלא מיושרות (איור 6A). אולם כאשר הם היו מיושרים באמצעות פרוטוקול זה, שלוש העקומות נראו דומות להפליא, מה שאיפשר השוואה של נתוני ניסוי (איור 6B).

באמצעות הפרמטרים CLOCCS של ציטומטריית הזרימה, תנאי 1 ותנאי 2 יושרו לסולם עורק חיים משותף, והיסטוגרמות תוכן הדנ"א שורטטו בתנאי 2 ובנקודות קו חיים שוות ערך בתנאי 1. הושוו מדידות ציטומטריות של תכולת הדנ"א על פני נקודות חיים (איור 6C). מכיוון שמדידות תכולת הדנ"א לא היו רציפות ולא עברו אינטרפולציה בקלות, יכולנו להשוות רק את נקודות קו החיים הקרובות ביותר. נתוני הפאזה של מחזור התא עבור כל נקודת עורק חיים דומה לא היו זהים בין שני התנאים (איור 6C), מה שמצביע על כך שה-CLOCCS מתאים והפרמטרים שהתקבלו היו ככל הנראה מעט לא מיושרים עבור תנאי 1. סביר להניח שזה נבע מההתאמה הנמוכה יותר של CLOCCS לנתונים הציטומטריים של הזרימה עבור תנאי 1 בהשוואה למצב 2 (איור משלים 2). עם זאת, היישור סטה רק במדגם אחד, ולכן עדיין מאפשר השוואות ספציפיות לפאזה משופרות.

לאחר מכן, יישור קו החיים הניצני יושם על נתוני הניסוי עבור ניסויי RNA-seq בתנאי 1, תנאי 2 ותנאי 3 (איור 7) באמצעות שימוש בפרמטרים CLOCCS ניצנים בפונקציית df_conversion_from_parameters על נתוני הניסוי. נתוני השעתוק היו מיושרים, וביטוי הגנים של הגן CDC20 עבור כל סדרת זמן הוצג עבור שלושת הניסויים. לפני היישור, דינמיקת התמליל של CDC20 לא הייתה חופפת (איור 7A). לאחר היישור, השיא הראשון והשני של ביטוי הגן CDC20 היו הרבה יותר מיושרים עבור כל שלושת מערכי הנתונים. לאחר היישור התברר שהשיאים התרחשו באותו שלב של מחזור התא, אולם צורות העקומות היו שונות (איור 7B). לתנאי 3 היה שיא ראשון נמוך ורחב יותר בהשוואה לשני התנאים האחרים, אפילו לאחר שקלול ההבדלים בתקופת מחזור התא, דבר המצביע על כך שהבדלים אלה היו קשורים ככל הנראה לתנאי הניסוי שנבדקו (איור 7B).

ניתן גם לערוך השוואות תמלול בקנה מידה גדול. לצורך השוואות אלה, 278 גנים נבחרו על ידי הפעלת אלגוריתם המחזוריות JTK_CYCLE23 על כל מערך נתונים ולקיחת ההצטלבות של הגנים המחזוריים המובילים. עם זאת, ניתן לבחור גנים בכל שיטה רצויה או מהספרות. הגנים האלה שורטטו באותו סדר עבור כל שלושת התנאים, גם עבור מפות החום הלא מיושרות (איור 7C) וגם עבור מפות החום המיושרות (איור 7D) באמצעות פונקציית פייתון plot_heatmap_comparison במחברת פייתון. מפות חום אלה מאפשרות לבצע מאות השוואות ברמת הגנים בו זמנית. ניתן לערוך השוואות בין ניסויים לא מיושרים לגבי השינוי בדינמיקה של העקומה, זמן השיא ביחס לגנים שכנים, אורך התקופה וכו' (איור 7C). עם זאת, לא ניתן היה לערוך השוואות מפורטות ספציפיות לפאזה מכיוון שנקודות הזמן אינן בהכרח תואמות לאותו שלב מחזור התא בין תנאים. אף על פי שהמחזורים השניים נראו דומים לאחר ההיערכות, המחזורים הראשונים הוזזו מעט בין התנאים (איור 7D). שינוי זה עשוי לשקף את העובדה שהמידע על שלב מחזור התא המתפתח היה באיכות נמוכה יותר עבור תנאי 3. עם זאת, התאמת הניסויים לשלושת התנאים אפשרה השוואה משופרת ספציפית לפאזה. לפני היישור, לא היה ברור אם שיא הביטוי הראשון בכל מצב יתרחש באותו שלב של מחזור התא (איור 7C); אולם לאחר היערכות, ניתן להשוות את הניסויים באופן ספציפי לשלב (איור 7D). לפני היישור, הפסגות במצב 3 נראו רחבות הרבה יותר מאשר בשני התנאים האחרים (איור 7C); אולם לאחר היישור התברר שהפסגות בתנאי 3 היו ברוחב דומה לשאר התנאים כאשר התיישרו (איור 7D).

