Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Alinhamento de dados sincronizados de séries temporais usando o modelo de caracterização de perda de sincronia do ciclo celular para comparações entre experimentos

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65466
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1
1Department of Biology, Duke University, 2Department of Biology, University of Massachusetts, 3Orlando Data Science LLC, 4Department of Computer Science, Duke University

Summary

Um desafio de analisar experimentos sincronizados de séries temporais é que os experimentos geralmente diferem na duração da recuperação da sincronia e no período do ciclo celular. Assim, as medidas de diferentes experimentos não podem ser analisadas de forma agregada ou facilmente comparadas. Aqui, descrevemos um método para alinhar experimentos para permitir comparações específicas de fase.

Abstract

A investigação do ciclo celular muitas vezes depende da sincronização das populações celulares para medir vários parâmetros em uma série temporal à medida que as células atravessam o ciclo celular. No entanto, mesmo sob condições semelhantes, experimentos replicados exibem diferenças no tempo necessário para se recuperar da sincronia e atravessar o ciclo celular, impedindo comparações diretas em cada ponto de tempo. O problema de comparar medidas dinâmicas entre experimentos é exacerbado em populações mutantes ou em condições alternativas de crescimento que afetam o tempo de recuperação da sincronia e/ou o período do ciclo celular.

Publicamos anteriormente um modelo matemático paramétrico chamado Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) que monitora como populações síncronas de células se liberam da sincronia e progridem através do ciclo celular. Os parâmetros aprendidos do modelo podem então ser usados para converter pontos de tempo experimentais de experimentos sincronizados de séries temporais em uma escala de tempo normalizada (pontos de linha de vida). Em vez de representar o tempo decorrido em minutos desde o início do experimento, a escala da linha de vida representa a progressão da sincronia para a entrada do ciclo celular e, em seguida, através das fases do ciclo celular. Como os pontos da linha de vida correspondem à fase da célula média dentro da população sincronizada, essa escala de tempo normalizada permite comparações diretas entre experimentos, incluindo aqueles com períodos e tempos de recuperação variáveis. Além disso, o modelo tem sido usado para alinhar experimentos de ciclo celular entre diferentes espécies (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe), permitindo assim a comparação direta de medidas do ciclo celular, que podem revelar semelhanças e diferenças evolutivas.

Introduction

Medidas de séries temporais realizadas em populações sincronizadas de células à medida que progridem ao longo do ciclo celular é um método padrão para investigar os mecanismos que controlam a progressão do ciclo celular 1,2,3,4,5,6,7,8 . A capacidade de fazer comparações entre experimentos de séries temporais de sincronia/liberação é vital para nossa compreensão desses processos dinâmicos. O uso de experimentos replicados para corroborar os achados pode aumentar a confiança na reprodutibilidade das conclusões. Além disso, comparações entre condições ambientais, entre mutantes e até mesmo entre espécies podem revelar muitos novos insights sobre a regulação do ciclo celular. No entanto, a variabilidade interexperimental na recuperação da sincronia e na velocidade de progressão do ciclo celular prejudica a capacidade de fazer comparações ponto-a-tempo entre réplicas ou entre experimentos com tempo alterado do ciclo celular. Devido a esses desafios, as réplicas muitas vezes não são incluídas para a série em tempo integral (por exemplo, Spellman et al.4). Quando réplicas para toda a série temporal são coletadas, os dados não podem ser analisados de forma agregada, mas uma única réplica é usada para análise, e outras réplicas são frequentemente relegadas a figuras suplementares (por exemplo, Orlando et al.8). Além disso, comparações entre experimentos com diferentes características de recuperação ou progressão do ciclo celular são difíceis. As medidas de intervalos menores entre um evento de interesse e um marco do ciclo celular (por exemplo, emergência de gemas, entrada em fase S ou início de anáfase) podem ajudar a reduzir erros se esses eventos de referência forem rastreados 1,2,3,9,10,11,12. No entanto, diferenças sutis, mas importantes, podem permanecer não detectadas ou obscurecidas usando esses métodos ad hoc. Finalmente, as análises de célula única permitem analisar a progressão do ciclo celular sem depender de sincronização ou alinhamento13, embora medições em larga escala em estudos unicelulares possam ser desafiadoras e caras.

Para superar essas dificuldades, desenvolvemos o modelo Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) para auxiliar a análise de medidas de séries temporais realizadas em populações sincronizadas14,15. CLOCCS é um modelo matemático flexível que descreve a distribuição de células sincronizadas através de fases do ciclo celular à medida que elas são liberadas da sincronia e progridem através do ciclo celular. A estrutura do processo de ramificação permite que o modelo dê conta das qualidades assimétricas das células mãe e filha após a divisão, como observado em S. cerevisiae, ao mesmo tempo em que é útil para organismos que se dividem por fissão, como S. pombe. O modelo pode receber entradas de um conjunto diverso de tipos de medição para especificar a fase do ciclo celular. Pode ingerir dados de fase do ciclo celular brotante, que incluem medidas da porcentagem de células brotadas ao longo do tempo, permitindo estimar o número de células fora da fase G1 não brotada14,15. O modelo também pode ingerir dados de citometria de fluxo que medem o conteúdo de DNA, permitindo a avaliação das transições de pontos de referência de G1 para S, S para G2 e M para G115. Marcadores morfológicos fluorescentes também podem ser usados para identificar a fase do ciclo celular. A marcação fluorescente de anéis de miosina, núcleos e fusos polos (SPBs) pode ser usada para determinar a fase do ciclo celular, e estes foram incorporados ao modelo CLOCCS11; no entanto, essas medidas não serão descritas neste protocolo. Adicionalmente, o índice de septação foi utilizado como entrada para a modelagem dos dados de S. pombe14. Assim, o modelo pode ser usado para análises do ciclo celular em uma variedade de organismos e pode ser expandido ainda mais.

O CLOCCS é um modelo paramétrico que permite a inferência bayesiana completa de múltiplos parâmetros a partir dos dados de entrada (por exemplo, porcentagem de brotamento, conteúdo de DNA). Esses parâmetros incluem o tempo de recuperação da sincronia, a duração do período do ciclo celular (estimado separadamente para as células mãe e filha) e a posição média do ciclo celular das células em cada ponto de tempo. Esses parâmetros representam o comportamento da célula média na população, permitindo ao pesquisador mapear cada ponto de tempo para uma posição do ciclo celular expressa como um ponto de linha de vida. A conversão para pontos da linha de vida depende dos parâmetros CLOCCS lambda (λ) e mu0 (μ0)14,15. O parâmetro λ corresponde ao período médio do ciclo celular das células-mãe. No entanto, devido ao atraso mãe-filha14,15, este não é o período médio do ciclo celular de toda a população que inclui tanto as células da mãe quanto as da filha. A CLOCCS infere adicionalmente o parâmetro delta (δ), que corresponde ao atraso mãe-filha e, assim, permite o cálculo do período médio do ciclo celular de toda a população. Finalmente, como cada experimento começa após a liberação da sincronização do ciclo celular, o tempo necessário para se recuperar do método de sincronização é representado pelo parâmetro CLOCCS μ0. O CLOCCS ajusta um modelo aos dados de fase do ciclo celular de entrada e, em seguida, infere esses parâmetros usando um algoritmo de Monte Carlo de cadeia de Markov de passeio aleatório14,15. Ao mapear vários experimentos para uma escala de tempo comum de linha de vida do ciclo celular, comparações diretas específicas de fase podem ser feitas entre réplicas ou experimentos onde o tempo de recuperação ou os períodos do ciclo celular não são idênticos 8,14,15.

Como populações sincronizadas perdem sincronia em alguma taxa ao longo da série temporal14,15,16,17, a variabilidade na taxa de perda de sincronia também pode impedir comparações quantitativas entre experimentos. Ao identificar a localização das populações e a variância em suas distribuições, a CLOCCS explica as diferenças nas taxas de perda de sincronia. Essa poderosa ferramenta permite comparações específicas e detalhadas entre experimentos, fornecendo a capacidade de fazer comparações relevantes diretamente não apenas entre replicantes, mas também entre condições ambientais, mutantes e até mesmo espécies que têm tempos de ciclo celular dramaticamente diferentes14,15.

