倒立共焦点顕微鏡での上皮組織動態を長期モニタリングするための合理化された生体内イメージングアプローチ
Summary
このプロトコルは、倒立共焦点顕微鏡を使用して生体内イメージングを簡素化する新しいツールを提供します。
Abstract
in vivo 細胞の正常な挙動と異常な挙動を理解することは、疾患の開始と進行を阻止するための臨床的介入を開発するために必要です。したがって、組織の構造と組成が乱れていない in situでの細胞動態の観察を容易にするイメージングアプローチを最適化することが重要です。表皮は体の最も外側のバリアであり、最も一般的なヒトの癌、すなわち皮膚癌の発生源でもあります。皮膚組織のアクセシビリティは、非侵襲的生体内顕微鏡を使用して、無傷の動物の上皮および真皮細胞の挙動をモニターするユニークな機会を提供します。それにもかかわらず、この高度なイメージングアプローチは、主に直立多光子顕微鏡を使用して達成されており、ほとんどの研究者にとって参入の大きな障壁となっています。この研究では、倒立共焦点顕微鏡での使用に適したカスタム設計の3Dプリント顕微鏡ステージインサートを提示し、生きたトランスジェニックマウスの耳の皮膚の長期的な生体内イメージングを合理化します。この汎用性の高い発明は、選択した倒立顕微鏡のブランドとモデルに合わせてカスタマイズでき、追加の臓器系のイメージングに適応できるため、生体内顕微鏡のアクセシビリティを大幅に向上させることで、より大きな科学研究コミュニティにとって非常に貴重であることが証明されると信じています。この技術的進歩は、正常および疾患における生細胞動態の理解を深めるために重要です。
Introduction
生体内顕微鏡は、in vivo環境での細胞挙動のモニタリングを可能にする強力なツールです。このユニークな手法は、肺1、脳2、肝臓3、乳腺4、腸5、皮膚6など、複雑な哺乳類の器官系の内部構造に関する重要な洞察をもたらしました。さらに、このアプローチにより、腫瘍発生7、創傷治癒8,9、炎症10、およびその他の多様な病態における細胞の挙動変化が明らかになりました。この研究では、無傷のマウス皮膚の生きた上皮および間質の動態を画像化するための生体内顕微鏡検査のアクセシビリティを高めることに焦点を当てています。哺乳類の皮膚における細胞挙動を理解することは、この組織の顕著な再生能力と腫瘍形成能力のために臨床的に非常に重要です。
マウスの生体内イメージングは、組織深度>100μm11,12)で高解像度イメージングを提供する能力があるため、主に直立多光子顕微鏡を使用して行われてきました。それにもかかわらず、これらの機器は、よりユーザーフレンドリーで費用対効果が高く、培養細胞を画像化する機能を提供し、画像取得中に完全な暗闇を必要とせず、一般的に安全であり、他の注目すべき利点の中でも特に、倒立共焦点顕微鏡の主力の汎用性とより一般的なアクセス性を欠いています13,14.本研究では、このアプローチを倒立共焦点顕微鏡に応用することで、生体内イメージングのアクセシビリティを大幅に向上させる新しいツールを紹介します。
ここでは、倒立共焦点顕微鏡でマウスの耳の皮膚を安定して長期間にわたって生体内イメージングするために、いくつかの重要な機能を組み込んだ3Dプリントによるカスタムステージインサートデザインを紹介します(図1、図2、図3、図4、図5)。 これらの特殊な機能には、イメージング中に成体マウスの全身を完全に平らにすることができるオフセット対物レンズ穴が含まれます。これにより、マウスの体の動きがイメージングに及ぼす振動干渉が最小限に抑えられ、呼吸を弱めるためにケタミンやキシラジンを投与する必要がなくなります6。さらに、インサートのコーナーブラケットは、イソフルランノーズコーンをマウスの表面に合わせるように正しく配置し、金属製のイヤークリップはマウスの耳を特注のカバーガラスディスクに固定し、オプションの取り外し可能なクローズドループバイオフィードバックヒートプレートは、長時間のイメージングセッション中にマウスの体温をサポートするためにインサート内の高さにあります。マウスの頭と耳を平らにするために不可欠な平らな表面を提供するカスタムカバーガラスディスクは、一般的なカバーガラスを含む細胞培養皿の壁を取り外して機械工場で作成されました。40倍シリコーンオイル浸漬レンズ(開口数1.25、作動距離0.3mm)をカバーガラスディスクとカスタムステージインサートと組み合わせて使用することで、耳の真皮の深さ>50μmの高解像度画像を提供します。
この新しい倒立顕微鏡ステージインサートの機能を試験するために、生きたトランスジェニックK14-H2B-mCherry15成体マウス(このマウス系統の上皮核には赤色蛍光標識が含まれています)の耳で、すべての表皮上皮層にわたるzスタックを3時間にわたってキャプチャしました(図6A-A‘)。また、皮膚真皮内のいくつかの線維芽細胞層にまたがるzスタックを、生きたトランスジェニックPdgfra-rtTA16の耳で3時間の時間経過でキャプチャしました。pTRE-H2B-GFP17成体マウス(このマウス系統の線維芽細胞核は、ドキシサイクリン誘導後の緑色蛍光標識を含む)(図6B-D‘)。当社の高解像度データは、x、y、z平面のドリフトがないことによる一貫した安定性を示しており、倒立顕微鏡で使用するこの新しい生体内イメージングツールの有効性を証明しています。重要なことは、この3Dプリントされたステージインサートの寸法は、補足ファイル1、補足ファイル2、および補足ファイル3に記載されているように、任意の倒立顕微鏡に合うように調整することができ、対物レンズの開口部の位置をインサート内の別の場所に移動して、関心のある特定の組織および/または動物モデルのイメージングにより適したものにすることができることである。 したがって、本発明は、個々の研究室、またはコア施設の共焦点アクセスを持つ研究者が、このツールを独自の生体内イメージングニーズに適合させ、それによって多様なin vivo細胞生物学の評価を合理化することを可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、倒立共焦点顕微鏡を用いて、無傷のマウス皮膚上皮を安定して長期間生体内イメージングすることを容易にする新しいツールを紹介します。この発明は、最も一般的で安価な3Dプリント可能な材料であるPLAで作られています。このインサートの社内3Dプリント費用は5<ドルです。2つの独立したインサートピース(図1、補足 ファイル1、 およ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
K14-mCherry-H2Bマウスを提供してくれたValentina Grecoに感謝します。ガラス製カバーガラスディスクを製造してくれたエモリー大学物理学科の機械工場に感謝します。この研究は、米国退役軍人省BLRDサービスからLSへのキャリア開発賞 #IK2 BX005370、MJMRへのNIH賞RF1-AG079269およびR56-AG072473、MJMRへのI3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Awardから資金提供を受けました。
Materials
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller – Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
References
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