תוצאות מייצגות אלה מדגימות את תהליך השימוש ב-CLOCCS כדי להתאים ניסויים לסולם זמן משותף. לפני היישור, השוואות ישירות של נקודות זמן לעתים קרובות אינן מתואמות לשלב דומה של מחזור התא. המרת זמן הניסוי שחלף בדקות לנקודות עורק חיים המייצגות את שלב מחזור התא מאפשרת השוואה ספציפית לפאזה ורלוונטית ביולוגית בין ניסויים באותה נקודה במחזור התא.

Figure 1
איור 1: מבט כולל על זרימת עבודה של יישור קו חיים של CLOCCS. זרימת העבודה הניסיונית ליישור של שתי ערכות נתונים לדוגמה באמצעות CLOCCS, ואחריה השוואות מייצגות בין ערכות הנתונים. השלבים העיקריים מהפרוטוקול מתוארים: איסוף שלב מחזור התא הבלתי מיושר ונתוני ניסוי עבור כל אחד ממערכי הנתונים (שלב 1), השימוש ב- CLOCCS עבור הפרמטרים של כל מערך נתונים (שלב 2 ושלב 3), יישור מערכי הנתונים לקו חיים משותף (שלב 4), ולבסוף, השוואה בין שלב מחזור התא לדינמיקה ניסויית (שלב 5 ושלב 6). נתוני הפאזה של מחזור התא הבלתי מיושרים מוזנים לתוך CLOCCS כדי לספק פרמטרים שנלמדו, אשר משמשים לאחר מכן ליישור לסולם קו חיים משותף. לאחר מכן משווים ערכות נתונים מיושרות אלה. קיצור: CLOCCS = אפיון אובדן סינכרון מחזור התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תבנית שלב מחזור התא ונתוני הניסוי הדרושים לזרימת העבודה. הנתונים הדרושים לזרימת העבודה מורכבים משני מרכיבים עיקריים: נתוני פאזות מחזור התא ונתוני ניסוי מחזור התא. נתוני הפאזה של מחזור התא יכולים להיות מורכבים מנתוני ניצני מחזור התא או נתוני תוכן DNA ציטומטרי של זרימה עבור כל נקודת זמן בסדרת הזמן. נתוני הניסוי יכולים ללבוש צורות רבות, אך במקרה זה, הם נתוני שעתוק, המורכבים מנתוני ביטוי גנים עבור כל גן עבור כל נקודת זמן בסדרת הזמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: דוגמה לתוצאות מהפעלת CLOCCS במערך נתונים של מחזור תאים S. cerevisiae. (A) צילום מסך של ממשק המשתמש הגרפי של CLOCCS עם ערכי הקלט וההגדרות שסופקו עבור נתוני ניצני תנאי 2. הזמנים, מספר התאים הלא ניצנים ומספר התאים הניצנים מוזנים, כמו גם סוג המודל, חזרות ותנאים וכו'. (B) צילום מסך של ניצני CLOCCS המתקבלים מתאימים לתנאי 2 תחת הכרטיסייה "התאמה חזויה" של התוצאות. לכל נקודת נתונים יש סרגל שגיאות דגימה משויך המתאים לרווחי סמך ביחס בינומי של 95% של הנתונים (עבור כל נקודת זמן, נספרו לפחות 200 תאים [בין 204 ל- 295 תאים]). עקומת ההתאמה המתקבלת מראה את רצועת הביטחון עבור רווח בר-סמך של 95% של התאמת CLOCCS בסגול. (C) צילום מסך של טבלת "הפרמטרים האחוריים" המתקבלת עבור ריצת CLOCCS ניצני תנאי 2 המורכבת מפרמטרי CLOCCS בממוצע, רווח בר-סמך של 2.5% ורווח בר-סמך של 97.5%. שיעורי הקבלה האחוריים מוצגים גם כן. (D) צילום מסך של ציטומטריית הזרימה CLOCCS מתאים לתנאי 2 ב- 70 דקות ו- 150 דקות. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: דוגמה לתהליך ההמרה מנקודות זמן לנקודות קו חיים מיושרות עבור ערכת הנתונים של תנאי 2 . (A) נוסחאות ההמרה המשמשות להמרה מנקודות זמן לנקודות קו חיים. צילום מסך של פונקציות Python במחברת Python להמרה והתוויית העקומות הניצניות. (B) עקומת הניצנים הלא מיושרת של תנאי 2 המציגה את אחוז הניצנים עבור כל נקודת זמן בדקות. מחזור התא ושלבי ההתאוששות מודגשים באופן הבא: התאוששות (אפור), מחזור תא ראשון (כחול), מחזור תא שני (מגנטה) ומחזור תא שלישי (סלמון). (C) עקומת הניצנים המיושרת של תנאי 2 המציגה את אותם אחוזי ניצנים אך משורטטת בסולם המיושר לקו החיים. מחזור התא ושלבי ההתאוששות מודגשים כמו בלוח C. (D) תרשימי ציטומטריית הזרימה המיושרים עבור נקודות זמן נבחרות מתנאי 2 המתאימים לשלבי מחזור תאים נפרדים בהתבסס על סולם קו החיים: תחילת G1, תחילת שלב S, תחילת G2/M וסוף G2/M. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תוצאות מייצגות להשוואה בין ניסויים משוכפלים של תנאי 1 מיושרים ולא מיושרים. השוואה בין תנאי 1 משכפלת: תנאי 1 RNA-seq (כחול), תנאי 1 microarray 1 (סגול), ותנאי 1 microarray 2 (אפור). (A) עקומת הניצנים הבלתי מיושרת עבור ערכות הנתונים של תנאי 1. (B) עקומת הניצנים המיושרת עבור ערכות הנתונים של תנאי 1. נקודות קו החיים הומרו לשלב מחזור התא והן מקודדות בצבע מתחת לציר ה-x. (C) ביטוי הגן הבלתי מיושר של גן מייצג, CDC20, עבור מערכי הנתונים של תנאי 1. (D) ביטוי הגן המיושר של גן מייצג, CDC20, עבור מערכי הנתונים של תנאי 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תוצאות מייצגות להשוואה של נתוני פאזות מיושרות ולא מיושרות של מחזור התא בין ניסויים בתקופות שונות. השוואה של נתוני שלב מחזור התא עבור מערכי נתונים עם שלושה תנאים סביבתיים שונים, ולפיכך, שלוש תקופות מחזור תא שונות: תנאי 1 RNA-seq (תקופת מחזור התא: 71 דקות), תנאי 2 RNA-seq (תקופת מחזור התא: 82 דקות) ותנאי 3 RNA-seq (תקופת מחזור התא: 110 דקות). (A) עקומת הניצנים הבלתי מיושרת עבור מערכי הנתונים. (B) עקומת הניצנים המיושרת עבור ערכות הנתונים. (C) היסטוגרמות תוכן הדנ"א הציטומטרי של זרימה עבור תנאי 2 (שורה עליונה) בהשוואה לנקודות קו החיים המקבילות בתנאי 1 (שורה תחתונה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: תוצאות מייצגות להשוואה בין נתוני התעתיק המיושרים והלא מיושרים על פני ניסויים בתקופות שונות. השוואה בין נתוני התעתיק המשויכים למערכי הנתונים באיור 6: תנאי 1 RNA-seq, תנאי 2 ותנאי 3. (A) ביטוי הגן הבלתי מיושר של גן מייצג, CDC20, עבור מערכי הנתונים RNA-seq של תנאי 1, תנאי 2 ותנאי 3. (B) ביטוי הגן המיושר של CDC20 עבור מערכי הנתונים. (C) מפת החום הבלתי מיושרת של הגנים המחזוריים של מחזור התא העליון באותו סדר עבור כל מערך נתונים. (D) מפות החום המיושרות לקו החיים של אותם גנים מחזוריים של מחזור התא מלוח C באותו סדר. הקווים הסגולים המקווקווים מתאימים לנקודות קו החיים 100 ו-200. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: נקודת קו חיים להמרת שלב מחזור התא. מפתח ההמרה בין סולם נקודת החיים לשלב המתאים בניסוי. נקודות קו חיים 0-100 מתאימות להתאוששות מסנכרון. כל 100 נקודות עורק החיים הבאות מתאימות למחזור תא חדש, כאשר 15.5 נקודות קו החיים הראשונות מתאימות ל-G1, 20 הבאות מתאימות לשלב S, ושאר נקודות קו החיים מתאימות ל-G2/M. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: ניצני פרמטרים של CLOCCS. פרמטרי CLOCCS הניצנים המתקבלים "lambda" ו- "mu0" עבור כל ניסוי מהתוצאות המייצגות. בנוסף, העיכוב הספציפי לבת "דלתא" ותקופת מחזור התא המחושבת מוצגים עבור כל ניסוי. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: טבלת המרות המציגה את ההמרה בין נקודות זמן בדקות לבין נקודות קו החיים התואמות שלהן עבור תנאי 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