Este artigo descreve um método usando CLOCCS para estimar parâmetros ajustando dados de experimentos de séries temporais de sincronia/liberação, mapear os dados para uma escala de linha de vida comum e, em seguida, fazer comparações relevantes entre réplicas ou experimentos. O alinhamento da linha de vida permite comparações diretas específicas de fase nesses experimentos, o que permite a agregação e comparação de réplicas e fazer comparações mais relevantes entre experimentos com diferentes tempos de recuperação e períodos de ciclo celular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Coleta de dados experimentais e de fase do ciclo celular

  1. Sincronizar as células em relação ao ciclo celular usando o método de sincronização desejado (por exemplo, elutriação centrífuga como descrito em Leman et al.18 ou parada de feromônio de acasalamento como descrito em Rosebrock 19; tanto Leman et al.18 quanto Rosebrock 19 também incluem métodos para a liberação de sincronia). Comece a amostragem ao longo da série temporal, garantindo que a série temporal tenha pelo menos dois períodos completos de ciclo celular e, idealmente, colete pelo menos 10 amostras por ciclo celular. Em cada ponto de tempo, coletar uma amostra para dados de fase do ciclo celular (brotamento ou citometria de fluxo) e uma amostra para dados experimentais, conforme descrito abaixo.
  2. Se estiver usando dados de brotamento como dados de fase do ciclo celular, colete dados sobre brotamento para o alinhamento do CLOCCS.
    1. Amostra ao longo da série temporal. Para cada momento, coletar células e fixá-las misturando 200 μL de cultura de células sonicadas com 200 μL de solução fixadora, conforme descrito em Leman et al.18.
    2. Para brotamento padrão, conte pelo menos 200 células por ponto de tempo usando um microscópio de luz transmitida com uma objetiva de 40x e um hemocitômetro. Adicionar a amostra celular do passo 1.2.1 ao hemocitómetro e diluir se a densidade impedir a contagem. Registre o número de células brotadas e não brotadas em cada ponto de tempo. Calcule a porcentagem de células brotadas e plote para cada ponto de tempo em uma curva de brotamento.
      Observação : outros métodos de especificar as informações de fase do ciclo celular estão disponíveis, mas eles não são descritos neste protocolo. Os demais métodos estão descritos no leiame do CLOCCS e em trabalho anterior11.
  3. Se estiver usando dados de conteúdo de DNA por citometria de fluxo como dados de fase do ciclo celular, colete dados de coloração de DNA por citometria de fluxo para o alinhamento CLOCCS por citometria de fluxo.
    1. Amostra ao longo da série temporal. Para cada ponto de tempo, colete células e fixe-as conforme descrito em Haase e Reed20.
    2. Manchar o DNA e analisar usando análise de citometria de fluxo padrão. Um protocolo de coloração recomendado para S. cerevisiae é descrito em Haase e Reed20.
  4. Coletar dados ômicos associados ou experimentais relacionados. Para dados transcriptômicos padrão, coletar conforme descrito em Leman et al.18 e Kelliher et al.21,22. Certifique-se de que os dados estejam associados a pontos de tempo que contenham dados de fase do ciclo celular para permitir o alinhamento a jusante. Para um alinhamento ideal, certifique-se de que cada ponto de tempo que contém dados experimentais também tenha dados de fase associados a ele.
    NOTA: Os dados experimentais podem assumir muitas formas. Tradicionalmente, usamos o método de alinhamento descrito para alinhar experimentos transcriptômicos de séries temporais. No entanto, qualquer tipo de dado associado a pontos de tempo pode ser alinhado (i.e., proteômica22).

2. Instalando o software necessário

NOTA: Esta seção pressupõe que o Conda, o Java 19 e o Git já estão instalados (Tabela de Materiais).

  1. Baixe o repositório CLOCCS_alignment digitando o seguinte comando no terminal:
    git clone git clone https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
  2. Crie um ambiente Conda usando o arquivo conda_req.yml inserindo o seguinte comando no terminal na pasta onde o repositório CLOCCS_alignment foi clonado:
    conda env criar -f conda_req.yml

3. Utilização do CLOCCS para parametrização dos experimentos

  1. Clique duas vezes no arquivo cloccs_v2023.jar na pasta CLOCCS no repositório CLOCCS_alignment e aguarde a abertura de uma interface gráfica do usuário. Esta tela permite opções de entrada para a execução do CLOCCS e exibe os resultados depois de executados.
  2. Insira as configurações gerais.
    1. Defina Sim Anneal, Burn In e Iterations digitando as caixas de entrada de texto associadas. O Sim Anneal (recozimento simulado) identifica bons valores de parâmetros iniciais, o Burn In procura os modos posteriores e o estágio final permite que todas as inferências posteriores sejam desenhadas. Valores mais altos aumentam o tempo de execução, mas também aumentam a precisão.
    2. Insira as condições experimentais especificando a temperatura em Celsius e o método de sincronização usando a caixa de texto denominada Temperatura e o menu suspenso Sincronizar. Método, respectivamente.
    3. Opcionalmente, defina as configurações avançadas no menu Configurações avançadas. As configurações avançadas permitem que os priores sejam definidos para cada um dos parâmetros ("mu0", "sigma0", "sigmav", "lambda", "bud.start", "bud.end").
      Observação : mais informações sobre as configurações avançadas podem ser encontradas no readme.txt na pasta CLOCCS do repositório CLOCCS_alignment.
  3. Insira as configurações para uso com os dados de brotamento.
    1. Escolha a seleção apropriada no menu suspenso Tipo de modelo . A opção padrão Bud é para informações de brotamento padrão para levedura em brotamento.
      NOTA: Outras opções mais avançadas também existem no menu suspenso: Mutante para informações de brotamento para mutantes que passam por vários ciclos de brotamento sem divisão, BudSSLSMR para informações de brotamento e informações adicionais do corpo do polo do fuso e do anel de miosina, e BudNucDivNeck para informações de brotamento e informações adicionais de núcleos de divisão e pescoço de brotamento. Essas opções avançadas estão descritas no leiame do CLOCCS e em trabalhos anteriores11,14,15.
    2. Importe os dados usando o painel Importação de dados digitando nas caixas de entrada de texto ou carregando um arquivo clicando no botão Selecionar arquivo . A primeira coluna especifica os pontos de tempo. As duas colunas restantes especificam os dados de brotamento e podem usar qualquer uma das seguintes opções: o número de células não budadas (Sem Bud), o número de células budadas (Bud) ou o número total de células (Total).
  4. Insira as configurações para uso com os dados de citometria de fluxo. Para cada experimento, execute a etapa 3.3 ou a etapa 3.4.
    NOTA: Os dados de citometria de fluxo e os dados de brotamento podem ser usados juntos. Embora anteriormente tenhamos descrito executá-los juntos15, para esta ferramenta, eles devem ser executados de forma independente e, em seguida, comparados.
    1. Converta os arquivos .fcs no formato de entrada CLOCCS correto para citometria de fluxo seguindo as instruções no arquivo suplementar 1 (também encontrado no repositório CLOCCS_alignment como CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt).
    2. Selecione a seleção Fluxo no menu suspenso Tipo de modelo .
    3. Importe os dados usando o painel Importação de Dados. Clique em Selecionar arquivo e selecione o arquivo gerado na etapa 3.4.1.
    4. Selecione os pontos de tempo para os quais um ajuste de CLOCCS de citometria de fluxo deve ser plotado selecionando os pontos de tempo na caixa Tempos para ajuste .
  5. Depois que todas as entradas tiverem sido selecionadas para brotamento ou citometria de fluxo, clique no botão Aplicar e, em seguida, clique no botão Amostra na parte superior da tela.
  6. Visualize a curva de brotamento ou gráficos de citometria de fluxo com os ajustes previstos selecionando a guia Ajustes previstos . Essa guia é aberta por padrão imediatamente após a etapa anterior.
  7. Visualize os histogramas de parâmetros para cada parâmetro selecionando a guia Histogramas de parâmetro e, em seguida, selecionando a subguia que corresponde ao parâmetro de interesse nas seguintes opções: mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end, etc.
  8. Visualize o gráfico de pontuação posterior selecionando a guia Escore posterior .
  9. Visualize as configurações e altere-as ainda mais selecionando a guia Configurações ; exiba o log das execuções anteriores selecionando a guia Log .
  10. Obtenha os parâmetros CLOCCS a partir do ajuste selecionando a guia Parâmetros posteriores . A tabela resultante terá a seguinte forma: cada linha consiste em um parâmetro, com a linha final sendo a posterior. As colunas consistem no parâmetro previsto para a média, o intervalo de confiança inferior a 2,5%, o intervalo de confiança superior de 97,5% e a taxa de aceitação.
    1. Registrar os parâmetros usados para alinhamento para cada experimento: o tempo de recuperação da sincronia (μ0) e o período médio do ciclo celular das células-mãe (λ).
    2. Calcule o período do ciclo celular calculando a média do período da célula mãe (λ) e do período da célula filha (λ + δ), onde δ é o atraso específico da filha.
      NOTA: Repita a seção 3 com todos os experimentos a serem incluídos nas comparações.

