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Biology

Allineamento di dati di serie temporali sincronizzati utilizzando il modello caratterizzante della perdita di sincronia del ciclo cellulare per confronti cross-experiment

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65466
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1
1Department of Biology, Duke University, 2Department of Biology, University of Massachusetts, 3Orlando Data Science LLC, 4Department of Computer Science, Duke University

Summary

Una sfida nell'analizzare gli esperimenti sincronizzati di serie temporali è che gli esperimenti spesso differiscono nella durata del recupero dalla sincronia e nel periodo del ciclo cellulare. Pertanto, le misurazioni di diversi esperimenti non possono essere analizzate in forma aggregata o facilmente confrontate. Qui, descriviamo un metodo per allineare gli esperimenti per consentire confronti specifici di fase.

Abstract

Lo studio del ciclo cellulare spesso dipende dalla sincronizzazione delle popolazioni cellulari per misurare vari parametri in una serie temporale mentre le cellule attraversano il ciclo cellulare. Tuttavia, anche in condizioni simili, gli esperimenti replicati mostrano differenze nel tempo necessario per recuperare dalla sincronia e attraversare il ciclo cellulare, impedendo così confronti diretti in ogni punto temporale. Il problema di confrontare le misurazioni dinamiche tra gli esperimenti è esacerbato nelle popolazioni mutanti o in condizioni di crescita alternative che influenzano il tempo di recupero della sincronia e / o il periodo del ciclo cellulare.

Abbiamo precedentemente pubblicato un modello matematico parametrico chiamato Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) che monitora come le popolazioni sincrone di cellule si liberano dalla sincronia e progrediscono attraverso il ciclo cellulare. I parametri appresi dal modello possono quindi essere utilizzati per convertire i punti temporali sperimentali da esperimenti di serie temporali sincronizzati in una scala temporale normalizzata (punti della linea di vita). Piuttosto che rappresentare il tempo trascorso in minuti dall'inizio dell'esperimento, la scala della linea di vita rappresenta la progressione dalla sincronia all'ingresso del ciclo cellulare e quindi attraverso le fasi del ciclo cellulare. Poiché i punti vitali corrispondono alla fase della cellula media all'interno della popolazione sincronizzata, questa scala temporale normalizzata consente confronti diretti tra esperimenti, compresi quelli con periodi e tempi di recupero variabili. Inoltre, il modello è stato utilizzato per allineare gli esperimenti sul ciclo cellulare tra diverse specie (ad esempio, Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe), consentendo così il confronto diretto delle misurazioni del ciclo cellulare, che possono rivelare somiglianze e differenze evolutive.

Introduction

Le misurazioni di serie temporali effettuate su popolazioni sincronizzate di cellule mentre progrediscono attraverso il ciclo cellulare sono un metodo standard per studiare i meccanismi che controllano la progressione del ciclo cellulare 1,2,3,4,5,6,7,8 . La capacità di effettuare confronti tra esperimenti di sincronia / rilascio di serie temporali è vitale per la nostra comprensione di questi processi dinamici. L'uso di esperimenti replicati per corroborare i risultati può aumentare la fiducia nella riproducibilità delle conclusioni. Inoltre, i confronti tra le condizioni ambientali, tra i mutanti e persino tra le specie possono rivelare molte nuove intuizioni sulla regolazione del ciclo cellulare. Tuttavia, la variabilità intersperimentale nel recupero dalla sincronia e nella velocità di progressione del ciclo cellulare compromette la capacità di effettuare confronti punto-tempo-a-punto tra repliche o tra esperimenti con tempi alterati del ciclo cellulare. A causa di queste sfide, le repliche spesso non sono incluse per le serie temporali complete (ad esempio, Spellman et al.4). Quando vengono raccolte le repliche per l'intera serie temporale, i dati non possono essere analizzati in forma aggregata, ma piuttosto una singola replica viene utilizzata per l'analisi e altre repliche sono spesso relegate a cifre supplementari (ad esempio, Orlando et al.8). Inoltre, i confronti tra esperimenti con diverse caratteristiche di recupero o progressione del ciclo cellulare sono difficili. Le misurazioni di intervalli più piccoli tra un evento di interesse e un punto di riferimento del ciclo cellulare (ad esempio, emergenza delle gemme, ingresso della fase S o insorgenza dell'anafase) possono aiutare a ridurre gli errori se questi eventi di riferimento sono tracciati 1,2,3,9,10,11,12. Tuttavia, differenze sottili ma importanti possono rimanere inosservate o oscurate utilizzando questi metodi ad hoc. Infine, le analisi a singola cellula consentono di analizzare la progressione del ciclo cellulare senza fare affidamento sulla sincronizzazione o sull'allineamento13, sebbene le misurazioni su larga scala negli studi a singola cellula possano essere impegnative e costose.

Per superare queste difficoltà, abbiamo sviluppato il modello CLOCCS (Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony) per aiutare l'analisi delle misurazioni di serie temporali effettuate su popolazioni sincronizzate14,15. CLOCCS è un modello matematico flessibile che descrive la distribuzione delle cellule sincronizzate attraverso le fasi del ciclo cellulare mentre vengono rilasciate dalla sincronia e progrediscono attraverso il ciclo cellulare. La struttura del processo di ramificazione consente al modello di spiegare le qualità asimmetriche delle cellule madri e figlie dopo la divisione, come osservato in S. cerevisiae, pur essendo utile per gli organismi che si dividono per fissione, come S. pombe. Il modello può prendere input da una serie diversificata di tipi di misurazione per specificare la fase del ciclo cellulare. Può ingerire dati di fase del ciclo cellulare in erba, che includono misurazioni della percentuale di cellule gemmate nel tempo, consentendo la stima del numero di cellule al di fuori della fase G1 non gemmata14,15. Il modello può anche acquisire dati citometrici a flusso che misurano il contenuto di DNA, consentendo così la valutazione delle transizioni di riferimento da G1 a S, S a G2 e da M a G115. I marcatori morfologici fluorescenti possono anche essere utilizzati per identificare la fase del ciclo cellulare. La marcatura fluorescente degli anelli della miosina, dei nuclei e dei corpi dei poli del fuso (SPB) può essere utilizzata per determinare la fase del ciclo cellulare, e questi sono stati incorporati nel modello CLOCCS11; Tuttavia, queste misurazioni non saranno descritte in questo protocollo. Inoltre, l'indice di settazione è stato utilizzato come input per la modellazione dei dati di S. pombe14. Pertanto, il modello può essere utilizzato per analisi del ciclo cellulare in una varietà di organismi e può essere ulteriormente ampliato.

CLOCCS è un modello parametrico che consente l'inferenza bayesiana completa di più parametri dai dati di input (ad esempio, percentuale di gemmazione, contenuto di DNA). Questi parametri includono il tempo di recupero dalla sincronia, la lunghezza del periodo del ciclo cellulare (stimato separatamente per le cellule madri e figlie) e la posizione media del ciclo cellulare delle cellule in ciascun punto temporale. Questi parametri rappresentano il comportamento della cellula media nella popolazione, consentendo al ricercatore di mappare ogni punto temporale una posizione del ciclo cellulare espressa come punto di vita. La conversione in punti linea vita dipende dai parametri CLOCCS lambda (λ) e mu0 (μ0)14,15. Il parametro λ corrisponde al periodo medio del ciclo cellulare delle cellule madri. Tuttavia, a causa del ritardo madre-figlia14,15, questo non è il periodo medio del ciclo cellulare dell'intera popolazione che include sia le cellule madri che quelle figlie. CLOCCS deduce inoltre il parametro delta (δ), che corrisponde al ritardo madre-figlia e, quindi, consente il calcolo del periodo medio del ciclo cellulare dell'intera popolazione. Infine, poiché ogni esperimento inizia dopo il rilascio dalla sincronizzazione del ciclo cellulare, il tempo necessario per il ripristino dal metodo di sincronizzazione è rappresentato dal parametro CLOCCS μ0. CLOCCS adatta un modello ai dati di fase del ciclo cellulare di input e quindi deduce questi parametri utilizzando un algoritmo Monte Carlo a catena di Markov a camminata casuale14,15. Mappando più esperimenti su una scala temporale comune del ciclo di vita cellulare, è possibile effettuare confronti diretti specifici di fase tra repliche o esperimenti in cui il tempo di recupero o i periodi del ciclo cellulare non sono identici 8,14,15.

Poiché le popolazioni sincronizzate perdono sincronia ad un certo ritmo nel corso delle serie temporali14,15,16,17, la variabilità nel tasso di perdita di sincronia può anche impedire confronti quantitativi tra esperimenti. Identificando la posizione delle popolazioni e la varianza nelle loro distribuzioni, CLOCCS tiene conto delle differenze nei tassi di perdita di sincronia. Questo potente strumento consente confronti specifici e dettagliati tra esperimenti, fornendo così la possibilità di effettuare direttamente confronti rilevanti non solo tra repliche ma anche tra condizioni ambientali, mutanti e persino specie che hanno tempi del ciclo cellulare drammaticamente diversi14,15.

Questo documento descrive un metodo che utilizza CLOCCS per stimare i parametri adattando i dati da esperimenti di serie temporali di sincronia/rilascio, mappare i dati su una scala di linea di vita comune e quindi effettuare confronti pertinenti tra repliche o esperimenti. L'allineamento della linea di vita consente confronti diretti specifici di fase tra questi esperimenti, che consentono l'aggregazione e il confronto delle repliche e di effettuare confronti più pertinenti tra esperimenti con diversi tempi di recupero e periodi del ciclo cellulare.

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Protocol

1. Raccolta della fase del ciclo cellulare e dei dati sperimentali

  1. Sincronizzare le cellule rispetto al ciclo cellulare usando il metodo di sincronizzazione desiderato (ad esempio, elutriazione centrifuga come descritto in Leman et al.18 o arresto del feromone di accoppiamento come descritto in Rosebrock 19; sia Leman et al.18 che Rosebrock 19 includono anche metodi per il rilascio dalla sincronia). Iniziare il campionamento in tutte le serie temporali, assicurandosi che la serie temporale sia lunga almeno due periodi di ciclo cellulare completo e, in modo ottimale, raccogliere almeno 10 campioni per ciclo cellulare. In ogni punto temporale, raccogliere un campione per i dati di fase del ciclo cellulare (gemmazione o citometria a flusso) e un campione per i dati sperimentali, come descritto di seguito.
  2. Se si utilizzano dati di gemmazione come dati di fase del ciclo cellulare, raccogliere dati sul germogliamento per l'allineamento CLOCCS.
    1. Esempio in tutte le serie temporali. Per ogni punto temporale, raccogliere le cellule e fissarle mescolando 200 μL di coltura cellulare sonicata con 200 μL di soluzione fissativa, come descritto in Leman et al.18.
    2. Per il germogliamento standard, contare almeno 200 cellule per punto temporale utilizzando un microscopio a luce trasmessa con un obiettivo 40x e un emocitometro. Aggiungere il campione di cellule dal punto 1.2.1 all'emocitometro e diluire se la densità impedisce il conteggio. Registrare il numero di celle gemmate e non gemmate in ogni punto temporale. Calcola la percentuale di celle gemmate e traccia ogni punto temporale in una curva in erba.
      NOTA: sono disponibili altri metodi per specificare le informazioni sulla fase del ciclo cellulare, ma questi non sono descritti in questo protocollo. Gli altri metodi sono descritti nel readme del CLOCCS e in un precedente lavoro11.
  3. Se si utilizzano dati sul contenuto di DNA citometrico a flusso come dati della fase del ciclo cellulare, raccogliere i dati di colorazione del DNA della citometria a flusso per l'allineamento CLOCCS citometrico a flusso.
    1. Esempio in tutte le serie temporali. Per ogni punto temporale, raccogli le celle e correggile come descritto in Haase e Reed20.
    2. Colorare il DNA e analizzarlo utilizzando l'analisi citometrica a flusso standard. Un protocollo di colorazione raccomandato per S. cerevisiae è descritto in Haase e Reed20.
  4. Raccogliere omics associati o dati sperimentali correlati. Per i dati trascrittomici standard, raccogliere come descritto in Leman et al.18 e Kelliher et al.21,22. Assicurarsi che i dati siano associati a punti temporali contenenti dati di fase del ciclo cellulare per consentire l'allineamento a valle. Per un allineamento ottimale, assicurarsi che a ogni punto temporale contenente dati sperimentali siano associati anche dati di fase.
    NOTA: I dati sperimentali possono assumere molte forme. Tradizionalmente, utilizziamo il metodo di allineamento descritto per allineare gli esperimenti trascrittomici di serie temporali. Tuttavia, qualsiasi tipo di dati associati ai punti temporali può essere allineato (ad esempio, proteomica22).

2. Installazione del software richiesto

Nota : in questa sezione si presuppone che Conda, Java 19 e Git siano già installati (Tabella dei materiali).

  1. Scarica il repository CLOCCS_alignment inserendo il seguente comando nel terminale:
    git clone git clone https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
  2. Creare un ambiente Conda utilizzando il file conda_req.yml inserendo il seguente comando nel terminale nella cartella in cui è stato clonato il repository CLOCCS_alignment:
    conda env create -f conda_req.yml

3. Utilizzo di CLOCCS per parametrizzare gli esperimenti

  1. Fare doppio clic sul file cloccs_v2023.jar nella cartella CLOCCS nel repository CLOCCS_alignment e attendere l'apertura di un'interfaccia utente grafica. Questa schermata consente di immettere le opzioni per l'esecuzione di CLOCCS e visualizza i risultati una volta eseguita.
  2. Inserisci le impostazioni generali.
    1. Impostate Ricottura Sim, Masterizza e Iterazioni digitando le caselle di input di testo associate. Sim Anneal (ricottura simulata) identifica i buoni valori dei parametri di partenza, Burn In cerca le modalità posteriori e la fase finale consente di trarre tutte le inferenze posteriori. Valori più alti aumentano il tempo di esecuzione ma aumentano anche la precisione.
    2. Immettere le condizioni sperimentali specificando la temperatura in gradi Celsius e il metodo di sincronizzazione utilizzando la casella di testo denominata Temperatura e il menu a discesa Synchro. Metodo, rispettivamente.
    3. Facoltativamente, configurare le impostazioni avanzate nel menu Impostazioni avanzate. Le impostazioni avanzate consentono di impostare i priori per ciascuno dei parametri ("mu0", "sigma0", "sigmav", "lambda", "bud.start", "bud.end").
      Nota : ulteriori informazioni relative alle impostazioni avanzate sono disponibili nel file Leggimi.txt nella cartella CLOCCS del repository CLOCCS_alignment.
  3. Immettere le impostazioni da utilizzare con i dati in erba.
    1. Scegliete la selezione appropriata dal menu a discesa Tipo modello . L'opzione predefinita Bud è per le informazioni standard sul germogliamento per il lievito in erba.
      NOTA: nel menu a discesa sono presenti anche altre opzioni più avanzate: Mutante per informazioni sul germogliamento per i mutanti che subiscono più cicli di gemmazione senza divisione, BudSSLSMR per informazioni sul germogliamento e informazioni aggiuntive sul corpo del palo del fuso e sull'anello della miosina e BudNucDivNeck per informazioni sul germogliamento e ulteriori informazioni sulla divisione e sui nuclei del collo del germoglio. Queste opzioni avanzate sono descritte nel file CLOCCS readme e nel lavoro precedente11,14,15.
    2. Importare i dati utilizzando il pannello Importazione dati digitando nelle caselle di input di testo o caricando un file facendo clic sul pulsante Seleziona file . La prima colonna specifica i punti temporali. Le due colonne rimanenti specificano i dati di gemmazione e possono assumere una delle seguenti opzioni: il numero di celle non budded (No Budded ), il numero di budded cells (Bud) o il numero totale di celle (Totale).
  4. Immettere le impostazioni da utilizzare con i dati citometrici a flusso. Per ogni esperimento, eseguire il passaggio 3.3 o il passaggio 3.4.
    NOTA: i dati citometrici a flusso e i dati di gemmazione possono essere utilizzati insieme. Anche se in precedenza abbiamo descritto l'esecuzione insieme15, per questo strumento, devono essere eseguiti in modo indipendente e quindi confrontati.
    1. Convertire i file .fcs nel formato di input CLOCCS corretto per la citometria a flusso seguendo le istruzioni nel file supplementare 1 (che si trova anche nel repository CLOCCS_alignment come CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt).
    2. Selezionate la selezione Flusso (Flow ) dal menu a discesa Tipo di modello (Model Type ).
    3. Importate i dati utilizzando il pannello Importazione dati. Fare clic su Seleziona file e selezionare il file generato nel passaggio 3.4.1.
    4. Selezionare i punti temporali per i quali deve essere tracciato un adattamento CLOCCS citometrico a flusso selezionando i punti temporali nella casella Tempi per raccordo .
  5. Una volta selezionati tutti gli ingressi per la citometria in gemmazione o a flusso, fare clic sul pulsante Applica , quindi fare clic sul pulsante Campione nella parte superiore dello schermo.
  6. Visualizzare la curva di gemmazione o i grafici di citometria a flusso con gli adattamenti previsti selezionando la scheda Fit previsti . Questa scheda si apre per impostazione predefinita subito dopo il passaggio precedente.
  7. Visualizzare gli istogrammi dei parametri per ciascun parametro selezionando la scheda Istogrammi dei parametri e quindi selezionando la sottoscheda corrispondente al parametro di interesse tra le seguenti opzioni: mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end, ecc.
  8. Visualizzare il grafico del punteggio posteriore selezionando la scheda Punteggio posteriore .
  9. Visualizzare le impostazioni e modificarle ulteriormente selezionando la scheda Impostazioni ; visualizzare il registro delle esecuzioni precedenti selezionando la scheda Log .
  10. Ottenere i parametri CLOCCS dall'adattamento selezionando la scheda Parametri posteriori . La tabella risultante avrà la seguente forma: ogni riga è costituita da un parametro, con la riga finale che è la posteriore. Le colonne sono costituite dal parametro previsto per la media, dall'intervallo di confidenza inferiore del 2,5%, dall'intervallo di confidenza superiore del 97,5% e dal tasso di accettazione.
    1. Registrare i parametri utilizzati per l'allineamento per ogni esperimento: il tempo di recupero dalla sincronia (μ0) e il periodo medio del ciclo cellulare delle cellule madri (λ).
    2. Calcolare il periodo del ciclo cellulare calcolando la media del periodo della cellula madre (λ) e del periodo della cellula figlia (λ + δ), dove δ è il ritardo specifico della figlia.
      NOTA: Ripetere la sezione 3 con tutti gli esperimenti da includere nei confronti.

4. Conversione di punti temporali in punti vita utilizzando le funzioni di conversione Python e i parametri CLOCCS

NOTA: la conversione tra punti temporali e punti linea vita richiede due formule di conversione21. Un'implementazione Python per la conversione e la visualizzazione dei dati è disponibile nel repository CLOCCS_alignment e descritta di seguito.

  1. Attivare l'ambiente Conda inserendo il seguente comando nel terminale: conda activate CLOCCS_alignment
  2. Apri un notebook Python interattivo digitando il seguente comando nel terminale: jupyter notebook
  3. Creare un nuovo notebook Python nella cartella desiderata.
    NOTA: è stato incluso un blocco appunti di esempio per dimostrare l'utilizzo standard ed è disponibile in Alignment/JOVE_example.ipynb nel repository di allineamento CLOCCS_.
  4. Importare il file Python contenente le funzioni di allineamento eseguendo il seguente comando nella prima cella:
    %run path_to_repo/cloccs_alignment/Alignment/utilities.py
    1. Sostituire il percorso del repository CLOCCS_alignment con path_to_repo.
  5. Se utilizzate dati di gemmazione come dati della fase del ciclo cellulare, importate un frame di dati contenente la percentuale di spostamento in corrispondenza di ogni punto temporale eseguendo il comando seguente in una nuova cella:
    budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Sostituire il percorso e il nome del file appropriati. Se il file è un file .csv, rimuovere sep ="\t"
  6. Se si utilizzano dati di gemmazione come dati di fase del ciclo cellulare, allineare i dati di gemmazione a una scala temporale del punto di vita immettendo la seguente funzione in una nuova cella:
    aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, timepoints, param_mu0, param_lambda)
    1. Per i timepoint, sostituisci un elenco dei punti temporali come indice del frame di dati budding_df.
    2. Per param_mu0 e param_lambda, sostituire i parametri appresi dal CLOCCS in erba eseguito nella sezione 3 per l'esperimento.
  7. Se si utilizzano i dati della citometria a flusso, importare i dati della citometria a flusso eseguendo il seguente comando in una nuova cella:
    flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
    1. Per flow_input_folder, sostituire il percorso appropriato della cartella contenente i file .fcs di citometria a flusso.
  8. Se si utilizzano i dati della citometria a flusso, generare una tabella di conversione tra i punti temporali e i punti della linea di vita per ogni esperimento digitando il seguente comando in una nuova cella:
    flow_converter = convert_tp_to_ll(timepoints, param_mu0, param_lambda)
    1. Per i punti temporali, sostituire un elenco dei punti temporali dai dati di citometria a flusso.
    2. Per param_mu0 e param_lambda, sostituire i parametri appresi dalla citometria a flusso CLOCCS eseguita nella sezione 3 per l'esperimento.
  9. Importare il frame di dati contenente i dati sperimentali nel blocco appunti eseguendo il comando seguente in una nuova cella:
    data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Sostituire il percorso e il nome del file appropriati. Se il file è un file .csv, rimuovere sep ="\t".
      NOTA: questa operazione può essere eseguita per qualsiasi dato tabulare. I dati sperimentali devono semplicemente avere i punti temporali come colonne o indice del frame di dati. I dati di esempio sono disponibili nel repository CLOCCS_alignment.
  10. Allineare i dati sperimentali a una scala temporale dei punti vitali immettendo la seguente funzione in una nuova cella:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, timepoints, param_mu0, param_lambda, interpolate, lowerll, upperll)
    1. Per i timepoint, sostituire un elenco dei punti temporali come indice o le colonne del data_df sperimentale del passaggio precedente.
    2. Per param_mu0 e param_lambda, sostituire i valori ottenuti nella sezione 3 da CLOCCS.
      NOTA: i parametri possono provenire da qualsiasi esecuzione CLOCCS eseguita su uno qualsiasi dei tipi di dati di fase del ciclo cellulare accettati.
    3. Facoltativamente, sostituire Interpola con True o False oppure lasciare vuoto (il valore predefinito è False).
      Nota : quando impostato su False, i dati non verranno interpolati. Se impostato su True, i punti della linea vita verranno arrotondati e interpolati per riempire i valori tra i punti della linea vita, in modo che vi sia un punto per intero nell'intervallo dei punti della linea del vita. Ciò consente un migliore confronto tra i set di dati.
    4. Facoltativamente, sostituire lowerll e upperll con valori None o integer.
      NOTA: se impostato su Nessuno, tutti i punti della linea di vita dopo l'interpolazione vengono mantenuti. Quando vengono forniti numeri interi, questo tronca i dati in modo che i punti della linea di vita vadano dal più basso all'alto. Ciò consente il confronto tra set di dati con un lowerll o upperll diverso.
  11. Scaricare il set di dati allineato alla linea di vita immettendo il comando seguente in una nuova cella: lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
  12. Ripetere i passaggi 4.5-4.11 con tutti gli esperimenti da includere nei confronti.

5. Confronto tra curve di gemmazione e dati di citometria a flusso

  1. Tracciare le curve in erba prima dell'allineamento usando la funzione delle utilità Python immettendo il seguente comando in una nuova cella:
    plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, titolo = str_title)
    1. Sostituite un elenco contenente i frame di dati di tutte le curve di gemme desiderate per il plottaggio per list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2 bud_df3].
    2. Sostituire un elenco di etichette per la legenda-[Esperimento 1, Esperimento 2, Mutante] per leg_list se lo si desidera. In caso contrario, escludere o sostituire Nessuno.
    3. Sostituisci il tempo per str_type.
    4. Se lo si desidera, sostituire il titolo della stringa Confronto Curve in erba con str_title . In caso contrario, sostituire Nessuno o escludere.
  2. Tracciare le curve in erba dopo l'allineamento usando la funzione delle utilità Python seguendo le istruzioni nel passaggio 5.1, ma con un elenco di curve gemmeggianti allineate sostituite per list_of_budding_curves e con la linea di vita per point_type anziché per il tempo.
  3. Per tracciare i dati della citometria a flusso, tracciare i dati associati dai file .fcs nei punti della linea vita corrispondenti utilizzando il convertitore generato nel passaggio 4.8.
  4. Convertire i punti della linea vita nella fase del ciclo cellulare utilizzando la tabella dei convertitori (Tabella 1).
    NOTA: questo può anche essere tracciato seguendo le istruzioni nel passaggio 5.1, ma con fase per point_type anziché tempo.

6. Confronto dei dati sperimentali

  1. Determinare l'elenco dei geni da tracciare nei grafici a linee in base alle informazioni della letteratura o ai geni di interesse per la ricerca.
  2. Usare il plot_linegraph_comparison fornito nel file delle utilità Python per eseguire confronti grafici a linee sul frame di dati originale, allineato o allineato e interpolato digitando il comando seguente in una nuova cella:
    plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelista, point_type = str_type, titolo = str_title)
    1. Sostituire un elenco dei frame di dati degli esperimenti da confrontare per list_of_dfs.
      NOTA: i frame di dati possono essere non allineati o allineati; Tuttavia, il point_type corrispondente deve essere inserito nel punto 6.2.4.
    2. Sostituite un elenco dei titoli per ogni frame di dati nello stesso ordine dell'elenco dei frame di dati per list_for_legend.
    3. Sostituire un elenco dei nomi dei geni (che devono essere inclusi nell'indice dei frame di dati) da tracciare per genelist.
    4. Sostituite il tipo di punto con str_type. Utilizzare la linea di vita (l'impostazione predefinita è la scala dei punti della linea di vita) o la fase (la scala della linea di vita della fase del ciclo cellulare) per i frame di dati allineati nel passaggio 6.2.1 o il tempo per i frame di dati non allineati nel passaggio 6.2.1.
    5. Sostituire un titolo stringa facoltativo per str_title.
  3. Determinare l'elenco dei geni da includere nella mappa di calore utilizzando la letteratura o gli algoritmi per determinare i geni periodici principali.
    NOTA: per un corretto confronto delle mappe di calore, i dati devono essere allineati, interpolati e regolati nella scala temporale nel passaggio 6.2; Dovrebbe avere lo stesso valore di linea di vita iniziale e finale per ogni esperimento.
    1. Eseguire algoritmi di periodicità per determinare i geni periodici principali23,24 o utilizzare i metodi alternativi desiderati per determinare l'elenco dei geni (cioè i risultati della letteratura).
    2. Importare un file di elenco dei geni .csv o .tsv nel blocco appunti utilizzando il comando seguente in una nuova cella:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
    3. Sostituire il percorso e il nome del file appropriati. Se il file è un file .csv, rimuovere sep="\t".
  4. Usare la funzione fornita plot_heatmap_comparison nel file delle utilità Python per eseguire un confronto della mappa termica sul frame di dati allineato, interpolato e allineato in fase digitando il comando seguente in una nuova cella:
    plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelista, titolo = str_title)
    1. Sostituire un elenco dei frame di dati allineati degli esperimenti da confrontare per list_of_dfs.
    2. Sostituite un elenco dei titoli per ogni frame di dati nello stesso ordine dell'elenco dei frame di dati per list_for_legend.
    3. Sostituire un elenco dei nomi dei geni (che devono essere inclusi nell'indice dei frame di dati) da tracciare per genelist.
    4. Sostituire un titolo stringa facoltativo per str_title.
      NOTA: Il primo frame di dati nell'elenco è quello che verrà utilizzato per ordinare i geni nella mappa di calore. I geni saranno ordinati in base al massimo nel primo periodo per quel frame di dati e lo stesso ordine verrà utilizzato per i frame di dati successivi nell'elenco.

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Representative Results

I passaggi descritti nel protocollo di cui sopra e nel flusso di lavoro in Figura 1 sono stati applicati a cinque esperimenti di serie temporali sincronizzati con ciclo cellulare per dimostrare due confronti rappresentativi: tra repliche con diversi metodi di sincronia (feromone di accoppiamento ed elutriazione centrifuga18) e piattaforme di sequenziamento (sequenziamento dell'RNA [RNA-seq] e microarray), nonché in condizioni sperimentali. Sono stati eseguiti più esperimenti con S. cerevisiae e per ogni esperimento sono stati raccolti dati sperimentali e di fase del ciclo cellulare. Il flusso di lavoro prevede l'utilizzo di CLOCCS per parametrizzare i vari esperimenti di serie temporali di sincronia/rilascio, utilizzando questi parametri per allineare gli esperimenti a una scala di linee di vita comparabile comune e quindi utilizzando questi esperimenti allineati per i due confronti rappresentativi.

Per dimostrare il confronto rappresentativo tra le repliche, abbiamo selezionato tre esperimenti eseguiti con lo stesso ceppo e nelle stesse condizioni sperimentali, chiamati Condizione 1. Due di questi esperimenti erano repliche dirette l'uno dell'altro, ed entrambi sono stati analizzati tramite analisi microarray e sincronizzati tramite elutriazione centrifuga. Il terzo esperimento è stato analizzato utilizzando l'analisi RNA-seq e sincronizzato tramite l'arresto del feromone di accoppiamento del fattore alfa. Per dimostrare il secondo confronto tra esperimenti con periodi di ciclo cellulare variabili, l'esperimento RNA-seq della condizione 1 (periodo del ciclo cellulare: 71 min) dall'alto è stato confrontato con la condizione 2 (periodo del ciclo cellulare: 82 min) e la condizione 3 (periodo del ciclo cellulare: 110 min) (tabella 2). Per ogni esperimento, le cellule sono state coltivate nelle rispettive condizioni, sincronizzate, rilasciate e quindi campionate durante due o più periodi di ciclo cellulare. I dati di gemmazione e/o citometria a flusso sono stati raccolti per fornire informazioni sulla fase del ciclo cellulare, e sono stati raccolti dati trascrittomici di microarray o RNA-seq come descritto in Leman et al.18 (Supplemental Table S1).

Per ogni esperimento, i dati hanno assunto le forme descritte nella Figura 2, che presenta l'esperimento della Condizione 2 come esempio per la dimostrazione. Ogni set di dati aveva una curva di gemmazione, che consentiva l'inferenza della fase del ciclo cellulare. Questa curva comprendeva un valore percentuale di gemmazione per ogni punto temporale nella serie temporale, che è stato poi tracciato per produrre una curva in erba che mostra più oscillazioni del ciclo cellulare (Figura 2). I dati della fase del ciclo cellulare hanno anche assunto la forma di dati di colorazione del contenuto di DNA citometrico a flusso per ciascun punto temporale nella serie temporale. Sono stati tracciati i punti temporali selezionati per la condizione 2 (Figura 2). I file di citometria a flusso sono stati combinati in un'unica tabella comprendente le celle in ciascun contenitore di fluorescenza logaritmica per ogni punto temporale per l'immissione nel CLOCCS utilizzando la funzione flow_cytometry_CLOCCS_file_from_fcs nelle utility Python. Ogni set di dati conteneva anche dati sperimentali. In questo caso, i dati erano dati trascrittomici e i dati erano organizzati in righe di geni, ciascuno con un valore per l'abbondanza di RNA in ogni punto temporale dell'esperimento (Figura 2).

Abbiamo dimostrato l'uso di CLOCCS e la conversione in punti vitali per il set di dati RNA-seq Condition 2; Tuttavia, il processo era identico anche per gli altri esperimenti. Le informazioni in erba sono state inserite nell'algoritmo CLOCCS come descritto nella sezione 3 del protocollo e come mostrato nella Figura 3A. Sono stati utilizzati i valori predefiniti per Sim Anneal, Burn In, Iterazioni e Impostazioni avanzate. Sono state selezionate le condizioni sperimentali appropriate. Il tipo di modello di "Bud" è stato utilizzato per i dati in erba. I risultati degli adattamenti in erba CLOCCS sono stati considerati per garantire che le curve di gemmazione fossero correttamente adattate, come dimostrato dai punti dati che si sovrappongono alla corrispondente curva di adattamento con una piccola banda di confidenza del 95% (Figura 3B e Figura supplementare S1). I parametri μ0 e λ della tabella dei parametri posteriori (figura 3C) sono stati registrati per l'utilizzo nell'allineamento. I dati di citometria a flusso per la Condizione 2 sono stati inseriti separatamente in CLOCCS, come descritto nella sezione 3 del protocollo. Attualmente, CLOCCS prevede che i citometri a flusso produrranno dati a 10 bit con 1.024 canali; Tuttavia, i moderni citometri a flusso possono avere più canali. Poiché il nostro citometro a flusso produce dati con oltre 1.024 canali, i dati sono stati raggruppati in 1.024 contenitori. Con i dati di fase del ciclo cellulare della citometria a flusso, CLOCCS produce un adattamento CLOCCS per ogni punto temporale selezionato (Figura 3D e Figura supplementare S2) e fornisce una tabella dei parametri posteriori simile alla tabella dei parametri posteriori in erba nella Figura 3C. I parametri per il germogliamento che CLOCCS esegue per ciascuno degli altri esperimenti sono descritti nella Tabella 2 e i parametri per la citometria a flusso eseguita da CLOCCS sono descritti nella Tabella supplementare S2.

I parametri CLOCCS corrispondenti al periodo del ciclo cellulare delle cellule madri (λ) e al tempo di recupero (μ0) sono stati utilizzati per l'allineamento della linea vitale. È importante notare che λ non rappresenta necessariamente il periodo medio del ciclo cellulare della popolazione cellulare. Nei casi in cui le cellule subiscono una divisione completa, ci sono un numero uguale di cellule madri e figlie, quindi il periodo medio del ciclo cellulare è la media tra il periodo del ciclo cellulare delle cellule madri (λ) e il periodo del ciclo cellulare delle cellule figlie (λ + δ); In particolare, delta (δ) è la durata del ritardo specifico della figlia. Questo è il calcolo che abbiamo usato per il periodo del ciclo cellulare per ogni esperimento (Tabella 2). Per ogni esperimento, i parametri corrispondenti λ e μ0 sono stati quindi utilizzati nella funzione di conversione, df_conversion_from_parameters, fornita nel file di utilità Python, come dimostrato per la condizione 2 (Figura 4A). Per le curve in erba, i dati non sono stati interpolati. Tuttavia, per i dati sperimentali, i set di dati allineati alla linea vitale sono stati ricampionati utilizzando l'interpolazione in modo tale che ogni punto della linea di vita contenesse dati interpolati per migliorare la tracciatura. Per garantire che i set di dati allineati alla linea vita avessero lo stesso intervallo di punti della linea vita, sono stati impostati limiti inferiori e superiori della linea di vita per troncare i dati in tali punti. Questi parametri lowerll e upperll sono stati inseriti nella funzione df_conversion_from_parameters quando l'interpolazione è stata impostata su True. Per il confronto della condizione 1, sono stati impostati rispettivamente su 44 e 270 per tutti i set di dati e per il confronto tra le condizioni ambientali, sono stati impostati rispettivamente su 50 e 300. Un esempio di utilizzo di queste funzioni per l'allineamento e il confronto può essere visto nel notebook Python di esempio JOVE_example.ipynb e il codice utilizzato per generare le figure può essere visto nel notebook JOVE_Figures.ipynb nel repository CLOCCS_alignment.

Questa conversione da punti temporali a punti linea vita dipende da due formule21 (Figura 4A) che utilizzano μ0 (tempo di recupero) e λ (periodo madre). La prima formula, , Equation 1è la formula della fase di recupero (Figura 4A). Questa formula viene utilizzata solo per i punti temporali all'interno della fase di ripristino, che consiste nei punti temporali fino a μ 0inclusi, poiché μ0 corrisponde al tempo di recupero. I punti temporali vengono quindi convertiti in un intervallo di scala della linea di vita che termina con 100 punti della linea di vita (Tabella 1), segnando la fine della fase di recupero e l'inizio del primo ciclo cellulare. La fase di post-recupero utilizza la seconda formula, Equation 2 (Figura 4A), che converte ogni successivo punto temporale post-recupero in un punto di linea di vita dopo 100. Ogni successivo 100 punti della linea di vita corrisponde a un nuovo ciclo cellulare, con il primo ciclo corrispondente ai punti della linea di vita da 100 a 200, il secondo ciclo corrispondente ai punti della linea vita da 200 a 300 e così via (Tabella 1). La conversione da punti temporali a punti vitali viene applicata a ciascun set di dati singolarmente utilizzando i parametri CLOCCS corrispondenti per quel set di dati. Dopo che ogni set di dati è stato convertito nella scala della linea di vita, le fasi del ciclo cellulare vengono allineate, il che consente confronti specifici di fase tra i set di dati.

La tabella 3 mostra la conversione di punti temporali selezionati nei rispettivi punti della linea di vita per la conversione rappresentativa del set di dati della condizione 2 utilizzando i parametri dell'esecuzione CLOCCS in erba. I dati di gemmazione raccolti dalla condizione 2 RNA-seq sono stati tracciati in una curva di gemmazione che mostra la percentuale di germogliamento nel tempo sia per la scala temporale non allineata in minuti (Figura 4B) che per la scala temporale allineata in punti della linea di vita (Figura 4C) utilizzando la funzione Python plot_budding_curves in un notebook Python. I punti della linea di vita potevano essere facilmente convertiti in informazioni sulla fase sperimentale e del ciclo cellulare (Tabella 1), e la fase di recupero e i cicli dalla prima alla terza cella erano codificati a colori a mano di conseguenza (Figura 4B, C). Poiché ogni punto della linea di vita corrispondeva a una fase del ciclo cellulare, i singoli grafici di citometria a flusso potevano essere etichettati tramite le funzioni Python utilizzando la fase del ciclo cellulare determinata dall'allineamento della linea vitale. Queste fasi corrispondevano alle fasi determinate tramite analisi citometrica a flusso per la condizione 2. I dati di citometria a flusso raccolti per il set di dati della condizione 2 sono stati tracciati per punti temporali selezionati ed etichettati utilizzando la fase del ciclo cellulare determinata dall'allineamento della linea di vita della citometria a flusso. In ogni caso, i dati corrispondevano alla fase determinata dall'allineamento (Figura 4D).

È importante notare che il livello di espressione di ciascun gene per ciascun campione rimane lo stesso, ma l'etichettatura dei punti temporali viene modificata dal tempo in minuti ai punti della linea vita. Tuttavia, la conversione non è lineare. La fase di recupero, evidenziata in grigio, occupa una percentuale maggiore del tempo sperimentale una volta eseguita la conversione in punti vita (Figura 4B,C). Il vantaggio della scala della linea vita è che consente informazioni dettagliate sulle fasi e confronti di fase tra esperimenti. Le informazioni di fase sono contenute nei punti della linea vita, come descritto sopra e visualizzato nella Tabella 1. Inoltre, G1 è contenuto nei primi 15,5 punti della linea di vita di ciascun ciclo cellulare, S nei successivi 20 punti della linea di vita e G2 / M nei successivi 64,5 punti della linea di vita (Tabella 1). Tuttavia, questo vincola artificialmente il tempo di recupero allo stesso intervallo di tempo di ogni ciclo di celle consecutivo, anche se la fase di recupero appare molto breve nella scala temporale originale. Questo non oscura i confronti, perché le fasi di ogni esperimento sono allineate. Nella maggior parte dei casi, è più rilevante confrontare i dati in punti che si verificano nella stessa fase sperimentale e biologica piuttosto che in punti temporali che si verificano nello stesso momento in minuti.

Una volta che tutti gli esperimenti sono stati convertiti nella scala della linea di vita allineata utilizzando le funzioni Python fornite nel file delle utilità Python, possono essere confrontati. Qui, dimostriamo due confronti comuni tra esperimenti: uno tra repliche di un esperimento simile tra piattaforme e metodi di sincronizzazione (Figura 5) e uno tra diverse condizioni sperimentali con una lunghezza del periodo variabile (Figura 6 e Figura 7). Come descritto sopra, il primo confronto riguarda due repliche di microarray elutriate e un esperimento di RNA-seq sincronizzato con fattore alfa. Prima dell'allineamento, le due repliche del microarray mostravano dinamiche di sincronia e ciclo cellulare simili, ma la replica del microarray 2 della condizione 1 appariva leggermente ritardata (Figura 5A). La differenza più evidente è stata riscontrata confrontando i set di dati non allineati; il secondo ciclo RNA-seq della condizione 1 è apparso allineato con il primo ciclo dei due esperimenti di microarray. La differenza probabilmente non era correlata alle diverse piattaforme trascrittomiche, ma piuttosto ai diversi metodi di sincronizzazione. Le popolazioni cellulari negli esperimenti di microarray sono state sincronizzate mediante elutriazione centrifuga, mentre la popolazione per l'esperimento RNA-seq è stata sincronizzata da un trattamento con feromoni di accoppiamento. Infatti, la sincronizzazione con il feromone di accoppiamento ha ridotto sostanzialmente il tempo di recupero rispetto all'elutriazione (Figura 5A e Tabella 2).

Nonostante le ovvie differenze tra le repliche quando tracciate in termini di tempo trascorso, dopo l'allineamento della linea vita, le curve erano quasi identiche e sono stati resi possibili confronti più dettagliati e pertinenti tra le repliche (Figura 5B). La fase di recupero è stata allineata in modo che ogni esperimento iniziasse nello stesso punto della linea di vita e le variazioni nel periodo fossero normalizzate dall'allineamento della linea di vita. A causa dell'allineamento, i valori sperimentali nello stesso punto della linea di vita attraverso le repliche si sono verificati nella stessa fase del ciclo cellulare, consentendo così il calcolo della varianza sperimentale tra le repliche. Le fasi di recupero e ciclo cellulare sono etichettate nella Figura 5B per fornire ulteriori informazioni sulle fasi del ciclo cellulare in ciascuno degli esperimenti. Questo allineamento della linea di vita potrebbe quindi essere applicato al set di dati sperimentale (Figura 5C,D) utilizzando la funzione Python df_conversion_from_parameters fornita nel file di utilità, come descritto sopra.

Nella Figura 5D, i dati trascrittomici sono stati allineati e le dinamiche di espressione per il gene CDC20 sono state tracciate utilizzando la funzione Python plot_linegraph_comparison in un notebook Python. Prima dell'allineamento, sembrava che la prima espressione di picco degli esperimenti di microarray fosse allineata con il secondo picco dell'esperimento RNA-seq (Figura 5C); tuttavia, dopo l'allineamento, i primi picchi del ciclo cellulare di ciascun set di dati sono stati allineati correttamente (Figura 5D). Inoltre, la larghezza del picco degli esperimenti sembrava differire tra il set di dati RNA-seq e i set di dati di microarray, ma dopo l'allineamento, la larghezza del picco era più allineata (Figura 5C, D).

Il secondo confronto è tra esperimenti in diverse condizioni ambientali con diversi periodi del ciclo cellulare (Figura 6). Come descritto sopra, qui, abbiamo confrontato i set di dati di S. cerevisiae nella condizione 1 con la condizione 2 e la condizione 3, che corrispondono a periodi di ciclo cellulare di 71, 82 e 110 minuti, rispettivamente. Queste differenze nel periodo del ciclo cellulare hanno introdotto incertezza quando si confrontano gli esperimenti prima dell'allineamento di fase del ciclo cellulare, come mostrato nelle curve di gemmazione non allineate. Le differenze di periodo sono visibili nelle curve di gemmazione non allineate (Figura 6A). Tuttavia, quando sono stati allineati con CLOCCS utilizzando questo protocollo, le tre curve sembravano notevolmente simili, rendendo così possibili confronti di dati sperimentali (Figura 6B).

Utilizzando i parametri CLOCCS della citometria a flusso, la condizione 1 e la condizione 2 sono state allineate a una scala di linea di vita comune e gli istogrammi del contenuto di DNA sono stati tracciati nella condizione 2 e in punti equivalenti della linea di vita nella condizione 1. Sono state confrontate le misurazioni citometriche a flusso del contenuto di DNA attraverso i punti della linea di vita (Figura 6C). Poiché le misurazioni del contenuto di DNA non erano continue e non facilmente interpolabili, abbiamo potuto confrontare solo i punti vitali più vicini. I dati della fase del ciclo cellulare per ciascun punto della linea di vita comparabile non erano identici tra le due condizioni (Figura 6C), il che indica che il CLOCCS si adatta e i parametri risultanti erano probabilmente leggermente disallineati per la condizione 1. Ciò era probabilmente dovuto al CLOCCS più scarso adattamento ai dati citometrici a flusso per la condizione 1 rispetto alla condizione 2 (figura supplementare 2). Tuttavia, l'allineamento ha deviato solo in un campione e, quindi, consente ancora migliori confronti specifici di fase.

L'allineamento della linea di vita in erba è stato quindi applicato ai dati sperimentali per gli esperimenti RNA-seq nella condizione 1, condizione 2 e condizione 3 (figura 7) utilizzando i parametri CLOCCS in erba nella funzione df_conversion_from_parameters sui dati sperimentali. I dati trascrittomici sono stati allineati e l'espressione genica del gene CDC20 per ciascuna serie temporale è stata mostrata per i tre esperimenti. Prima dell'allineamento, la dinamica della trascrizione di CDC20 non si sovrapponeva (Figura 7A). Dopo l'allineamento, il primo e il secondo picco dell'espressione genica CDC20 erano molto più strettamente allineati per tutti e tre i set di dati. Dopo l'allineamento, è diventato chiaro che i picchi si sono verificati nella stessa fase del ciclo cellulare, ma le forme delle curve erano diverse (Figura 7B). La condizione 3 ha avuto un primo picco inferiore e più ampio rispetto alle altre due condizioni, anche dopo aver tenuto conto delle differenze nel periodo del ciclo cellulare, suggerendo che queste differenze erano probabilmente correlate alle condizioni sperimentali testate (Figura 7B).

Si potrebbero anche fare confronti trascrittomici su larga scala. Per questi confronti, 278 geni sono stati selezionati eseguendo l'algoritmo di periodicità JTK_CYCLE23 su ciascun set di dati e prendendo l'intersezione dei geni periodici principali. Tuttavia, i geni possono essere selezionati utilizzando qualsiasi metodo desiderato o dalla letteratura. Questi geni sono stati tracciati nello stesso ordine per tutte e tre le condizioni sia per le mappe di calore non allineate (Figura 7C) che per quelle allineate (Figura 7D) utilizzando la funzione Python plot_heatmap_comparison in un notebook Python. Queste mappe di calore consentono di effettuare centinaia di confronti a livello genetico contemporaneamente. Confronti tra esperimenti non allineati potrebbero essere fatti per quanto riguarda il cambiamento nella dinamica della curva, il tempo di picco rispetto ai geni vicini, e la lunghezza del periodo, ecc. (Figura 7C). Tuttavia, non è stato possibile effettuare confronti dettagliati specifici per fase perché i punti temporali non sono necessariamente correlati alla stessa fase del ciclo cellulare tra le condizioni. Sebbene i secondi cicli apparissero simili dopo l'allineamento, i primi cicli erano leggermente spostati tra le condizioni (Figura 7D). Questo spostamento può riflettere il fatto che le informazioni sulla fase del ciclo cellulare in erba erano di qualità inferiore per la condizione 3. Tuttavia, l'allineamento degli esperimenti per le tre condizioni ha permesso un migliore confronto fase-specifico. Prima dell'allineamento, non era chiaro se il primo picco di espressione in ciascuna condizione si sarebbe verificato nella stessa fase del ciclo cellulare (Figura 7C); tuttavia, dopo l'allineamento, gli esperimenti potrebbero essere confrontati in modo specifico per fase (Figura 7D). Prima dell'allineamento, i picchi nella condizione 3 apparivano molto più ampi rispetto alle altre due condizioni (figura 7C); tuttavia, dopo l'allineamento, è diventato chiaro che i picchi nella condizione 3 erano di larghezza simile alle altre condizioni quando allineati (Figura 7D).

Questi risultati rappresentativi dimostrano il processo per l'uso di CLOCCS per allineare gli esperimenti a una scala temporale comune. Prima dell'allineamento, i confronti diretti dei punti temporali spesso non sono correlati a una fase simile del ciclo cellulare. La conversione del tempo sperimentale trascorso in minuti in punti vitali che rappresentano la fase del ciclo cellulare consente confronti specifici di fase e biologicamente rilevanti tra esperimenti nello stesso punto del ciclo cellulare.

Figure 1
Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro di allineamento delle linee vita CLOCCS. Il flusso di lavoro sperimentale per l'allineamento di due dataset di esempio utilizzando CLOCCS, seguito da confronti rappresentativi tra i dataset. Vengono illustrati i passaggi principali del protocollo: la raccolta di dati sperimentali e di fase del ciclo cellulare non allineati per ciascuno dei set di dati (fase 1), l'uso di CLOCCS per la parametrizzazione di ciascun set di dati (fase 2 e fase 3), l'allineamento dei set di dati a una linea di vita comune (fase 4) e, infine, il confronto della fase del ciclo cellulare e delle dinamiche sperimentali (fase 5 e fase 6). I dati di fase del ciclo cellulare non allineati vengono inseriti in CLOCCS per fornire parametri appresi, che vengono quindi utilizzati per l'allineamento a una scala di vita comune. Questi set di dati allineati vengono quindi confrontati. Abbreviazione: CLOCCS = Caratterizzante la perdita della sincronia del ciclo cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Formato della fase del ciclo cellulare e dati sperimentali necessari per il flusso di lavoro. I dati necessari per il flusso di lavoro sono costituiti da due componenti principali: dati di fase del ciclo cellulare e dati sperimentali del ciclo cellulare. I dati della fase del ciclo cellulare possono consistere in dati di gemmazione del ciclo cellulare o dati sul contenuto di DNA citometrico a flusso per ciascun punto temporale nella serie temporale. I dati sperimentali possono assumere molte forme, ma in questo caso sono dati trascrittomici, che consistono in dati di espressione genica per ciascun gene per ogni punto temporale della serie temporale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Esempio di risultati dell'esecuzione di CLOCCS su un set di dati del ciclo cellulare di S. cerevisiae. (A) Uno screenshot dell'interfaccia utente grafica CLOCCS con i valori di input e le impostazioni fornite per i dati in erba della condizione 2. Vengono immessi i tempi, il numero di celle non modificate e il numero di celle gemmate, nonché il tipo di modello, le iterazioni e le condizioni, ecc. (B) Uno screenshot del CLOCCS risultante adatto alla condizione 2 nella scheda "Adattamento previsto" dei risultati. Ogni punto dati ha una barra di errore di campionamento associata corrispondente agli intervalli di confidenza della proporzione binomiale del 95% dei dati (per ogni punto temporale, sono state contate almeno 200 celle [tra 204 e 295 celle]). La curva di adattamento in erba risultante mostra la banda di confidenza per l'intervallo di confidenza del 95% del CLOCCS fit in viola. (C) Uno screenshot della tabella "Parametri posteriori" risultante per l'esecuzione CLOCCS in erba della condizione 2 costituita dai parametri CLOCCS alla media, all'intervallo di confidenza del 2,5% e all'intervallo di confidenza al 97,5%. Vengono mostrati anche i tassi posteriori e di accettazione. (D) Uno screenshot della citometria a flusso CLOCCS adatto alla condizione 2 a 70 minuti e 150 minuti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Esempio del processo di conversione da punti temporali a punti linea vita allineati per il set di dati della condizione 2. (A) Le formule di conversione utilizzate per convertire da punti temporali a punti linea vita. Uno screenshot delle funzioni Python nel notebook Python per la conversione e il plottaggio delle curve in erba. (B) La curva di gemmazione non allineata della condizione 2 che mostra la percentuale di germogliamento per ogni punto temporale in minuti. Il ciclo cellulare e le fasi di recupero sono evidenziati come segue: recupero (grigio), primo ciclo cellulare (blu), secondo ciclo cellulare (magenta) e terzo ciclo cellulare (salmone). (C) La curva di gemmazione allineata della condizione 2 che mostra le stesse percentuali di gemmazione ma tracciate sulla scala allineata alla linea vita. Il ciclo cellulare e le fasi di recupero sono evidenziati come nel pannello C. (D) I grafici di citometria a flusso allineati per punti temporali selezionati dalla condizione 2 corrispondenti a fasi distinte del ciclo cellulare basate sulla scala della linea vitale: l'inizio di G1, l'inizio della fase S, l'inizio di G2 / M e il tardo G2 / M. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Risultati rappresentativi per il confronto degli esperimenti replicati della Condizione 1 allineati e non allineati. Il confronto delle repliche della condizione 1: condizione 1 RNA-seq (blu), condizione 1 microarray 1 (viola) e condizione 1 microarray 2 (grigio). (A) La curva di gemmazione non allineata per i set di dati della condizione 1. (B) La curva di gemmazione allineata per i set di dati della condizione 1. I punti della linea di vita sono stati convertiti nella fase del ciclo cellulare e sono codificati a colori sotto l'asse x. (C) L'espressione genica non allineata di un gene rappresentativo, CDC20, per i set di dati della Condizione 1. (D) L'espressione genica allineata di un gene rappresentativo, CDC20, per i set di dati della condizione 1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Risultati rappresentativi per il confronto dei dati di fase del ciclo cellulare allineati e non allineati tra esperimenti con periodi variabili. Confronto dei dati della fase del ciclo cellulare per set di dati con tre diverse condizioni ambientali e, quindi, tre diversi periodi del ciclo cellulare: Condizione 1 RNA-seq (periodo del ciclo cellulare: 71 min), Condizione 2 RNA-seq (periodo del ciclo cellulare: 82 min) e Condizione 3 RNA-seq (periodo del ciclo cellulare: 110 min). (A) La curva di gemmazione non allineata per i set di dati. (B) La curva di gemmazione allineata per i set di dati. (C) Gli istogrammi del contenuto di DNA citometrico a flusso per la condizione 2 (riga superiore) rispetto ai punti di linea di vita equivalenti nella condizione 1 (riga inferiore). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Risultati rappresentativi per il confronto dei dati trascrittomici allineati e non allineati tra esperimenti con periodi variabili. Confronto dei dati trascrittomici associati ai set di dati in Figura 6: Condizione 1 RNA-seq, Condizione 2 e Condizione 3. (A) L'espressione genica non allineata di un gene rappresentativo, CDC20, per i set di dati RNA-seq Condizione 1, Condizione 2 e Condizione 3. (B) L'espressione genica allineata di CDC20 per i set di dati. (C) La mappa di calore non allineata dei geni periodici del ciclo cellulare superiore nello stesso ordine per ciascun set di dati. (D) Le mappe di calore allineate alla linea di vita degli stessi geni periodici del ciclo cellulare del pannello C nello stesso ordine. Le linee viola tratteggiate corrispondono ai punti della linea vita 100 e 200. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Conversione della fase da punto a ciclo cellulare. La chiave di conversione tra la scala dei punti della linea di vita e la fase corrispondente dell'esperimento. I punti vitali 0-100 corrispondono al recupero dalla sincronia. Ogni successivo 100 punti della linea vita corrisponde a un nuovo ciclo cellulare, con i primi 15,5 punti della linea vita corrispondenti a G1, i successivi 20 corrispondenti alla fase S e i restanti punti della linea vita corrispondenti a G2 / M. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: parametri CLOCCS in erba. I parametri CLOCCS in erba risultanti "lambda" e "mu0" per ciascun esperimento dai risultati rappresentativi. Inoltre, il ritardo specifico della figlia "Delta" e il periodo del ciclo cellulare calcolato sono mostrati per ogni esperimento. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Tabella di conversione che mostra la conversione tra i punti temporali in minuti e i rispettivi punti della linea di vita corrispondenti per la condizione 2. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura supplementare S1: CLOCCS che germoglia si adatta alla condizione 1 e alla condizione 3. Screenshot del CLOCCS budding fit risultante per (A) i dati di gemmazione dell'RNA seq della Condizione 1, (B) i dati di gemmazione del microarray 1 della Condizione 1, (C) i dati di gemmazione del microarray 2 della Condizione 1 e per (D) i dati di gemmazione della Condizione 3. Il CLOCCS in erba adatto alla Condizione 2 può essere visto nella Figura 3B. La banda di confidenza del 95% e le barre di errore di campionamento sono descritte nella documentazione CLOCCS14,15 e nella figura 3. Per ogni punto temporale per ogni serie temporale, sono state contate circa 200 celle. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: La citometria a flusso CLOCCS si adatta alla condizione 1 e alla condizione 2. Lo screenshot della citometria a flusso CLOCCS si adatta ai campioni mostrati nella Figura 6C per la condizione 2 (riga superiore: A-D) e la condizione 1 (riga inferiore: E, F). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S3: Sensibilità dell'allineamento alle variazioni dei parametri CLOCCS. Confronto dell'allineamento del set di dati RNA-Seq della condizione 1 utilizzando variazioni (A-C) nei parametri CLOCCS λ e μ0 all'interno dell'intervallo di confidenza dell'adattamento CLOCCS e (D,E) con grandi variazioni nei parametri. Confronto tra il valore medio con i valori di confidenza del 2,5% e del 97,5% emessi nella tabella dei parametri da CLOCCS per (A) il parametro μ0, (B) il parametro λ e (C) per entrambi i parametri μ0 e λ. (D) Confronto tra l'allineamento utilizzando il valore medio per μ0 rispetto a grandi variazioni del parametro μ0 (da 200% a 0,25% di μ0). (E) Confronto tra l'allineamento utilizzando il valore medio per λ rispetto a grandi variazioni del parametro λ (da 200% a 0,25% di λ). Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S1: Descrizione della raccolta dei dati per ciascun esperimento. Per ogni esperimento, questa tabella fornisce una descrizione dei dati in erba, dei dati di citometria a flusso, dei dati trascrittomici e del metodo di sincronizzazione. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S2: parametri CLOCCS dalle corse CLOCCS citometriche a flusso. I parametri CLOCCS "mu0" e "lambda" per la citometria a flusso CLOCCS della Condizione 1 e della Condizione 2. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: Istruzioni per la conversione dei dati citometrici a flusso nel formato di input CLOCCS. Per l'utilizzo di CLOCCS con dati citometrici a flusso, è richiesto un formato di input specifico. Questo file fornisce istruzioni più dettagliate relative al passaggio del protocollo 3.4.1 per spiegare come utilizzare le funzioni dell'utilità Python per eseguire questa conversione. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Questo articolo presenta un metodo per valutare in modo più accurato e quantitativo i dati provenienti da esperimenti di serie temporali su popolazioni sincronizzate di cellule. Il metodo utilizza i parametri appresi da CLOCCS, un modello di inferenza bayesiana che utilizza i dati di fase del ciclo cellulare di input, come i dati di gemmazione e i dati del contenuto di DNA citometrico a flusso, per parametrizzare ogni esperimento14,15. CLOCCS utilizza i dati di fase del ciclo cellulare di input per dedurre i parametri per ciascun esperimento, che vengono quindi utilizzati per l'allineamento a una scala di linea di vita comune. La conversione di più esperimenti di serie temporali di sincronizzazione/rilascio in una singola scala temporale allineata alla linea di vita consente confronti specifici di fase e pertinenti tra esperimenti e l'aggregazione di più esperimenti replicati, che in precedenza erano difficili o impossibili.

I passaggi critici di questo protocollo includono la raccolta dei dati, l'esecuzione di CLOCCS, l'allineamento dei set di dati e il confronto tra i set di dati. Innanzitutto, i dati devono essere raccolti per l'uso in questo protocollo. I dati devono consistere sia di dati sperimentali contenenti informazioni riguardanti la questione di interesse (cioè dati trascrittomici, dati di espressione genica, dati proteomici) sia di dati di fase del ciclo cellulare contenenti informazioni sulla fase del ciclo cellulare (cioè dati di gemmazione, dati sul contenuto di DNA citometrico a flusso). Quindi, i dati della fase del ciclo cellulare possono essere utilizzati in CLOCCS per raccogliere le informazioni sui parametri per ciascun esperimento. I parametri μ0 (lunghezza della fase di recupero) e λ (periodo del ciclo della cellula madre) vengono utilizzati per convertire i punti temporali in punti della linea vita. L'allineamento dei punti della linea vita consente di confrontare direttamente le serie temporali allineate.

Una limitazione del metodo è che il corretto allineamento dipende dall'identificazione di una buona corrispondenza ai dati. Il raggiungimento del miglior adattamento CLOCCS si basa sulla qualità dei dati della fase del ciclo cellulare e sull'uso delle impostazioni di input corrette per l'esperimento in CLOCCS. L'adattamento ai dati della fase del ciclo cellulare determina l'accuratezza dei parametri appresi e, quindi, influisce notevolmente sull'accuratezza dell'allineamento, perché dipende dall'uso di questi parametri. Poiché ampie variazioni dei parametri influenzerebbero notevolmente l'allineamento, le modifiche rimangono minime entro l'intervallo di confidenza fornito nell'output CLOCCS (figura supplementare S3). È importante notare che questa sensibilità alle variazioni dei parametri è anche ciò che consente l'allineamento tra set di dati con tempi di ciclo cellulare variabili.

La precisione dell'adattamento CLOCCS può essere determinata utilizzando la curva di adattamento CLOCCS risultante e le barre di errore e la banda di errore corrispondenti (Figura 3B, D, Figura supplementare S1 e Figura supplementare S2). La scheda CLOCCS fit mostra i punti dati originali, nonché la curva di adattamento CLOCCS con la banda di confidenza corrispondente all'intervallo di confidenza dell'adattamento CLOCCS e le barre di errore corrispondenti all'intervallo di confidenza della proporzione binomiale del 95% dei dati, poiché i conteggi sono considerati variabili casuali binomiali indipendenti14. Ad esempio, le barre di confidenza sui dati in erba misurano la fiducia nella proporzione di cellule gemmate per un determinato campione.

Un metodo per determinare la qualità dell'adattamento CLOCCS consiste nel determinare se le barre di errore dei dati si sovrappongono alla banda dell'intervallo di confidenza dell'adattamento CLOCCS. Un'altra indicazione è l'ampiezza della fascia di confidenza del 95% del CLOCCS fit. In generale, la larghezza della fascia diminuisce con l'aumentare della bontà di vestibilità. Un'indicazione di scarso allineamento è se la fase del ciclo cellulare dei dati originali non corrisponde alla fase del ciclo cellulare dedotta dall'allineamento. Ogni allineamento può essere ricontrollato confermando che, per ogni punto temporale, la fase indicata dai dati informativi sulla fase del ciclo cellulare corrisponde alla fase del ciclo cellulare assegnata dall'allineamento.

Un CLOCCS scadente o uno scarso allineamento potrebbero essere il risultato di dati di fase del ciclo cellulare di bassa qualità. I dati di germogliamento di alta qualità avranno una percentuale di germogliamento molto bassa subito dopo l'arresto e una percentuale di germogliamento molto alta al primo picco. I picchi e le depressioni successivi perderanno sincronia ma dovrebbero essere distinti e uniformemente distanziati. Poiché i punti della linea di vita rappresentano la fase media del ciclo cellulare della popolazione, una scarsa sincronizzazione può impedire anche il corretto allineamento. I dati di alta qualità sul contenuto citometrico del DNA a flusso avranno picchi distinti di 1C e 2C per ciascun punto temporale corrispondente alla fase appropriata del ciclo cellulare. Inoltre, dati insufficienti sulle fasi del ciclo cellulare introducono problemi di identificabilità dei parametri. Nel caso di dati sufficienti, i parametri possono essere dedotti e non cambiano sostanzialmente tra le esecuzioni di CLOCCS. Tuttavia, i parametri descritti in questo protocollo (lambda, delta, mu0) non possono essere districati quando i dati della fase del ciclo cellulare contengono solo un ciclo completo della cella. Per consentire una migliore stima dei parametri, è necessario utilizzare dati sufficienti e ben costruiti sul ciclo cellulare per il CLOCCS fits14,15. Inoltre, il modello CLOCCS utilizza informazioni preliminari come descritto in Orlando et al.15, ma queste informazioni possono essere adattate per adattarsi meglio alle condizioni sperimentali utilizzate.

Se la qualità dei dati della fase del ciclo cellulare è buona, la regolazione delle impostazioni CLOCCS può aiutare a produrre un adattamento più accurato. Ad esempio, il numero di iterazioni selezionate potrebbe essere aumentato per migliorare la precisione. Può anche essere utile confermare che il metodo di sincronizzazione corretto è stato selezionato in CLOCCS, poiché l'arresto del fattore alfa è associato a un tempo di recupero più breve rispetto all'elutriazione.

Questo metodo è anche limitato in termini di tipi di dati di fase del ciclo cellulare attualmente supportati. Tuttavia, CLOCCS è flessibile e può essere adattato per supportare altri tipi di dati. Ad esempio, CLOCCS è stato precedentemente adattato per supportare la marcatura fluorescente del ciclo cellulare dei corpi dei poli del fuso, degli anelli della miosina e dei nuclei11 da utilizzare come identificatori di fase del ciclo cellulare. Inoltre, è stato reso possibile l'uso di CLOCCS con specie diverse da S. cerevisiae. CLOCCS accetta indici di settazione come marcatore per la fase del ciclo cellulare in S. pombe14, così come i dati sul contenuto di DNA citometrico a flusso, che sono facilmente raccoglibili per molte specie15. Ciò consente il confronto dei dati sperimentali nella stessa fase del ciclo cellulare per due specie completamente diverse e può fornire informazioni sui cambiamenti nel ciclo cellulare attraverso l'evoluzione.

Sebbene solo le forme supportate di dati di fase del ciclo cellulare possano essere utilizzate con questo metodo di allineamento della linea vitale, questo metodo è agnostico rispetto al tipo di dati sperimentali delle serie temporali utilizzati. In questo protocollo, abbiamo dimostrato il suo uso nell'allineamento dell'espressione genica di un singolo gene, così come i dati trascrittomici di serie temporali per centinaia di geni in tandem. Abbiamo dimostrato che questo metodo può essere utilizzato per confrontare tra piattaforme e, quindi, fare confronti tra set di dati RNA-seq e set di dati di microarray presi in condizioni simili. Abbiamo anche dimostrato che questo metodo può essere utilizzato per allineare i set di dati con diversi metodi di sincronizzazione confrontando tra un set di dati che è stato elutrizzato (Condizione 1 Microarray) con un set di dati che è stato arrestato fattore alfa (Condizione 1 RNA-seq). In precedenza, CLOCCS è stato utilizzato anche per allineare i dati di trascrittomica e proteomica delle serie temporali utilizzando i dati di fase22 del ciclo cellulare in erba, che hanno permesso confronti diretti tra la dinamica dell'mRNA e la dinamica della proteina corrispondente. CLOCCS è stato utilizzato anche per allineare i dati delle serie temporali tra le specie, come per l'allineamento tra S. cerevisiae e S. pombe14 e tra il primo ciclo di S. cerevisiae e il lievito patogeno Cryptococcus neoformans21. Infine, l'allineamento CLOCCS è attualmente specifico per i dati delle serie temporali del ciclo cellulare e non è stato ancora adattato per l'uso con altri tipi di processi ritmici. Un'area in cui questo sarebbe di particolare interesse è per i ritmi circadiani, dove il tempo circadiano (CT) è convenzionalmente usato per allineare gli esperimenti, sebbene la sua implementazione non sia applicata in modo coerente. Un'altra area di interesse è lo studio dei ritmi di sviluppo, come quelli del parassita della malaria. Ad esempio, l'allineamento dei ceppi di Plasmodium falciparum con periodi diversi, come descritto in Smith et al.25, consentirebbe confronti più dettagliati tra i ceppi. L'allineamento di questi processi periodici per il confronto consentirebbe una migliore comprensione di queste importanti funzioni biologiche ritmiche. Questi tipi di confronti del ciclo cellulare sono stati resi possibili utilizzando CLOCCS per l'allineamento della linea vita, come descritto in questo protocollo.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

S. Campione e S. Haase sono stati sostenuti da finanziamenti della National Science Foundation (DMS-1839288) e del National Institutes of Health (5R01GM126555). Inoltre, gli autori desiderano ringraziare Huarui Zhou (Duke University) per i commenti sul manoscritto e per il beta testing del protocollo. Ringraziamo anche Francis Motta (Florida Atlantic University) e Joshua Robinson per il loro aiuto con il codice Java.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2x PBS For Fixative Solution. Described in Leman 2014.
4% formaldehyde For Fixative Solution.
100% Ethanol For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002.
CLOCCS https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow Cytometer For flow cytometry protocol.
Git https://git-scm.com/
Java 19 https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
Microscope For counting cells and buds.
Miniconda https://docs.conda.io/en/latest/
Protease solution For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
RNAse A solution For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid Stain Invitrogen S7020 For flow cytometry staining. Described in Haase 2002.
Tris pH 7.5

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References

  1. Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
  2. Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
  3. Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
  4. Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
  5. Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
  6. Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
  7. Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
  8. Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
  9. Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
  10. Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
  11. Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
  12. Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
  13. Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
  14. Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
  15. Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
  16. Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
  17. Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
  18. Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
  19. Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
  20. Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
  21. Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453 (2016).
  22. Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
  23. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  24. Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
  25. Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).

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