איור משלים S1: ניצני CLOCCS מתאימים לתנאי 1 ולמצב 3. צילום מסך של ניצני CLOCCS שהתקבלו מתאימים עבור (A) נתוני ניצני RNA seq של תנאי 1, (B) נתוני ניצני מיקרו-מערך 1 של Condition 1, (C) נתוני ניצני microarray 2 של תנאי 1, ועבור (D) נתוני ניצני תנאי 3. ניתן לראות את ניצני ה-CLOCCS המתאימים לתנאי 2 באיור 3B. פס הביטחון של 95% ופסי השגיאה של הדגימה הם כמתואר בתיעוד CLOCCS14,15 ובאיור 3. עבור כל נקודת זמן עבור כל סדרת זמן, נספרו כ-200 תאים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: ציטומטריית זרימה CLOCCS מתאימה לתנאי 1 ולמצב 2. צילום מסך של ציטומטריית הזרימה CLOCCS מתאים לדגימות המוצגות באיור 6C עבור תנאי 2 (שורה עליונה: A-D) ותנאי 1 (שורה תחתונה: E,F). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S3: רגישות היישור לשינויים בפרמטרים של CLOCCS. השוואה של היישור של ערכת הנתונים RNA-Seq של תנאי 1 באמצעות וריאציות (A-C) בפרמטרים של CLOCCS λ ו- μ0 בתוך הרווח בר-סמך של התאמת CLOCCS ו- (D,E) עם וריאציות גדולות בפרמטרים. השוואה בין הערך הממוצע עם ערכי הביטחון של 2.5% ו- 97.5% הפלט בטבלת הפרמטרים לפי CLOCCS עבור (A) הפרמטר μ0, (B) הפרמטר λ ו- (C) עבור שני הפרמטרים μ0 ו- λ. (D) השוואה בין היישור באמצעות הערך הממוצע של μ0 לעומת שינויים גדולים בפרמטר μ0 (200% עד 0.25% מ-μ0). (E) השוואה בין היישור באמצעות הערך הממוצע עבור λ בהשוואה לשינויים גדולים בפרמטר λ (200% עד 0.25% של λ). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S1: תיאור איסוף הנתונים עבור כל ניסוי. עבור כל ניסוי, טבלה זו מספקת תיאור של נתוני ניצנים, נתוני ציטומטריית זרימה, נתוני תעתיק ושיטת סינכרון. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S2: פרמטרי CLOCCS מריצות CLOCCS ציטומטריות זרימה. פרמטרי CLOCCS "mu0" ו- "lambda" עבור ציטומטריית הזרימה של תנאי 1 ו- Condition 2 CLOCCS פועל. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: הוראות להמרת הנתונים הציטומטריים של זרימה לתבנית קלט CLOCCS. לשימוש ב- CLOCCS עם נתונים ציטומטריים של זרימה, נדרשת תבנית קלט ספציפית. קובץ זה מספק הוראות מפורטות יותר בנוגע לשלב הפרוטוקול 3.4.1 כדי להסביר כיצד להשתמש בפונקציות השירות של Python לביצוע המרה זו. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מציג שיטה להערכה מדויקת וכמותית יותר של נתונים מניסויים בסדרות זמן על אוכלוסיות מסונכרנות של תאים. השיטה משתמשת בפרמטרים שנלמדו מ-CLOCCS, מודל היסק בייסיאני המשתמש בנתוני פאזות של מחזור תאי קלט, כגון נתוני ניצנים ונתוני תוכן DNA ציטומטרי של זרימה, כדי לקבוע פרמטרים לכל ניסוי14,15. CLOCCS משתמשת בנתוני הפאזה של מחזור תאי הקלט כדי להסיק את הפרמטרים עבור כל ניסוי, אשר משמשים לאחר מכן ליישור לקנה מידה משותף של קו חיים. המרת ניסויים מרובים של סדרות זמן סינכרוני/שחרור לסולם זמן יחיד המיושר לקו החיים מאפשרת השוואה ספציפית לשלב ורלוונטית בין ניסויים לבין צבירה של ניסויים משוכפלים מרובים, שבעבר היו קשים או בלתי אפשריים.

השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים איסוף הנתונים, הפעלת CLOCCS, יישור מערכי הנתונים והשוואה בין מערכי הנתונים. ראשית, יש לאסוף נתונים לשימוש בפרוטוקול זה. הנתונים חייבים להיות מורכבים הן מנתונים ניסיוניים המכילים מידע לגבי שאלת העניין (כלומר, נתוני שעתוק, נתוני ביטוי גנים, נתונים פרוטאומיים) - והן מנתוני פאזות מחזור התא המכילים מידע על הפאזה של מחזור התא (כלומר, נתוני ניצנים, נתוני תוכן DNA ציטומטרי של זרימה). לאחר מכן, ניתן להשתמש בנתוני פאזת מחזור התא ב- CLOCCS כדי לאסוף את פרטי הפרמטרים עבור כל ניסוי. הפרמטרים μ0 (אורך שלב ההתאוששות) ו- λ (תקופת מחזור תאי האם) משמשים להמרת נקודות הזמן לנקודות קו חיים. יישור נקודת קו החיים מאפשר השוואה ישירה בין סדרות הזמן המיושרות.

מגבלה אחת של השיטה היא שיישור נכון תלוי בזיהוי התאמה טובה לנתונים. השגת התאמת CLOCCS הטובה ביותר מסתמכת על איכות נתוני הפאזה של מחזור התא והשימוש בהגדרות הקלט הנכונות עבור הניסוי ב- CLOCCS. ההתאמה לנתוני שלב מחזור התא קובעת את דיוק הפרמטרים הנלמדים, ובכך משפיעה מאוד על דיוק היישור, מכיוון שהיא תלויה בשימוש בפרמטרים אלה. מכיוון ששינויים נרחבים בפרמטרים ישפיעו מאוד על היישור, השינויים יישארו מינימליים בתוך הרווח בר-סמך המסופק בפלט CLOCCS (איור משלים S3). חשוב לציין כי רגישות זו לשינויים בפרמטרים היא גם המאפשרת יישור בין מערכי נתונים עם תזמון משתנה של מחזור התא.

ניתן לקבוע את הדיוק של התאמת CLOCCS באמצעות עקומת ההתאמה של CLOCCS המתקבלת ופסי השגיאה ופס השגיאה המתאימים (איור 3B,D, איור משלים S1 ואיור משלים S2). הכרטיסיה התאמה של CLOCCS מציגה את נקודות הנתונים המקוריות, כמו גם את עקומת ההתאמה של CLOCCS עם פס הביטחון המתאים לרווח בר-סמך של התאמת CLOCCS ופסי השגיאה המתאימים לרווח בר-סמך של יחס בינומי של 95% של הנתונים, מכיוון שההנחה היא שהספירות הן משתנים אקראיים בינומיים בלתי תלויים14. לדוגמה, פסי הביטחון בנתוני ניצנים מודדים את הביטחון בשיעור התאים הניצנים עבור מדגם נתון.

