Summary
Il protocollo presenta un nuovo strumento per semplificare l'imaging intravitale utilizzando la microscopia confocale invertita.
Abstract
Comprendere i comportamenti cellulari normali e aberranti in vivo è necessario per sviluppare interventi clinici per contrastare l'inizio e la progressione della malattia. È quindi fondamentale ottimizzare gli approcci di imaging che facilitano l'osservazione della dinamica cellulare in situ, dove la struttura e la composizione del tessuto rimangono imperturbate. L'epidermide è la barriera più esterna del corpo, nonché la fonte dei tumori umani più diffusi, vale a dire i carcinomi cutanei cutanei. L'accessibilità del tessuto cutaneo rappresenta un'opportunità unica per monitorare i comportamenti delle cellule epiteliali e dermiche in animali intatti utilizzando la microscopia intravitale non invasiva. Tuttavia, questo sofisticato approccio di imaging è stato realizzato principalmente utilizzando microscopi multifotoni verticali, che rappresentano una barriera significativa per l'ingresso per la maggior parte dei ricercatori. Questo studio presenta un inserto per microscopio stampato in 3D progettato su misura adatto per l'uso con microscopi confocali invertiti, semplificando l'imaging intravitale a lungo termine della pelle dell'orecchio in topi transgenici vivi. Riteniamo che questa invenzione versatile, che può essere personalizzata per adattarsi alla marca e al modello di microscopio invertito scelto e adattata per visualizzare sistemi di organi aggiuntivi, si rivelerà preziosa per la più ampia comunità di ricerca scientifica migliorando significativamente l'accessibilità della microscopia intravitale. Questo progresso tecnologico è fondamentale per rafforzare la nostra comprensione delle dinamiche delle cellule vive in contesti normali e patologici.
Introduction
La microscopia intravitale è un potente strumento che consente il monitoraggio dei comportamenti delle cellule nei loro ambienti imperturbati in vivo. Questo metodo unico ha fornito informazioni chiave sul funzionamento interno di complessi sistemi di organi dei mammiferi, tra cui il polmone1, il cervello2, il fegato3, la ghiandola mammaria4, l'intestino5 e la pelle6. Inoltre, questo approccio ha rivelato alterazioni comportamentali cellulari durante lo sviluppo del tumore7, la guarigione delle ferite8,9, l'infiammazione10 e altre diverse patologie in situ. In questo studio, ci concentriamo sul miglioramento dell'accessibilità della microscopia intravitale per visualizzare le dinamiche epiteliali e stromali vive nella pelle intatta del topo. La comprensione dei comportamenti cellulari nella pelle dei mammiferi è di grande importanza clinica a causa della notevole capacità rigenerativa e tumorigenica di questo tessuto.
L'imaging intravitale nei topi è stato eseguito principalmente utilizzando microscopi multifotoni verticali grazie alla loro capacità di fornire immagini ad alta risoluzione a profondità tissutali >100 μm11,12. Tuttavia, questi strumenti non hanno la versatilità e l'accessibilità più generale dei microscopi confocali invertiti, che sono più facili da usare ed economici, offrono la capacità di visualizzare cellule in coltura, non richiedono un'oscurità completa durante l'acquisizione delle immagini e sono generalmente più sicuri, tra gli altri notevoli vantaggi13,14. In questo studio, presentiamo un nuovo strumento che migliora significativamente l'accessibilità all'imaging intravitale adattando questo approccio ai microscopi confocali invertiti.
Qui, presentiamo un design dell'inserto del palco personalizzato stampato in 3D che incorpora diverse caratteristiche chiave per facilitare l'imaging intravitale stabile e a lungo termine della pelle dell'orecchio del topo su un microscopio confocale invertito (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5). Queste caratteristiche specializzate includono un foro dell'obiettivo sfalsato che consente all'intero corpo di un topo adulto di essere completamente piatto durante l'imaging. Ciò riduce al minimo l'interferenza vibrazionale dei movimenti del corpo del topo sull'imaging ed elimina la necessità di somministrare ketamina e xilazina per smorzare la respirazione, una pratica spesso abbinata all'imaging intravitale6. Inoltre, le staffe angolari sull'inserto posizionano correttamente un cono nasale in isoflurano per allinearlo con la faccia del mouse, una clip auricolare in metallo immobilizza l'orecchio del mouse su un disco coprioggetti costruito su misura e una piastra riscaldante biofeedback a circuito chiuso staccabile opzionale si trova a filo all'interno dell'inserto per supportare la temperatura corporea del mouse durante le lunghe sessioni di imaging. Il disco coprioggetto personalizzato, che fornisce una superficie piana essenziale per la testa e l'orecchio del topo, è stato generato in un'officina meccanica rimuovendo le pareti di un piatto di coltura cellulare contenente vetrino coprioggetti generico. L'uso di una lente a immersione in olio di silicone 40x (apertura numerica 1,25 [N.A.], distanza di lavoro 0,3 mm) in combinazione con il disco coprioggetti e l'inserto del tavolino personalizzato fornisce immagini ad alta risoluzione >50 μm di profondità nel derma dell'orecchio.
Per testare la funzionalità di questo nuovo inserto per microscopio invertito, abbiamo catturato z-stack che coprono tutti gli strati epiteliali epidermici in un corso di tempo di 3 ore nell'orecchio di un topo adulto transgenico vivo K14-H2B-mCherry15 (i nuclei epiteliali in questa linea murina contengono un'etichetta fluorescente rossa) (Figura 6A-A'). Abbiamo anche catturato z-stack che si estendono su diversi strati di fibroblasti all'interno del derma cutaneo in un corso di tempo di 3 ore nell'orecchio di un Pdgfra-rtTA16 transgenico vivo; pTRE-H2B-GFP17 topo adulto (i nuclei dei fibroblasti in questa linea murina contengono un'etichetta fluorescente verde dopo l'induzione della doxiciclina) (Figura 6B-D'). I nostri dati ad alta risoluzione dimostrano una stabilità costante grazie all'assenza di deriva nei piani x, y e z, dimostrando così l'efficacia di questo nuovo strumento di imaging intravitale per l'uso su microscopi invertiti. È importante sottolineare che le dimensioni di questo inserto per tavolino stampato in 3D possono essere regolate, come descritto in File supplementare 1, File supplementare 2 e File supplementare 3, per adattarsi a qualsiasi microscopio invertito e il posizionamento dell'apertura dell'obiettivo può essere spostato in posizioni alternative all'interno dell'inserto per adattarsi meglio all'imaging di un particolare tessuto e/o modello animale di interesse. Questa invenzione può quindi consentire ai singoli laboratori, o ai ricercatori con accesso confocale alla struttura principale, di adattare questo strumento alle loro esigenze uniche di imaging intravitale, semplificando così la valutazione di diverse biologia cellulari in vivo.
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Protocol
Questa ricerca è stata eseguita in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali della Emory University e dell'Atlanta Veterans Affairs Medical Center ed è stata approvata dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Installazione dell'inserto per imaging dal vivo sul tavolino del microscopio invertito
- Costruire l'inserto utilizzando file .stl (File supplementare 1, File supplementare 2 e File supplementare 3) specificando le dimensioni e il design 3D (vedere la Figura 1 e la Figura 2A), una stampante 3D e l'acido polilattico (PLA).
- Posizionare con cautela l'inserto (Figura 2B,C) nella grande scanalatura del tavolino del microscopio (Figura 2C e Figura 3A). Utilizzare le viti per fissare l'inserto tramite quattro fori per viti situati in ciascun angolo dell'inserto (Figura 2B-C).
NOTA: L'inserto è bidirezionale e può essere ruotato di 180° a seconda dell'orientamento del tavolino del microscopio e dell'apparecchio per anestesia. - Far scorrere la piastra riscaldante nell'inserto con il lato rivolto verso il basso (Figura 2D) in modo che l'unità si trovi sopra le scanalature inferiori dell'inserto con la porta della spina che passa sotto il stage (Figura 3B).
- Allineare l'apertura circolare scanalata nell'inserto con un obiettivo a immersione in olio di silicone 40x (Figura 3C) e applicare olio di silicone al centro dell'obiettivo.
- Se si esegue l'imaging per periodi di tempo più lunghi (>1 ora), applicare una generosa quantità di olio che persisterà sull'interfaccia vetrino coprioggetto/obiettivo durante l'imaging. Evitare che l'olio fuoriesca dai bordi dell'obiettivo.
- Utilizzare una siringa per applicare una piccola quantità di grasso sottovuoto lungo l'apertura circolare scanalata e posizionare il disco coprioggetto sopra per sigillare l'inserto (Figura 3D).
NOTA: Il disco coprioggetti viene creato rimuovendo le pareti di una piastra di coltura cellulare con fondo in vetro da 35 mm x 10 mm (eseguita da un'officina meccanica). - Alza l'obiettivo 40x finché l'olio non bacia il fondo del vetrino.
2. Configurazione dell'isoflurano e preparazione del mouse
- Posizionare i componenti elettronici del vaporizzatore a basso flusso (camera di anestesia, tubo, vaporizzatore, contenitore di carbone) in modo che l'ogiva e il tubo collegato raggiungano l'inserto (Figura 3A).
ATTENZIONE: L'isoflurano è un anestetico per inalazione e deve essere maneggiato con cura per evitare fuoriuscite e ridurre al minimo l'esposizione umana. - Misurare il peso del flacone di isoflurano prima dell'uso e registrare. Attacca il tappo del vaporizzatore elettronico al flacone di isoflurano.
- Collegare il cavo di alimentazione al vaporizzatore elettronico. Chiudere le clip a cono blu e aprire le clip bianche della camera di induzione per consentire il flusso d'aria attraverso la camera nel contenitore del carbone. Rimuovere il cappello dell'aria ambiente rosso dal lato sinistro della macchina per consentire il flusso d'aria.
- Lasciare che il sistema si riscaldi per 5 minuti a 200 ml/min (flusso basso) e isoflurano al 2%.
NOTA: Sebbene sia selezionata l'impostazione del cono del naso, la linea del cono del naso blu deve rimanere chiusa e la linea della camera di induzione bianca deve rimanere aperta. - Una volta che il sistema è correttamente bilanciato, spurgare le linee per rimuovere l'isoflurano rimanente dalla camera.
- Posizionare il mouse nella camera di induzione e selezionare High Flow. Completare tutta la preparazione del topo (ad esempio, depilazione, somministrazione di farmaci topici, applicazione di unguento per gli occhi, ecc.) prima di posizionare il corpo dell'animale sopra l'inserto. Verificare che il mouse sia completamente anestetizzato utilizzando il metodo del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi.
- Con la gamba estesa, usa un'unghia per pizzicare saldamente la punta del piede senza causare danni fisici. Se il topo mostra una reazione positiva allo stimolo (ad esempio, retrazione delle gambe, contrazione del piede, ecc.), continuare a somministrare l'anestetico all'interno della camera fino a quando non si osserva alcuna reazione. Una volta anestetizzato in modo appropriato, la frequenza respiratoria del topo dovrebbe rallentare a ~55-65 respiri al minuto18.
- Quando il mouse è completamente anestetizzato, selezionare di nuovo High Flow per interrompere l'erogazione di isoflurano. Spurgare la camera prima di aprirla e regolare le clip (blu: aperte; bianche: chiuse) per erogare l'isoflurano attraverso l'ogiva. Selezionare Flusso basso mentre l'ogiva è attaccata al mouse per continuare l'erogazione dell'isoflurano.
- Infilare il tubo in isoflurano con il cono del naso attaccato attraverso la staffa angolare del tubo sull'inserto (Figura 3A e Figura 5).
3. Posizionamento del topo sull'inserto per l'imaging intravitale
- Collegare la piastra riscaldante al controller (contenente una sonda anale collegata), accenderla e lasciare che la piastra raggiunga i 36 °C (Figura 4A).
- Rimuovere il topo anestetizzato dalla camera di induzione e posizionarlo sulla piastra riscaldante (Figura 4B e Figura 5A). Eseguire rapidamente il trasferimento dalla camera all'inserimento per ridurre al minimo il tempo di attività del topo senza anestesia inalante.
- Fissare l'ogiva sul mouse (Figura 4B, C e Figura 5). Se necessario, utilizzare del nastro adesivo per fissare ulteriormente l'angolo e il posizionamento dell'ogiva.
- Inserire la sonda anale e regolare la temperatura del controller fino a quando la temperatura corporea del mouse non è stabile a ~36 °C (Figura 4A,B). Dopo che il mouse è stato posizionato correttamente, utilizzare una pellicola trasparente di plastica per intrappolare il calore, se necessario, per supportare ulteriormente la temperatura corporea appropriata (Figura 4C).
- Posizionate il mouse in modo che la testa sia allineata con il disco coprioggetto e immobilizzate l'orecchio al centro del vetrino coprioggetti utilizzando una clip auricolare in metallo (Figura 5A,B) o del nastro adesivo (Figura 5C).
NOTA: La pressione della clip auricolare in metallo sull'orecchio può essere regolata allentando la vite che fissa la clip all'inserto. È possibile aggiungere una molla metallica per una maggiore flessibilità di serraggio della clip.- Per modificare la posizione della clip auricolare, svitare il bullone con una chiave a brugola da 2.5 mm e trasferirlo nel sito secondario (Figura 2B,C). Quando si rimonta la clip per l'orecchio, posizionare la clip contro l'inserto, seguita dalla rondella sulla parte superiore. Utilizzare un bullone per fissare saldamente la clip con una leggera forza per ruotare la clip.
- Regolare il posizionamento z dell'obiettivo fino a quando le celle non si trovano all'interno della posizione focale (Figura 6A,D). Impostare i parametri z-stack e time-lapse in base agli obiettivi sperimentali e avviare l'acquisizione delle immagini.
NOTA: Se si ottiene la configurazione corretta, l'orecchio del mouse può essere ripreso per almeno 3 ore consecutive (Figura 6A',D').- Una volta impostati i limiti dello z-stack, regolare la potenza e il guadagno del laser per assicurarsi che nessun piano z sia sovrasaturato per ridurre al minimo il fotosbiancamento. Determinare i parametri time-lapse utilizzando lo spessore totale dello z-stack, i numeri dei passi (campionamento di Nyquist consigliato) e gli intervalli di tempo.
- Determinare i parametri di imaging (intervalli di tempo, tempo totale di imaging, ecc.) utilizzando più fattori, tra cui la vitalità animale in anestesia, il fotosbiancamento/fototossicità indotto dal laser e l'obiettivo dell'imaging dal vivo (ad esempio, dinamiche di divisione cellulare, interazioni cellula-cellula, ecc.).
4. Cessazione dell'imaging
- Accendere il termoforo a circolazione d'acqua e impostarlo su Ciclo continuo e 35 °C per almeno 30 minuti prima di terminare l'acquisizione dell'immagine.
- Al termine dell'imaging, selezionare Low Flow sul vaporizzatore elettronico per interrompere l'erogazione di isoflurano e spostare il mouse su un termoforo fino a quando non si deambula.
- Una volta sveglio, sposta il mouse nel contenitore di trasferimento continuando a tenerlo su un termoforo fino a quando non è completamente deambulante. Monitora costantemente il mouse mentre sei sul termoforo finché non è reattivo.
- Sul vaporizzatore elettronico, fai clic su Seleziona menu > Controllo anestetico > Vuoto. Rimuovere il flacone di isoflurano dal sistema e riposizionare il tappo del produttore sul flacone.
- Misurare il peso della bombola di isoflurano e del contenitore del carbone e inserire i pesi nel registro. Una volta che il contenitore del carbone pesa 50 g oltre la misurazione di base, smaltire il contenitore e sostituirlo con una nuova unità. Rimettere l'isoflurano nella cassetta di sicurezza.
- Rimuovere il disco coprioggetti e pulirlo con carta per lenti e soluzione per lenti. Conservare correttamente per evitare graffi per il riutilizzo.
- Rimuovere il tubo per anestesia dalla staffa dell'inserto e svitare l'inserto dal tavolino del microscopio.
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Representative Results
Il corretto assemblaggio dell'inserto di imaging dal vivo su un microscopio confocale invertito e l'orientamento appropriato di un topo transgenico in cima all'inserto sono convalidati acquisendo pile z di tessuto dell'orecchio vivo marcato con fluorescenza in un corso di tempo ≥1 ora con evidenza minima di deriva negli assi x, y e z. Le immagini devono essere acquisite a intervalli coerenti (il tempo di intervallo dipenderà dalla domanda biologica, dalla forza del segnale di fluorescenza, ecc.) in modo che la dinamica cellulare e la deriva dell'immagine possano essere monitorate nel tempo. Durante tutto il corso del tempo, il monitoraggio dei singoli piani z per assicurarsi che rimangano a fuoco rivela se il movimento degli animali interferisce con la stabilità dell'imaging. Nella Figura 6 è illustrato un esempio di singoli piani z che rimangono a fuoco per un periodo di tempo prolungato utilizzando l'inserto di imaging dal vivo.
Le immagini di quattro punti temporali di 60 minuti visualizzati nella Figura 6A' sono state selezionate da un filmato time-lapse di 3 ore di cellule epidermiche mCherry+ nell'orecchio di un topo maschio adulto di 3 mesi K14-H2B-mCherry (~30 g) catturato a intervalli di 2 minuti utilizzando un passo z di 0,246 μm per ottenere il campionamento di Nyquist su una profondità z totale di 24 μm (99 immagini z-stack acquisite per punto temporale).
Le immagini di quattro punti temporali di 60 minuti visualizzati nella Figura 6D' sono state selezionate da un filmato time-lapse di 3 ore di fibroblasti dermici GFP+ nell'orecchio di una femmina adulta di 8 mesi Pdgfra:rtTA; pTRE:H2B-GFP mouse (~30 g; Figura 6B). Questi sono stati catturati a intervalli di 5 minuti utilizzando un passo z di 2 μm per ottenere il campionamento di Nyquist su una profondità z totale di 54 μm (28 immagini z-stack acquisite per punto temporale). Questo topo è stato trattato con 2 mg di doxiciclina a giorni alterni per 6 giorni (quattro trattamenti, 8 mg in totale) prima dell'imaging (Figura 6C).
Figura 1: Design personalizzato dell'inserto del palco stampato in 3D. (A,B) Design e dimensioni di un inserto personalizzato stampato in 3D con un'apertura della piastra riscaldante (A), nonché un supporto inferiore della piastra riscaldante (B), che viene stampato separatamente e quindi avvitato nell'inserto (vedere il file supplementare 1, il file supplementare 2 e il file supplementare 3 corrispondenti). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il nuovo inserto a stadi semplifica l'imaging intravitale su microscopi confocali invertiti . (A) Inserto in fase di costruzione utilizzando una stampante 3D. (B) Modello con inserto semplice senza dispositivo di riscaldamento; L'inserto per l'imaging dal vivo contiene quattro siti di viti (frecce blu) per il fissaggio del tavolino del microscopio. La clip auricolare in metallo appiattisce e immobilizza l'orecchio su un disco di plastica largo 35 mm contenente un vetrino coprioggetti largo 20 mm. L'inserto contiene due opzioni per il posizionamento della clip auricolare per fornire flessibilità con l'orientamento del mouse. Il posizionamento asimmetrico del foro dell'obiettivo consente al topo adulto di sdraiarsi. Le staffe laterali allineano e immobilizzano il cono nasale in isoflurano per facilitare l'attacco del mouse. Il modello semplificato richiede il posizionamento di un piccolo termoforo (o di una fonte di calore alternativa) sotto il mouse per aiutare a regolare la temperatura corporea. (C) Modello con inserto avanzato con piastra riscaldante incorporata. (D) La piastra riscaldante viene installata facendola scorrere in un'apertura scanalata dell'inserto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Inserto per imaging intravitale installato su un tavolino per microscopio invertito . (A) Inserto montato sul tavolino di un microscopio confocale invertito a scansione laser. La vicinanza del vaporizzatore e della camera dell'isoflurano consente l'infilatura del tubo del cono del naso attraverso la staffa dell'inserto. (B) La spina della piastra riscaldante si estende sotto il tavolino del microscopio per il collegamento al controller. (C) Il foro dell'inserto si allinea con un obiettivo in silicone 40x. (D) Un disco di plastica (35 mm di diametro) contenente un vetrino coprioggetti (20 mm di diametro) viene posato sopra l'apertura scanalata dell'inserto del tavolino e sigillato in posizione con grasso sottovuoto. Il disco coprioggetti è stato creato rimuovendo le pareti di una piastra di coltura cellulare con fondo in vetro di 35 mm x 10 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Monitoraggio della temperatura corporea dell'animale mediante un controller a piastre riscaldanti . (A) Controller a piastra riscaldante, che può essere regolato per stabilizzare la temperatura corporea del topo a 36 °C ottimali durante la sessione di imaging intravitale. (B) Una sonda anale viene utilizzata per monitorare la temperatura corporea del topo una volta che il topo è posizionato sopra la piastra riscaldante. (C) La pellicola trasparente di plastica può essere utilizzata per intrappolare il calore per aumentare ulteriormente la temperatura corporea del topo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Posizionamento del topo sull'inserto di imaging intravitale . (A) Il corpo del topo è distribuito lungo la parte superiore della piastra riscaldante, con l'orecchio centrato sul vetrino coprioggetti e immobilizzato con una clip auricolare in metallo. La staffa posiziona il cono nasale in isoflurano per il fissaggio del mouse. (B) Area ingrandita di (A) che mostra l'immobilizzazione dell'orecchio del topo con una clip auricolare in metallo sul vetrino coprioggetti e l'attacco del cono nasale dell'isoflurano al topo. (C) Il nastro può essere utilizzato come metodo alternativo di immobilizzazione dell'orecchio sul vetrino coprioggetto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: L'inserto personalizzato facilita l'imaging intravitale stabile a lungo termine dell'epidermide dell'orecchio di topo e dei fibroblasti. (A) Un singolo piano z catturato dall'esecuzione di imaging intravitale sull'epitelio epidermico dell'orecchio di un topo transgenico maschio adulto K14-H2B-mCherry di 3 mesi. La casella tratteggiata indica l'area ingrandita mostrata in (A'). Barra della scala = 50 μm. (A') Area ingrandita di (A) che mostra le immagini ogni ora per un filmato di 3 ore. Barra di scala = 10 μm. (B) Schema del sistema transgenico inducibile dalla doxiciclina utilizzato per promuovere la marcatura GFP in vivo dei nuclei dei fibroblasti dermici. (C) Cronologia delle iniezioni di doxiciclina. (D) Proiezione di massima intensità (che rappresenta una profondità z totale di 54 μm) dei fibroblasti dermici catturati eseguendo l'imaging intravitale sull'orecchio di una femmina di Pdgfra:rtTA di 8 mesi iniettata con dox; pTRE: topo transgenico H2B-GFP. La casella tratteggiata indica l'area ingrandita mostrata in (D'). Barra della scala = 50 μm. (D') Area ingrandita di (D) che mostra le immagini ogni ora per un filmato di 3 ore. Barra della scala = 10 μm. Questi corsi temporali dimostrano la stabilità dell'imaging intravitale a lungo termine utilizzando l'inserto personalizzato stampato in 3D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: File di progettazione per l'inserto stampato in 3D con un'apertura per la piastra riscaldante. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 2: file di progettazione per il supporto inferiore della piastra riscaldante stampato in 3D. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 3: file di progettazione per l'inserto stampato in 3D senza apertura della piastra riscaldante. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
In questo studio, presentiamo un nuovo strumento che facilita l'imaging intravitale stabile e a lungo termine di epiteli cutanei di topo intatti su microscopi confocali invertiti. Questa invenzione è realizzata in PLA, che è il materiale stampabile in 3D più comune ed economico; tutti i costi di stampa 3D interni per questo inserto ammontano a < $ 5. I due pezzi separati dell'inserto (Figura 1, File supplementare 1 e File supplementare 2) possono essere facilmente assemblati utilizzando viti di fermo (vedere la tabella dei materiali). In particolare, i file .stl forniti possono essere utilizzati anche per ordinare questo inserto con mezzi commerciali. Un'opzione aggiuntiva è quella di utilizzare una macchina a controllo numerico computerizzato (CNC) per generare l'inserto in alluminio anodizzato, anche se questo è significativamente più costoso.
Per garantire un imaging affidabile ed efficiente per un periodo di tempo utilizzando questo nuovo strumento, è fondamentale dimensionare correttamente l'inserto di imaging dal vivo in base al tavolino del microscopio dell'utente. Il file supplementare 1, il file supplementare 2 e il file supplementare 3 forniti possono essere adattati per riflettere le dimensioni dell'inserto appropriate che sono compatibili con il microscopio scelto prima della stampa 3D. Le dimensioni accurate dell'inserto con un disco coprioggetto immobilizzato riducono al minimo la deriva posizionale (x/y) e focale (z) durante ogni sessione di imaging. È inoltre importante assicurarsi che la profondità dell'inserto sia sufficiente per far passare la porta della spina della piastra riscaldante sotto il tavolino.
Prima dell'imaging, è essenziale confermare che il topo sia completamente anestetizzato, che la sua temperatura corporea rimanga stabile a ~36 °C misurata con la sonda del termometro anale e che l'orecchio sia saldamente immobilizzato per evitare movimenti dovuti alla respirazione. Quando si utilizza la clip per l'orecchio in metallo per fissare l'orecchio al vetrino coprioggetti, si dovrebbe evitare di interrompere la normale circolazione sanguigna assicurandosi che il morsetto auricolare non sia avvitato troppo strettamente. È anche fondamentale monitorare e reintegrare l'unguento per gli occhi sul topo quando necessario per mantenere l'umidità oculare durante lunghe sessioni di imaging.
Sebbene questo design unico dell'inserto fornisca un nuovo approccio per l'imaging intravitale, presenta alcune limitazioni degne di nota. A causa del basso posizionamento dell'inserto nel tavolino del microscopio, il movimento del tavolino nei piani X e Y deve essere molto limitato dopo che l'obiettivo è stato posizionato e il disco coprioggetto è stato sigillato in posizione. Questo movimento limitato è fondamentale per evitare danni all'obiettivo. Inoltre, va notato che il disco coprioggetti in vetro non è attualmente disponibile in commercio. Per ricreare il disco coprioggetti utilizzato in questo studio, potrebbe essere necessaria la collaborazione con un'officina meccanica.
Mentre dimostriamo che questo metodo basato sulla confocalità può ottenere un imaging stabile a lungo termine in profondità nel tessuto intatto, va notato che i microscopi multifotone causano meno fotodanni e penetrano a profondità maggiori rispetto agli strumenti confocali19. Pertanto, l'utilità di questo strumento si basa sulla forza del segnale di fluorescenza nel modello animale transgenico di scelta, nonché sulla profondità del tessuto necessaria per raggiungere gli obiettivi sperimentali. Si consiglia quindi di utilizzare la potenza laser più bassa possibile per ridurre al minimo il fotosbiancamento e ottenere la risoluzione desiderata. È inoltre importante che l'obiettivo utilizzato con questo inserto abbia un N.A. elevato per una risoluzione ottimale, nonché una lunga distanza di lavoro in modo che possa raggiungere il disco coprioggetti. Va notato che questo approccio non è destinato a sostituire il metodo di imaging intravitale basato su multifotoni verticali ben convalidato descritto in Pineda et al. 6. Invece, questo nuovo strumento ha lo scopo di fornire un'alternativa efficace ai laboratori che non hanno accesso ad apparecchiature multifotone, preferiscono un sistema meno ingombrante e/o possiedono un microscopio invertito.
Il nostro nuovo strumento è notevolmente personalizzabile in base alle esigenze e alle preferenze sperimentali individuali. Questo inserto può essere utilizzato con o senza piastra riscaldante, poiché alcune opzioni alternative includono il posizionamento di un sottile cuscinetto riscaldante sotto il mouse, avvolgendo uno scaldalenti dell'obiettivo attorno al busto e/o intrappolando il calore coprendo il mouse con pellicola trasparente di plastica (Figura 4C). Inoltre, il nastro può essere utilizzato in combinazione o al posto della clip auricolare per fornire un'immobilizzazione ottimale dei tessuti (Figura 5C). L'orientamento dell'inserto del tavolino è reversibile, in modo che l'utente possa decidere se è ottimale orientare il foro dell'obiettivo sul lato destro o sinistro. Inoltre, l'inserto è dotato di opzioni di posizionamento alternative integrate per la clip auricolare e il tubo dell'isoflurano per fornire la massima flessibilità in base all'orientamento desiderato del mouse (imaging dell'orecchio destro rispetto a quello sinistro), alla posizione della configurazione dell'isoflurano e alle configurazioni specifiche del microscopio (Figura 2C). L'inserto è facilmente installabile e rimovibile, con un design semplificato pensato per essere altamente facile da usare in modo che l'imaging intravitale possa essere reso accessibile anche ai microscopisti alle prime armi. Inoltre, il foro dell'obiettivo localizzato in modo asimmetrico fornisce la capacità di visualizzare diversi modelli animali e organi di varie dimensioni.
Intendiamo che questa invenzione migliori l'applicazione della microscopia intravitale all'interno di singoli laboratori, nonché nuclei di microscopia che contengono strumenti confocali invertiti. Questo strumento altamente accessibile e personalizzabile fornirà ai ricercatori la libertà di visualizzare le dinamiche delle cellule vive in diversi sistemi di organi per rivelare informazioni biologiche cellulari significative.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Valentina Greco per i topi K14-mCherry-H2B. Siamo grati alla Emory University Physics Department Machine Shop per aver generato i dischi coprioggetti in vetro. Questo lavoro è stato finanziato dal Career Development Award #IK2 BX005370 dal Dipartimento degli Affari dei Veterani degli Stati Uniti BLRD Service a LS, NIH Awards RF1-AG079269 e R56-AG072473 a MJMR e I3 Emory SOM / GT Computational and Data Analysis Award a MJMR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
References
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