4. Conversão de pontos de tempo em pontos de linha de vida usando as funções de conversão Python e os parâmetros CLOCCS

NOTA: A conversão entre pontos de tempo e pontos de linha de vida requer duas fórmulas de conversão21. Uma implementação Python para conversão e visualização de dados está disponível no repositório CLOCCS_alignment e descrita abaixo.

  1. Ative o ambiente Conda digitando o seguinte comando no terminal: conda activate CLOCCS_alignment
  2. Abra um bloco de anotações Python interativo digitando o seguinte comando no terminal: jupyter notebook
  3. Crie um novo bloco de anotações Python na pasta desejada.
    Observação : um bloco de anotações de exemplo foi incluído para demonstrar o uso padrão e pode ser encontrado em Alignment/JOVE_example.ipynb no repositório de alinhamento CLOCCS_.
  4. Importe o arquivo Python que contém as funções de alinhamento executando o seguinte comando na primeira célula:
    %execute path_to_repo/cloccs_alignment/Alinhamento/utilitários.py
    1. Substitua o caminho para o repositório CLOCCS_alignment por path_to_repo.
  5. Se estiver usando dados de budding como os dados da fase do ciclo celular, importe um quadro de dados contendo a porcentagem de budded em cada ponto de tempo executando o seguinte comando em uma nova célula:
    budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Substitua o caminho e o nome do arquivo apropriados. Se o arquivo for um arquivo .csv, remova sep ="\t"
  6. Se estiver usando dados de brotamento como os dados de fase do ciclo celular, alinhe os dados de brotamento a uma escala de tempo de ponto de linha de vida inserindo a seguinte função em uma nova célula:
    aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, timepoints, param_mu0, param_lambda)
    1. Para pontos de tempo, substitua uma lista dos pontos de tempo para ser o índice do quadro de dados budding_df.
    2. Para param_mu0 e param_lambda, substitua os parâmetros aprendidos do CLOCCS em brotamento executado na seção 3 pelo experimento.
  7. Se estiver usando dados de citometria de fluxo, importe os dados de citometria de fluxo executando o seguinte comando em uma nova célula:
    flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
    1. Por flow_input_folder, substitua o caminho apropriado para a pasta que contém os arquivos .fcs da citometria de fluxo.
  8. Se estiver usando dados de citometria de fluxo, gere uma tabela de conversão entre os pontos de tempo e os pontos da linha de vida para cada experimento digitando o seguinte comando em uma nova célula:
    flow_converter = convert_tp_to_ll(pontos de tempo, param_mu0, param_lambda)
    1. Para pontos de tempo, substitua uma lista dos pontos de tempo dos dados de citometria de fluxo.
    2. Para param_mu0 e param_lambda, substitua os parâmetros aprendidos da citometria de fluxo CLOCCS executada na seção 3 pelo experimento.
  9. Importe o quadro de dados que contém os dados experimentais para o bloco de anotações executando o seguinte comando em uma nova célula:
    data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Substitua o caminho e o nome do arquivo apropriados. Se o arquivo for um arquivo .csv, remova sep ="\t".
      Observação : isso pode ser feito para quaisquer dados tabulares. Os dados experimentais devem simplesmente ter os pontos de tempo como as colunas ou o índice do quadro de dados. Dados de exemplo podem ser encontrados no repositório CLOCCS_alignment.
  10. Alinhe os dados experimentais a uma escala de tempo de ponto de linha de vida inserindo a seguinte função em uma nova célula:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, timepoints, param_mu0, param_lambda, interpolar, lowerll, upperll)
    1. Para pontos de tempo, substitua uma lista dos pontos de tempo como o índice ou as colunas do data_df experimental da etapa anterior.
    2. Para param_mu0 e param_lambda, substitua os valores obtidos na seção 3 do CLOCCS.
      Observação : os parâmetros podem vir de qualquer execução CLOCCS executada em qualquer um dos tipos de dados de fase de ciclo celular aceitos.
    3. Opcionalmente, substitua interpolar por True ou False, ou deixe em branco (o padrão é False).
      Observação : quando definido como False, os dados não serão interpolados. Quando definido como True, os pontos da linha de vida serão arredondados e interpolados para preencher os valores entre os pontos da linha de vida, de modo que haja um ponto por inteiro no intervalo dos pontos da linha de vida. Isso permite uma melhor comparação entre conjuntos de dados.
    4. Opcionalmente, substitua lowerll e upperll por Nenhum ou valores inteiros.
      Observação : quando definido como Nenhum, todos os pontos de linha de vida após a interpolação são mantidos. Quando inteiros são fornecidos , isso trunca os dados para que os pontos da linha de vida variem do lowerll ao upperll. Isso permite a comparação entre conjuntos de dados com um lowerll ou upperll diferente.
  11. Baixe o conjunto de dados alinhado à linha de vida inserindo o seguinte comando em uma nova célula: lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
  12. Repita as etapas 4.5-4.11 com todos os experimentos a serem incluídos nas comparações.

5. Comparação entre curvas de brotamento e dados de citometria de fluxo

  1. Plote as curvas de brotamento antes do alinhamento usando a função de utilitários Python inserindo o seguinte comando em uma nova célula:
    plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, título = str_title)
    1. Substitua uma lista contendo os quadros de dados de todas as curvas de brotamento desejadas pela plotagem por list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2, bud_df3].
    2. Substitua uma lista dos rótulos pela legenda - [Experimento 1, Experimento 2, Mutante] por leg_list se desejar. Caso contrário, exclua ou substitua Nenhum.
    3. Substitua o tempo por str_type.
    4. Substitua um título de cadeia de caracteres Comparison Budding Curves por str_title se desejar. Caso contrário, substitua Nenhum ou exclua.
  2. Plote as curvas de brotamento após o alinhamento usando a função de utilitários Python seguindo as instruções na etapa 5.1, mas com uma lista de curvas de brotamento alinhadas substituídas por list_of_budding_curves e com linha de vida para point_type em vez de tempo.
  3. Para plotar os dados de citometria de fluxo, plote os dados associados dos arquivos .fcs nos pontos de linha de vida correspondentes usando o conversor gerado na etapa 4.8.
  4. Converta os pontos da linha de vida para a fase do ciclo celular usando a tabela do conversor (Tabela 1).
    Observação : isso também pode ser plotado seguindo as instruções na etapa 5.1, mas com fase para point_type em vez de tempo.

6. Comparação dos dados experimentais

  1. Determinar a lista de genes a ser plotada nos gráficos de linhas com base em informações da literatura ou nos genes de interesse para a pesquisa.
  2. Use as plot_linegraph_comparison fornecidas no arquivo de utilitários Python para executar comparações de gráfico de linha no quadro de dados original, alinhado ou alinhado e interpolado digitando o seguinte comando em uma nova célula:
    plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelista, point_type = str_type, título = str_title)
    1. Substitua uma lista dos quadros de dados dos experimentos a serem comparados por list_of_dfs.
      Observação : os quadros de dados podem ser desalinhados, ou alinhados; No entanto, o point_type correspondente deve ser introduzido na etapa 6.2.4.
    2. Substitua uma lista dos títulos de cada quadro de dados na mesma ordem que a lista de quadros de dados para list_for_legend.
    3. Substitua uma lista dos nomes dos genes (que devem ser incluídos no índice dos quadros de dados) a serem plotados por genelista.
    4. Substitua o tipo de ponto por str_type. Use linha de vida (o padrão é escala de ponto de linha de vida) ou fase (a escala de linha de vida de fase de ciclo celular) para os quadros de dados alinhados na etapa 6.2.1 ou tempo para os quadros de dados não alinhados na etapa 6.2.1.
    5. Substitua um título de cadeia de caracteres opcional por str_title.
  3. Determinar a lista de genes a serem incluídos no mapa de calor usando a literatura ou algoritmos para determinar os principais genes periódicos.
    NOTA: Para comparações adequadas do mapa de calor, os dados devem ser alinhados, interpolados e ajustados na escala de tempo na etapa 6.2; ele deve ter o mesmo valor de linha de vida inicial e final para cada experimento.
    1. Executar algoritmos de periodicidade para determinar os principais genes periódicos23,24, ou usar os métodos alternativos desejados para determinar a lista de genes (i.e., resultados da literatura).
    2. Importe um arquivo de lista de genes .csv ou .tsv para o bloco de anotações usando o seguinte comando em uma nova célula:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
    3. Substitua o caminho e o nome do arquivo apropriados. Se o arquivo for um arquivo .csv, remova sep="\t".
  4. Use a função fornecida plot_heatmap_comparison no arquivo de utilitários Python para executar uma comparação de mapa de calor no quadro de dados alinhado, interpolado e alinhado à fase digitando o seguinte comando em uma nova célula:
    plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelista, título = str_title)
    1. Substitua uma lista dos quadros de dados alinhados dos experimentos a serem comparados por list_of_dfs.
    2. Substitua uma lista dos títulos de cada quadro de dados na mesma ordem que a lista de quadros de dados para list_for_legend.
    3. Substitua uma lista dos nomes dos genes (que devem ser incluídos no índice dos quadros de dados) a serem plotados por genelista.
    4. Substitua um título de cadeia de caracteres opcional por str_title.
      NOTA: O primeiro quadro de dados na lista é aquele que será usado para ordenar os genes no mapa de calor. Os genes serão ordenados pelo máximo no primeiro período para esse quadro de dados, e a mesma ordem será usada para os quadros de dados subsequentes na lista.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

As etapas descritas no protocolo acima e no fluxo de trabalho da Figura 1 foram aplicadas a cinco experimentos de séries temporais sincronizadas em ciclo celular para demonstrar duas comparações representativas: entre réplicas com diferentes métodos de sincronia (feromônio de acasalamento e elutriação centrífuga18) e plataformas de sequenciamento (RNA-sequenciamento [RNA-seq] e microarray), bem como entre condições experimentais. Múltiplos experimentos foram realizados com S. cerevisiae, e a fase do ciclo celular e dados experimentais foram coletados para cada experimento. O fluxo de trabalho envolve o uso de CLOCCS para parametrizar os vários experimentos de séries temporais de sincronia/liberação, usando esses parâmetros para alinhar os experimentos a uma escala de linha de vida comparável comum e, em seguida, usando esses experimentos alinhados para as duas comparações representativas.

Para demonstrar a comparação representativa entre as repetições, foram selecionados três experimentos realizados com a mesma linhagem e nas mesmas condições experimentais, denominados Condição 1. Dois desses experimentos foram réplicas diretas um do outro, e ambos foram analisados via análise de microarray e sincronizados via elutriação centrífuga. O terceiro experimento foi analisado usando análise de RNA-seq e sincronizado via parada de feromônio de acasalamento com fator alfa. Para demonstrar a segunda comparação entre experimentos com diferentes períodos de ciclo celular, o experimento RNA-seq da Condição 1 (período do ciclo celular: 71 min) de cima foi comparado com a Condição 2 (período do ciclo celular: 82 min) e a Condição 3 (período do ciclo celular: 110 min) (Tabela 2). Para cada experimento, as células foram cultivadas em suas respectivas condições, sincronizadas, liberadas e, em seguida, amostradas ao longo de dois ou mais períodos de ciclo celular. Os dados de brotamento e/ou citometria de fluxo foram coletados para fornecer informações sobre a fase do ciclo celular, e dados transcriptômicos de séries temporais de microarray ou RNA-seq foram coletados conforme descrito em Leman et al.18 (Tabela Suplementar S1).

Para cada experimento, os dados tomaram as formas descritas na Figura 2, que apresenta o experimento da Condição 2 como exemplo para demonstração. Cada conjunto de dados apresentou uma curva de brotamento, que permitiu a inferência da fase do ciclo celular. Essa curva compreendeu um valor percentual de brotamento para cada ponto de tempo da série temporal, que foi então plotado para produzir uma curva de brotamento exibindo múltiplas oscilações do ciclo celular (Figura 2). Os dados da fase do ciclo celular também assumiram a forma de dados de coloração de conteúdo de DNA por citometria de fluxo para cada ponto de tempo na série temporal. Foram plotados os pontos de tempo selecionados para a Condição 2 (Figura 2). Os arquivos de citometria de fluxo foram combinados em uma única tabela contendo as células em cada silo de fluorescência logarítmica para cada ponto de tempo para entrada no CLOCCS usando a função flow_cytometry_CLOCCS_file_from_fcs nos utilitários Python. Cada conjunto de dados também continha dados experimentais. Neste caso, os dados foram transcriptômicos, e os dados foram organizados em fileiras de genes, cada um com um valor para a abundância de RNA em cada momento do experimento (Figura 2).

Demonstramos o uso de CLOCCS e a conversão para pontos de linha de vida para o conjunto de dados RNA-seq da Condição 2; no entanto, o processo foi idêntico para os outros experimentos também. As informações de brotamento foram inseridas no algoritmo CLOCCS conforme descrito na seção 3 do protocolo e como mostrado na Figura 3A. Os valores padrão para Sim Anneal, Burn In, Iterations e Advanced Settings foram usados. Foram selecionadas as condições experimentais adequadas. O tipo de modelo "Bud" foi utilizado para os dados de brotamento. Os ajustes de brotamento CLOCCS resultantes foram visualizados para garantir que as curvas de brotamento estivessem adequadamente ajustadas, como demonstrado pelos pontos de dados sobrepondo a curva de ajuste correspondente com uma pequena banda de confiança de 95% (Figura 3B e Figura Suplementar S1). Os parâmetros μ0 e λ da tabela de parâmetros posteriores (Figura 3C) foram registrados para uso no alinhamento. Os dados de citometria de fluxo para a Condição 2 foram inseridos separadamente no CLOCCS, conforme descrito na seção 3 do protocolo. Atualmente, a CLOCCS espera que os citômetros de fluxo produzam dados de 10 bits com 1.024 canais; no entanto, os citômetros de fluxo modernos podem ter mais canais. Como nosso citômetro de fluxo produz dados com mais de 1.024 canais, os dados foram agrupados em 1.024 bins. Com dados de fase do ciclo celular da citometria de fluxo, o CLOCCS produz um ajuste de CLOCCS para cada ponto de tempo selecionado (Figura 3D e Figura Suplementar S2) e fornece uma tabela de parâmetros posteriores semelhante à tabela de parâmetros posteriores brotantes na Figura 3C. Os parâmetros para brotamento que o CLOCCS executa para cada um dos outros experimentos estão descritos na Tabela 2, e os parâmetros para a citometria de fluxo que o CLOCCS executa estão descritos na Tabela Suplementar S2.

Os parâmetros CLOCCS correspondentes ao período de ciclo celular das células-mãe (λ) e ao tempo de recuperação (μ0) foram utilizados para o alinhamento da linha de vida. É importante notar que λ não representa necessariamente o período médio do ciclo celular da população celular. Nos casos em que as células sofrem uma divisão completa, há um número igual de células mãe e filha, de modo que o período médio do ciclo celular é a média entre o período do ciclo celular das células-mãe (λ) e o período do ciclo celular das células-filhas (λ + δ); Especificamente, delta (δ) é a duração do atraso específico da filha. Este é o cálculo que utilizamos para o período de ciclo celular para cada experimento (Tabela 2). Para cada experimento, os parâmetros correspondentes λ e μ0 foram então utilizados na função de conversão, df_conversion_from_parameters, fornecida no arquivo de utilitários Python, como demonstrado para a Condição 2 (Figura 4A). Para as curvas de brotamento, os dados não foram interpolados. No entanto, para dados experimentais, os conjuntos de dados alinhados à linha de vida foram reamostrados usando interpolação de tal forma que cada ponto da linha de vida contivesse dados interpolados para melhorar a plotagem. Para garantir que os conjuntos de dados alinhados à linha de vida tivessem o mesmo intervalo de pontos de linha de vida, os limites inferior e superior da linha de vida foram definidos para truncar os dados nesses pontos. Esses parâmetros lowerll e upperll foram inseridos na função df_conversion_from_parameters quando a interpolação foi definida como True. Para a comparação da Condição 1, eles foram ajustados como 44 e 270, respectivamente, para todos os conjuntos de dados, e para a comparação entre as condições ambientais, eles foram ajustados para 50 e 300, respectivamente. Um exemplo de uso dessas funções para alinhamento e comparação pode ser visto no exemplo de notebook Python JOVE_example.ipynb, e o código usado para gerar as figuras pode ser visto no bloco de anotações JOVE_Figures.ipynb no repositório CLOCCS_alignment.

Essa conversão de pontos de tempo para pontos de linha de vida depende de duas fórmulas21 (Figura 4A) usando μ0 (tempo de recuperação) e λ (período mãe). A primeira fórmula, , Equation 1é a fórmula da fase de recuperação (Figura 4A). Essa fórmula é usada apenas para pontos de tempo dentro da fase de recuperação, que consiste nos pontos de tempo até e incluindo μ 0, já que μ0 corresponde ao tempo de recuperação. Os pontos de tempo são então convertidos para um intervalo de escala de linha de vida terminando com 100 pontos de linha de vida (Tabela 1), marcando o final da fase de recuperação e o início do primeiro ciclo celular. A fase pós-recuperação usa a segunda fórmula, Equation 2 (Figura 4A), que converte cada ponto de tempo pós-recuperação subsequente em um ponto de linha de vida após 100. Cada 100 pontos subsequentes da linha de vida corresponde a um novo ciclo celular, com o primeiro ciclo correspondendo aos pontos da linha de vida 100 a 200, o segundo ciclo correspondendo aos pontos da linha de vida 200 a 300, e assim por diante (Tabela 1). A conversão de pontos de tempo em pontos de linha de vida é aplicada a cada conjunto de dados individualmente usando os parâmetros CLOCCS correspondentes para esse conjunto de dados. Depois que cada conjunto de dados é convertido para a escala da linha de vida, as fases do ciclo celular são alinhadas, o que permite comparações específicas de fase entre conjuntos de dados.

A Tabela 3 mostra a conversão de pontos de tempo selecionados em seus respectivos pontos de linha de vida para a conversão representativa do conjunto de dados da Condição 2 usando parâmetros da execução CLOCCS em brotamento. Os dados de brotamento coletados do RNA-seq da Condição 2 foram plotados em uma curva de brotamento mostrando a porcentagem de brotamento ao longo do tempo tanto para a escala de tempo não alinhada, em minutos (Figura 4B), quanto para a escala de tempo alinhada em pontos da linha de vida (Figura 4C), usando a função Python plot_budding_curves em um caderno Python. Os pontos da linha de vida puderam ser facilmente convertidos em informações experimentais e de fase do ciclo celular (Tabela 1), e a fase de recuperação e o primeiro ao terceiro ciclos celulares foram codificados manualmente por cores (Figura 4B,C). Uma vez que cada ponto da linha de vida correspondia a uma fase do ciclo celular, gráficos individuais de citometria de fluxo poderiam ser rotulados através das funções Python usando a fase do ciclo celular determinada pelo alinhamento da linha de vida. Essas fases coincidiram com as fases determinadas por citometria de fluxo para a Condição 2. Os dados de citometria de fluxo coletados para o conjunto de dados da Condição 2 foram plotados para pontos de tempo selecionados e marcados usando a fase do ciclo celular determinada a partir do alinhamento da linha de vida da citometria de fluxo. Em cada caso, os dados corresponderam à fase determinada pelo alinhamento (Figura 4D).

É importante notar que o nível de expressão de cada gene para cada amostra permanece o mesmo, mas a marcação dos pontos de tempo é alterada de tempos em minutos para pontos de linha de vida. No entanto, a conversão não é linear. A fase de recuperação, destacada em cinza, ocupa uma porcentagem maior do tempo experimental, uma vez realizada a conversão para pontos da linha de vida (Figura 4B,C). A vantagem da escala de linha de vida é que ela permite informações detalhadas de fase e comparações de fases entre experimentos. As informações de fase estão contidas nos pontos da linha de vida, conforme descrito acima e exibido na Tabela 1. Além disso, G1 está contido nos primeiros 15,5 pontos da linha de vida de cada ciclo celular, S nos próximos 20 pontos da linha de vida e G2/M nos próximos 64,5 pontos da linha de vida (Tabela 1). No entanto, isso restringe artificialmente o tempo de recuperação ao mesmo período de tempo de cada ciclo celular consecutivo, mesmo que a fase de recuperação pareça muito curta na escala de ponto de tempo original. Isso não obscurece as comparações, pois as fases de cada experimento estão alinhadas. Na maioria dos casos, é mais relevante comparar os dados em pontos que ocorrem na mesma fase experimental e biológica do que em pontos de tempo que ocorrem ao mesmo tempo em minutos.

Uma vez que todos os experimentos tenham sido convertidos para a escala de linha de vida alinhada usando as funções Python fornecidas no arquivo de utilitários Python, eles podem ser comparados. Aqui, demonstramos duas comparações comuns entre experimentos: uma entre réplicas de um experimento semelhante entre plataformas e métodos de sincronização (Figura 5) e outra entre diferentes condições experimentais com um comprimento de período variável (Figura 6 e Figura 7). Como descrito acima, a primeira comparação é entre duas réplicas de microarray elutadas e um experimento RNA-seq sincronizado com fator alfa. Antes do alinhamento, as duas réplicas de microarray mostraram sincronia e dinâmica de ciclo celular semelhantes, mas a réplica de Microarray 2 da Condição 1 pareceu ligeiramente atrasada (Figura 5A). A diferença mais marcante foi encontrada ao comparar os conjuntos de dados não alinhados; o segundo ciclo RNA-seq da Condição 1 apareceu alinhado com o primeiro ciclo dos dois experimentos de microarrays. A diferença provavelmente não estava relacionada às diferentes plataformas transcriptômicas, mas sim aos diferentes métodos de sincronização. As populações celulares nos experimentos de microarranjos foram sincronizadas por elutriação centrífuga, enquanto a população para o experimento RNA-seq foi sincronizada por um tratamento com feromônio de acasalamento. De fato, a sincronização com feromônio de acasalamento reduziu substancialmente o tempo de recuperação em comparação com a elutriação (Figura 5A e Tabela 2).

Apesar das diferenças óbvias entre as réplicas quando plotadas em termos do tempo decorrido, após o alinhamento da linha de vida, as curvas foram quase idênticas, e comparações mais detalhadas e relevantes entre as réplicas foram possíveis (Figura 5B). A fase de recuperação foi alinhada de modo que cada experimento começasse no mesmo ponto da linha de vida, e as variações no período foram normalizadas pelo alinhamento da linha de vida. Devido ao alinhamento, os valores experimentais no mesmo ponto da linha de vida entre as réplicas ocorreram na mesma fase do ciclo celular, permitindo assim o cálculo da variância experimental entre as réplicas. As fases de recuperação e ciclo celular são rotuladas na Figura 5B para fornecer informações adicionais sobre as fases do ciclo celular em cada um dos experimentos. Esse alinhamento da linha de vida poderia então ser aplicado ao conjunto de dados experimental (Figura 5C,D) usando a função Python df_conversion_from_parameters fornecida no arquivo de utilitários, conforme descrito acima.

Na Figura 5D, os dados transcriptômicos foram alinhados, e a dinâmica de expressão para o gene CDC20 foi plotada usando a função plot_linegraph_comparison Python em um caderno Python. Antes do alinhamento, parecia que o primeiro pico de expressão dos experimentos de microarray estava alinhado com o segundo pico do experimento RNA-seq (Figura 5C); no entanto, após o alinhamento, os primeiros picos do ciclo celular de cada conjunto de dados alinharam-se corretamente (Figura 5D). Além disso, a largura do pico dos experimentos pareceu diferir entre o conjunto de dados RNA-seq e os conjuntos de dados de microarrays, mas após o alinhamento, a largura do pico foi mais alinhada (Figura 5C,D).

A segunda comparação é entre experimentos em diferentes condições ambientais com diferentes períodos de ciclo celular (Figura 6). Como descrito acima, comparamos os conjuntos de dados de S. cerevisiae na Condição 1 com a Condição 2 e a Condição 3, que correspondem a períodos de ciclo celular de 71, 82 e 110 min, respectivamente. Essas diferenças no período do ciclo celular introduziram incerteza ao comparar entre experimentos anteriores ao alinhamento da fase do ciclo celular, como mostrado nas curvas de brotamento não alinhadas. As diferenças de período são visíveis nas curvas de brotamento não alinhadas (Figura 6A). No entanto, quando foram alinhados com o CLOCCS usando esse protocolo, as três curvas pareceram notavelmente semelhantes, possibilitando comparações de dados experimentais (Figura 6B).

