نهج التصوير داخل الجسم المبسط للمراقبة طويلة المدى لديناميكيات الأنسجة الظهارية على مجهر متحد البؤر مقلوب
Summary
يقدم البروتوكول أداة جديدة لتبسيط التصوير داخل الجسم باستخدام المجهر المقلوب متحد البؤر.
Abstract
يعد فهم السلوكيات الطبيعية والشاذة في الخلايا الحية أمرا ضروريا لتطوير التدخلات السريرية لإحباط بدء المرض وتطوره. لذلك من الأهمية بمكان تحسين مناهج التصوير التي تسهل مراقبة ديناميكيات الخلايا في الموقع ، حيث تظل بنية الأنسجة وتكوينها غير مضطربة. البشرة هي الحاجز الخارجي للجسم ، وكذلك مصدر السرطانات البشرية الأكثر انتشارا ، وهي سرطان الجلد الجلدي. توفر إمكانية الوصول إلى أنسجة الجلد فرصة فريدة لمراقبة سلوكيات الخلايا الظهارية والجلدية في السليمة باستخدام الفحص المجهري داخل الجسم غير الباضع. ومع ذلك ، فقد تم تحقيق نهج التصوير المتطور هذا في المقام الأول باستخدام المجاهر متعددة الفوتونات المستقيمة ، والتي تمثل حاجزا كبيرا أمام دخول معظم الباحثين. تقدم هذه الدراسة مجهرا مصمما خصيصا ، مطبوعا 3D ، مناسبا للاستخدام مع المجاهر متحدة البؤر المقلوبة ، مما يبسط التصوير داخل الجسم على المدى الطويل لجلد الأذن في الفئران المعدلة وراثيا الحية. نعتقد أن هذا الاختراع متعدد الاستخدامات ، والذي يمكن تخصيصه ليناسب العلامة التجارية للمجهر المقلوب والنموذج المفضل وتكييفه مع أنظمة الأعضاء الإضافية للصورة ، سيثبت أنه لا يقدر بثمن لمجتمع البحث العلمي الأكبر من خلال تعزيز إمكانية الوصول إلى الفحص المجهري داخل الجسم بشكل كبير. هذا التقدم التكنولوجي أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا لديناميكيات الخلايا الحية في السياقات الطبيعية والمرضية.
Introduction
الفحص المجهري داخل الجسم هو أداة قوية تسمح بمراقبة سلوكيات الخلايا في بيئاتها غير المضطربة في الجسم الحي. قدمت هذه الطريقة الفريدة رؤى رئيسية حول الأعمال الداخلية لأنظمة أعضاء الثدييات المعقدة ، بما في ذلك الرئة1 والدماغ2 والكبد3 والغدة الثديية4 والأمعاء5 والجلد6. علاوة على ذلك ، كشف هذا النهج عن تغيرات سلوكية للخلايا أثناء تطور الورم7 ، والتئام الجروح 8,9 ، والالتهاب10 ، وغيرها من الأمراض المتنوعة في الموقع. في هذه الدراسة ، نركز على تعزيز إمكانية الوصول إلى الفحص المجهري داخل الجسم لتصوير الديناميكيات الظهارية واللحمية الحية في جلد الفأر السليم. إن فهم سلوكيات الخلايا في جلد الثدييات له أهمية سريرية عالية بسبب القدرة التجديدية والأورام الرائعة لهذا النسيج.
تم إجراء التصوير داخل الجسم في الفئران بشكل أساسي باستخدام المجاهر متعددة الفوتونات المستقيمة نظرا لقدرتها على توفير تصوير عالي الدقة على أعماق الأنسجة >100 ميكرومتر11,12. ومع ذلك ، تفتقر هذه الأدوات إلى تعدد استخدامات العمود الفقري وإمكانية الوصول بشكل عام للمجاهر متحدة البؤر المقلوبة ، والتي تكون أكثر سهولة في الاستخدام وفعالية من حيث التكلفة ، وتوفر القدرة على تصوير الخلايا المستزرعة ، ولا تتطلب ظلاما كاملا أثناء الحصول على الصور ، وهي أكثر أمانا بشكل عام ، من بين مزايا ملحوظة أخرى13,14. في هذه الدراسة ، نقدم أداة جديدة تعزز بشكل كبير إمكانية الوصول إلى التصوير داخل الجسم من خلال تكييف هذا النهج للمجاهر متحدة البؤر المقلوبة.
هنا ، نقدم تصميم إدراج مرحلة مخصص مطبوع ثلاثي الأبعاد يتضمن العديد من الميزات الرئيسية لتسهيل التصوير المستقر والطويل المدى داخل الجسم لجلد أذن الفأر على مجهر متحد البؤر مقلوب (الشكل 1 ، الشكل 2 ، الشكل 3 ، الشكل 4 ، والشكل 5). تتضمن هذه الميزات المتخصصة ثقبا موضوعيا للإزاحة يسمح لجسم الفأر البالغ بالكامل بالاستلقاء تماما أثناء التصوير. هذا يقلل من التداخل الاهتزازي لحركات جسم الفأر على التصوير ويلغي الحاجة إلى إعطاء الكيتامين والزيلازين لتثبيط التنفس ، وهي ممارسة غالبا ما تقترن بالتصوير داخل الجسم6. بالإضافة إلى ذلك ، تضع أقواس الزاوية الموجودة على الملحق مخروط أنف إيزوفلوران بشكل صحيح لمحاذاة وجه الماوس ، ومشبك أذن معدني يجمد أذن الماوس إلى قرص غطاء مصمم خصيصا ، ولوحة حرارية اختيارية مغلقة الحلقة للارتجاع البيولوجي قابلة للفصل تقع داخل الملحق لدعم درجة حرارة جسم الماوس أثناء جلسات التصوير الطويلة. تم إنشاء قرص غطاء مخصص ، والذي يوفر سطحا مستويا ضروريا لرأس الفأر والأذن ليكون مسطحا ، في ورشة آلات عن طريق إزالة جدران طبق زراعة الخلايا العام الذي يحتوي على غطاء الغطاء. يوفر استخدام عدسة غمر زيت السيليكون 40x (فتحة رقمية 1.25 [N.A.] ، مسافة عمل 0.3 مم) جنبا إلى جنب مع قرص غطاء الانزلاق وإدراج المسرح المخصص صورا عالية الدقة >50 ميكرومتر في عمق أدمة الأذن.
لاختبار وظائف إدخال مرحلة المجهر المقلوب الجديد هذا ، التقطنا مداخن z تغطي جميع طبقات ظهارة البشرة على مدار 3 ساعات في أذن فأر بالغ K14-H2B-mCherry15 معدل وراثيا (تحتوي النوى الظهارية في خط الماوس هذا على ملصق فلوري أحمر) (الشكل 6A-A‘). لقد التقطنا أيضا مداخن z تمتد على عدة طبقات من الخلايا الليفية داخل الأدمة الجلدية على مدار 3 ساعات في أذن Pdgfra-rtTA16 المعدلة وراثيا الحية. pTRE-H2B-GFP17 فأر بالغ (تحتوي نوى الخلايا الليفية في خط الفأر هذا على ملصق فلوري أخضر بعد تحريض الدوكسيسيكلين) (الشكل 6B-D ‘). تظهر بياناتنا عالية الدقة استقرارا ثابتا بسبب عدم الانجراف في المستويات x و y و z ، مما يثبت فعالية أداة التصوير الجديدة داخل الجسم هذه للاستخدام على المجاهر المقلوبة. الأهم من ذلك ، يمكن تعديل أبعاد إدراج المرحلة المطبوع ثلاثي الأبعاد ، كما هو موضح في الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3 ، لتناسب أي مجهر مقلوب ، ويمكن نقل موضع الفتحة الموضوعية إلى مواقع بديلة داخل الإدراج لتناسب بشكل أفضل تصوير نسيج معين و / أو نموذج حيواني مهم. وبالتالي يمكن لهذا الاختراع أن يمكن المختبرات الفردية ، أو الباحثين الذين لديهم وصول متحد البؤر للمنشأة الأساسية ، من تكييف هذه الأداة مع احتياجات التصوير الفريدة داخل الجسم الحيوي ، وبالتالي تبسيط تقييم بيولوجيا الخلية المتنوعة في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، نقدم أداة جديدة تسهل التصوير المستقر والطويل الأمد داخل الجسم لظهارة جلد الفأر السليمة على المجاهر متحدة البؤر المقلوبة. يتكون هذا الاختراع من جيش التحرير الشعبى الصينى, وهو الأكثر شيوعا وغير مكلفة 3D المواد القابلة للطباعة; جميع تكاليف الطباعة ثلاثية الأبعاد الداخلية له?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر فالنتينا جريكو على الفئران K14-mCherry-H2B. نحن ممتنون لورشة آلات قسم الفيزياء بجامعة إيموري لتوليد أقراص الغطاء الزجاجي. تم تمويل هذا العمل من قبل جائزة التطوير الوظيفي #IK2 BX005370 من خدمة BLRD التابعة لوزارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكية إلى LS ، وجوائز NIH RF1-AG079269 و R56-AG072473 إلى MJMR ، وجائزة I3 Emory SOM / GT الحاسوبية وتحليل البيانات إلى MJMR.
Materials
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller – Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
References
- Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
- Nal Chen, ., et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy. Cells. 11 (14), 2196 (2022).
- Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).
- Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. Multidimensional imaging of breast cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).
- Fischer, M., Edelblum, K. L. Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration. Current Protocols. 2 (8), (2022).
- Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin. Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).
- Pal Arndt, ., et al. A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system. Frontiers in Physiology. 13, 980787 (2022).
- Oal Yam, A., et al. Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy. Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).
- Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).
- Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008 (2011).
- Tauer, U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).
- Yoshitake, T., et al. Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue. Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021 (2016).
- Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool. Nature. 522, 94-97 (2015).
- Ral Li, ., et al. Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response. eLife. 7, (2018).
- Tal Tumbar, ., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563 (2011).
- Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).