שיטה אחת לקביעת איכות התאמת CLOCCS כרוכה בקביעה אם פסי השגיאה של הנתונים חופפים לפס הרווח בר-סמך של התאמת CLOCCS. אינדיקציה נוספת היא רוחב רצועת הביטחון של 95% של התאמת CLOCCS. באופן כללי, רוחב הרצועה יורד עם טוב יותר של התאמה. אינדיקציה ליישור לקוי היא אם שלב מחזור התא של הנתונים המקוריים אינו תואם לשלב מחזור התא שהוסק מהיישור. ניתן לבדוק שוב כל יישור על-ידי אישור שעבור כל נקודת זמן, הפאזה המצוינת על-ידי נתוני המידע של שלב מחזור התא תואמת לשלב מחזור התא שהוקצה על-ידי היישור.

התאמות CLOCCS גרועות או יישור לקוי יכולות להיות תוצאה של נתוני פאזות מחזור תא באיכות נמוכה. נתוני ניצנים באיכות גבוהה יהיו בעלי אחוז ניצנים נמוך מאוד מיד לאחר המעצר ואחוז ניצנים גבוה מאוד בשיא הראשון. הפסגות והשפלים הבאים יאבדו את הסנכרון, אך עליהם להיות מובחנים ומרווחים באופן שווה. מאחר שנקודות קו החיים מייצגות את שלב מחזור התא הממוצע של האוכלוסייה, סנכרון לקוי יכול לעכב גם את היישור התקין. נתוני תוכן DNA ציטומטריים באיכות גבוהה יהיו בעלי פסגות 1C ו- 2C נפרדות עבור כל נקודת זמן המתאימה לשלב מחזור התא המתאים. בנוסף, נתונים לא מספיקים בשלב מחזור התא מציגים בעיות בזיהוי פרמטרים. במקרה של נתונים מספיקים, ניתן להסיק את הפרמטרים ואינם משתנים באופן משמעותי בין ריצות CLOCCS. עם זאת, לא ניתן להתיר את הפרמטרים המתוארים בפרוטוקול זה (lambda, delta, mu0) כאשר נתוני שלב מחזור התא מכילים מחזור תא מלא אחד בלבד. כדי לאפשר הערכת פרמטרים משופרת, יש להשתמש בנתוני מחזור תא מספיקים ובנויים היטב עבור CLOCCS מתאים14,15. יתר על כן, מודל CLOCCS משתמש במידע מוקדם כמתואר באורלנדו ואחרים 15, אך ניתן להתאים מידע זה כך שיתאים טוב יותר לתנאי הניסוי בהם נעשה שימוש.

אם איכות נתוני הפאזה של מחזור התא טובה, התאמה מחדש של הגדרות CLOCCS עשויה לסייע ביצירת התאמה מדויקת יותר. לדוגמה, ניתן להגדיל את מספר האיטרציות שנבחרו כדי לשפר את הדיוק. אישור כי שיטת הסנכרון הנכונה נבחרה ב- CLOCCS יכול גם להיות שימושי, שכן מעצר גורם אלפא קשור לזמן התאוששות קצר יותר בהשוואה לאילוטריציה.

שיטה זו מוגבלת גם במונחים של סוגי נתוני פאזת מחזור התא הנתמכים כעת. עם זאת, CLOCCS גמיש וניתן להתאים אותו לתמיכה בסוגים אחרים של נתונים. לדוגמה, CLOCCS הותאם בעבר לתמיכה בתיוג פלואורסצנטי של מחזור התא של גופי מוטות ציר, טבעות מיוזין וגרעינים11 לשימוש כמזהי פאזות של מחזור התא. יתר על כן, השימוש ב- CLOCCS עם מינים שאינם S. cerevisiae התאפשר. CLOCCS מקבל מדדי מחיצה כסמן לשלב מחזור התא ב- S. pombe14, כמו גם נתוני תוכן DNA ציטומטרי זרימה, הניתנים לאיסוף בקלות עבור מינים רבים15. זה מאפשר השוואה של נתוני ניסוי באותו שלב של מחזור התא עבור שני מינים שונים לחלוטין ויכול לתת תובנות לגבי שינויים במחזור התא לאורך האבולוציה.

למרות שניתן להשתמש רק בצורות נתמכות של נתוני פאזות מחזור התא בשיטת יישור קו חיים זו, שיטה זו אגנוסטית לסוג הנתונים הניסיוניים מסדרות הזמן שבהן נעשה שימוש. בפרוטוקול זה, הדגמנו את השימוש בו ביישור ביטוי הגנים של גן בודד, כמו גם נתוני שעתוק סדרות זמן עבור מאות גנים במקביל. הראינו שניתן להשתמש בשיטה זו כדי להשוות בין פלטפורמות שונות, ובכך לערוך השוואות בין מערכי נתונים של RNA-seq לבין מערכי נתונים של מיקרו-מערך שצולמו בתנאים דומים. הראינו גם שניתן להשתמש בשיטה זו כדי ליישר מערכי נתונים עם שיטות סנכרון שונות על-ידי השוואה בין מערך נתונים שעבר אילוטריזציה (תנאי 1 מיקרו-מערך) עם מערך נתונים שנעצר גורם אלפא (תנאי 1 RNA-seq). בעבר, CLOCCS שימש גם ליישור נתונים פרוטאומיים של סדרות זמן וסדרות זמן באמצעות נתוני שלב22 של מחזור התא, שאפשרו השוואה ישירה בין דינמיקת ה-mRNA לבין הדינמיקה של החלבון המתאים. CLOCCS שימש גם ליישור נתוני סדרות זמן בין מינים, כגון יישור בין S. cerevisiae ו- S. pombe14 ובין המחזור הראשון של S. cerevisiae והשמרים הפתוגניים Cryptococcus neoformans21. לבסוף, יישור CLOCCS הוא כרגע ספציפי עבור נתוני סדרות זמן של מחזור התא ועדיין לא הותאם לשימוש עם סוגים אחרים של תהליכים ריתמיים. תחום אחד שבו זה יהיה מעניין במיוחד הוא עבור מקצבים צירקדיים, שבו הזמן הביולוגי (CT) משמש באופן קונבנציונלי ליישור ניסויים, אם כי היישום שלה אינו מיושם באופן עקבי. תחום עניין נוסף הוא חקר מקצבים התפתחותיים, כמו אלה של טפיל המלריה. לדוגמה, היישור של זני פלסמודיום פלציפרום עם תקופות שונות, כפי שמתואר בסמית ואחרים 25, יאפשר השוואות מפורטות יותר בין זנים. ההתאמה של תהליכים מחזוריים אלה להשוואה תאפשר הבנה טובה יותר של תפקודים ביולוגיים ריתמיים חשובים אלה. סוגים אלה של השוואות מחזור התא התאפשרו באמצעות CLOCCS ליישור קו החיים, כמתואר בפרוטוקול זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

קמפיונה וס' האזה נתמכו על ידי מימון מהקרן הלאומית למדע (DMS-1839288) ומהמכונים הלאומיים לבריאות (5R01GM126555). בנוסף, המחברים רוצים להודות ל-Huarui Zhou (אוניברסיטת דיוק) על הערות על כתב היד ועל בדיקת בטא של הפרוטוקול. אנו מודים גם לפרנסיס מוטה (אוניברסיטת פלורידה אטלנטיק) וג'ושוע רובינסון על עזרתם בקוד Java.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2x PBS For Fixative Solution. Described in Leman 2014.
4% formaldehyde For Fixative Solution.
100% Ethanol For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002.
CLOCCS https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow Cytometer For flow cytometry protocol.
Git https://git-scm.com/
Java 19 https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
Microscope For counting cells and buds.
Miniconda https://docs.conda.io/en/latest/
Protease solution For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
RNAse A solution For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid Stain Invitrogen S7020 For flow cytometry staining. Described in Haase 2002.
Tris pH 7.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
  2. Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
  3. Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
  4. Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
  5. Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
  6. Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
  7. Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
  8. Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
  9. Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
  10. Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
  11. Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
  12. Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
  13. Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
  14. Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
  15. Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
  16. Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
  17. Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
  18. Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
  19. Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
  20. Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
  21. Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453 (2016).
  22. Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
  23. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  24. Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
  25. Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 196 יישור סדרות זמן תמלול סנכרון מחזור התא ציטומטריית זרימה מודלים תוכנה
יישור נתוני סדרות זמן מסונכרנות באמצעות מודל אפיון אובדן מחזור התא לצורך השוואות בין ניסויים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Campione, S. A., Kelliher, C. M.,… More

Campione, S. A., Kelliher, C. M., Orlando, D. A., Tran, T. Q., Haase, S. B. Alignment of Synchronized Time-Series Data Using the Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony Model for Cross-Experiment Comparisons. J. Vis. Exp. (196), e65466, doi:10.3791/65466 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter