Summary
הפרוטוקול מציג כלי חדש לפישוט הדמיה תוך חיונית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך.
Abstract
הבנת התנהגויות נורמליות וחריגות של תאי in vivo נחוצה לפיתוח התערבויות קליניות לסיכול התחלת המחלה והתקדמותה. לכן חיוני לייעל גישות הדמיה המאפשרות תצפית על דינמיקה של תאים באתרם, כאשר מבנה הרקמה והרכבה נותרים ללא הפרעה. האפידרמיס הוא המחסום החיצוני ביותר של הגוף, כמו גם המקור לסרטן האנושי הנפוץ ביותר, כלומר קרצינומה עורית של העור. הנגישות של רקמת העור מהווה הזדמנות ייחודית לנטר התנהגויות אפיתל ותאי עור בבעלי חיים שלמים באמצעות מיקרוסקופ תוך-חיוני לא פולשני. עם זאת, גישת הדמיה מתוחכמת זו הושגה בעיקר באמצעות מיקרוסקופים רבי-פוטונים זקופים, המהווים חסם כניסה משמעותי עבור רוב החוקרים. מחקר זה מציג עלון במה מותאם אישית למיקרוסקופ מודפס בתלת-ממד המתאים לשימוש עם מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, ומייעל את ההדמיה התוך-חיונית ארוכת הטווח של עור האוזן בעכברים טרנסגניים חיים. אנו מאמינים כי המצאה רב-תכליתית זו, אשר עשויה להיות מותאמת אישית כך שתתאים למותג המיקרוסקופ ההפוך ולדגם המועדף ותותאם לתמונות של מערכות איברים נוספות, תוכיח את עצמה כבעלת ערך רב לקהילת המחקר המדעי הגדולה יותר על ידי שיפור משמעותי של הנגישות של מיקרוסקופיה תוך חיונית. התקדמות טכנולוגית זו היא קריטית לחיזוק הבנתנו את הדינמיקה של תאים חיים בהקשרים נורמליים ומחלות.
Introduction
מיקרוסקופיה תוך-חיונית היא כלי רב עוצמה המאפשר ניטור של התנהגויות תאים בסביבות in-vivo שאינן מוטרדות. שיטה ייחודית זו סיפקה תובנות מפתח על פעולתן הפנימית של מערכות איברים מורכבות של יונקים, כולל ריאות1, מוח2, כבד3, בלוטת חלב4, מעי5 ועור6. יתר על כן, גישה זו חשפה שינויים התנהגותיים בתאים במהלך התפתחות הגידול7, ריפוי פצעים8,9, דלקת10, ופתולוגיות מגוונות אחרות באתרן. במחקר זה אנו מתמקדים בשיפור הנגישות של מיקרוסקופ תוך-חיוני לדימוי דינמיקה חיה של אפיתל וסטרומה בעור עכבר שלם. הבנת התנהגויות תאים בעור יונקים היא בעלת חשיבות קלינית גבוהה בשל יכולת ההתחדשות והגידול המדהימה של רקמה זו.
הדמיה תוך-חיונית בעכברים בוצעה בעיקר באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון זקוף בשל יכולתם לספק הדמיה ברזולוציה גבוהה בעומקי רקמות >100 מיקרומטר11,12. עם זאת, מכשירים אלה חסרים את הרבגוניות של סוס העבודה ואת הנגישות הכללית יותר של מיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים, שהם ידידותיים יותר למשתמש וחסכוניים יותר, מספקים את היכולת לצלם תאים בתרבית, אינם דורשים חושך מוחלט במהלך רכישת תמונה, והם בדרך כלל בטוחים יותר, בין יתרונות בולטים אחרים13,14. במחקר זה אנו מציגים כלי חדש המשפר באופן משמעותי את נגישות ההדמיה התוך-חיונית על ידי התאמת גישה זו למיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים.