Usando os parâmetros CLOCCS de citometria de fluxo, a Condição 1 e a Condição 2 foram alinhadas a uma escala de linha de vida comum, e histogramas de conteúdo de DNA foram plotados na Condição 2 e em pontos equivalentes da linha de vida na Condição 1. As medidas por citometria de fluxo do conteúdo de DNA ao longo dos pontos da linha de vida foram comparadas (Figura 6C). Como as medidas de conteúdo de DNA não foram contínuas e não foram facilmente interpoladas, só pudemos comparar os pontos mais próximos da linha de vida. Os dados de fase do ciclo celular para cada ponto comparável da linha de vida não foram idênticos entre as duas condições (Figura 6C), o que indica que os ajustes do CLOCCS e os parâmetros resultantes provavelmente estavam ligeiramente desalinhados para a Condição 1. Isso provavelmente se deveu ao pior ajuste da CLOCCS aos dados de citometria de fluxo para a Condição 1 em comparação com a Condição 2 (Figura 2 Suplementar). No entanto, o alinhamento só se desviou em uma amostra e, portanto, ainda permite melhores comparações fase-específicas.

O alinhamento da linha de vida do brotamento foi então aplicado aos dados experimentais para os experimentos de RNA-seq na Condição 1, Condição 2 e Condição 3 (Figura 7) usando os parâmetros CLOCCS de brotamento na função df_conversion_from_parameters nos dados experimentais. Os dados transcriptômicos foram alinhados, e a expressão gênica do gene CDC20 para cada série temporal foi mostrada para os três experimentos. Antes do alinhamento, a dinâmica do transcrito do CDC20 não se sobrepunha (Figura 7A). Após o alinhamento, o primeiro e o segundo picos de expressão do gene CDC20 foram muito mais alinhados para todos os três conjuntos de dados. Após o alinhamento, ficou claro que os picos ocorreram na mesma fase do ciclo celular, mas as formas das curvas eram diferentes (Figura 7B). A condição 3 apresentou um primeiro pico menor e mais amplo em relação às outras duas condições, mesmo depois de contabilizadas as diferenças no período do ciclo celular, sugerindo que essas diferenças provavelmente estavam relacionadas às condições experimentais testadas (Figura 7B).

Comparações transcriptômicas em larga escala também poderiam ser feitas. Para essas comparações, 278 genes foram selecionados executando o algoritmo de periodicidade JTK_CYCLE23 em cada conjunto de dados e tomando a intersecção dos genes periódicos superiores. No entanto, os genes podem ser selecionados usando qualquer método desejado ou da literatura. Esses genes foram plotados na mesma ordem para as três condições, tanto para os heatmaps não alinhados (Figura 7C) quanto para os alinhados (Figura 7D) usando a função plot_heatmap_comparison Python em um caderno Python. Esses mapas de calor permitem que centenas de comparações em nível de genes sejam feitas simultaneamente. Comparações entre experimentos não alinhados poderiam ser feitas em relação à mudança na dinâmica da curva, o tempo de pico em relação aos genes vizinhos, a duração do período, etc. (Figura 7C). No entanto, comparações detalhadas específicas de fase não puderam ser feitas porque os pontos de tempo não necessariamente se correlacionam com a mesma fase do ciclo celular entre as condições. Embora os segundos ciclos tenham aparecido semelhantes após o alinhamento, os primeiros ciclos foram ligeiramente deslocados entre as condições (Figura 7D). Essa mudança pode refletir o fato de que a informação da fase do ciclo celular brotante foi de menor qualidade para a Condição 3. No entanto, o alinhamento dos experimentos para as três condições permitiu uma melhor comparação fase-específica. Antes do alinhamento, não estava claro se o primeiro pico de expressão em cada condição ocorreria na mesma fase do ciclo celular (Figura 7C); no entanto, após o alinhamento, os experimentos puderam ser comparados de forma fase-específica (Figura 7D). Antes do alinhamento, os picos na Condição 3 pareciam muito mais amplos do que nas outras duas condições (Figura 7C); no entanto, após o alinhamento, ficou claro que os picos da Condição 3 eram de largura semelhante às demais condições quando alinhados (Figura 7D).

Estes resultados representativos demonstram o processo para o uso de CLOCCS para alinhar experimentos a uma escala de tempo comum. Antes do alinhamento, comparações diretas de pontos de tempo geralmente não se correlacionam a uma fase semelhante do ciclo celular. A conversão do tempo experimental decorrido em minutos para pontos da linha de vida que representam a fase do ciclo celular permite comparações fase-específicas e biologicamente relevantes entre experimentos no mesmo ponto do ciclo celular.

Figure 1
Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho de alinhamento da linha de vida do CLOCCS. O fluxo de trabalho experimental para o alinhamento de dois conjuntos de dados de exemplo usando CLOCCS, seguido por comparações representativas entre os conjuntos de dados. As principais etapas do protocolo são ilustradas: a coleta de dados experimentais e de fase do ciclo celular não alinhados para cada um dos conjuntos de dados (etapa 1), o uso de CLOCCS para a parametrização de cada conjunto de dados (etapa 2 e etapa 3), o alinhamento dos conjuntos de dados a uma linha de vida comum (etapa 4) e, finalmente, a comparação da fase do ciclo celular e da dinâmica experimental (etapa 5 e etapa 6). Os dados de fase do ciclo celular não alinhados são inseridos no CLOCCS para fornecer parâmetros aprendidos, que são usados para alinhamento a uma escala de linha de vida comum. Esses conjuntos de dados alinhados são então comparados. Abreviação: CLOCCS = Caracterizando a Perda de Sincronia do Ciclo Celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Formato da fase do ciclo celular e dados experimentais necessários para o fluxo de trabalho. Os dados necessários para o fluxo de trabalho consistem em dois componentes principais: dados de fase de ciclo celular e dados experimentais de ciclo celular. Os dados de fase do ciclo celular podem consistir em dados de brotamento do ciclo celular ou dados de conteúdo de DNA de citometria de fluxo para cada ponto de tempo na série temporal. Os dados experimentais podem assumir muitas formas, mas, neste caso, são dados transcriptômicos, que consistem em dados de expressão gênica para cada gene para cada ponto de tempo na série temporal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Exemplo de resultados da execução do CLOCCS em um conjunto de dados do ciclo celular de S. cerevisiae. (A) Uma captura de tela da interface gráfica do usuário do CLOCCS com os valores de entrada e as configurações fornecidas para os dados de brotamento da Condição 2. As vezes, o número de células não brotadas e o número de células brotadas são inseridas, bem como o tipo de modelo, iterações e condições, etc. (B) Uma captura de tela do CLOCCS resultante ajustado para a Condição 2 na guia "Ajuste previsto" dos resultados. Cada ponto de dados tem uma barra de erro amostral associada correspondente aos intervalos de confiança de proporção binomial de 95% dos dados (para cada ponto de tempo, pelo menos 200 células foram contadas [entre 204 e 295 células]). A curva de ajuste brotamento resultante mostra a banda de confiança para o intervalo de confiança de 95% do ajuste de CLOCCS em roxo. (C) Uma captura de tela da tabela "Parâmetros Posteriores" resultante para a corrida CLOCCS da Condição 2 que consiste nos parâmetros CLOCCS na média, no intervalo de confiança de 2,5% e no intervalo de confiança de 97,5%. As taxas posterior e de aceitação também são mostradas. (D) Uma captura de tela da citometria de fluxo CLOCCS se encaixa para a Condição 2 em 70 min e 150 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Exemplo do processo de conversão de pontos de tempo em pontos de linha de vida alinhados para o conjunto de dados da Condição 2. (A) As fórmulas de conversão usadas para converter de pontos de tempo em pontos de linha de vida. Uma captura de tela das funções Python no notebook Python para conversão e plotagem das curvas de brotamento. (B) A curva de brotamento não alinhada da Condição 2 mostrando a porcentagem de brotamento para cada ponto de tempo em minutos. As fases do ciclo celular e da recuperação são destacadas da seguinte forma: recuperação (cinza), primeiro ciclo celular (azul), segundo ciclo celular (magenta) e terceiro ciclo celular (salmão). (C) A curva de brotamento alinhada da Condição 2 mostrando as mesmas porcentagens de brotamento, mas plotada na escala alinhada à linha de vida. As fases do ciclo celular e da recuperação são destacadas como no painel C. (D) Os gráficos de citometria de fluxo alinhados para pontos de tempo selecionados da Condição 2 correspondentes a fases distintas do ciclo celular com base na escala da linha de vida: o início de G1, o início da fase S, o início de G2/M e o final de G2/M. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Resultados representativos para a comparação dos experimentos de réplica da Condição 1 alinhados e não alinhados. Comparação das réplicas da Condição 1: Condição 1 RNA-seq (azul), Condição 1 microarray 1 (roxo) e Condição 1 microarray 2 (cinza). (A) A curva de brotamento não alinhada para os conjuntos de dados da Condição 1. (B) A curva de brotamento alinhada para os conjuntos de dados da Condição 1. Os pontos da linha de vida foram convertidos para a fase do ciclo celular e são codificados por cores abaixo do eixo x. (C) A expressão gênica não alinhada de um gene representativo, CDC20, para os conjuntos de dados da Condição 1. (D) A expressão gênica alinhada de um gene representativo, CDC20, para os conjuntos de dados da Condição 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Resultados representativos para a comparação de dados de fase do ciclo celular alinhados e não alinhados em experimentos com períodos variados. Comparação dos dados de fase do ciclo celular para conjuntos de dados com três condições ambientais diferentes e, portanto, três períodos de ciclo celular diferentes: Condição 1 RNA-seq (período de ciclo celular: 71 min), Condição 2 RNA-seq (período de ciclo celular: 82 min) e Condição 3 RNA-seq (período de ciclo celular: 110 min). (A) A curva de brotamento não alinhada para os conjuntos de dados. (B) A curva de brotamento alinhada para os conjuntos de dados. (C) Os histogramas de conteúdo de DNA por citometria de fluxo para a Condição 2 (linha superior) em comparação com os pontos equivalentes da linha de vida na Condição 1 (linha inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Resultados representativos para a comparação dos dados transcriptômicos alinhados e não alinhados entre experimentos com períodos variados. Comparação dos dados transcriptômicos associados aos conjuntos de dados na Figura 6: Condição 1 RNA-seq, Condição 2 e Condição 3. (A) A expressão gênica não alinhada de um gene representativo, CDC20, para os conjuntos de dados RNA-seq da Condição 1, Condição 2 e Condição 3. (B) A expressão gênica alinhada de CDC20 para os conjuntos de dados. (C) O mapa de calor não alinhado dos genes periódicos do ciclo celular superior na mesma ordem para cada conjunto de dados. (D) Os mapas de calor alinhados à linha de vida dos mesmos genes periódicos do ciclo celular do painel C na mesma ordem. As linhas roxas tracejadas correspondem aos pontos 100 e 200 da linha de vida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Linha de vida aponta para conversão de fase do ciclo celular. A chave de conversão entre a escala de pontos da linha de vida e a fase correspondente no experimento. Os pontos de linha de vida 0-100 correspondem à recuperação da sincronia. Cada 100 pontos de linha de vida subsequentes correspondem a um novo ciclo celular, com os primeiros 15,5 pontos de linha de vida correspondendo a G1, os próximos 20 correspondendo à fase S e os pontos restantes da linha de vida correspondendo a G2/M. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Parâmetros de CLOCCS em brotamento. Os parâmetros CLOCCS resultantes "lambda" e "mu0" para cada experimento a partir dos resultados representativos. Além disso, o atraso específico da filha "Delta" e o período de ciclo celular calculado são mostrados para cada experimento. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Tabela de conversão mostrando a conversão entre pontos de tempo em minutos e seus respectivos pontos de linha de vida correspondentes para a Condição 2. Clique aqui para baixar esta tabela.

Figura suplementar S1: O brotamento de CLOCCS se encaixa na Condição 1 e na Condição 3. Captura de tela do brotamento CLOCCS resultante para (A) os dados de brotamento seq de RNA da Condição 1, (B) os dados de brotamento do microarray 1 da Condição 1, (C) os dados de brotamento do microarray 2 da Condição 1 e para (D) os dados de brotamento da Condição 3. O brotamento CLOCCS adequado para a Condição 2 pode ser visto na Figura 3B. A banda de confiança de 95% e as barras de erro amostral estão descritas na documentação da CLOCCS14,15 e na Figura 3. Para cada momento de cada série temporal, foram contadas aproximadamente 200 células. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S2: A citometria de fluxo CLOCCS se ajusta para a Condição 1 e Condição 2. Captura de tela da citometria de fluxo CLOCCS se ajusta para as amostras mostradas na Figura 6C para a Condição 2 (linha superior: A-D) e Condição 1 (linha inferior: E,F). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S3: Sensibilidade do alinhamento às variações nos parâmetros da CLOCCS. Comparação do alinhamento do conjunto de dados RNA-Seq da Condição 1 usando (A-C) variações nos parâmetros CLOCCS λ e μ0 dentro do intervalo de confiança do ajuste do CLOCCS e (D,E) com grandes variações nos parâmetros. Comparação entre a média com os valores de confiança de 2,5% e 97,5% na tabela de parâmetros pela CLOCCS para (A) o parâmetro μ0, (B) o parâmetro λ e (C) para ambos os parâmetros μ0 e λ. (D) Comparação entre o alinhamento usando o valor médio de μ0 comparado a grandes variações no parâmetro μ0 (200% a 0,25% de μ0). (E) Comparação entre o alinhamento usando o valor médio de λ em comparação com grandes variações no parâmetro λ (200% a 0,25% de λ). Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar S1: Descrição da coleta de dados para cada experimento. Para cada experimento, esta tabela fornece uma descrição dos dados de brotamento, dados de citometria de fluxo, dados transcriptômicos e método de sincronização. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar S2: Parâmetros de CLOCCS das execuções de CLOCCS por citometria de fluxo. Os parâmetros CLOCCS "mu0" e "lambda" para a citometria de fluxo Condição 1 e Condição 2 CLOCCS executa. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 1: Instruções para a conversão dos dados de citometria de fluxo em formato de entrada CLOCCS. Para o uso de CLOCCS com dados de citometria de fluxo, um formato de entrada específico é necessário. Este arquivo fornece instruções mais detalhadas sobre a etapa de protocolo 3.4.1 para explicar como usar as funções do utilitário Python para executar essa conversão. Clique aqui para baixar este arquivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este artigo apresenta um método para avaliar de forma mais precisa e quantitativa dados de experimentos de séries temporais em populações sincronizadas de células. O método utiliza parâmetros aprendidos do CLOCCS, um modelo bayesiano de inferência que utiliza dados de fase do ciclo celular de entrada, como dados de brotamento e dados de conteúdo de DNA de citometria de fluxo, para parametrizar cada experimento14,15. O CLOCCS usa os dados de fase do ciclo celular de entrada para inferir os parâmetros para cada experimento, que são então usados para alinhamento a uma escala de linha de vida comum. A conversão de vários experimentos de séries temporais de sincronização/liberação em uma única escala de tempo alinhada à linha de vida permite comparações relevantes e específicas de fase entre experimentos e a agregação de vários experimentos de replicação, que antes eram difíceis ou impossíveis.

As etapas críticas desse protocolo incluem coletar os dados, executar CLOCCS, alinhar os conjuntos de dados e comparar entre os conjuntos de dados. Primeiro, os dados devem ser coletados para uso neste protocolo. Os dados devem consistir tanto em dados experimentais contendo informações sobre a questão de interesse (i.e., dados transcriptômicos, dados de expressão gênica, dados proteômicos) - quanto dados de fase do ciclo celular - contendo informações sobre a fase do ciclo celular (i.e., dados de brotamento, dados de conteúdo de DNA de citometria de fluxo). Em seguida, os dados da fase do ciclo celular podem ser usados no CLOCCS para reunir as informações de parâmetros para cada experimento. Os parâmetros μ0 (duração da fase de recuperação) e λ (período do ciclo da célula-mãe) são usados para converter os pontos de tempo em pontos de linha de vida. O alinhamento do ponto da linha de vida permite que as séries temporais alinhadas sejam diretamente comparadas.

Uma limitação do método é que o alinhamento adequado depende da identificação de um bom ajuste aos dados. A obtenção do melhor ajuste do CLOCCS depende da qualidade dos dados de fase do ciclo celular e do uso das configurações de entrada corretas para o experimento no CLOCCS. O ajuste aos dados de fase do ciclo celular determina a precisão dos parâmetros aprendidos e, portanto, impacta muito na precisão do alinhamento, pois depende do uso desses parâmetros. Como mudanças amplas nos parâmetros afetariam muito o alinhamento, as mudanças permanecem mínimas dentro do intervalo de confiança fornecido na saída do CLOCCS (Figura Suplementar S3). É importante notar que essa sensibilidade a variações nos parâmetros também é o que permite o alinhamento entre conjuntos de dados com diferentes tempos de ciclo celular.

A precisão do ajuste do CLOCCS pode ser determinada usando a curva de ajuste do CLOCCS resultante e as barras de erro e a banda de erro correspondentes (Figura 3B,D, Figura Suplementar S1 e Figura Suplementar S2). A aba de ajuste do CLOCCS mostra os pontos de dados originais, bem como a curva de ajuste do CLOCCS com a banda de confiança correspondente ao intervalo de confiança do ajuste do CLOCCS e as barras de erro correspondentes ao intervalo de confiança da proporção binomial de 95% dos dados, uma vez que as contagens são assumidas como variáveis aleatórias binomiais independentes14. Por exemplo, as barras de confiança nos dados de brotamento medem a confiança na proporção de células brotadas para uma determinada amostra.

Um método para determinar a qualidade do ajuste do CLOCCS envolve determinar se as barras de erro dos dados se sobrepõem à banda de intervalo de confiança do ajuste do CLOCCS. Outro indício é a amplitude da faixa de confiança de 95% do ajuste CLOCCS. Em geral, a largura da banda diminui com o aumento da qualidade de ajuste. Uma indicação de mau alinhamento é se a fase do ciclo celular dos dados originais não coincidir com a fase do ciclo celular inferida a partir do alinhamento. Cada alinhamento pode ser verificado duas vezes confirmando que, para cada ponto de tempo, a fase indicada pelos dados de informação da fase do ciclo celular corresponde à fase do ciclo celular atribuída pelo alinhamento.

Um ajuste de CLOCCS ruim ou um alinhamento ruim pode ser o resultado de dados de fase de ciclo celular de baixa qualidade. Os dados de brotamento de alta qualidade terão uma porcentagem de brotamento muito baixa imediatamente após a prisão e uma porcentagem de brotamento muito alta no primeiro pico. Os picos e vales subsequentes perderão sincronia, mas devem ser distintos e uniformemente espaçados. Como os pontos da linha de vida representam a fase média do ciclo celular da população, a sincronização deficiente também pode impedir o alinhamento adequado. Dados de conteúdo de DNA por citometria de fluxo de alta qualidade terão picos distintos de 1C e 2C para cada ponto de tempo correspondente à fase apropriada do ciclo celular. Além disso, dados insuficientes de fase do ciclo celular introduzem problemas de identificação de parâmetros. No caso de dados suficientes, os parâmetros podem ser inferidos e não mudam substancialmente entre as execuções do CLOCCS. No entanto, os parâmetros descritos neste protocolo (lambda, delta, mu0) não podem ser desembaraçados quando os dados da fase do ciclo celular contêm apenas um ciclo celular completo. Para permitir uma melhor estimativa dos parâmetros, dados suficientes e bem construídos do ciclo celular devem ser usados para os ajustes de CLOCCS14,15. Além disso, o modelo CLOCCS utiliza informações prévias, como descrito em Orlando et al.15, mas essas informações podem ser ajustadas para melhor se adequarem às condições experimentais utilizadas.

Se a qualidade dos dados da fase do ciclo celular for boa, o reajuste das configurações do CLOCCS pode ajudar a produzir um ajuste mais preciso. Por exemplo, o número de iterações selecionadas pode ser aumentado para melhorar a precisão. A confirmação de que o método correto de sincronização foi selecionado no CLOCCS também pode ser útil, uma vez que a parada do fator alfa está associada a um menor tempo de recuperação em comparação com a elutriação.

Esse método também é limitado em termos dos tipos de dados de fase do ciclo celular atualmente suportados. No entanto, o CLOCCS é flexível e pode ser adaptado para suportar outros tipos de dados. Por exemplo, o CLOCCS foi previamente adaptado para suportar a marcação fluorescente do ciclo celular de corpos de polos fusiformes, anéis de miosina e núcleos11 para uso como identificadores de fase do ciclo celular. Além disso, o uso de CLOCCS com outras espécies além de S. cerevisiae tem sido possível. A CLOCCS aceita índices de septação como marcador da fase do ciclo celular em S. pombe14, bem como dados de conteúdo de DNA por citometria de fluxo, que são facilmente colecionáveis para muitas espécies15. Isso permite a comparação de dados experimentais na mesma fase do ciclo celular para duas espécies completamente diferentes e pode fornecer informações sobre mudanças no ciclo celular ao longo da evolução.

Embora apenas formas suportadas de dados de fase de ciclo celular possam ser usadas com este método de alinhamento da linha de vida, este método é agnóstico ao tipo de dados experimentais de série temporal usados. Neste protocolo, demonstramos seu uso no alinhamento da expressão gênica de um gene individual, bem como dados transcriptômicos de séries temporais para centenas de genes em conjunto. Nós mostramos que este método pode ser usado para comparar entre plataformas e, assim, fazer comparações entre conjuntos de dados RNA-seq e conjuntos de dados de microarray tomados em condições semelhantes. Também mostramos que esse método pode ser usado para alinhar conjuntos de dados com diferentes métodos de sincronização, comparando entre um conjunto de dados que foi elitriado (Condition 1 Microarray) com um conjunto de dados que foi preso pelo fator alfa (Condition 1 RNA-seq). Anteriormente, o CLOCCS também foi usado para alinhar dados proteômicos transcriptômicos e de séries temporais usando dados de fase do ciclo celular22, o que permitiu comparações diretas entre a dinâmica do RNAm e a dinâmica da proteína correspondente. CLOCCS também tem sido usado para alinhar dados de séries temporais entre espécies, como para alinhamento entre S. cerevisiae e S. pombe14 e entre o primeiro ciclo de S. cerevisiae e a levedura patogênica Cryptococcus neoformans21. Finalmente, o alinhamento CLOCCS é atualmente específico para dados de séries temporais de ciclo celular e ainda não foi adaptado para uso com outros tipos de processos rítmicos. Uma área em que isso seria de particular interesse é para os ritmos circadianos, onde o tempo circadiano (CT) é convencionalmente usado para alinhar experimentos, embora sua implementação não seja consistentemente aplicada. Outra área de interesse é a investigação de ritmos de desenvolvimento, como os do parasita da malária. Por exemplo, o alinhamento de cepas de Plasmodium falciparum com diferentes períodos, como descrito em Smith et al.25, permitiria comparações mais detalhadas entre as cepas. O alinhamento desses processos periódicos para comparação permitiria um melhor entendimento dessas importantes funções biológicas rítmicas. Esses tipos de comparações do ciclo celular foram possíveis com o uso de CLOCCS para alinhamento da linha de vida, conforme descrito neste protocolo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgments

S. Campione e S. Haase foram apoiados por financiamento da National Science Foundation (DMS-1839288) e dos Institutos Nacionais de Saúde (5R01GM126555). Além disso, os autores gostariam de agradecer a Huarui Zhou (Duke University) pelos comentários sobre o manuscrito e pelo teste beta do protocolo. Agradecemos também a Francis Motta (Florida Atlantic University) e Joshua Robinson pela ajuda com o código Java.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2x PBS For Fixative Solution. Described in Leman 2014.
4% formaldehyde For Fixative Solution.
100% Ethanol For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002.
CLOCCS https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow Cytometer For flow cytometry protocol.
Git https://git-scm.com/
Java 19 https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
Microscope For counting cells and buds.
Miniconda https://docs.conda.io/en/latest/
Protease solution For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
RNAse A solution For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid Stain Invitrogen S7020 For flow cytometry staining. Described in Haase 2002.
Tris pH 7.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
  2. Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
  3. Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
  4. Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
  5. Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
  6. Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
  7. Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
  8. Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
  9. Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
  10. Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
  11. Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
  12. Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
  13. Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
  14. Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
  15. Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
  16. Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
  17. Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
  18. Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
  19. Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
  20. Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
  21. Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453 (2016).
  22. Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
  23. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  24. Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
  25. Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).

Tags

Este mês em JoVE Edição 196 Alinhamento séries temporais ômica sincronização ciclo celular citometria de fluxo modelos software
Alinhamento de dados sincronizados de séries temporais usando o modelo de caracterização de perda de sincronia do ciclo celular para comparações entre experimentos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Campione, S. A., Kelliher, C. M.,… More

Campione, S. A., Kelliher, C. M., Orlando, D. A., Tran, T. Q., Haase, S. B. Alignment of Synchronized Time-Series Data Using the Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony Model for Cross-Experiment Comparisons. J. Vis. Exp. (196), e65466, doi:10.3791/65466 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter