Summary
Præsenteret her er en metode til berigelse og analyse af de flygtige komponenter i teekstrakter ved hjælp af opløsningsmiddelassisteret smagsfordampning og opløsningsmiddelekstraktion efterfulgt af gaskromatografi-massespektrometri, som kan anvendes på alle typer teprøver.
Abstract
Tearoma er en vigtig faktor i tekvaliteten, men det er udfordrende at analysere på grund af kompleksiteten, den lave koncentration, mangfoldigheden og labiliteten af de flygtige komponenter i teekstrakt. Denne undersøgelse præsenterer en metode til opnåelse og analyse af de flygtige komponenter i teekstrakt med lugtbevarelse ved hjælp af opløsningsmiddelassisteret smagsfordampning (SAFE) og opløsningsmiddelekstraktion efterfulgt af gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS). SAFE er en højvakuumdestillationsteknik, der kan isolere flygtige forbindelser fra komplekse fødevarematricer uden ikke-flygtig interferens. En komplet trin-for-trin procedure til tearomaanalyse præsenteres i denne artikel, herunder teinfusionspræparatet, opløsningsmiddelekstraktion, SAFE-destillation, ekstraktkoncentration og analyse af GC-MS. Denne procedure blev anvendt på to teprøver (grøn te og sort te), og der blev opnået kvalitative såvel som kvantitative resultater på teprøvernes flygtige sammensætning. Denne metode kan ikke kun bruges til aromaanalyse af forskellige typer teprøver, men også til molekylære sensoriske undersøgelser af dem.
Introduction
Te er en foretrukken drik for mange mennesker over hele verden 1,2. Teens aroma er et kvalitetskriterium såvel som en prisbestemmende faktor for teblade 3,4. Således er analysen af aromasammensætningen og indholdet af te af stor betydning for molekylære sensoriske undersøgelser og kvalitetskontrol af te. Som følge heraf har aromasammensætningsanalyse været et vigtigt emne i teforskning i de senere år 5,6,7.
Indholdet af aromakomponenter i te er meget lavt, da de generelt kun tegner sig for 0,01% -0,05% af tørvægten af tebladene8. Desuden interfererer den store mængde ikke-flygtige komponenter i prøvematrixen signifikant med analyse ved gaskromatografi 9,10. Derfor er en prøveforberedelsesprocedure afgørende for at isolere de flygtige forbindelser i te. Den vigtigste overvejelse for isolerings- og berigelsesmetoden er at minimere matrixinterferensen og samtidig maksimere bevarelsen af prøvens originale lugtprofil.
Opløsningsmiddelassisteret smagsfordampning (SAFE), oprindeligt udviklet af Engel, Bahr og Schieberle, er en forbedret højvakuumdestillationsteknik, der bruges til at isolere flygtige forbindelser fra komplekse fødevarematrixer11,12. En kompakt glasenhed forbundet til en højvakuumpumpe (under et typisk driftstryk på 5 x 10-3 Pa) kan effektivt opsamle flygtige forbindelser fra opløsningsmiddelekstrakter, olieholdige fødevarer og vandige prøver.
Denne artikel beskrev en metode, der kombinerer SAFE-teknikken med opløsningsmiddelekstraktion for at isolere flygtige stoffer fra en infusion af sort te, efterfulgt af analyse ved hjælp af GC-MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af den interne standard og teinfusion
- Stamopløsning: 10,0 mg paraxylen-d10 (se materialetabel) opløses i 10,0 ml vandfri ethanol for at fremstille en 1.000 ppm stamopløsning af den interne standard.
- Arbejdsløsning: 1 ml stamopløsning (trin 1.1) fortyndes til 100 ml med rent vand for at forberede en 10 ppm arbejdsløsning af den interne standard.
BEMÆRK: Arbejdsløsningen skal udarbejdes samme dag som analysen. - Læg 3 g teblade (både til grøn te og sort te, se Materialetabel) i en Erlenmeyerkolbe, og tilsæt 150 ml kogende vand. Kolben dækkes med en glasprop.
- Efter 5 minutter filtreres teinfusionen hurtigt gennem en sigte med 300 masker.
- Vask de brugte teblade to gange med 30 ml vand, og kombiner vaskeopløsningen med teinfusionen.
- Afkøl teinfusionen hurtigt til stuetemperatur i et isvandbad.
- Tilsæt 1,00 ml arbejdsløsning (trin 1.2) i teinfusionen, og bland dem godt.
2. Destillation af teinfusionen ved SAFE og væske-væskeekstraktion af destillatet
- Forbered SAFE-enheden ved at følge nedenstående trin.
- Installer SAFE-enheden (figur 1), og tilslut destillationsflasken nederst til venstre (figur 1[3]) og opsamlingsflasken nederst til højre (figur 1[4]). Tilslut cirkulationsvandrøret bag på SAFE-glasenheden. Installer kuldeudladeren (figur 1[5]), og tilslut røret til vakuumpumpen (se materialetabellen) øverst til højre på glasenheden.
BEMÆRK: Kontroller forbindelsen af det cirkulerende vandrør; Sørg for, at indløbet kommer ind i toppen, og udløbet kommer ud fra bunden. Brug deioniseret vand til cirkulationen for at forhindre vægten i at blokere det hvide rør i SAFE-enheden, hvilket ville resultere i dårlig cirkulation af det cirkulerende vand og den eventuelle eksplosion af SAFE-enheden. Destillationsbunden (figur 1[3]) kan omrøres ved hjælp af en omrøringsstang for at lette fordampningen af prøven. - Temperaturen i det cirkulerende vand indstilles til 50 °C og temperaturen i vandbadet for prøvekolben til 40 °C. Luk vakuumventilen (figur 1[2]).
- Installer SAFE-enheden (figur 1), og tilslut destillationsflasken nederst til venstre (figur 1[3]) og opsamlingsflasken nederst til højre (figur 1[4]). Tilslut cirkulationsvandrøret bag på SAFE-glasenheden. Installer kuldeudladeren (figur 1[5]), og tilslut røret til vakuumpumpen (se materialetabellen) øverst til højre på glasenheden.
- Udfør vakuumpumpens drift.
- Tænd for vakuumpumpen.
- Forøg gradvist hastigheden til den maksimale hastighed på 100%.
BEMÆRK: Hvis hastigheden ikke når 100%, skal du kontrollere, om systemet er lufttæt, og om der er opløsningsmiddelrester inde i systemet. - Efter at have nået et højt vakuum (helst 10-3 Pa)
BEMÆRK: Vakuumet forbedres, når det flydende nitrogen tilsættes til kuldefælden.
- Udfør prøvedestillation.
- Start vandcirkulationen.
- Tilsæt flydende nitrogen til kuldefælden for at dække ydersiden af opsamlingsflasken.
- Hæld teinfusionen i prøvetragten øverst til venstre (figur 1[1]), og dæk den derefter med en glasprop.
- Prøven hældes dråbevis ind i destillationskolben. Kontroller prøvens faldhastighed, så vakuumet holdes i det korrekte område på omkring 10-3 Pa.
BEMÆRK: Tilsæt flydende nitrogen under processen for at sikre, at den rigtige opsamlingsflaske altid er nedsænket i flydende nitrogen. Prøv at undgå kondensatdannelse i den kolde fælde.
- Sluk for vakuumpumpen, når destillationen er afsluttet.
- Tryk på afbryderen . Når "STOP" blinker, skal du trykke på Enter-tasten for at bekræfte.
- Tag netledningen ud, når molekylærpumpens hastighed falder til "0".
BEMÆRK: Genstart kun, når hastigheden falder til "0".
- Gendan systemet til atmosfærisk tryk.
- Fjern slibeproppen over prøvetagningsflasken.
- Skru langsomt vakuumventilens knap af for at gendanne systemet til atmosfærisk tryk.
- Tag opsamlingsflasken ned med prøven.
- Fjern det flydende nitrogen uden for opsamlingsflasken, når systemet er genvundet til atmosfærisk tryk.
- Skru opsamlingsflasken langsomt af. Tag forsigtigt opsamlingsflasken med prøven ned.
- Luk det cirkulerende vand.
- Udfør væske-væskeekstraktion af SAFE-destillatet.
- Lad SAFE-destillatet i flasken varme op til stuetemperatur.
- SAFE-destillatet ekstraheres tre gange med 50 ml dichlormethan (se materialetabel).
- Kombiner dichlormethanlagene. Tør ekstraktet med vandfrit natriumsulfat (se materialetabellen).
BEMÆRK: Det vandfrie natriumsulfat i opløsningsmidlet betragtes som tørt nok, når det ikke længere er cementeret og kan strømme frit. - Koncentrer ekstraktet til ca. 2 ml ved hjælp af en mild nitrogenstrøm.
- Overfør til et prøvehætteglas på 1-2 ml og koncentrer yderligere til 200 μL ved hjælp af en mild nitrogenstrøm.
3. GC-MS-analyse og databehandling
- Aromakoncentraterne fremstillet i protokolafsnit 2 analyseres ved hjælp af et GC-MS-system (figur 2) udstyret med smeltede silicakapillærsøjler (se materialetabellen).
- Brug helium som bæregas med en lineær hastighed på 40 cm/s.
- Indsprøjt 3 μL koncentrat i splitless injektionstilstand.
- Indstil GC-ovnens temperaturprogram: (1) hold ved 40 °C i 5 min; (2) øges til 200 °C ved 5 °C/min (3) øges til 280 °C ved 10 °C/min (4) Hold ved 280 °C i 10 minutter.
- Betjen den masseselektive detektor i positiv EI-tilstand13 med et massescanningsområde fra 30 m/z til 350 m/z ved 70 eV.
- Deconvolute GC-MS-dataene ved hjælp af Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System (AMDIS, se materialetabellen).
- Match og kvalificer dataene efter dekonvolution ved hjælp af NIST (National Institute of Standards and Technology) 17 massespektrometer søgeprogram3.
- Beregn retentionsindekset for forbindelserne14 baseret på resultatet af et sæt n-alkaner (C5-C25, se materialetabellen) under de samme GC-betingelser.
- Identificer GC-toppene ved hjælp af NIST-massespektrometribiblioteket og fastholdelsesindeksdatabasen baseret på samtidig matchning af masse- og retentionsindekserne.
- Koncentrationen af hver flygtig komponent i SAFE-prøven beregnes i forhold til den interne standard ved hjælp af TIC-toparealet (total ionkromatografi).
- Gentag analysen tre gange, startende fra teinfusionspræparatet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ovenfor beskrevne analysemetode er illustreret i dette afsnit ved hjælp af eksemplet på aromaanalysen af prøver af sort te og grøn te.
Figur 3 viser et repræsentativt GC-MS-kromatogram. Figur 3A viser et sæt n-alkaner, og figur 3B viser profilen for en intern standard. Evalueringsresultaterne for ekstrakterne fra prøverne af grøn te og sort te er vist i henholdsvis figur 3C og figur 3D. Ved at analysere de interne standarder kan der påvises en endelig top med en stabil baseline (figur 3B). GC-kromatogrammet viser de komplette GC-profiler opnået fra infusionsekstrakterne for grøn te og sort te efter den totale iontælling.
I alt 104 aromaforbindelser blev identificeret i grøn te og sort te prøver ved massespektrometri matchning kombineret med retentionsindekset. Den relative kvantificering blev beregnet ved forbindelsens topareal i forhold til den interne standard. Varmekortet, tegnet i henhold til de kvalitative og kvantitative resultater, viser indholdet af aromaforbindelser i forhold til den interne standard for prøverne af grøn te og sort te (figur 4).
Figur 1: Skematisk diagram over SAFE-systemet. (1) Prøveflasken til prøveindsamlingen. (2) Vakuumventilen; Systemet skal holdes lukket, før der tilsættes prøver, og dråbestrømmen af prøven skal justeres korrekt. (3) Destillationsflasken til prøvedestillationen. (4) Opsamlingsflasken til indsamling af den destillerede prøve. (5) Kuldeudskilleren til genvinding af prøver, der ikke er indsamlet af opsamlingsflasken, og til at forhindre opløsningsmidlet i at trænge ind i vakuumpumpen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk diagram over GC-MSD-systemet. GC/MS-systemet er udstyret med (1) en multi-mode injektionsport, (2) et flowkontrolmodul (PCM), der styrer heliumbærerstrømmen, (3) en 60 m x 0,25 m x 0,25 m 5 ms kapillarsøjle og (4) en GC-søjleovn. Teekstrakterne i den injicerede prøve adskilles i GC-kolonnen, hvorigennem bæregassen strømmer, og ovnens temperatur stiger. Komponenterne ioniseres af en EI-ionkilde og analyseres derefter i en masseanalysator. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Typisk totalt ionkromatogram fra en vellykket GC-MS-analyse. A) N-alkanernes kromatogram. Alle n-alkantoppene tildeles det tilsvarende kulstofnummer. B) Den interne standards kromatogram (paraxylen-d10). (C) Repræsentativ aromaprofil af infusionen med grøn te. (D) Repræsentativ aromaprofil af infusionen med sort te. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Heatmap over 104 aromaforbindelser identificeret i sort te (BT) og grøn te (GT) prøver. Tallet ved siden af farvenoten i højre side af varmekortet angiver indholdet af forbindelsen (i forhold til den interne standard). Farvedybden angiver niveauet af stofindhold; Jo dybere farven er, desto højere er det relative indhold. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel beskriver en effektiv metode til analyse af flygtige forbindelser i teinfusioner ved hjælp af SAFE- og GC-MS-analyse.
Teinfusioner har en kompleks matrix med et højt indhold af ikke-flygtige komponenter. Flere metoder er beskrevet i litteraturen til isolering af de flygtige komponenter fra teinfusioner. En almindelig metode er samtidig destillationsekstraktion (SDE)15,16. Det er imidlertid ikke egnet til analyse af tearomaer, fordi tebladene skal koges med vand under hele destillations-/ekstraktionsprocessen, hvilket resulterer i, at tekomponenterne gennemgår en kemisk reaktion og dermed giver en lugtprofil, der er meget forskellig fra den oprindelige prøve17. SAFE destillerer teinfusionen ved lav temperatur under højt vakuum, hvilket minimerer ændringer i analysanderne og gør det muligt at bevare den oprindelige aromasammensætning.
Fastfasemikroekstraktion (SPME) er en anden metode, der almindeligvis anvendes til aromaanalyse af te18,19. Dens fordele ligger i den enkle og opløsningsmiddelfri procedure. Selektiviteten af fiberadsorptionen af aromakomponenterne gør det imidlertid vanskeligt at opnå en kvantitativ profil, der afspejler prøvens aromaegenskaber, hvilket begrænser anvendelsen af denne metode til tearomaanalyse20.
HVT-teknikken (high-vacuum transfer) blev udviklet for at reducere risikoen for, at artefakter dannes i aromaanalyser21. HVT har imidlertid et lavt ekstraktionsudbytte for stoffer med høje kogepunkter og stærk polaritet, hvilket begrænser dets anvendelsesområde.
I modsætning til ovenstående brugerdefinerede metoder er SAFE-destillatet af en teinfusion fri for ikke-flygtige komponenter22,23,24. Aromaen i destillatet kan kvantitativt ekstraheres ved hjælp af organiske opløsningsmidler, hvilket betyder, at der kan opnås et ekstrakt med en lugtprofil tæt på den oprindelige prøve. Engel et al.11 destillerede blandinger af n-alkaner under anvendelse af HVT- eller SAFE-destillation for at kontrollere effektiviteten. Destillatudbyttet ved hjælp af SAFE-systemet viste sig at være signifikant højere end HVT-udbyttet for hver alkan. Desuden kunne alkaner med kogepunkter under 285 °C genvindes fuldstændigt af SAFE.
Der skal lægges stor vægt på de eksperimentelle detaljer for yderligere vellykkede analyser. (1) Vakuumtrykket under SAFE-destillationen kan påvirke genvindingen af de flygtige bestanddele og skal holdes på et højt niveau, f.eks. ved at bremse prøvetilsætningen. (2) Det er nødvendigt at sikre, at opsamlingsflasken nedsænkes i flydende nitrogen, før systemet vender tilbage til atmosfærisk tryk, for at undgå, at flygtige opløsningsmidler kondenseres af den øverste højre kuldefælde eller trænger ind i vakuumpumpen. (3) Man bør sikre, at det cirkulerende vand tændes først og slukkes sidst. Det cirkulerende vand bør kun slukkes, når det flydende nitrogen er fjernet; Ellers fryser det enheden. (4) Vandbadet skal omrøres med en magnet for at hjælpe varmeoverførslen.
I dette studie blev SAFE-destillation udført før ekstraktionen af opløsningsmidlet. En omvendt procedure er også mulig, og dette ville være særligt fordelagtigt, hvis en stor mængde teinfusion ekstraheres først, og det opnåede ekstrakt derefter destilleres af SAFE. Udfordringen ved infusionsekstraktion ved anvendelse af et organisk opløsningsmiddel er den mulige dannelse af en emulsion. I dette tilfælde er der behov for yderligere trin for at genvinde det organiske lag, såsom centrifugering eller valg af forskellige opløsningsmidler. Efter eksperimentet skal SAFE-glasenheden rengøres. Ethanol eller acetone kan anvendes som rengøringsmiddel. Delene skal tørres før brug.
Sammenfattende foreslår denne protokol en metode til opnåelse af et aromakoncentrat med en lugtprofil tæt på den originale teprøve ved anvendelse af SAFE-destillation efterfulgt af opløsningsmiddelekstraktion. Denne metode kan anvendes på alle typer teprøver, herunder for eksempel instant tepulver og tekoncentrater, og er velegnet til molekylære sensoriske undersøgelser af te.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af National Natural Science Foundation of China (32002094, 32102444), China Agriculture Research System of MOF og MARA (CARS-19) og Innovation Project for Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS-ASTIP-TRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkane mix (C10-C25) | ANPEL | CDAA-M-690035 | |
| Alkane mix (C5-C10) | ANPEL | CDAA-M-690037 | |
| AMDIS | National Institute of Standards and Technology | version 2.72 | Gaithersburg, MD |
| Analytical balance | OHAUS | EX125DH | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm | ||
| Anhydrous sodium sulfate | aladdin | ||
| Black tea | Qianhe Tea | Huangshan, Anhui province, China | |
| Concentrator | Biotage | TurboVap | |
| Data processor | Agilent | MassHunter | |
| Dichloromethane | TEDIA | ||
| GC | Agilent | 7890B | |
| GC column | Agilent | DB-5MS | |
| Green tea | Qianhe Tea | Huangshan, Anhui province, China | |
| MS | Agilent | 5977B | |
| p-Xylene-d10 | Sigma-Aldrich | ||
| SAFE | Glasbläserei Bahr | ||
| Ultra-pure deionized water | Milipore | Milli-Q | |
| Vacuum pump | Edwards | T-Station 85H |
References
- Liang, S., et al. Processing technologies for manufacturing tea beverages: From traditional to advanced hybrid processes. Trends in Food Science & Technology. 118, 431-446 (2021).
- Guo, X. Y., Ho, C. T., Schwab, W., Wan, X. C. Aroma profiles of green tea made with fresh tea leaves plucked in summer). Food Chemistry. 363, 130328 (2021).
- Feng, Z. H., Li, M., Li, Y. F., Wan, X. C., Yang, X. G. Characterization of the orchid-like aroma contributors in selected premium tea leaves. Food Research International. 129, 108841 (2020).
- Hong, X., et al. Characterization of the key aroma compounds in different aroma types of Chinese yellow tea. Foods. 12 (1), 27 (2023).
- Flaig, M., Qi, S. C., Wei, G., Yang, X., Schieberle, P. Characterisation of the key aroma compounds in aLongjinggreen tea infusion (Camellia sinensis) by the sensomics approach and their quantitative changes during processing of the tea leaves. European Food Research and Technology. 246 (12), 2411-2425 (2020).
- Feng, Z., et al. Tea aroma formation from six model manufacturing processes. Food Chemistry. 285, 347-354 (2019).
- Wang, J. -Q., et al. Effects of baking treatment on the sensory quality and physicochemical properties of green tea with different processing methods. Food Chemistry. 380, 132217 (2022).
- Zhai, X., Zhang, L., Granvogl, M., Ho, C. -T., Wan, X. Flavor of tea (Camellia sinensis): A review on odorants and analytical techniques. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 21 (5), 3867-3909 (2022).
- Chaturvedula, V. S. P., Prakash, I. The aroma, taste, color and bioactive constituents of tea. Journal of Medicinal Plants Research. 5 (11), 2110-2124 (2011).
- Ridgway, K., Lalljie, S. P. D., Smith, R. M. Sample preparation techniques for the determination of trace residues and contaminants in foods. Journal of Chromatography A. 1153 (1-2), 36-53 (2007).
- Engel, W., Bahr, W., Schieberle, P. Solvent assisted flavour evaporation - A new and versatile technique for the careful and direct isolation of aroma compounds from complex food matrices. European Food Research and Technology. 209 (3-4), 237-241 (1999).
- Wang, B., et al. Characterization of aroma compounds of Pu-erh ripen tea using solvent assisted flavor evaporation coupled with gas chromatography-mass spectrometry and gas chromatography-olfactometry. Food Science and Human Wellness. 11 (3), 618-626 (2022).
- Zou, C., et al. Zijuan tea- based kombucha: Physicochemical, sensorial, and antioxidant profile. Food Chemistry. 363, 130322 (2021).
- Vandendool, H., Kratz, P. D. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. Journal of Chromatography. 11, 463-471 (1963).
- Khvalbota, L., Virba, M., Furdikova, K., Spanik, I. Simultaneous distillation-solvent extraction gas chromatography-mass spectrometry analysis of Tokaj Muscat Yellow wines. Separation Science Plus. 5 (8), 393-406 (2022).
- Ayalew, Y., et al. Volatile organic compounds of anchote tuber and leaf extracted using simultaneous steam distillation and solvent extraction. International Journal of Food Science. 2022, 3265488 (2022).
- Zhu, M., Li, E., He, H. Determination of volatile chemical constitutes in tea by simultaneous distillation extraction, vacuum hydrodistillation and thermal desorption. Chromatographia. 68 (7-8), 603-610 (2008).
- Lau, H., et al. Characterising volatiles in tea (Camellia sinensis). Part I: Comparison of headspace-solid phase microextraction and solvent assisted flavour evaporation. Lwt-Food Science and Technology. 94, 178-189 (2018).
- Li, Z. W., Wang, J. H. Analysis of volatile aroma compounds from five types of Fenghuang Dancong tea using headspace-solid phase microextraction combined with GC-MS and GC-olfactometry. International Food Research Journal. 28 (3), 612-626 (2021).
- Dong, F., et al. Herbivore-induced volatiles from tea (Camellia sinensis) plants and their involvement in intraplant communication and changes in endogenous nonvolatile metabolites. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (24), 13131-13135 (2011).
- Acena, L., Vera, L., Guasch, J., Busto, O., Mestres, M. Comparative study of two extraction techniques to obtain representative aroma extracts for being analysed by gas chromatography-olfactometry: Application to roasted pistachio aroma. Journal of Chromatography A. 1217 (49), 7781-7787 (2010).
- Kumazawa, K., Wada, Y., Masuda, H. Characterization of epoxydecenal isomers as potent odorants in black tea (Dimbula) infusion. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (13), 4795-4801 (2006).
- Wu, H. T., et al. Effects of three different withering treatments on the aroma of white tea. Foods. 11 (16), 2502 (2022).
- Wang, J., et al. Decoding the specific roasty aroma Wuyi rock tea (Camellia sinensis: Dahongpao) by the sensomics approach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 70 (34), 10571-10583 (2022).