כאן, אנו מציגים עיצוב של עלון במה מותאם אישית המודפס בתלת-ממד המשלב מספר תכונות עיקריות כדי להקל על הדמיה תוך-חיונית יציבה וארוכת טווח של עור אוזני עכבר במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך (איור 1, איור 2, איור 3, איור 4 ואיור 5). תכונות מיוחדות אלה כוללות חור אובייקטיבי אופסט המאפשר את כל הגוף של עכבר בוגר לשכב שטוח לחלוטין במהלך ההדמיה. זה ממזער את הפרעות הרטט של תנועות גוף העכבר בהדמיה ומבטל את הצורך לתת קטמין וקסילזין כדי לדכא את הנשימה, תרגול שלעתים קרובות משולב עם הדמיה תוך חיונית6. בנוסף, סוגריים פינתיים בעלון ממקמים נכון חרוט אף איזופלורני כדי ליישר קו עם פני העכבר, אטב אוזניים מתכתי משתק את אוזן העכבר לדיסק כיסוי שנבנה בהתאמה אישית, ופלטת חום ביופידבק אופציונלית בלולאה סגורה הניתנת להסרה מונחת בתוך העלון כדי לתמוך בטמפרטורת גוף העכבר במהלך מפגשי הדמיה ארוכים. דיסק הכיסוי המותאם אישית, המספק משטח שטוח החיוני לראש העכבר ולאוזן לשכב שטוחים, נוצר בחנות מכונות על ידי הסרת הדפנות של צלחת תרבית תאים גנרית המכילה כיסוי. השימוש בעדשת טבילה בשמן סיליקון 40x (צמצם מספרי 1.25 [N.A.], מרחק עבודה של 0.3 מ"מ) בשילוב עם דיסק הכיסוי ותוספת הבמה המותאמת אישית מספק תמונות ברזולוציה גבוהה >50 מיקרומטר עמוק לתוך הדרמיס של האוזן.
כדי לבחון את הפונקציונליות של שלב המיקרוסקופ ההפוך החדש הזה, לכדנו ערימות z המשתרעות על פני כל שכבות אפיתל האפידרמיס במהלך זמן של 3 שעות באוזן של עכבר בוגר חי מהונדס K14-H2B-mCherry15 (גרעיני אפיתל בקו העכבר הזה מכילים תווית פלואורסצנטית אדומה) (איור 6A-A'). לכדנו גם ערימות z המשתרעות על פני מספר שכבות פיברובלסטים בתוך דרמיס העור במהלך 3 שעות באוזן של Pdgfra-rtTA16 מהונדס חי; pTRE-H2B-GFP17 עכבר בוגר (גרעיני פיברובלסטים בקו העכבר הזה מכילים תווית פלואורסצנטית ירוקה לאחר השראת דוקסיציקלין) (איור 6B-D'). הנתונים ברזולוציה גבוהה שלנו מראים יציבות עקבית על ידי חוסר סחף במישורי x, y ו- z, ובכך מוכיחים את יעילותו של כלי הדמיה תוך חיוני חדש זה לשימוש במיקרוסקופים הפוכים. חשוב לציין, ניתן להתאים את הממדים של תוספת שלב זו המודפסת בתלת-ממד, כמתואר בקובץ משלים 1, קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3, כך שיתאימו לכל מיקרוסקופ הפוך, וניתן להעביר את מיקום פתח המטרה למיקומים חלופיים בתוך העלון כדי להתאים טוב יותר להדמיית רקמה מסוימת ו/או מודל בעל חיים מעניין. המצאה זו יכולה אפוא להעצים מעבדות בודדות, או חוקרים עם גישה קונפוקלית למתקני הליבה, להתאים כלי זה לצרכי הדימות התוך-חיוניים הייחודיים שלהם, ובכך לייעל את ההערכה של ביולוגיה מגוונת של התא in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה בוצע בהתאם להנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אמורי והמרכז הרפואי לענייני חיילים משוחררים באטלנטה ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).
1. התקנת עלון ההדמיה החיה על במת המיקרוסקופ ההפוך
- בנה את ההוספה באמצעות קובצי .stl (קובץ משלים 1, קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3) המציינים את הממדים והעיצוב התלת-ממדיים (ראה איור 1 ואיור 2A), מדפסת תלת-ממד וחומצה פולילקטית (PLA).
- הניחו בזהירות את האינסרט (איור 2B,C) בחריץ הגדול של שלב המיקרוסקופ (איור 2C ואיור 3A). השתמשו בברגים כדי לאבטח את האינסרט באמצעות ארבעה חורי ברגים הממוקמים בכל פינה של האינסרט (איור 2B-C).
הערה: העלון הוא דו-כיווני וניתן לסובב אותו ב-180° בהתאם לכיוון שלב המיקרוסקופ ומנגנון ההרדמה. - החליקו את לוחית החום לתוך תקע ההוספה כלפי מטה (איור 2D) כך שהיחידה תניח על גבי חריצי ההוספה התחתונים כשיציאת התקע עוברת מתחת לשלב (איור 3B).
- יישרו את הפתח העגול והמחורץ באינסרט עם יעד טבילה של שמן סיליקון 40x (איור 3C) ומרחו שמן סיליקון על מרכז המטרה.
- אם ההדמיה נמשכת פרקי זמן ארוכים יותר (>1 שעות), יש למרוח כמות נדיבה של שמן שתישאר בממשק הכיסוי/אובייקטיבי לאורך כל ההדמיה. אין לאפשר לשמן להישפך על קצוות העדשה.
- השתמשו במזרק כדי למרוח כמות קטנה של שומן ואקום לאורך הפתח העגול והמחורץ והניחו את דיסק הכיסוי מעליו כדי לאטום את האינסרט (איור 3D).
הערה: דיסק הכיסוי נוצר על ידי הסרת הדפנות של צלחת תרבית תאים בתחתית זכוכית בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ (מבוצעת על ידי חנות מכונות). - מרימים את המטרה פי 40 עד שהשמן נושק לתחתית מכסה הזכוכית.
2. תצורת איזופלורן והכנת עכבר
- מקם את רכיבי הוופורייזר האלקטרוני בזרימה נמוכה (תא הרדמה, צינורות, וופורייזר, מיכל פחם) כדי לאפשר לקונוס האף ולצינורות המחוברים להגיע לאינסרט (איור 3A).
אזהרה: איזופלורן הוא חומר הרדמה באינהלציה ויש לטפל בו בזהירות כדי למנוע שפיכות ולמזער את החשיפה לבני אדם. - יש למדוד את משקל בקבוק האיזופלורן לפני השימוש ולתושם. חברו את הפקק מהוופורייזר האלקטרוני לבקבוק האיזופלורן.
- חבר את כבל החשמל למכשיר האידוי האלקטרוני. סגרו את אטבי חרוט האף הכחולים ופתחו את אטבי תא האינדוקציה הלבנים כדי לאפשר זרימת אוויר דרך התא לתוך מכל הפחם. הסר את מכסה האוויר האדום מצדה השמאלי של ההתקן כדי לאפשר זרימת אוויר.
- אפשר למערכת להתחמם במשך 5 דקות ב-200 מ"ל/דקה (זרימה נמוכה) ו-2% איזופלורן.
הערה: למרות שהגדרת חרוט האף נבחרה, קו חרוט האף הכחול צריך להישאר סגור, וקו תא האינדוקציה הלבן צריך להישאר פתוח. - ברגע שהמערכת מאוזנת כראוי, נקה את הקווים כדי להסיר את שאריות האיזופלורן מהחדר.
- מקם את העכבר בתא האינדוקציה ובחר זרימה גבוהה. השלם את כל הכנת העכבר (כלומר, הסרת שיער, אספקת תרופות מקומית, מריחת משחת עיניים וכו ') לפני הנחת גוף בעל החיים על גבי העלון. ודא שהעכבר מורדם לחלוטין באמצעות שיטת רפלקס צביטת הבוהן.
- כאשר הרגל מורחבת, השתמש בציפורן כדי לצבוט בחוזקה את הבוהן מבלי לגרום נזק פיזי. אם העכבר מפגין תגובה חיובית לגירוי (כלומר, נסיגה ברגל, עווית ברגל וכו '), המשך לתת הרדמה בתוך החדר עד שלא נצפתה תגובה. לאחר הרדמה מתאימה, קצב נשימת העכבר צריך להאט ל~ 55-65 נשימות לדקה18.
- כאשר העכבר מורדם לחלוטין, בחר שוב זרימה גבוהה כדי לעצור את העברת האיזופלורן. נקו את התא לפני פתיחתו וכווננו את האטבים (כחול: פתוח; לבן: סגור) כדי להעביר איזופלורן דרך חרוט האף. בחר זרימה נמוכה כאשר חרוט האף מחובר לעכבר כדי להמשיך בהעברת איזופלורן.
- צינורות איזופלורן חוט עם חרוט האף המחובר דרך תושבת הצינור הפינתי באינסרט (איור 3A ואיור 5).
3. מיקום העכבר על העלון לצורך הדמיה תוך חיונית
- חברו את פלטת החום לבקר (המכילה בדיקה אנאלית מחוברת), הפעילו אותה ואפשרו לצלחת להגיע לטמפרטורה של 36°C (איור 4A).
- הוציאו את העכבר המרדים מתא האינדוקציה ושכבו על פלטת החום (איור 4B ואיור 5A). בצע את ההעברה מהחדר להחדרה במהירות כדי למזער את הזמן שהעכבר פעיל ללא הרדמה ממסים נדיפים.
- הצמידו את חרוט האף לעכבר (איור 4B,C ואיור 5). במידת הצורך, השתמש בסרט כדי לאבטח עוד יותר את הזווית והמיקום של חרוט האף.
- הכנס את הבדיקה האנאלית וכוונן את טמפרטורת הבקר עד שטמפרטורת גוף העכבר יציבה ב~36 מעלות צלזיוס (איור 4A,B). לאחר שהעכבר ממוקם כראוי, השתמשו בניילון נצמד כדי ללכוד חום, במידת הצורך, כדי לתמוך עוד יותר בטמפרטורת הגוף המתאימה (איור 4C).
- מקם את העכבר כך שהראש יתיישר עם דיסק הכיסוי והכנס את האוזן למרכז מכסה הזכוכית באמצעות אטב אוזניים מתכתי (איור 5A,B) או סרט (איור 5C).
הערה: ניתן לכוונן את הלחץ של אטב האוזן המתכתי על האוזן על-ידי שחרור הבורג שמחבר את האטב לעלון. ניתן להוסיף קפיץ מתכת לגמישות הידוק קליפס מוגברת.- כדי לשנות את מיקום אטב האוזן, פתחו את הברגת הבורג באמצעות מפתח אלן בקוטר 2.5 מ"מ והעבירו אותו לאתר המשני (איור 2B,C). בעת הרכבה מחדש של אטב האוזן, הניחו את האטב כנגד העלון, ולאחר מכן את מכונת הכביסה מעליו. השתמש בבורג כדי להדק היטב את התפס בכוח קל כדי לסובב את התפס.
- התאימו את מיקום ה-z האובייקטיבי עד שהתאים יהיו בתוך מקום המוקד (איור 6A,D). הגדר את הפרמטרים z-stack ו- time-lapse בהתאם למטרות הניסוי והתחל ברכישת תמונה.
הערה: אם הושגה ההגדרה הנכונה, ניתן לצלם את אוזן העכבר במשך 3 שעות רצופות לפחות (איור 6A',D).- לאחר קביעת גבולות מחסנית z, כוונן את עוצמת הלייזר ואת הרווח כדי להבטיח שאף מישור z אינו רווי יתר על המידה כדי למזער את ההלבנה. קבע את פרמטרי קיטועי הזמן באמצעות העובי הכולל של ערימת z, מספרי צעדים (מומלץ דגימת Nyquist) ומרווחי זמן.
- לקבוע את פרמטרי ההדמיה (מרווחי זמן, זמן הדמיה כולל וכו ') באמצעות גורמים מרובים, כולל כדאיות בעלי חיים תחת הרדמה, הלבנה / פוטוטוקסיות המושרה בלייזר, והמטרה של הדמיה חיה (כלומר, דינמיקה של חלוקת תאים, אינטראקציות תא-תא וכו ').
4. הפסקת הדמיה
- הפעל את כרית החום במחזור המים והגדר למחזור רציף ו- 35 ° C למשך 30 דקות לפחות לפני סיום רכישת התמונה.
- בסיום ההדמיה, בחר זרימה נמוכה במכשיר האידוי האלקטרוני כדי לעצור את העברת האיזופלורן ולהעביר את העכבר לכרית חום עד לאמבולטורי.
- לאחר התעוררות, החזירו את העכבר למיכל ההעברה תוך המשך שמירה על כרית חום עד לאמולטורי מלא. נטר באופן עקבי את העכבר בזמן שהוא על כרית החום עד שהוא מגיב.
- במכשיר האידוי האלקטרוני, לחץ על בחר תפריט > בקרת הרדמה > ריק. הסר את בקבוק האיזופלורן מהמערכת והחזיר את פקק היצרן לבקבוק.
- מדדו את משקל בקבוק האיזופלורן ומיכל הפחם והכניסו משקולות לבול עץ. לאחר שמיכל הפחם שוקל 50 גרם מעל המדידה הבסיסית, השליכו את המיכל והחליפו אותו ביחידה חדשה. החזר את האיזופלורן לתיבת הנעילה.
- הסר את דיסק הכיסוי ונגב באמצעות נייר עדשה ותמיסת עדשה. יש לאחסן כראוי כדי למנוע שריטות לשימוש חוזר.
- הסר את צינורית ההרדמה מתושבת ההחדרה ופתח את ההברגה משלב המיקרוסקופ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הרכבה נכונה של עלון הדמיה חיה במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך והתמצאות מתאימה של עכבר מהונדס על גבי העלון מאומתת על ידי רכישת ערימות z של רקמת אוזן חיה עם תווית פלואורסצנטית לאורך מסלול זמן ≥1 שעות עם עדות מינימלית לסחף בצירי x, y ו-z. יש לצלם תמונות במרווחי זמן קבועים (זמן המרווח יהיה תלוי בשאלה הביולוגית, עוצמת האות הפלואורסצנטי וכו ') כך שניתן יהיה לעקוב אחר דינמיקת התא וסחף התמונה לאורך זמן. במהלך הזמן, ניטור של מישורי Z בודדים כדי לוודא שהם נשארים בפוקוס מגלה אם תנועת בעלי חיים מפריעה ליציבות ההדמיה. דוגמה למישורי z בודדים שנותרו בפוקוס לאורך מסלול זמן ממושך באמצעות עלון הדמיה חיה מתוארת באיור 6.
תמונות מארבע נקודות זמן של 60 דקות המוצגות באיור 6A' נבחרו מתוך סרט קיטועי זמן של 3 שעות של תאי אפידרמיס mCherry+ באוזן של עכבר K14-H2B-mCherry זכר בוגר בן 3 חודשים (~30 גרם) שצולמו במרווחים של 2 דקות באמצעות צעד z של 0.246 מיקרומטר כדי להשיג דגימת Nyquist על פני עומק z כולל של 24 מיקרומטר (99 תמונות z-stack שנרכשו בכל נקודת זמן).
תמונות מארבע נקודות זמן של 60 דקות המוצגות באיור 6D' נבחרו מתוך סרט קיטועי זמן של 3 שעות של פיברובלסטים עוריים GFP+ באוזן של נקבה בוגרת בת 8 חודשים Pdgfra:rtTA; pTRE:עכבר H2B-GFP (~ 30 גרם; איור 6B). אלה צולמו במרווחים של 5 דקות באמצעות צעד z של 2 מיקרומטר כדי להשיג דגימה Nyquist על פני עומק z כולל של 54 מיקרומטר (28 תמונות z-stack שנרכשו בכל נקודת זמן). עכבר זה טופל ב-2 מ"ג דוקסיציקלין פעם ביומיים במשך 6 ימים (ארבעה טיפולים, 8 מ"ג בסך הכל) לפני ההדמיה (איור 6C).
איור 1: עיצוב מותאם אישית של תוספת במה מודפסת בתלת-ממד. (A,B) עיצוב ומידות של תוספת מותאמת אישית המודפסת בתלת-ממד עם פתח לוחית חום (A), וכן מחזיק תחתון של לוחית חום (B), המודפס בנפרד ולאחר מכן מוברג לתוך העלון (ראה קובץ משלים מתאים 1, קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עלון שלב חדש מייעל את ההדמיה התוך-חיונית במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך . (A) הכנס נבנה באמצעות מדפסת תלת-ממד. (ב) דגם פשוט ללא מכשיר חימום; עלון ההדמיה החיה מכיל ארבעה אתרי בורג (חיצים כחולים) לחיבור שלב המיקרוסקופ. אטב האוזן המתכתי משטח ומשתק את האוזן על דיסק פלסטיק ברוחב 35 מ"מ המכיל כיסוי זכוכית ברוחב 20 מ"מ. העלון מכיל שתי אפשרויות למיקום אטב אוזניים כדי לספק גמישות בכיוון העכבר. מיקום א-סימטרי של החור האובייקטיבי מאפשר לעכבר הבוגר לשכב שטוח. סוגריים צדדיים מיישרים ומשתקים את חרוט האף האיזופלורני כדי להקל על חיבור העכבר. המודל הפשוט דורש מיקום של כרית חימום קטנה (או מקור חום חלופי) מתחת לעכבר כדי לסייע בוויסות טמפרטורת הגוף. (C) דגם הוספה מתקדם עם פלטת חום מובנית. (D) פלטת החום מותקנת על ידי החלקה לתוך פתח מחורץ של העלון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: עלון הדמיה תוך-חיוני המותקן על במת מיקרוסקופ הפוך. (A) הכנס מותקן על במת מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך הסורק לייזר. הקרבה של הוופורייזר והתא של האיזופלורן מאפשרת השחלה של צינור חרוט האף דרך תושבת ההחדרה. (B) תקע לוחית החום משתרע מתחת לשלב המיקרוסקופ כדי להתחבר לבקר. (C) חור ההוספה מתיישר עם מטרת סיליקון של 40x. (D) דיסק פלסטיק (בקוטר 35 מ"מ) המכיל כיסוי זכוכית (בקוטר 20 מ"מ) מונח על גבי הפתח המחורץ של כניסת הבמה ואטום במקומו בשמן ואקום. דיסק הכיסוי נוצר על ידי הסרת הדפנות של צלחת תרבית תאים בתחתית זכוכית בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניטור טמפרטורת הגוף של בעלי חיים באמצעות בקר לוחית חום. (A) בקר לוחית חום, שניתן לכוונן כדי לייצב את טמפרטורת גוף העכבר בטמפרטורה אופטימלית של 36°C לאורך כל סשן ההדמיה התוך-חיונית. (B) בדיקה אנאלית משמשת לניטור טמפרטורת גוף העכבר ברגע שהעכבר מונח על פלטת החום. (C) ניתן להשתמש בניילון נצמד כדי ללכוד חום כדי להעלות עוד יותר את טמפרטורת גוף העכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מיקום העכבר על עלון ההדמיה התוך-חיונית . (A) גוף העכבר פרוש לאורך החלק העליון של פלטת החום, כאשר האוזן ממורכזת על מכסה הזכוכית ומשותקת באמצעות אטב אוזניים מתכתי. הסוגר ממקם את חרוט האף האיזופלורני לחיבור עכבר. (B) אזור מוגדל של (A) המראה אימוביליזציה של אוזני עכבר עם אטב אוזניים מתכתי על מכסה הזכוכית וחיבור חרוט האף האיזופלורני לעכבר. (C) ניתן להשתמש בסרט הדבקה כשיטה חלופית להצמדת האוזן לכיסוי הזכוכית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: הוספה מותאמת אישית מאפשרת הדמיה תוך-חיונית יציבה לטווח ארוך של אפידרמיס אוזניים ופיברובלסטים של עכברים . (A) מישור Z יחיד שנלכד מביצוע הדמיה תוך-חיונית על אפיתל אפידרמיס האוזן של עכבר מהונדס זכר K14-H2B-mCherry בוגר בן 3 חודשים. התיבה המנוקדת מציינת את האזור המוגדל המוצג ב- (A'). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (A') אזור מוגדל של (A) המציג תמונות כל שעה במהלך סרט של 3 שעות. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) סכמטי של המערכת המהונדסת המושרה דוקסיציקלין המשמשת לקידום תיוג GFP in vivo של גרעיני פיברובלסטים עוריים. (C) ציר הזמן של זריקות דוקסיציקלין. (D) הקרנה בעוצמה מרבית (המייצגת עומק z כולל של 54 מיקרומטר) של פיברובלסטים עוריים שנלכדו על ידי ביצוע הדמיה תוך-חיונית על אוזנה של נקבה בת 8 חודשים בהזרקת דוקס Pdgfra:rtTA; pTRE: עכבר מהונדס H2B-GFP. התיבה המנוקדת מציינת את האזור המוגדל המוצג ב- (D'). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (D') אזור מוגדל של (D) המציג תמונות כל שעה במהלך סרט של 3 שעות. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. קורסי זמן אלה מדגימים את היציבות של הדמיה תוך-חיונית לטווח ארוך באמצעות עלון מותאם אישית המודפס בתלת-ממד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1: קובץ עיצוב לעלון המודפס בתלת ממד עם פתח פלטת חום. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: קובץ עיצוב למחזיק התחתון של לוחית החום המודפסת בתלת-ממד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 3: קובץ עיצוב לתוספת המודפסת בתלת מימד ללא פתח פלטת חום. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה אנו מציגים כלי חדש המאפשר הדמיה תוך-חיונית יציבה וארוכת טווח של אפיתל עור עכבר שלם על גבי מיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים. המצאה זו עשויה PLA, שהוא החומר הנפוץ ביותר וזול ביותר להדפסה תלת מימדית; כל עלויות הדפסת התלת-ממד הפנימיות עבור עלון זה מסתכמות ב-<$5. את שני חלקי ההוספה הנפרדים (איור 1, קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2) ניתן להרכיב בקלות באמצעות ברגים קבועים (ראו טבלת חומרים). יש לציין כי קבצי .stl שסופקו יכולים לשמש גם להזמנת הוספה זו באמצעים מסחריים. אפשרות נוספת היא להשתמש במכונת בקרה נומרית ממוחשבת (CNC) כדי לייצר את האינסרט מאלומיניום אנודיזציה, אם כי זה יקר יותר באופן משמעותי.
כדי להבטיח הדמיה אמינה ויעילה לאורך זמן באמצעות כלי חדש זה, חשוב מאוד לשנות את גודל התקן ההדמיה החי בהתאם לשלב המיקרוסקופ של המשתמש. ניתן להתאים את הקובץ המשלים 1, הקובץ המשלים 2 והקובץ המשלים 3 כך שישקפו את מידות ההוספה המתאימות התואמות את המיקרוסקופ שנבחר לפני ההדפסה בתלת-ממד. מידות הוספה מדויקות עם דיסק כיסוי משותק ממזערות את הסחף המיקומי (x/y) והמוקד (z) לאורך כל הפעלת הדמיה. חשוב גם לוודא שעומק ההכנסה מספיק כדי לעבור את יציאת תקע פלטת החום מתחת לבמה.
לפני ההדמיה, חיוני לאשר כי העכבר מורדם לחלוטין, טמפרטורת הגוף שלו נשארת יציבה ב ~ 36 ° C כפי שנמדד עם בדיקת מדחום אנאלי, ואת האוזן משותקת היטב כדי למנוע תנועה עקב נשימה. כאשר משתמשים באטב אוזניים מתכתי כדי להצמיד את האוזן לכיסוי, יש למנוע ניתוק זרימת הדם הרגילה על ידי וידוא כי מהדק האוזן אינו מוברג חזק מדי. כמו כן, חיוני לעקוב ולחדש את משחת העיניים בעכבר בעת הצורך כדי לשמור על לחות העין במהלך מפגשי הדמיה ארוכים.
בעוד עיצוב ייחודי זה מספק גישה חדשה עבור הדמיה intravital יש לו כמה מגבלות בולטות. בשל המיקום הנמוך של האינסרט בשלב המיקרוסקופ, תנועת השלב במישורי x ו-y צריכה להיות מוגבלת מאוד לאחר מיקום המטרה ואטימת דיסק הכיסוי למקומו. תנועה מוגבלת זו היא קריטית כדי למנוע נזק למטרה. יתר על כן, יש לציין כי דיסק כיסוי הזכוכית אינו זמין כיום מסחרית. כדי ליצור מחדש את דיסק הכיסוי ששימש במחקר זה, ייתכן שיהיה צורך בשיתוף פעולה עם חנות מכונות.
בעוד אנו מראים כי שיטה מבוססת קונפוקלית זו יכולה להשיג הדמיה יציבה לטווח ארוך עמוק לתוך רקמה שלמה, יש לציין כי מיקרוסקופים מולטיפוטונים גורמים פחות נזק לאור וחודרים לעומקים גדולים יותר בהשוואה למכשירים קונפוקליים19. לכן, התועלת של כלי זה מסתמכת על עוצמת האות הפלואורסצנטי במודל בעלי החיים הטרנסגניים הנבחרים, כמו גם על עומק הרקמה הנדרש להשגת מטרות הניסוי. לכן אנו ממליצים להשתמש בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר האפשרית כדי למזער את ההלבנה תוך השגת הרזולוציה הרצויה. כמו כן, חשוב שלעדשה האובייקטיבית המשמשת עם תוספת זו יהיה N.A גבוה לרזולוציה אופטימלית, כמו גם מרחק עבודה ארוך כדי שתוכל להגיע לדיסק הכיסוי. יש לציין כי גישה זו לא נועדה להחליף את שיטת ההדמיה התוך-חיונית מבוססת המולטיפוטונים המאומתת היטב המתוארת ב- Pineda et al. 6. במקום זאת, הכלי החדש נועד לספק אלטרנטיבה יעילה למעבדות שאין להן גישה לציוד מולטיפוטונים, מעדיפות מערכת פחות מסורבלת ו/או בעלות מיקרוסקופ הפוך.
הכלי החדש שלנו ניתן להתאמה אישית להפליא לדרישות והעדפות ניסיוניות אינדיבידואליות. ניתן להשתמש בהתקן זה עם או בלי פלטת חום, מאחר שחלק מהאפשרויות החלופיות כוללות מיקום של כרית חימום דקה מתחת לעכבר, כריכת עדשה אובייקטיבית חמה יותר סביב פלג גופו העליון, ו/או לכידת חום על-ידי כיסוי העכבר בניילון נצמד (איור 4C). יתר על כן, ניתן להשתמש בטייפ בשילוב עם אטב האוזן או במקומו כדי לספק אימוביליזציה אופטימלית של רקמות (איור 5C). כיוון הוספת הבמה הפיך, כך שהמשתמש יכול להחליט אם אופטימלי לכוון את חור המטרה בצד ימין או שמאל. יתר על כן, העלון כולל אפשרויות מיקום חלופיות מובנות עבור אטב האוזן וצינור איזופלורן כדי לספק גמישות מרבית המבוססת על כיוון העכבר הרצוי (הדמיה של האוזן הימנית לעומת השמאלית), מיקום מערך האיזופלורן ותצורות מיקרוסקופ ספציפיות (איור 2C). העלון ניתן להתקנה ולהסרה בקלות, עם עיצוב פשוט שנועד להיות ידידותי מאוד למשתמש, כך שניתן יהיה להפוך את ההדמיה התוך-חיונית לנגישה אפילו למיקרוסקופים מתחילים. בנוסף, החור האובייקטיבי הא-סימטרי מספק את היכולת לצלם מודלים מגוונים של בעלי חיים, כמו גם איברים בגדלים שונים.
בכוונתנו שהמצאה זו תשפר את היישום של מיקרוסקופיה תוך-חיונית במעבדות בודדות, כמו גם ליבות מיקרו-קופי המכילות מכשירים קונפוקליים הפוכים. כלי נגיש וניתן להתאמה אישית זה יספק לחוקרים את החופש לדמיין דינמיקה של תאים חיים במערכות איברים מגוונות כדי לחשוף תובנות ביולוגיות משמעותיות של התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לוולנטינה גרקו על עכברי K14-mCherry-H2B. אנו אסירי תודה לחנות המכונות של המחלקה לפיזיקה באוניברסיטת אמורי על יצירת דיסקיות כיסוי הזכוכית. עבודה זו מומנה על ידי פרס פיתוח קריירה #IK2 BX005370 מהמחלקה לענייני חיילים משוחררים של ארה"ב BLRD Service ל-LS, פרסי NIH RF1-AG079269 ו-R56-AG072473 ל-MJMR, ופרס I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award ל-MJMR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
References
- Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
- Nal Chen,, et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy. Cells. 11 (14), 2196 (2022).
- Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).
- Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J.
- Fischer, M., Edelblum, K. L. Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration. Current Protocols. 2 (8), (2022).
- Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin. Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).
- Pal Arndt,, et al. A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system. Frontiers in Physiology. 13, 980787 (2022).
- Oal Yam, A., et al. Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy. Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).
- Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).
- Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008 (2011).
- Tauer, U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).
- Yoshitake, T., et al. Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue. Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021 (2016).
- Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool. Nature. 522, 94-97 (2015).
- Ral Li,, et al. Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response. eLife. 7, (2018).
- Tal Tumbar,, et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563 (2011).
- Sanderson, J.
