Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Çapraz deney karşılaştırmaları için hücre döngüsü senkron modelinin karakterizleştirici kaybı kullanılarak senkronize zaman serisi verilerinin hizalanması

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65466
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1
1Department of Biology, Duke University, 2Department of Biology, University of Massachusetts, 3Orlando Data Science LLC, 4Department of Computer Science, Duke University

Summary

Senkronize zaman serisi deneylerini analiz etmenin bir zorluğu, deneylerin genellikle senkronizasyondan ve hücre döngüsü periyodundan kurtarma uzunluğunda farklılık göstermesidir. Bu nedenle, farklı deneylerden elde edilen ölçümler toplu olarak analiz edilemez veya kolayca karşılaştırılamaz. Burada, faza özgü karşılaştırmalara izin vermek için deneyleri hizalamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

Hücre döngüsünün araştırılması, genellikle, hücreler hücre döngüsünü geçerken bir zaman serisindeki çeşitli parametreleri ölçmek için hücre popülasyonlarının senkronize edilmesine bağlıdır. Bununla birlikte, benzer koşullar altında bile, tekrarlanan deneyler, senkronizasyondan kurtulmak ve hücre döngüsünü geçmek için gereken sürede farklılıklar gösterir, böylece her zaman noktasında doğrudan karşılaştırmaları önler. Deneyler arasında dinamik ölçümleri karşılaştırma sorunu, mutant popülasyonlarda veya senkron iyileşme süresini ve / veya hücre döngüsü periyodunu etkileyen alternatif büyüme koşullarında daha da kötüleşmektedir.

Daha önce, senkronize hücre popülasyonlarının senkronizasyondan nasıl salındığını ve hücre döngüsü boyunca nasıl ilerlediğini izleyen Hücre Döngüsü Senkron Kaybını Karakterize Etme (CLOCCS) adlı parametrik bir matematiksel model yayınladık. Modelden öğrenilen parametreler daha sonra deneysel zaman noktalarını senkronize zaman serisi deneylerinden normalleştirilmiş bir zaman ölçeğine (yaşam çizgisi noktaları) dönüştürmek için kullanılabilir. Yaşam çizgisi ölçeği, deneyin başlangıcından itibaren dakika cinsinden geçen süreyi temsil etmek yerine, senkronizasyondan hücre döngüsü girişine ve ardından hücre döngüsünün aşamalarına ilerlemeyi temsil eder. Yaşam çizgisi noktaları, senkronize edilmiş popülasyondaki ortalama hücrenin fazına karşılık geldiğinden, bu normalleştirilmiş zaman ölçeği, değişen periyotlara ve iyileşme sürelerine sahip olanlar da dahil olmak üzere deneyler arasında doğrudan karşılaştırmalara izin verir. Ayrıca, model, farklı türler (örneğin, Saccharomyces cerevisiae ve Schizosaccharomyces pombe) arasındaki hücre döngüsü deneylerini hizalamak için kullanılmıştır, böylece evrimsel benzerlikleri ve farklılıkları ortaya çıkarabilecek hücre döngüsü ölçümlerinin doğrudan karşılaştırılmasını sağlamıştır.

Introduction

Hücre döngüsü boyunca ilerlerken senkronize hücre popülasyonları üzerinde yapılan zaman serisi ölçümleri, hücre döngüsü ilerlemesini kontrol eden mekanizmaları araştırmak için standart bir yöntemdir 1,2,3,4,5,6,7,8 . Senkron / serbest bırakma zaman serisi deneyleri arasında karşılaştırmalar yapabilme yeteneği, bu dinamik süreçleri anlamamız için hayati öneme sahiptir. Bulguları doğrulamak için yinelenen deneylerin kullanılması, sonuçların tekrarlanabilirliğine olan güveni artırabilir. Ayrıca, çevresel koşullar, mutantlar ve hatta türler arasındaki karşılaştırmalar, hücre döngüsü düzenlemesine ilişkin birçok yeni anlayışı ortaya çıkarabilir. Bununla birlikte, senkronizasyondan ve hücre döngüsü ilerlemesinin hızından kurtulmadaki deneyler arası değişkenlik, replikalar arasında veya değiştirilmiş hücre döngüsü zamanlamasına sahip deneyler arasında zaman noktasından zaman noktasına karşılaştırmalar yapma yeteneğini bozar. Bu zorluklar nedeniyle, replikalar genellikle tam zamanlı serilere dahil edilmez (örneğin, Spellman ve ark.4). Tüm zaman serileri için çoğaltmalar toplandığında, veriler toplu olarak analiz edilemez, bunun yerine analiz için tek bir çoğaltma kullanılır ve diğer çoğaltmalar genellikle ek rakamlara indirgenir (örneğin, Orlando ve ark.8). Ayrıca, farklı iyileşme veya hücre döngüsü ilerleme özelliklerine sahip deneyler arasında karşılaştırmalar yapmak zordur. İlgilenilen bir olay ile bir hücre döngüsü dönüm noktası (örneğin, tomurcuk ortaya çıkışı, S-fazı girişi veya anafaz başlangıcı) arasındaki daha küçük aralıkların ölçümleri, bu dönüm noktası olayları 1,2,3,9,10,11,12 izlenirse hataları azaltmaya yardımcı olabilir. Bununla birlikte, ince ama önemli farklılıklar bu geçici yöntemler kullanılarak tespit edilemeyebilir veya gizlenebilir. Son olarak, tek hücreli analizler, senkronizasyona veya hizalamaya13 güvenmeden hücre döngüsü ilerlemesini analiz etmeye izin verir, ancak tek hücreli çalışmalarda büyük ölçekli ölçümler zor ve maliyetli olabilir.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, senkronize popülasyonlarda yapılan zaman serisi ölçümlerinin analizine yardımcı olmak için Hücre Döngüsü Senkron Kaybının Karakterize Edilmesi (CLOCCS) modelini geliştirdik14,15. CLOCCS, senkronize hücrelerin hücre döngüsü aşamaları boyunca dağılımını, senkronizasyondan serbest bırakıldıkça ve hücre döngüsü boyunca ilerledikçe tanımlayan esnek bir matematiksel modeldir. Dallanma süreci çerçevesi, modelin, S. cerevisiae'de gözlemlendiği gibi, bölünmeden sonra anne ve kız hücrelerinin asimetrik niteliklerini hesaba katmasını sağlarken, S. pombe gibi fisyonla bölünen organizmalar için hala yararlıdır. Model, hücre döngüsü fazını belirtmek için çeşitli ölçüm türleri kümesinden girdiler alabilir. Zaman içinde tomurcuklanan hücrelerin yüzdesinin ölçümlerini içeren tomurcuklanan hücre döngüsü faz verilerini alabilir ve tomurcuklanmamış G1 fazı14,15'in dışındaki hücre sayısının tahmin edilmesine izin verir. Model ayrıca DNA içeriğini ölçen akış sitometrik verilerini de alabilir, böylece G1'den S'ye, S'den G2'ye ve M'den G115'e dönüm noktası geçişlerinin değerlendirilmesini sağlar. Floresan morfolojik belirteçler, hücre döngüsü fazını tanımlamak için de kullanılabilir. Miyozin halkalarının, çekirdeklerin ve iğ kutup gövdelerinin (SPB'ler) floresan etiketlemesi, hücre döngüsü fazını belirlemek için kullanılabilir ve bunlar CLOCCS model11'e dahil edilmiştir; ancak, bu ölçümler bu protokolde açıklanmayacaktır. Ek olarak, septasyon indeksi S. pombe14'ten gelen verileri modellemek için bir girdi olarak kullanılmıştır. Böylece, model çeşitli organizmalarda hücre döngüsü analizleri için kullanılabilir ve daha da genişletilebilir.

CLOCCS, giriş verilerinden çoklu parametrelerin (örneğin, tomurcuklanma yüzdesi, DNA içeriği) tam Bayes çıkarımına izin veren parametrik bir modeldir. Bu parametreler, senkronizasyondan kurtarma süresini, hücre döngüsü periyodunun uzunluğunu (anne ve yavru hücreler için ayrı ayrı tahmin edilir) ve hücrelerin her zaman noktasındaki ortalama hücre döngüsü konumunu içerir. Bu parametreler, popülasyondaki ortalama hücrenin davranışını temsil eder ve araştırmacının her zaman noktasını bir yaşam çizgisi noktası olarak ifade edilen bir hücre döngüsü konumuna haritalamasını sağlar. Yaşam çizgisi noktalarına dönüşüm, CLOCCS parametreleri lambda (λ) ve mu0 (μ0)14,15'e bağlıdır. λ parametresi, ana hücrelerin ortalama hücre döngüsü süresine karşılık gelir. Bununla birlikte, anne-kız gecikmesi14,15 nedeniyle, bu hem anne hem de kız hücrelerini içeren tüm popülasyonun ortalama hücre döngüsü periyodu değildir. CLOCCS ayrıca anne-kız gecikmesine karşılık gelen delta (δ) parametresini çıkarır ve böylece tüm popülasyonun ortalama hücre döngüsü periyodunun hesaplanmasına izin verir. Son olarak, her deneme hücre döngüsü eşitlemesinden serbest bırakıldıktan sonra başladığından, eşitleme yönteminden kurtarmak için gereken süre0 μ CLOCCS parametresiyle temsil edilir. CLOCCS, giriş hücresi döngüsü faz verilerine bir model sığdırır ve daha sonra rastgele bir yürüyüş Markov zinciri Monte Carlo algoritması14,15 kullanarak bu parametreleri çıkarır. Birden fazla deneyi ortak bir hücre döngüsü yaşam çizgisi zaman ölçeğine eşleyerek, iyileşme süresinin veya hücre döngüsü dönemlerinin aynı olmadığı çoğaltmalar veya deneyler arasında doğrudan faza özgü karşılaştırmalar yapılabilir 8,14,15.

Senkronize popülasyonlar14,15,16,17 zaman serisi boyunca bir oranda senkronizasyonu kaybettiğinden, senkronizasyon kaybı oranındaki değişkenlik deneyler arasında nicel karşılaştırmaları da engelleyebilir. Popülasyonların yerini ve dağılımlarındaki varyansı tanımlayarak, CLOCCS senkronize kayıp oranlarındaki farklılıkları açıklar. Bu güçlü araç, deneyler arasında spesifik ve ayrıntılı karşılaştırmalara izin verir, böylece sadece replikalar arasında değil, aynı zamanda çevresel koşullar, mutantlar ve hatta önemli ölçüde farklı hücre döngüsü zamanlamasına sahip türler arasında da doğrudan ilgili karşılaştırmalar yapma yeteneği sağlar14,15.

Bu makalede, senkronizasyon/sürüm zaman serisi deneylerinden gelen verileri sığdırarak parametreleri tahmin etmek, verileri ortak bir yaşam çizgisi ölçeğine eşlemek ve ardından çoğaltmalar veya deneyler arasında ilgili karşılaştırmalar yapmak için CLOCCS'yi kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Yaşam çizgisi hizalaması, bu deneyler arasında doğrudan faza özgü karşılaştırmalara izin verir, bu da kopyaların toplanmasına ve karşılaştırılmasına ve farklı kurtarma zamanlamaları ve hücre döngüsü dönemlerine sahip deneyler arasında daha alakalı karşılaştırmalar yapılmasına olanak tanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücre döngüsü aşaması ve deneysel verilerin toplanması

  1. İstenilen senkronizasyon yöntemini kullanarak hücreleri hücre döngüsüne göre senkronize edin (örneğin, Leman ve ark.18'de tarif edildiği gibi santrifüj elütriasyonu veya Rosebrock 19'da tarif edildiği gibi çiftleşme feromon arresti; hem Leman hem de ark.18 ve Rosebrock 19 da senkronizasyondan serbest bırakma yöntemlerini içerir). Zaman serisi boyunca örneklemeye başlayın, zaman serisinin en az iki tam hücre döngüsü periyodu uzunluğunda olduğundan emin olun ve en uygun şekilde, hücre döngüsü başına en az 10 örnek toplayın. Her zaman noktasında, aşağıda açıklandığı gibi, hücre döngüsü faz verileri (tomurcuklanma veya akış sitometrisi) için bir örnek ve deneysel veriler için bir örnek toplayın.
  2. Tomurcuklanan verileri hücre döngüsü faz verileri olarak kullanıyorsanız, CLOCCS hizalaması için tomurcuklanma hakkında veri toplayın.
    1. Zaman serisi boyunca örnek. Her zaman noktası için, hücreleri toplayın ve Leman ve ark.18'de açıklandığı gibi, 200 μL soniklenmiş hücre kültürünü 200 μL fiksatif çözelti ile karıştırarak sabitleyin.
    2. Standart tomurcuklanma için, 40x hedefi ve bir hemositometre ile iletilen bir ışık mikroskobu kullanarak zaman noktası başına en az 200 hücre sayın. Hücre örneğini adım 1.2.1'den hemositometreye ekleyin ve yoğunluk saymayı engelliyorsa seyreltin. Her zaman noktasında tomurcuklanmış ve tomurcuklanmamış hücrelerin sayısını kaydedin. Tomurcuklanan hücrelerin yüzdesini hesaplayın ve tomurcuklanan bir eğrideki her zaman noktası için çizim yapın.
      NOT: Hücre döngüsü faz bilgilerini belirtmek için başka yöntemler de mevcuttur, ancak bunlar bu protokolde açıklanmamıştır. Diğer yöntemler CLOCCS benioku ve önceki bir çalışmadaaçıklanmıştır 11.
  3. Hücre döngüsü faz verileri olarak akış-sitometrik DNA içeriği verilerini kullanıyorsanız, akış-sitometrik CLOCCS hizalaması için akış sitometrisi DNA boyama verilerini toplayın.
    1. Zaman serisi boyunca örnek. Her zaman noktası için hücreleri toplayın ve Haase ve Reed20'de açıklandığı gibi düzeltin.
    2. DNA'yı lekeleyin ve standart akış sitometrik analizini kullanarak analiz edin. S. cerevisiae için önerilen bir boyama protokolü Haase ve Reed20'de açıklanmıştır.
  4. İlişkili omikleri veya ilgili deneysel verileri toplayın. Standart transkriptomik veriler için, Leman ve ark.18 ve Kelliher ve ark.21,22'de açıklandığı gibi toplayın. Aşağı akış hizalamasına izin vermek için verilerin hücre döngüsü faz verilerini içeren zaman noktalarıyla ilişkilendirildiğinden emin olun. En iyi hizalama için, deneysel veriler içeren her zaman noktasının kendisiyle ilişkili faz verilerine de sahip olduğundan emin olun.
    NOT: Deneysel veriler birçok biçimde olabilir. Geleneksel olarak, zaman serisi transkriptomik deneylerini hizalamak için açıklanan hizalama yöntemini kullanırız. Bununla birlikte, zaman noktalarıyla ilişkili her türlü veri hizalanabilir (yani, proteomik22).

2. Gerekli yazılımı yükleme

NOT: Bu bölümde Conda, Java 19 ve Git'in zaten yüklü olduğu varsayılmaktadır (Malzeme Tablosu).

  1. Terminale aşağıdaki komutu girerek CLOCCS_alignment deposunu indirin:
    git klonu git klonu https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
  2. CLOCCS_alignment deposunun klonlandığı klasördeki terminale aşağıdaki komutu girerek conda_req.yml dosyasını kullanarak bir Conda ortamı oluşturun:
    conda env create -f conda_req.yml

3. Deneyleri parametrelendirmek için CLOCCS kullanma

  1. CLOCCS_alignment deposundaki CLOCCS klasöründeki cloccs_v2023.jar dosyasına çift tıklayın ve grafik kullanıcı arabiriminin açılmasını bekleyin. Bu ekran, CLOCCS çalıştırması için giriş seçeneklerine izin verir ve çalıştırıldıktan sonra sonuçları görüntüler.
  2. Genel ayarları girin.
    1. İlişkili metin giriş kutularına yazarak Sim Anneal, Burn In ve Iterations'ı ayarlayın. Sim Anneal (simüle tavlama) iyi başlangıç parametre değerlerini tanımlar, Burn In arka modları arar ve son aşama tüm posterior çıkarımların çizilmesine izin verir. Daha yüksek değerler çalışma süresini artırır, ancak doğruluğu da artırır.
    2. Sıcaklığı Celsius cinsinden belirterek deneysel koşulları ve Sıcaklık etiketli metin kutusunu ve Synchro açılır menüsünü kullanarak senkronizasyon yöntemini girin. Yöntem, sırasıyla.
    3. İsteğe bağlı olarak, Gelişmiş Ayarlar menüsünde gelişmiş ayarları yapılandırın. Gelişmiş ayarlar, parametrelerin her biri için öncüllerin ayarlanmasına izin verir ("mu0", "sigma0", "sigmav", "lambda", "bud.start", "bud.end").
      NOT: Gelişmiş ayarlarla ilgili daha fazla bilgi CLOCCS_alignment deposunun CLOCCS klasöründeki benioku.txt bölümünde bulunabilir.
  3. Tomurcuklanan verilerle kullanmak için ayarları girin.
    1. Model Türü açılır menüsünden uygun seçimi yapın. Varsayılan seçenek Bud, tomurcuklanan maya için standart tomurcuklanma bilgileri içindir.
      NOT: Açılır menüde daha gelişmiş başka seçenekler de mevcuttur: Bölünme olmadan birden fazla tomurcuklanma döngüsüne giren mutantlar için tomurcuklanma bilgileri için Mutant, tomurcuklanma bilgileri ve ek iğ kutup gövdesi ve miyozin halkası bilgileri için BudSSLSMR ve tomurcuklanma bilgileri ve ek bölme ve tomurcuk boynu çekirdekleri bilgileri için BudNucDivNeck. Bu gelişmiş seçenekler CLOCCS benioku ve önceki çalışma11,14,15'te açıklanmıştır.
    2. Metin giriş kutularına yazarak veya Dosya Seç düğmesini tıklatarak bir dosya yükleyerek Veri İçe Aktarma panelini kullanarak verileri içe aktarın. İlk sütun zaman noktalarını belirtir. Kalan iki sütun tomurcuklanan verileri belirtir ve aşağıdaki seçeneklerden herhangi birini alabilir: tomurcuklanmamış hücrelerin sayısı (Tomurcuk Yok), tomurcuklanan hücrelerin sayısı (Tomurcuk) veya toplam hücre sayısı (Toplam).
  4. Akış sitometrik verileriyle kullanılacak ayarları girin. Her deneme için adım 3.3 veya adım 3.4'ü çalıştırın.
    NOT: Akış sitometrik verileri ve tomurcuklanma verileri birlikte kullanılabilir. Daha önce bunları birlikte çalıştırmayı15 olarak tanımlamış olsak da, bu araç için bağımsız olarak çalıştırılmaları ve daha sonra karşılaştırılmaları gerekir.
    1. Ek Dosya 1'deki (CLOCCS_alignment deposunda CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt olarak da bulunur) yönergeleri izleyerek .fcs dosyalarını akış sitometrisi için doğru CLOCCS giriş biçimine dönüştürün.
    2. Model Türü açılır menüsünden Akış seçimini seçin.
    3. Veri İçe Aktarma panelini kullanarak verileri içe aktarın. Dosya Seç'e tıklayın ve adım 3.4.1'de oluşturulan dosyayı seçin.
    4. Bir akış sitometrik CLOCCS'nin uyduğu zaman noktalarını, Takma Zamanları kutusundaki zaman noktalarını seçerek çizilmelidir.
  5. Tomurcuklanma veya akış sitometrisi için tüm girişler seçildikten sonra, Uygula düğmesine tıklayın ve ardından ekranın üst kısmındaki Örnek düğmesine tıklayın.
  6. Tahmin Edilen Uyumlar sekmesini seçerek tomurcuklanan eğriyi veya akış sitometrisi grafiklerini tahmin edilen uyumlarla görüntüleyin. Bu sekme varsayılan olarak önceki adımdan hemen sonra açılır.
  7. Parametre Histogramları sekmesini ve ardından aşağıdaki seçeneklerden ilgilendiğiniz parametreye karşılık gelen alt sekmeyi seçerek her parametre için parametre histogramlarını görüntüleyin: mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end, vb.
  8. Posterior Skor sekmesini seçerek posterior skor grafiğini görüntüleyin.
  9. Ayarları görüntüleyin ve Ayarlar sekmesini seçerek bunları daha da değiştirin; Günlük sekmesini seçerek önceki çalıştırmaların günlüğünü görüntüleyin.
  10. Arka Parametreler sekmesini seçerek CLOCCS parametrelerini sığdırmadan alın. Ortaya çıkan tablo aşağıdaki biçime sahip olacaktır: her satır bir parametreden oluşur ve son satır posteriordur. Sütunlar, ortalama için tahmin edilen parametreden, %2,5 daha düşük güven aralığından, %97,5 üst güven aralığından ve kabul oranından oluşur.
    1. Her deney için hizalama için kullanılan parametreleri kaydedin: senkronizasyondan kurtarma süresi (μ0) ve ana hücrelerin ortalama hücre döngüsü süresi (λ).
    2. Ana hücre periyodunun (λ) ve kızı hücre periyodunun (λ + δ) ortalamasını hesaplayarak hücre döngüsü periyodunu hesaplayın, burada δ kıza özgü gecikmedir.
      NOT: Bölüm 3'ü, karşılaştırmalara dahil edilecek tüm deneylerle birlikte tekrarlayın.

4. Python dönüştürme işlevlerini ve CLOCCS parametrelerini kullanarak zaman noktalarının yaşam çizgisi noktalarına dönüştürülmesi

NOT: Zaman noktaları ve yaşam çizgisi noktaları arasındaki dönüşüm için iki dönüştürme formülü21 gerekir. Dönüştürme ve veri görselleştirme için bir Python uygulaması CLOCCS_alignment deposunda mevcuttur ve aşağıda açıklanmıştır.

  1. Terminale aşağıdaki komutu girerek Conda ortamını etkinleştirin: conda activate CLOCCS_alignment
  2. Terminale aşağıdaki komutu yazarak etkileşimli bir Python not defteri açın: jupyter not defteri
  3. İstediğiniz klasörde yeni bir Python not defteri oluşturun.
    NOT: Standart kullanımı göstermek için örnek bir not defteri eklenmiştir ve CLOCCS_ hizalama deposundaki Alignment/JOVE_example.ipynb içinde bulunabilir.
  4. İlk hücrede aşağıdaki komutu çalıştırarak hizalama işlevlerini içeren Python dosyasını içe aktarın:
    %run path_to_repo/cloccs_alignment/Hizalama/yardımcı programlar.py
    1. path_to_repo için CLOCCS_alignment deposunun yolunu değiştirin.
  5. Tomurcuklanan verileri hücre döngüsü aşaması verileri olarak kullanıyorsanız, yeni bir hücrede aşağıdaki komutu çalıştırarak her zaman noktasında tomurcuklanma yüzdesini içeren bir veri çerçevesini içeri aktarın:
    budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Uygun dosya yolunu ve dosya adını değiştirin. Dosya bir .csv dosyasıysa, sep ="\t" öğesini kaldırın
  6. Tomurcuklanan verileri hücre döngüsü fazı verileri olarak kullanıyorsanız, aşağıdaki işlevi yeni bir hücreye girerek tomurcuklanan verileri bir yaşam çizgisi noktası zaman ölçeğine hizalayın:
    aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, zaman noktaları, param_mu0, param_lambda)
    1. Zaman noktaları için, budding_df veri çerçevesinin dizini olacak zaman noktalarının bir listesini değiştirin.
    2. param_mu0 ve param_lambda için, deney için bölüm 3'te çalıştırılan tomurcuklanan CLOCCS çalışmasından öğrenilen parametreleri değiştirin.
  7. Akış sitometri verilerini kullanıyorsanız, aşağıdaki komutu yeni bir hücrede çalıştırarak akış sitometri verilerini alın:
    flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
    1. flow_input_folder için, akış sitometrisi .fcs dosyalarını içeren klasörün uygun yolunu değiştirin.
  8. Akış sitometrisi verilerini kullanıyorsanız, aşağıdaki komutu yeni bir hücreye yazarak her deneme için zaman noktaları ve yaşam çizgisi noktaları arasında bir dönüşüm tablosu oluşturun:
    flow_converter = convert_tp_to_ll(zaman noktaları, param_mu0, param_lambda)
    1. Zaman noktaları için, akış sitometrisi verilerindeki zaman noktalarının bir listesini değiştirin.
    2. param_mu0 ve param_lambda için, deney için bölüm 3'te çalıştırılan akış sitometrisi CLOCCS'den öğrenilen parametreleri değiştirin.
  9. Yeni bir hücrede aşağıdaki komutu çalıştırarak deneysel verileri içeren veri çerçevesini not defterine alın:
    data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Uygun dosya yolunu ve dosya adını değiştirin. Dosya bir .csv dosyasıysa, sep ="\t" öğesini kaldırın.
      NOT: Bu, herhangi bir tablo verisi için yapılabilir. Deneysel veriler, veri çerçevesinin sütunları veya dizini olarak zaman noktalarına sahip olmalıdır. Örnek veriler CLOCCS_alignment deposunda bulunabilir.
  10. Aşağıdaki işlevi yeni bir hücreye girerek deneysel verileri bir yaşam çizgisi noktası zaman ölçeğine hizalayın:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, zaman noktaları, param_mu0, param_lambda, interpolat, lowerll, upperll)
    1. Zaman noktaları için, dizin olarak zaman noktalarının bir listesini veya önceki adımdaki deneysel data_df sütunlarını kullanın.
    2. param_mu0 ve param_lambda için, bölüm 3'te CLOCCS'den elde edilen değerleri değiştirin.
      NOT: Parametreler, kabul edilen hücre döngüsü fazı veri türlerinden herhangi birinde gerçekleştirilen herhangi bir CLOCCS çalıştırmasından gelebilir.
    3. İsteğe bağlı olarak, True veya False ile interpolate yapın veya boş bırakın (varsayılan değer False'tur).
      NOT: False olarak ayarlandığında, veriler enterpolasyona tabi tutulmaz. Doğru olarak ayarlandığında, yaşam çizgisi noktaları, yaşam çizgisi noktaları arasındaki değerleri doldurmak için yuvarlanır ve enterpolasyona tabi tutulur, böylece yaşam çizgisi noktaları aralığında tamsayı başına bir nokta olur. Bu, veri kümeleri arasında daha iyi karşılaştırma yapılmasına olanak tanır.
    4. İsteğe bağlı olarak, lowerll ve upperll değerlerini None veya tamsayı değerleriyle değiştirin.
      NOT: Hiçbiri olarak ayarlandığında, enterpolasyondan sonraki tüm yaşam çizgisi noktaları korunur. Tamsayılar sağlandığında, bu durum verileri keser, böylece yaşam çizgisi noktaları alt seviyeden üst seviyeye kadar değişir. Bu, farklı bir alt veya üst alt ile veri kümeleri arasında karşılaştırmaya olanak tanır.
  11. Yeni bir hücreye aşağıdaki komutu girerek yaşam çizgisi hizalanmış veri kümesini indirin: lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
  12. 4.5-4.11 arasındaki adımları, karşılaştırmalara dahil edilecek tüm deneylerle birlikte tekrarlayın.

5. Tomurcuklanma eğrileri ile akış sitometri verilerinin karşılaştırılması

  1. Aşağıdaki komutu yeni bir hücreye girerek Python yardımcı programları işlevini kullanarak hizalamadan önce tomurcuklanan eğrileri çizin:
    plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, başlık = str_title)
    1. list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2, bud_df3] için çizim yapmak üzere istenen tüm tomurcuklanan eğrilerin veri çerçevelerini içeren bir listeyi değiştirin.
    2. İsterseniz göstergenin [Deneme 1, Deneme 2, Mutant] etiketlerinin bir listesini leg_list yerine koyun. Değilse, Hiçbiri'ni hariç tutun veya yerine koyun.
    3. str_type yerine zaman koyun.
    4. İsterseniz str_title için Karşılaştırma Tomurcuklanan Eğriler dize başlığını değiştirin. Değilse, Hiçbiri yerine koyun veya hariç tutun.
  2. Adım 5.1'deki talimatları izleyerek Python yardımcı programları işlevini kullanarak hizalamadan sonra tomurcuklanan eğrileri çizin, ancak list_of_budding_curves yerine hizalanmış tomurcuklanma eğrilerinin bir listesiyle ve zaman yerine point_type için yaşam çizgisi ile.
  3. Akış sitometrisi verilerini çizmek için, adım 4.8'de oluşturulan dönüştürücüyü kullanarak .fcs dosyalarından ilişkili verileri karşılık gelen yaşam çizgisi noktalarında çizin.
  4. Dönüştürücü tablosunu kullanarak yaşam çizgisi noktalarını hücre döngüsü aşamasına dönüştürün (Tablo 1).
    NOT: Bu, adım 5.1'deki yönergeler izlenerek de çizilebilir, ancak zaman yerine point_type için faz ile.

6. Deneysel verilerin karşılaştırılması

  1. Çizgi grafiklerde çizilecek gen listesini, literatür bilgilerine veya araştırma için ilgilenilen genlere dayanarak belirleyin.
  2. Yeni bir hücreye aşağıdaki komutu yazarak orijinal, hizalanmış veya hizalanmış ve enterpolasyonlu veri çerçevesi üzerinde çizgi grafik karşılaştırmaları gerçekleştirmek için Python yardımcı programları dosyasında sağlanan plot_linegraph_comparison kullanın:
    plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, point_type = str_type, title = str_title)
    1. list_of_dfs için karşılaştırılacak deneylerin veri çerçevelerinin bir listesini değiştirin.
      NOT: Veri çerçeveleri hizalanmamış veya hizalanmış olabilir; ancak, karşılık gelen point_type adım 6.2.4'te girilmelidir.
    2. Her veri çerçevesinin başlık listesini, list_for_legend için veri çerçeveleri listesiyle aynı sırada değiştirin.
    3. Genlist için çizilecek gen adlarının bir listesini (veri çerçevelerinin dizinine dahil edilmesi gereken) değiştirin.
    4. Puan türünü str_type yerine koyun. Adım 6.2.1'de hizalanmış veri çerçeveleri için yaşam çizgisi (varsayılan, yaşam çizgisi noktası ölçeğidir) veya faz (hücre döngüsü fazı yaşam çizgisi ölçeği) veya adım 6.2.1'de hizalanmamış veri çerçeveleri için zaman kullanın.
    5. str_title yerine isteğe bağlı bir dize başlığı koyun.
  3. En iyi periyodik genleri belirlemek için literatürü veya algoritmaları kullanarak ısı haritasına dahil edilecek gen listesini belirleyin.
    NOT: Uygun ısı haritası karşılaştırmaları için, veriler adım 6.2'de hizalanmalı, enterpolasyonlu ve zaman ölçeği ayarlanmalıdır; Her deneme için aynı başlangıç ve bitiş yaşam çizgisi değerine sahip olmalıdır.
    1. En iyi periyodik genleri belirlemek için periyodiklik algoritmalarını çalıştırın23,24 veya gen listesini belirlemek için istenen alternatif yöntemleri kullanın (örneğin, literatür sonuçları).
    2. Yeni bir hücrede aşağıdaki komutu kullanarak bir .csv veya .tsv gen listesi dosyasını not defterine alın:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
    3. Uygun dosya yolunu ve dosya adını değiştirin. Dosya bir .csv dosyasıysa, sep="\t" öğesini kaldırın.
  4. Yeni bir hücreye aşağıdaki komutu yazarak hizalanmış, enterpolasyonlu ve faz hizalanmış veri çerçevesi üzerinde bir ısı haritası karşılaştırması yapmak için Python yardımcı programları dosyasında sağlanan işlev plot_heatmap_comparison kullanın:
    plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, title = str_title)
    1. list_of_dfs için karşılaştırılacak deneylerin hizalanmış veri çerçevelerinin bir listesini değiştirin.
    2. Her veri çerçevesinin başlık listesini, list_for_legend için veri çerçeveleri listesiyle aynı sırada değiştirin.
    3. Genlist için çizilecek gen adlarının bir listesini (veri çerçevelerinin dizinine dahil edilmesi gereken) değiştirin.
    4. str_title yerine isteğe bağlı bir dize başlığı koyun.
      NOT: Listedeki ilk veri çerçevesi, ısı haritasındaki genleri sıralamak için kullanılacak olan veri çerçevesidir. Genler, bu veri çerçevesi için ilk periyotta maksimum sıraya göre sıralanacak ve aynı sıra, listedeki sonraki veri çerçeveleri için kullanılacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yukarıdaki protokolde ve Şekil 1'deki iş akışında açıklanan adımlar, iki temsili karşılaştırmayı göstermek için beş hücre döngüsü senkronize zaman serisi deneyine uygulanmıştır: farklı senkronizasyon yöntemlerine sahip replikalar (çiftleşme feromonu ve santrifüj elütriasyonu18) ve dizileme platformları (RNA-dizileme [RNA-seq] ve mikrodizi) arasında ve deneysel koşullar arasında. S. cerevisiae ile çoklu deneyler yapılmış ve her deney için hücre döngüsü fazı ve deneysel veriler toplanmıştır. İş akışı, çeşitli senkron/yayın zaman serisi deneylerini parametreleştirmek için CLOCCS'nin kullanılmasını, bu parametrelerin deneyleri ortak bir karşılaştırılabilir yaşam çizgisi ölçeğine hizalamak için kullanılmasını ve ardından bu hizalanmış deneylerin iki temsili karşılaştırma için kullanılmasını içerir.

Replikalar arasındaki temsili karşılaştırmayı göstermek için, aynı suşla ve aynı deneysel koşullarda gerçekleştirilen ve Koşul 1 adı verilen üç deney seçtik. Bu deneylerden ikisi birbirlerinin doğrudan kopyalarıydı ve her ikisi de mikroarray analizi ile analiz edildi ve santrifüj elütriasyonu ile senkronize edildi. Üçüncü deney, RNA-seq analizi kullanılarak analiz edildi ve alfa faktörü çiftleşme feromon tutuklaması ile senkronize edildi. Değişen hücre döngüsü periyotlarına sahip deneyler arasında ikinci karşılaştırmayı göstermek için, yukarıdan Koşul 1 RNA-seq deneyi (hücre döngüsü periyodu: 71 dakika), Koşul 2 (hücre döngüsü periyodu: 82 dakika) ve Koşul 3 (hücre döngüsü periyodu: 110 dakika) ile karşılaştırılmıştır (Tablo 2). Her deney için, hücreler kendi koşullarında büyütüldü, senkronize edildi, serbest bırakıldı ve daha sonra iki veya daha fazla hücre döngüsü periyodu boyunca örneklendi. Tomurcuklanma ve / veya akış sitometri verileri, hücre döngüsü fazı hakkında bilgi sağlamak için toplandı ve Leman ve ark.18'de (Ek Tablo S1) açıklandığı gibi mikroarray veya RNA-seq zaman serisi transkriptomik verileri toplandı.

Her deney için veriler, Koşul 2 deneyini gösterim için bir örnek olarak sunan Şekil 2'de açıklanan formları almıştır. Her veri kümesinin, hücre döngüsü aşamasının çıkarımına izin veren bir tomurcuklanma eğrisi vardı. Bu eğri, zaman serisindeki her zaman noktası için tomurcuklanan bir yüzde değeri içeriyordu ve daha sonra birden fazla hücre döngüsü salınımını gösteren bir tomurcuklanma eğrisi üretmek için çizildi (Şekil 2). Hücre döngüsü faz verileri ayrıca zaman serisindeki her zaman noktası için akış-sitometrik DNA içeriği boyama verileri biçimini aldı. Koşul 2 için seçilen zaman noktaları çizilmiştir (Şekil 2). Akış sitometri dosyaları, Python yardımcı programlarındaki flow_cytometry_CLOCCS_file_from_fcs işlevini kullanarak CLOCCS'ye girmek için her bir günlük floresan kutusundaki hücreleri içeren tek bir tabloda birleştirildi. Her veri kümesi ayrıca deneysel veriler içeriyordu. Bu durumda, veriler transkriptomik verilerdi ve veriler, her biri deneydeki her zaman noktasında RNA'nın bolluğu için bir değere sahip olan gen sıraları halinde düzenlendi (Şekil 2).

CLOCCS'nin kullanımını ve Koşul 2 RNA-seq veri kümesi için yaşam çizgisi noktalarına dönüşümü gösterdik; Bununla birlikte, süreç diğer deneyler için de aynıydı. Tomurcuklanan bilgiler, protokol bölüm 3'te açıklandığı gibi ve Şekil 3A'da gösterildiği gibi CLOCCS algoritmasına girilmiştir. Sim Anneal, Burn In, Iterations ve Advanced Settings için varsayılan değerler kullanılmıştır. Uygun deney koşulları seçildi. Tomurcuklanma verileri için "Tomurcuk" model tipi kullanılmıştır. Ortaya çıkan CLOCCS tomurcuklanma uyumları, karşılık gelen uyum eğrisini küçük% 95'lik bir güven bandı ile kaplayan veri noktalarının gösterdiği gibi, tomurcuklanan eğrilerin uygun şekilde oturduğundan emin olmak için görüntülenmiştir (Şekil 3B ve Ek Şekil S1). Arka parametreler tablosundaki 0 ve λ μ parametreleri (Şekil 3C) hizalamada kullanılmak üzere kaydedildi. Durum 2 için akış sitometri verileri, protokol bölüm 3'te açıklandığı gibi CLOCCS'ye ayrı ayrı girilmiştir. Şu anda, CLOCCS akış sitometrelerinin 1.024 kanallı 10 bit veri üretmesini beklemektedir; Bununla birlikte, modern akış sitometreleri daha fazla kanala sahip olabilir. Akış sitometremiz 1.024'ten fazla kanala sahip veriler ürettiğinden, veriler 1.024 kutuya bağlandı. Akış sitometrisi hücre döngüsü faz verileri ile CLOCCS, seçilen her zaman noktası için uygun bir CLOCCS üretir (Şekil 3D ve Ek Şekil S2) ve Şekil 3C'deki tomurcuklanan posterior parametreler tablosuna benzer bir posterior parametreler tablosu sağlar. CLOCCS'nin diğer deneylerin her biri için çalıştırdığı tomurcuklanma parametreleri Tablo 2'de açıklanmıştır ve CLOCCS'nin çalıştırdığı akış sitometrisi parametreleri Ek Tablo S2'de açıklanmıştır.

Yaşam çizgisi hizalaması için ana hücrelerin hücre döngüsü periyoduna (λ) ve iyileşme süresine (μ0) karşılık gelen CLOCCS parametreleri kullanıldı. λ'nun mutlaka hücre popülasyonunun ortalama hücre döngüsü süresini temsil etmediğine dikkat etmek önemlidir. Hücrelerin tam bir bölünmeye uğradığı durumlarda, eşit sayıda anne ve kız hücre vardır, bu nedenle ortalama hücre döngüsü periyodu, ana hücrelerin hücre döngüsü periyodu (λ) ile yavru hücrelerin hücre döngüsü periyodu (λ + δ) arasındaki ortalamadır; Özellikle, Delta (δ), kıza özgü gecikmenin uzunluğudur. Bu, her deney için hücre döngüsü periyodu için kullandığımız hesaplamadır (Tablo 2). Her deney için, karşılık gelen λ ve μ0 parametreleri daha sonra Koşul 2'de gösterildiği gibi Python yardımcı programları dosyasında sağlanan df_conversion_from_parameters dönüştürme işlevinde kullanılmıştır (Şekil 4A). Tomurcuklanan eğriler için, veriler enterpolasyona tabi tutulmamıştır. Bununla birlikte, deneysel veriler için, yaşam çizgisi hizalanmış veri kümeleri, interpolasyon kullanılarak yeniden örneklenmiştir, böylece her yaşam çizgisi noktası, gelişmiş çizim için enterpolasyonlu veriler içermektedir. Yaşam çizgisi hizalanmış veri kümelerinin aynı yaşam çizgisi noktası aralığına sahip olduğundan emin olmak için, alt ve üst yaşam çizgisi sınırları bu noktalardaki verileri kesmek üzere ayarlanmıştır. Bu lowerll ve upperll parametreleri, enterpolasyon True olarak ayarlandığında df_conversion_from_parameters fonksiyonuna girildi. Koşul 1 karşılaştırması için, tüm veri kümeleri için sırasıyla 44 ve 270 olarak ayarlandılar ve çevresel koşullar arasındaki karşılaştırma için sırasıyla 50 ve 300 olarak ayarlandılar. Bu işlevlerin hizalama ve karşılaştırma için örnek bir kullanımı örnek Python not defteri JOVE_example.ipynb'de görülebilir ve rakamları oluşturmak için kullanılan kod CLOCCS_alignment deposundaki JOVE_Figures.ipynb not defterinde görülebilir.

Zaman noktalarından yaşam çizgisi noktalarına bu dönüşüm, μ0 (iyileşme süresi) ve λ (ana dönem) kullanan iki formül21'e (Şekil 4A) bağlıdır. İlk formül, Equation 1kurtarma aşaması formülüdür (Şekil 4A). Bu formül yalnızca, μ 0 kurtarma süresine karşılık geldiğinden, μ 0'a kadar olan ve0 dahil olmak üzere zaman noktalarından oluşan kurtarma aşamasındaki zaman noktaları için kullanılır. Zaman noktaları daha sonra 100 yaşam çizgisi noktasıyla biten bir yaşam çizgisi ölçeği aralığına dönüştürülür (Tablo 1), kurtarma aşamasının sonunu ve ilk hücre döngüsünün başlangıcını işaretler. Kurtarma sonrası aşama, Equation 2 sonraki her kurtarma sonrası zaman noktasını 100'den sonra bir yaşam çizgisi noktasına dönüştüren ikinci formülü kullanır (Şekil 4A). Takip eden her 100 yaşam çizgisi noktası, yeni bir hücre döngüsüne karşılık gelir; ilk döngü 100 ila 200 yaşam çizgisi noktalarına, ikinci döngü 200 ila 300 yaşam çizgisi noktalarına karşılık gelir ve bu şekilde devam eder (Tablo 1). Zaman noktalarından yaşam çizgisi noktalarına dönüştürme, söz konusu veri kümesi için karşılık gelen CLOCCS parametreleri kullanılarak her veri kümesine ayrı ayrı uygulanır. Her veri kümesi yaşam çizgisi ölçeğine dönüştürüldükten sonra, hücre döngüsü aşamaları hizalanır ve bu da veri kümeleri arasında aşamaya özgü karşılaştırmalara olanak tanır.

Tablo 3 , tomurcuklanan CLOCCS çalıştırmasından parametreleri kullanarak Koşul 2 veri kümesinin temsili dönüşümü için seçilen zaman noktalarının ilgili yaşam çizgisi noktalarına dönüştürülmesini gösterir. Koşul 2 RNA-seq'ten toplanan tomurcuklanma verileri, bir Python not defterinde plot_budding_curves Python işlevi kullanılarak hem dakikalar içinde hizalanmamış zaman ölçeği (Şekil 4B) hem de yaşam çizgisi noktalarındaki hizalanmış zaman ölçeği (Şekil 4C) için zaman içinde tomurcuklanan yüzdeyi gösteren bir tomurcuklanma eğrisinde çizilmiştir. Yaşam çizgisi noktaları kolayca deneysel ve hücre döngüsü faz bilgisine dönüştürülebilir (Tablo 1) ve iyileşme fazı ve birinci ila üçüncü hücre döngüleri buna göre elle renk kodlanmıştır (Şekil 4B, C). Her yaşam çizgisi noktası bir hücre döngüsü fazına karşılık geldiğinden, bireysel akış sitometri grafikleri, yaşam çizgisi hizalaması tarafından belirlenen hücre döngüsü fazı kullanılarak Python fonksiyonları aracılığıyla etiketlenebilir. Bu fazlar, Koşul 2 için akış-sitometrik analiz yoluyla belirlenen fazlarla eşleşti. Koşul 2 veri kümesi için toplanan akış sitometrisi verileri, seçilen zaman noktaları için çizilmiş ve akış sitometrisi yaşam çizgisi hizalamasından belirlenen hücre döngüsü fazı kullanılarak etiketlenmiştir. Her durumda, veriler hizalama tarafından belirlenen aşamayla eşleşti (Şekil 4D).

Her örnek için her genin ekspresyon seviyesinin aynı kaldığını, ancak zaman noktalarının etiketlenmesinin dakikalar içinde yaşam çizgisi noktalarına değiştirildiğini belirtmek önemlidir. Ancak, dönüşüm doğrusal değildir. Gri renkle vurgulanan kurtarma aşaması, yaşam çizgisi noktalarına dönüşüm gerçekleştirildikten sonra deneysel sürenin daha yüksek bir yüzdesini kaplar (Şekil 4B, C). Yaşam çizgisi ölçeğinin avantajı, deneyler arasında ayrıntılı faz bilgilerine ve faz karşılaştırmalarına izin vermesidir. Faz bilgileri, yukarıda açıklandığı ve Tablo 1'de gösterildiği gibi yaşam çizgisi noktalarında bulunur. Ayrıca, G1 her hücre döngüsünün ilk 15.5 yaşam çizgisi noktasında, S sonraki 20 yaşam çizgisi noktasında ve G2 / M sonraki 64.5 yaşam çizgisi noktasında bulunur (Tablo 1). Bununla birlikte, bu, kurtarma aşaması orijinal zaman noktası ölçeğinde çok kısa görünse bile, kurtarma süresini yapay olarak her ardışık hücre döngüsünün aynı zaman aralığına sınırlar. Bu, karşılaştırmaları gizlemez, çünkü her deneyin aşamaları hizalanmıştır. Çoğu durumda, verileri dakikalar içinde aynı anda meydana gelen zaman noktalarından ziyade aynı deneysel ve biyolojik aşamada meydana gelen noktalarda karşılaştırmak daha önemlidir.

Tüm denemeler, Python yardımcı programları dosyasında sağlanan Python işlevleri kullanılarak hizalanmış yaşam çizgisi ölçeğine dönüştürüldükten sonra karşılaştırılabilir. Burada, deneyler arasında iki yaygın karşılaştırma gösteriyoruz: biri benzer bir deneyin platformlar ve senkronizasyon yöntemleri arasındaki kopyaları arasında (Şekil 5) ve diğeri değişen bir dönem uzunluğuna sahip farklı deneysel koşullar arasında (Şekil 6 ve Şekil 7). Yukarıda açıklandığı gibi, ilk karşılaştırma iki elütriye mikroarray replikasyonu ve bir alfa faktörü senkronize RNA-seq deneyi arasındadır. Hizalamadan önce, iki mikrodizi replikası benzer senkronizasyon ve hücre döngüsü dinamikleri gösterdi, ancak Koşul 1 Mikroarray 2 replikası biraz gecikmiş görünüyordu (Şekil 5A). En çarpıcı fark, hizalanmamış veri kümeleri karşılaştırıldığında bulundu; Koşul 1 RNA-seq ikinci döngüsü, iki mikroarray deneyinin ilk döngüsü ile aynı hizada ortaya çıktı. Aradaki fark muhtemelen farklı transkriptomik platformlarla değil, farklı senkronizasyon yöntemleriyle ilgiliydi. Mikroarray deneylerindeki hücre popülasyonları santrifüjlü elütriasyon ile senkronize edilirken, RNA-seq deneyi için popülasyon çiftleşme feromon tedavisi ile senkronize edildi. Gerçekten de, çiftleşme feromonu ile senkronizasyon, elütriasyona kıyasla iyileşme süresini önemli ölçüde azaltmıştır (Şekil 5A ve Tablo 2).

Geçen süre açısından çizildiğinde replikalar arasındaki bariz farklılıklara rağmen, yaşam çizgisi hizalamasından sonra, eğriler neredeyse aynıydı ve replikalar arasında daha ayrıntılı ve alakalı karşılaştırmalar mümkün olmuştur (Şekil 5B). İyileşme aşaması, her deneyin aynı yaşam çizgisi noktasında başlaması ve dönemdeki varyasyonların yaşam çizgisi hizalaması ile normalleştirilmesi için hizalandı. Hizalama nedeniyle, replikalar arasında aynı yaşam çizgisi noktasındaki deneysel değerler aynı hücre döngüsü fazında meydana geldi ve böylece replikalar arasındaki deneysel varyansın hesaplanmasını sağladı. İyileştirme ve hücre döngüsü aşamaları, deneylerin her birinde hücre döngüsü aşamaları hakkında ek bilgi sağlamak için Şekil 5B'de etiketlenmiştir. Bu yaşam çizgisi hizalaması daha sonra yukarıda açıklandığı gibi yardımcı programlar dosyasında sağlanan Python işlevi kullanılarak deneysel veri kümesine (Şekil 5C,D) df_conversion_from_parameters uygulanabilir.

Şekil 5D'de, transkriptomik veriler hizalandı ve CDC20 geninin ifade dinamikleri, bir Python not defterindeki plot_linegraph_comparison Python işlevi kullanılarak çizildi. Hizalamadan önce, mikroarray deneylerinin ilk tepe ifadesi, RNA-seq deneyinin ikinci zirvesi ile hizalanmış gibi görünüyordu (Şekil 5C); ancak, hizalamadan sonra, her veri kümesinin ilk hücre döngüsü zirveleri düzgün bir şekilde hizalanmıştır (Şekil 5D). Ayrıca, deneylerin tepe genişliğinin RNA-seq veri kümesi ile mikroarray veri kümeleri arasında farklılık gösterdiği görülmüştür, ancak hizalamadan sonra tepe genişliği daha hizalanmıştı (Şekil 5C, D).

İkinci karşılaştırma, farklı hücre döngüsü periyotlarına sahip farklı çevresel koşullardaki deneyler arasındadır (Şekil 6). Yukarıda açıklandığı gibi, burada, Koşul 1'deki S. cerevisiae veri kümelerini, sırasıyla 71, 82 ve 110 dakikalık hücre döngüsü dönemlerine karşılık gelen Koşul 2 ve Koşul 3 ile karşılaştırdık. Hücre döngüsü periyodundaki bu farklılıklar, hizalanmamış tomurcuklanma eğrilerinde gösterildiği gibi, hücre döngüsü faz hizalamasından önceki deneyler arasında karşılaştırma yaparken belirsizlik yarattı. Periyot farklılıkları hizalanmamış tomurcuklanma eğrilerinde görülebilir (Şekil 6A). Bununla birlikte, bu protokol kullanılarak CLOCCS hizalandığında, üç eğri oldukça benzer görünüyordu, böylece deneysel verilerin karşılaştırılması mümkün hale geldi (Şekil 6B).

Akış sitometrisi CLOCCS parametreleri kullanılarak, Koşul 1 ve Koşul 2 ortak bir yaşam çizgisi ölçeğine hizalandı ve DNA içeriği histogramları Koşul 2'de ve Koşul 1'deki eşdeğer yaşam çizgisi noktalarında çizildi. DNA içeriğinin yaşam çizgisi noktaları arasındaki akış sitometrik ölçümleri karşılaştırıldı (Şekil 6C). DNA içeriği ölçümleri sürekli olmadığından ve kolayca enterpolasyona tabi tutulmadığından, sadece en yakın yaşam çizgisi noktalarını karşılaştırabildik. Her karşılaştırılabilir yaşam çizgisi noktası için hücre döngüsü faz verileri, iki koşul arasında aynı değildi (Şekil 6C), bu da CLOCCS'nin uyduğunu ve sonuçta ortaya çıkan parametrelerin Koşul 1 için muhtemelen biraz yanlış hizalandığını göstermektedir. Bu muhtemelen Koşul 2'ye kıyasla Koşul 1 için akış sitometrik verilerine daha zayıf CLOCCS uyumundan kaynaklanıyordu (Ek Şekil 2). Bununla birlikte, hizalama sadece bir numunede sapmıştır ve bu nedenle hala faza özgü karşılaştırmaların iyileştirilmesine izin vermektedir.

Tomurcuklanan yaşam çizgisi hizalaması daha sonra deneysel veriler üzerindeki df_conversion_from_parameters fonksiyonunda tomurcuklanan CLOCCS parametreleri kullanılarak Koşul 1, Koşul 2 ve Koşul 3'teki RNA-seq deneyleri için deneysel verilere uygulanmıştır (Şekil 7). Transkriptomik veriler hizalandı ve üç deney için her zaman serisi için CDC20 geninin gen ekspresyonu gösterildi. Hizalamadan önce, CDC20'nin transkript dinamikleri örtüşmüyordu (Şekil 7A). Hizalamadan sonra, CDC20 gen ekspresyonunun birinci ve ikinci zirveleri, her üç veri kümesi için de çok daha yakından hizalanmıştı. Hizalamadan sonra, zirvelerin aynı hücre döngüsü fazında meydana geldiği, ancak eğrilerin şekillerinin farklı olduğu anlaşıldı (Şekil 7B). Koşul 3, hücre döngüsü periyodundaki farklılıkları hesaba kattıktan sonra bile, diğer iki koşula kıyasla daha düşük ve daha geniş bir ilk zirveye sahipti, bu da bu farklılıkların muhtemelen test edilen deneysel koşullarla ilişkili olduğunu düşündürmektedir (Şekil 7B).

Büyük ölçekli transkriptomik karşılaştırmalar da yapılabilir. Bu karşılaştırmalar için, periyodiklik algoritması çalıştırılarak278 gen seçildi JTK_CYCLE her veri kümesinde 23 ve en üst periyodik genlerin kesişimi alındı. Bununla birlikte, genler istenen herhangi bir yöntem kullanılarak veya literatürden seçilebilir. Bu genler, bir Python not defterindeki plot_heatmap_comparison Python işlevi kullanılarak hem hizalanmamış (Şekil 7C) hem de hizalanmış (Şekil 7D) ısı haritaları için her üç koşul için de aynı sırada çizilmiştir. Bu ısı haritaları, yüzlerce gen seviyesi karşılaştırmasının aynı anda yapılmasına izin verir. Eğri dinamiklerindeki değişim, komşu genlere göre pik zamanı ve dönem uzunluğu vb. İle ilgili olarak hizalanmamış deneyler arasında karşılaştırmalar yapılabilir (Şekil 7C). Bununla birlikte, ayrıntılı faza özgü karşılaştırmalar yapılamamıştır, çünkü zaman noktaları, koşullar arasında aynı hücre döngüsü fazı ile mutlaka ilişkili değildir. İkinci döngüler hizalamadan sonra benzer görünse de, ilk döngüler koşullar arasında hafifçe kaydırılmıştır (Şekil 7D). Bu değişim, tomurcuklanan hücre döngüsü faz bilgisinin Koşul 3 için daha düşük kalitede olduğu gerçeğini yansıtıyor olabilir. Bununla birlikte, deneylerin üç koşul için hizalanması, faza özgü karşılaştırmanın iyileştirilmesine izin verdi. Hizalamadan önce, her koşuldaki ilk ekspresyon zirvesinin aynı hücre döngüsü aşamasında gerçekleşip gerçekleşmeyeceği belirsizdi (Şekil 7C); ancak, hizalamadan sonra, deneyler faza özgü bir şekilde karşılaştırılabilir (Şekil 7D). Hizalamadan önce, Koşul 3'teki zirveler diğer iki koşuldan çok daha geniş görünüyordu (Şekil 7C); ancak, hizalamadan sonra, Koşul 3'teki zirvelerin hizalandığında diğer koşullara benzer genişlikte olduğu anlaşılmıştır (Şekil 7D).

Bu temsili sonuçlar, deneyleri ortak bir zaman ölçeğine hizalamak için CLOCCS'nin kullanım sürecini göstermektedir. Hizalamadan önce, doğrudan zaman noktası karşılaştırmaları genellikle benzer bir hücre döngüsü fazı ile ilişkili değildir. Geçen deneysel sürenin dakikalar içinde hücre döngüsü fazını temsil eden yaşam çizgisi noktalarına dönüştürülmesi, hücre döngüsünün aynı noktasındaki deneyler arasında faza özgü ve biyolojik olarak ilgili karşılaştırmalara izin verir.

Figure 1
Şekil 1: CLOCCS yaşam çizgisi hizalama iş akışına genel bakış. CLOCCS kullanarak iki örnek veri kümesinin hizalanmasına yönelik deneysel iş akışı, ardından veri kümeleri arasında temsili karşılaştırmalar. Protokolün başlıca adımları gösterilmiştir: veri kümelerinin her biri için hizalanmamış hücre döngüsü aşaması ve deneysel verilerin toplanması (adım 1), her veri kümesinin parametrelendirilmesi için CLOCCS'nin kullanılması (adım 2 ve adım 3), veri kümelerinin ortak bir yaşam çizgisine hizalanması (adım 4) ve son olarak, hücre döngüsü aşamasının ve deneysel dinamiklerin karşılaştırılması (adım 5 ve adım 6). Hizalanmamış hücre döngüsü faz verileri, öğrenilmiş parametreleri sağlamak için CLOCCS'ye girilir ve bunlar daha sonra ortak bir yaşam çizgisi ölçeğine hizalamak için kullanılır. Bu hizalanmış veri kümeleri daha sonra karşılaştırılır. Kısaltma: CLOCCS = Hücre Döngüsü Senkron Kaybının Karakterize Edilmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Hücre döngüsü aşamasının biçimi ve iş akışı için gerekli deneysel veriler. İş akışı için gerekli veriler iki ana bileşenden oluşur: hücre döngüsü faz verileri ve hücre döngüsü deneysel verileri. Hücre döngüsü faz verileri, zaman serisindeki her zaman noktası için hücre döngüsü tomurcuklanma verilerinden veya akış-sitometrik DNA içerik verilerinden oluşabilir. Deneysel veriler birçok biçimde olabilir, ancak bu durumda, zaman serisindeki her zaman noktası için her gen için gen ekspresyon verilerinden oluşan transkriptomik verilerdir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Bir S. cerevisiae hücre döngüsü veri kümesinde CLOCCS çalıştırmanın sonuçlarına örnek. (A) Koşul 2 tomurcuklanma verileri için sağlanan giriş değerleri ve ayarları içeren CLOCCS grafik kullanıcı arayüzünün ekran görüntüsü. Zamanlar, tomurcuklanmamış hücrelerin sayısı ve tomurcuklanan hücrelerin sayısı, model türü, yinelemeler ve koşullar vb. (B) Sonuçların "Öngörülen Uyum" sekmesi altındaki Koşul 2 için uyan sonuçta ortaya çıkan CLOCCS tomurcuklanmasının ekran görüntüsü. Her veri noktasının, verilerin %95 binom oranı güven aralıklarına karşılık gelen ilişkili bir örnekleme hata çubuğu vardır (her zaman noktası için en az 200 hücre sayılmıştır [204 ile 295 hücre arasında]). Ortaya çıkan tomurcuklanan uyum eğrisi, CLOCCS uyumunun mor renkteki %95 güven aralığı için güven bandını gösterir. (C) Ortalama CLOCCS parametreleri, %2,5 güven aralığı ve %97,5 güven aralığından oluşan Koşul 2 tomurcuklanan CLOCCS çalıştırması için ortaya çıkan "Arka Parametreler" tablosunun ekran görüntüsü. Posterior ve kabul oranları da gösterilmiştir. (D) Akış sitometrisi CLOCCS'nin ekran görüntüsü, 70 dakika ve 150 dakikada Koşul 2'ye uygundur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Koşul 2 veri kümesi için zaman noktalarından hizalanmış yaşam çizgisi noktalarına dönüştürme işlemi örneği. (A) Zaman noktalarından yaşam çizgisi noktalarına dönüştürmek için kullanılan dönüştürme formülleri. Tomurcuklanan eğrileri dönüştürmek ve çizmek için Python not defterindeki Python işlevlerinin ekran görüntüsü. (B) Her zaman noktası için tomurcuklanma yüzdesini dakika cinsinden gösteren hizalanmamış Koşul 2 tomurcuklanma eğrisi. Hücre döngüsü ve iyileşme aşamaları aşağıdaki gibi vurgulanır: iyileşme (gri), birinci hücre döngüsü (mavi), ikinci hücre döngüsü (macenta) ve üçüncü hücre döngüsü (somon). (C) Aynı tomurcuklanma yüzdelerini gösteren, ancak yaşam çizgisi hizalanmış ölçekte çizilen hizalanmış Koşul 2 tomurcuklanma eğrisi. Hücre döngüsü ve kurtarma aşamaları, panel C'de olduğu gibi vurgulanır. (D) Hizalanmış akış sitometrisi, yaşam çizgisi ölçeğine dayalı farklı hücre döngüsü fazlarına karşılık gelen Koşul 2'den seçilen zaman noktaları için grafikler: G1'in başlangıcı, S-fazının başlangıcı, G2 / M'nin başlangıcı ve geç G2 / M. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Hizalanmış ve hizalanmamış Koşul 1 çoğaltma deneylerinin karşılaştırılması için temsili sonuçlar. Koşul 1 replikalarının karşılaştırılması: Koşul 1 RNA-seq (mavi), Koşul 1 mikroarray 1 (mor) ve Koşul 1 mikroarray 2 (gri). (A) Koşul 1 veri kümeleri için hizalanmamış tomurcuklanma eğrisi. (B) Koşul 1 veri kümeleri için hizalanmış tomurcuklanma eğrisi. Yaşam çizgisi noktaları hücre döngüsü aşamasına dönüştürülmüştür ve x ekseninin altında renk kodludur. (C) Koşul 1 veri kümeleri için temsili bir genin, CDC20'nin hizalanmamış gen ekspresyonu. (D) Koşul 1 veri kümeleri için temsili bir genin, CDC20'nin hizalanmış gen ekspresyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Farklı periyotlardaki deneyler arasında hizalanmış ve hizalanmamış hücre döngüsü faz verilerinin karşılaştırılması için temsili sonuçlar. Üç farklı çevresel koşula ve dolayısıyla üç farklı hücre döngüsü periyoduna sahip veri kümeleri için hücre döngüsü faz verilerinin karşılaştırılması: Koşul 1 RNA-seq (hücre döngüsü periyodu: 71 dakika), Koşul 2 RNA-seq (hücre döngüsü periyodu: 82 dakika) ve Koşul 3 RNA-seq (hücre döngüsü periyodu: 110 dakika). (A) Veri kümeleri için hizalanmamış tomurcuklanma eğrisi. (B) Veri kümeleri için hizalanmış tomurcuklanma eğrisi. (C) Koşul 2 (üst sıra) için akış-sitometrik DNA içeriği histogramları, Koşul 1'deki (alt sıra) eşdeğer yaşam çizgisi noktalarıyla karşılaştırıldığında. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Farklı periyotlardaki deneyler arasında hizalanmış ve hizalanmamış transkriptomik verilerin karşılaştırılması için temsili sonuçlar. Veri kümeleriyle ilişkili transkriptomik verilerin karşılaştırılması Şekil 6: Koşul 1 RNA-seq, Koşul 2 ve Koşul 3. (A) Koşul 1, Koşul 2 ve Koşul 3 RNA-seq veri kümeleri için temsili bir gen olan CDC20'nin hizalanmamış gen ekspresyonu. (B) Veri kümeleri için CDC20'nin hizalanmış gen ekspresyonu. (C) Üst hücre döngüsü periyodik genlerinin her veri kümesi için aynı sırayla hizalanmamış ısı haritası. (D) C panelinden aynı hücre döngüsü periyodik genlerinin yaşam çizgisi hizalanmış ısı haritaları. Kesikli mor çizgiler, 100 ve 200 yaşam çizgisi noktalarına karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Yaşam çizgisi, hücre döngüsü faz dönüşümüne işaret eder. Yaşam çizgisi noktası ölçeği ile denemedeki ilgili aşama arasındaki dönüştürme anahtarı. Yaşam çizgisi noktaları 0-100, senkronizasyondan kurtarmaya karşılık gelir. Takip eden her 100 yaşam çizgisi noktası yeni bir hücre döngüsüne karşılık gelir, ilk 15.5 yaşam çizgisi noktası G1'e, sonraki 20 yaşam çizgisi noktası S-fazına karşılık gelir ve kalan yaşam çizgisi noktaları G2 / M'ye karşılık gelir .

Tablo 2: Tomurcuklanan CLOCCS parametreleri. Ortaya çıkan tomurcuklanan CLOCCS parametreleri, temsili sonuçlardan her deney için "lambda" ve "mu0" parametreleri. Ek olarak, her deney için kıza özgü gecikme "Delta" ve hesaplanan hücre döngüsü periyodu gösterilmiştir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 3: Dakika cinsinden zaman noktaları ile Koşul 2 için bunlara karşılık gelen yaşam çizgisi noktaları arasındaki dönüşümü gösteren dönüşüm tablosu. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S1: CLOCCS tomurcuklanması Koşul 1 ve Koşul 3 için uygundur. Elde edilen CLOCCS tomurcuklanmasının ekran görüntüsü, (A) Koşul 1 RNA seq tomurcuklanma verilerine, (B) Koşul 1 mikroarray 1 tomurcuklanma verilerine, (C) Koşul 1 mikroarray 2 tomurcuklanma verilerine ve (D) Koşul 3 tomurcuklanma verilerine uygundur. Durum 2'ye uygun CLOCCS tomurcuklanması Şekil 3B'de görülebilir. %95 güven bandı ve örnekleme hata çubukları, CLOCCS belgeleri14,15'te ve Şekil 3'te açıklandığı gibidir. Her zaman serisi için her zaman noktası için yaklaşık 200 hücre sayıldı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: CLOCCS akış sitometrisi Koşul 1 ve Koşul 2 için uygundur. Akış sitometrisi CLOCCS'nin ekran görüntüsü, Durum 2 (üst sıra: A-D) ve Koşul 1 (alt sıra: E, F) için Şekil 6C'de gösterilen örneklere uygundur. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S3: Hizalamanın CLOCCS parametrelerindeki değişikliklere duyarlılığı. Koşul 1 RNA-Seq veri kümesinin, CLOCCS uyumunun güven aralığındaki λ ve μ0 parametrelerindeki (A-C) varyasyonları ve (D,E) parametrelerindeki büyük varyasyonlar kullanılarak hizalanmasının karşılaştırılması. Ortalama değer ile %2,5 ve %97,5 güven değerleri arasında karşılaştırma CLOCCS tarafından CLOCCS tarafından (A) μ0 ve λ parametrelerinin her ikisi için de μ0 ve λ parametresi için çıktı. (D) μ0 parametresindeki büyük varyasyonlarla (μ0'ın %200 ila %0,25'i) karşılaştırıldığında, μ0 için ortalama değer kullanılarak yapılan hizalama arasındaki karşılaştırma. (E) λ parametresindeki büyük varyasyonlarla (λ'nun %200 ila %0,25'i) λ için ortalama değer kullanılarak yapılan hizalama arasındaki karşılaştırma. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S1: Her deneme için veri toplamanın açıklaması. Her deney için, bu tablo tomurcuklanan verilerin, akış sitometri verilerinin, transkriptomik verilerin ve senkronizasyon yönteminin bir açıklamasını sağlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S2: Akış-sitometrik CLOCCS çalışmalarından CLOCCS parametreleri. Durum 1 ve Koşul 2 akış sitometrisi için CLOCCS parametreleri "mu0" ve "lambda" CLOCCS çalışır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Akış-sitometrik verilerin CLOCCS giriş formatına dönüştürülmesi için talimatlar. CLOCCS'nin akış-sitometrik verilerle kullanımı için belirli bir giriş formatı gereklidir. Bu dosya, bu dönüştürmeyi gerçekleştirmek için Python yardımcı programı işlevlerinin nasıl kullanılacağını açıklamak için protokol adımı 3.4.1 ile ilgili daha ayrıntılı talimatlar sağlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu makale, senkronize hücre popülasyonları üzerindeki zaman serisi deneylerinden elde edilen verileri daha doğru ve nicel olarak değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, her deneyi14,15 parametrelendirmek için tomurcuklanan veriler ve akış-sitometrik DNA içerik verileri gibi giriş hücresi döngüsü faz verilerini kullanan bir Bayes çıkarım modeli olan CLOCCS'den öğrenilen parametreleri kullanır. CLOCCS, her bir deneyin parametrelerini çıkarmak için giriş hücresi döngüsü faz verilerini kullanır ve bunlar daha sonra ortak bir yaşam çizgisi ölçeğine hizalamak için kullanılır. Birden çok senkronizasyon/yayın zaman serisi deneyini tek bir yaşam çizgisi hizalanmış zaman ölçeğine dönüştürmek, deneyler ile daha önce zor veya imkansız olan birden çok çoğaltma deneyinin toplanması arasında faza özgü ve ilgili karşılaştırmalara olanak tanır.

Bu protokolün kritik adımları arasında veri toplama, CLOCCS çalıştırma, veri kümelerini hizalama ve veri kümeleri arasında karşılaştırma yer alır. İlk olarak, bu protokolde kullanılmak üzere veriler toplanmalıdır. Veriler, hem ilgilenilen soruyla ilgili deneysel veri içeren bilgilerden (yani, transkriptomik veriler, gen ekspresyon verileri, proteomik veriler) hem de hücre döngüsünün fazı hakkında bilgi içeren hücre döngüsü faz verilerinden (yani, tomurcuklanan veriler, akış-sitometrik DNA içerik verileri) oluşmalıdır. Daha sonra, hücre döngüsü faz verileri, her deney için parametre bilgilerini toplamak üzere CLOCCS'de kullanılabilir. Zaman noktalarını yaşam çizgisi noktalarına dönüştürmek için μ0 (kurtarma fazı uzunluğu) ve λ (ana hücre döngüsü periyodu) parametreleri kullanılır. Yaşam çizgisi noktası hizalaması, hizalanmış zaman serilerinin doğrudan karşılaştırılmasını sağlar.

Yöntemin bir sınırlaması, uygun hizalamanın verilere iyi bir uyum sağlamaya bağlı olmasıdır. En iyi CLOCCS uyumunu elde etmek, hücre döngüsü faz verilerinin kalitesine ve CLOCCS'deki deney için doğru giriş ayarlarının kullanılmasına bağlıdır. Hücre döngüsü faz verilerine uyum, öğrenilen parametrelerin doğruluğunu belirler ve bu nedenle, hizalamanın doğruluğunu büyük ölçüde etkiler, çünkü bu parametrelerin kullanımına bağlıdır. Parametrelerdeki geniş değişiklikler hizalamayı büyük ölçüde etkileyeceğinden, değişiklikler CLOCCS çıkışında sağlanan güven aralığı içinde minimum düzeyde kalır (Ek Şekil S3). Parametrelerdeki değişikliklere karşı bu duyarlılığın, değişen hücre döngüsü zamanlamasına sahip veri kümeleri arasında hizalamaya izin veren şey olduğunu da belirtmek önemlidir.

CLOCCS uyumunun doğruluğu, elde edilen CLOCCS uyum eğrisi ve ilgili hata çubukları ve hata bandı kullanılarak belirlenebilir (Şekil 3B, D, Ek Şekil S1 ve Ek Şekil S2). CLOCCS sığdırma sekmesi, orijinal veri noktalarının yanı sıra CLOCCS uyumunun güven aralığına karşılık gelen güven bandı ve verilerin %95 binom oranı güven aralığına karşılık gelen hata çubukları ile CLOCCS uyum eğrisini gösterir, çünkü sayımların bağımsız binom rasgele değişkenleri olduğu varsayılır14. Örneğin, tomurcuklanan verilerdeki güven çubukları, belirli bir örnek için tomurcuklanan hücrelerin oranına olan güveni ölçer.

CLOCCS uyumunun kalitesini belirlemeye yönelik bir yöntem, verilerin hata çubuklarının CLOCCS uyumunun güven aralığı bandıyla örtüşüp örtüşmediğini belirlemeyi içerir. Diğer bir gösterge ise CLOCCS uyumunun %95 güven bandının genişliğidir. Genel olarak, bandın genişliği, uyum iyiliğinin artmasıyla azalır. Zayıf hizalamanın bir göstergesi, orijinal verilerin hücre döngüsü aşamasının, hizalamadan çıkarılan hücre döngüsü aşamasıyla eşleşmemesidir. Her hizalama, her zaman noktası için, hücre döngüsü fazı bilgi verileriyle gösterilen fazın, hizalama tarafından atanan hücre döngüsü fazıyla eşleştiğini doğrulayarak iki kez kontrol edilebilir.

Zayıf bir CLOCCS uyumu veya zayıf hizalama, düşük kaliteli hücre döngüsü faz verilerinin bir sonucu olabilir. Yüksek kaliteli tomurcuklanma verileri, tutuklandıktan hemen sonra çok düşük bir tomurcuklanma yüzdesine ve ilk zirvede çok yüksek bir tomurcuklanma yüzdesine sahip olacaktır. Sonraki zirveler ve oluklar senkronizasyonu kaybedecek, ancak farklı ve eşit aralıklı olmalıdır. Yaşam çizgisi noktaları popülasyonun ortalama hücre döngüsü aşamasını temsil ettiğinden, zayıf senkronizasyon da uygun hizalamayı engelleyebilir. Yüksek kaliteli akış-sitometrik DNA içeriği verileri, uygun hücre döngüsü fazına karşılık gelen her zaman noktası için farklı 1C ve 2C zirvelerine sahip olacaktır. Ek olarak, yetersiz hücre döngüsü faz verileri, parametre tanımlanabilirlik sorunlarına neden olur. Yeterli veri olması durumunda, parametreler çıkarılabilir ve CLOCCS çalıştırmaları arasında önemli ölçüde değişmez. Ancak, bu protokolde açıklanan parametreler (lambda, delta, mu0), hücre döngüsü faz verileri yalnızca bir tam hücre döngüsü içerdiğinde çözülemez. Geliştirilmiş parametre tahminine izin vermek için, CLOCCS 14,15'e uyan yeterli ve iyi yapılandırılmış hücre döngüsü verileri kullanılmalıdır. Ayrıca, CLOCCS modeli, Orlando ve ark.15'te açıklandığı gibi önceki bilgileri kullanır, ancak bu bilgiler kullanılan deneysel koşullara daha iyi uyacak şekilde ayarlanabilir.

Hücre döngüsü faz verilerinin kalitesi iyiyse, CLOCCS ayarlarının yeniden ayarlanması daha doğru bir uyum sağlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, doğruluğu artırmak için seçilen yineleme sayısı artırılabilir. CLOCCS'de doğru senkronizasyon yönteminin seçildiğini doğrulamak da yararlı olabilir, çünkü alfa faktörü durması elütriasyona kıyasla daha kısa bir iyileşme süresi ile ilişkilidir.

Bu yöntem, şu anda desteklenen hücre döngüsü faz verilerinin türleri açısından da sınırlıdır. Bununla birlikte, CLOCCS esnektir ve diğer veri türlerini destekleyecek şekilde uyarlanabilir. Örneğin, CLOCCS daha önce hücre döngüsü faz tanımlayıcıları olarak kullanılmak üzere iğ kutup gövdelerinin, miyozin halkalarının ve çekirdeklerin11'in hücre döngüsü floresan etiketlemesini destekleyecek şekilde uyarlanmıştır. Ayrıca, CLOCCS'nin S. cerevisiae dışındaki türlerle kullanımı mümkün olmuştur. CLOCCS, septasyon indekslerini S. pombe14'teki hücre döngüsü fazı için bir belirteç olarak ve ayrıca birçok tür15 için kolayca toplanabilen akış-sitometrik DNA içeriği verileri olarak kabul eder. Bu, tamamen farklı iki tür için hücre döngüsünün aynı aşamasındaki deneysel verilerin karşılaştırılmasına izin verir ve evrim boyunca hücre döngüsündeki değişiklikler hakkında fikir verebilir.

Bu yaşam çizgisi hizalama yöntemiyle yalnızca desteklenen hücre döngüsü faz verileri biçimleri kullanılabilse de, bu yöntem kullanılan zaman serisi deneysel verilerinin türünden bağımsızdır. Bu protokolde, tek bir genin gen ekspresyonunun yanı sıra yüzlerce gen için zaman serisi transkriptomik verilerinin art arda hizalanmasında kullanımını gösterdik. Bu yöntemin platformlar arasında karşılaştırma yapmak ve böylece RNA-seq veri kümeleri ile benzer koşullarda alınan mikrodizi veri kümeleri arasında karşılaştırmalar yapmak için kullanılabileceğini gösterdik. Ayrıca, bu yöntemin, elütriye edilmiş bir veri kümesi (Koşul 1 Mikrodizi) ile alfa faktörü tutuklanmış bir veri kümesi (Koşul 1 RNA-seq) arasında karşılaştırma yaparak veri kümelerini farklı senkronizasyon yöntemleriyle hizalamak için kullanılabileceğini gösterdik. Daha önce, CLOCCS, mRNA dinamikleri ile karşılık gelen proteinin dinamikleri arasında doğrudan karşılaştırmalara izin veren, tomurcuklanan hücre döngüsü faz verileri22'yi kullanarak zaman serisi transkriptomik ve zaman serisi proteomik verilerini hizalamak için de kullanılmıştır. CLOCCS ayrıca, S. cerevisiae ve S. pombe14 arasındaki hizalama ve S. cerevisiae'nin ilk döngüsü ile patojenik maya Cryptococcus neoformans21 arasındaki hizalama gibi türler arasındaki zaman serisi verilerini hizalamak için de kullanılmıştır. Son olarak, CLOCCS hizalaması şu anda hücre döngüsü zaman serisi verileri için spesifiktir ve henüz diğer ritmik süreç türleriyle kullanılmak üzere uyarlanmamıştır. Bunun özellikle ilgi çekici olacağı bir alan, sirkadiyen zamanın (BT) geleneksel olarak deneyleri hizalamak için kullanıldığı, ancak uygulamasının tutarlı bir şekilde uygulanmadığı sirkadiyen ritimler içindir. Bir başka ilgi alanı, sıtma parazitininkiler gibi gelişimsel ritimleri araştırmaktır. Örneğin, Smith ve ark.25'te açıklandığı gibi, Plasmodium falciparum suşlarının farklı periyotlarla hizalanması, suşlar arasında daha ayrıntılı karşılaştırmalara izin verecektir. Bu periyodik süreçlerin karşılaştırma için hizalanması, bu önemli ritmik biyolojik fonksiyonların daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. Bu tür hücre döngüsü karşılaştırmaları, bu protokolde açıklandığı gibi, yaşam çizgisi hizalaması için CLOCCS kullanılarak mümkün kılınmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgments

S. Campione ve S. Haase, Ulusal Bilim Vakfı (DMS-1839288) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (5R01GM126555) tarafından finanse edildi. Ek olarak, yazarlar makale hakkındaki yorumları ve protokolün beta testi için Huarui Zhou'ya (Duke Üniversitesi) teşekkür eder. Ayrıca Francis Motta (Florida Atlantik Üniversitesi) ve Joshua Robinson'a Java koduyla ilgili yardımları için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2x PBS For Fixative Solution. Described in Leman 2014.
4% formaldehyde For Fixative Solution.
100% Ethanol For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002.
CLOCCS https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow Cytometer For flow cytometry protocol.
Git https://git-scm.com/
Java 19 https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
Microscope For counting cells and buds.
Miniconda https://docs.conda.io/en/latest/
Protease solution For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
RNAse A solution For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid Stain Invitrogen S7020 For flow cytometry staining. Described in Haase 2002.
Tris pH 7.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
  2. Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
  3. Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
  4. Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
  5. Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
  6. Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
  7. Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
  8. Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
  9. Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
  10. Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
  11. Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
  12. Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
  13. Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
  14. Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
  15. Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
  16. Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
  17. Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
  18. Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
  19. Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
  20. Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
  21. Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453 (2016).
  22. Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
  23. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  24. Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
  25. Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 196 Hizalama zaman serisi transkriptomik senkronizasyon hücre döngüsü akış sitometrisi modeller yazılım
Çapraz deney karşılaştırmaları için hücre döngüsü senkron modelinin karakterizleştirici kaybı kullanılarak senkronize zaman serisi verilerinin hizalanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Campione, S. A., Kelliher, C. M.,… More

Campione, S. A., Kelliher, C. M., Orlando, D. A., Tran, T. Q., Haase, S. B. Alignment of Synchronized Time-Series Data Using the Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony Model for Cross-Experiment Comparisons. J. Vis. Exp. (196), e65466, doi:10.3791/65466 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter