Summary
Протокол представляет собой новый инструмент для упрощения прижизненной визуализации с помощью инвертированной конфокальной микроскопии.
Abstract
Понимание нормального и аберрантного поведения клеток in vivo необходимо для разработки клинических вмешательств, направленных на предотвращение начала и прогрессирования заболевания. Поэтому крайне важно оптимизировать подходы к визуализации, которые облегчают наблюдение за клеточной динамикой in situ, когда структура и состав тканей остаются неизменными. Эпидермис является самым внешним барьером организма, а также источником наиболее распространенных видов рака человека, а именно кожных карцином. Доступность кожных тканей предоставляет уникальную возможность мониторинга поведения эпителиальных и дермальных клеток у интактных животных с помощью неинвазивной прижизненной микроскопии. Тем не менее, этот сложный подход к визуализации в основном был достигнут с помощью вертикальных многофотонных микроскопов, которые представляют собой значительный барьер для входа для большинства исследователей. В этом исследовании представлена специально разработанная, напечатанная на 3D-принтере вставка для микроскопа, подходящая для использования с инвертированными конфокальными микроскопами, оптимизирующая долгосрочную прижизненную визуализацию кожи уха у живых трансгенных мышей. Мы считаем, что это универсальное изобретение, которое может быть адаптировано к выбранной марке и модели инвертированного микроскопа и адаптировано для визуализации дополнительных систем органов, окажется бесценным для более широкого научно-исследовательского сообщества, значительно повысив доступность прижизненной микроскопии. Этот технологический прогресс имеет решающее значение для укрепления нашего понимания динамики живых клеток в нормальном и болезненном контекстах.
Introduction
Прижизненная микроскопия является мощным инструментом, который позволяет отслеживать поведение клеток в их невозмущенной среде in vivo. Этот уникальный метод позволил получить ключевое представление о внутренней работе сложных систем органов млекопитающих, включая легкое1, мозг2, печень3, молочную железу4, кишечник5 и кожу6. Кроме того, этот подход выявил поведенческие изменения клеток во время развития опухоли7, заживления ран8,9, воспаления10 и других разнообразных патологий in situ. В этом исследовании мы сосредоточимся на улучшении доступности прижизненной микроскопии для визуализации динамики живого эпителия и стромы в интактной коже мышей. Понимание поведения клеток в коже млекопитающих имеет большое клиническое значение из-за замечательной регенеративной и опухолегенной способности этой ткани.
Прижизненная визуализация у мышей в основном выполнялась с помощью вертикальных многофотонных микроскопов из-за их способности обеспечивать визуализацию с высоким разрешением на глубине тканей >100 мкм11,12. Тем не менее, этим инструментам не хватает универсальности «рабочей лошадки» и более широкой доступности, присущей инвертированным конфокальным микроскопам, которые более удобны в использовании и экономичны, обеспечивают возможность получения изображений культивируемых клеток, не требуют полной темноты во время получения изображения и, как правило, более безопасны, среди других заметных преимуществ13,14. В этом исследовании мы представляем новый инструмент, который значительно повышает доступность прижизненной визуализации за счет адаптации этого подхода для инвертированных конфокальных микроскопов.
В этой статье мы представляем напечатанную на 3D-принтере конструкцию вставки, которая включает в себя несколько ключевых функций, облегчающих стабильную, долгосрочную прижизненную визуализацию кожи уха мыши на инвертированном конфокальном микроскопе (рис. 1, рис. 2, рис. 3, рис. 4 и рис. 5). Эти специализированные функции включают смещенное отверстие объектива, которое позволяет всему телу взрослой мыши лежать полностью горизонтально во время визуализации. Это сводит к минимуму вибрационную интерференцию движений тела мыши при визуализации и устраняет необходимость введения кетамина и ксилазина для ослабления дыхания, что часто сочетается с прижизненной визуализацией6. Кроме того, угловые кронштейны на вставке правильно позиционируют носовой конус изофлурана так, чтобы он совпадал с лицевой стороной мыши, металлический ушной зажим обездвиживает ухо мыши к специально изготовленному покровному диску, а дополнительная съемная нагревательная пластина с обратной связью с обратной связью находится заподлицо со вставкой для поддержания температуры тела мыши во время длительных сеансов визуализации. Изготовленный на заказ диск для покровного стекла, который обеспечивает плоскую поверхность, необходимую для того, чтобы голова и ухо мыши лежали ровно, был создан в механическом цехе путем удаления стенок универсальной чашки с клеточной культурой, содержащей покровное стекло. Использование 40-кратной иммерсионной линзы с силиконовым маслом (числовая апертура 1,25, рабочее расстояние 0,3 мм) в сочетании с покровным диском и специальной вставкой столика позволяет получать изображения с высоким разрешением >50 мкм вглубь ушной кожи.
Чтобы проверить функциональность этого нового вкладыша для инвертированного микроскопа, мы захватили z-стеки, охватывающие все эпидермальные эпителиальные слои, в течение 3 часов в ухе живой трансгенной взрослой мыши K14-H2B-mCherry15 (эпителиальные ядра в этой линии мышей содержат красную флуоресцентную метку) (рис. 6A-A'). Мы также зафиксировали z-стеки, охватывающие несколько слоев фибробластов в дерме кожи в течение 3 ч в ухе живого трансгенного Pdgfra-rtTA16; Взрослая мышь pTRE-H2B-GFP17 (ядра фибробластов в этой линии мышей содержат зеленую флуоресцентную метку после индукции доксициклина) (рис. 6B-D'). Наши данные с высоким разрешением демонстрируют стабильную стабильность благодаря отсутствию дрейфа в плоскостях x, y и z, тем самым доказывая эффективность этого нового инструмента прижизненной визуализации для использования на инвертированных микроскопах. Важно отметить, что размеры этой напечатанной на 3D-принтере вставки можно регулировать, как описано в Дополнительном файле 1, Дополнительном файле 2 и Дополнительном файле 3, чтобы соответствовать любому инвертированному микроскопу, а расположение отверстия объектива может быть перемещено в альтернативные места внутри вставки, чтобы лучше подходить для визуализации конкретной интересующей модели ткани и/или животного. Таким образом, это изобретение может дать возможность отдельным лабораториям или исследователям, имеющим конфокальный доступ к основному оборудованию, адаптировать этот инструмент для своих уникальных потребностей в прижизненной визуализации, тем самым оптимизируя оценку разнообразной клеточной биологии in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями по уходу за животными и использованию Медицинского центра по делам ветеранов Университета Эмори и Атланты и было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC).
1. Установка вставки для получения изображений в реальном времени на столик инвертированного микроскопа
- Создайте вставку с помощью файлов .stl (Дополнительный файл 1, Дополнительный файл 2 и Дополнительный файл 3), указав 3D-размеры и конструкцию (см. рис. 1 и Рисунок 2A), 3D-принтер и полимолочную кислоту (PLA).
- Осторожно поместите вкладыш (Рисунок 2B, C) в канавку большого столика микроскопа (Рисунок 2C и Рисунок 3A). Используйте винты, чтобы закрепить пластину с помощью четырех отверстий для винтов, расположенных в каждом углу пластины (Рисунок 2B-C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Вкладыш является двунаправленным и может поворачиваться на 180° в зависимости от ориентации предметного столика микроскопа и наркозного аппарата. - Вставьте нагревательную пластину во врезную вилку стороной вниз (Рисунок 2D) так, чтобы устройство лежало поверх нижних канавок вставки, а порт вилки проходил под столиком (Рисунок 3B).
- Совместите рифленое круглое отверстие во вставке с помощью 40-кратного погружного объектива с силиконовым маслом (рис. 3C) и нанесите силиконовое масло на центр объектива.
- Если визуализация выполняется в течение более длительных периодов времени (>1 ч), нанесите обильную ложку масла, которое будет сохраняться на границе покровного стекла и объектива на протяжении всей визуализации. Не допускайте попадания масла за края объектива.
- С помощью шприца нанесите небольшое количество вакуумной смазки вдоль желобчатого круглого отверстия и положите сверху покровный скользящий диск для герметизации на вкладыше (Рисунок 3D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Покровный скользящий диск создается путем удаления стенок чашки для клеточных культур со стеклянным дном размером 35 мм x 10 мм (выполняется в механическом цехе). - Поднимите объектив 40x до тех пор, пока масло не коснется нижней части стеклянного покровного стекла.
2. Конфигурация изофлурана и подготовка мыши
- Расположите компоненты электронного испарителя с низким расходом (наркозную камеру, трубку, испаритель, канистру с древесным углем) так, чтобы носовой конус и прикрепленная трубка достигли вкладыша (Рисунок 3A).
ВНИМАНИЕ: Изофлуран является ингаляционным анестетиком, и с ним следует обращаться осторожно, чтобы избежать разливов и свести к минимуму воздействие на человека. - Измерьте вес флакона с изофлураном перед использованием и зарегистрируйте. Прикрепите колпачок от электронного испарителя к бутылке с изофлураном.
- Подключите шнур питания к электронному испарителю. Закройте синие зажимы носового конуса и откройте белые зажимы индукционной камеры, чтобы обеспечить поток воздуха через камеру в канистру с углем. Снимите красную крышку окружающего воздуха с левой стороны машины, чтобы обеспечить приток воздуха.
- Дайте системе прогреться в течение 5 минут при 200 мл/мин (низкий расход) и 2% изофлуране.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что выбрана настройка носового обтекателя, синяя линия носового обтекателя должна оставаться закрытой, а белая линия индукционной камеры должна оставаться открытой. - После того, как система будет правильно сбалансирована, продуйте трубопроводы, чтобы удалить оставшийся изофлуран из камеры.
- Поместите мышь в индукционную камеру и выберите High Flow (Высокий расход). Завершите всю подготовку мыши (например, удаление шерсти, местное введение лекарства, нанесение глазной мази и т. д.) перед тем, как положить тело животного на вкладыш. Убедитесь, что мышь полностью обезболина, используя метод рефлекса сжатия пальцев ног.
- Вытянув ногу, сильно зажмите палец ногтем, не причиняя физического вреда. Если мышь демонстрирует положительную реакцию на раздражитель (например, втягивание ноги, подергивание стопы и т. д.), продолжайте вводить анестетик в камере до тех пор, пока не будет наблюдаться отсутствие реакции. После соответствующего обезболивания частота дыхания мыши должна замедлиться до ~55-65 вдохов в минуту18.
- Когда мышь будет полностью обезболина, снова выберите «Высокий поток», чтобы остановить подачу изофлурана. Перед открытием продуйте камеру и отрегулируйте зажимы (синий: открыт; белый: закрыт) для подачи изофлурана через носовой обтекатель. Выберите Low Flow (Низкий расход), когда носовой обтекатель прикреплен к мыши, чтобы продолжить подачу изофлурана.
- Проденьте трубку изофлурана с прикрепленным носовым конусом через угловой кронштейн трубки на вставке (Рисунок 3А и Рисунок 5).
3. Размещение мыши на вкладыше для прижизненной визуализации
- Подключите нагревательную пластину к контроллеру (с прикрепленным анальным зондом), включите питание и дайте пластине нагреться до 36 °C (Рисунок 4A).
- Извлеките обезболиваемую мышь из индукционной камеры и положите ее поперек нагревательной пластины (Рисунок 4B и Рисунок 5A). Выполняйте перенос из камеры во вставку быстро, чтобы свести к минимуму время активности мыши без ингаляционной анестезии.
- Закрепите носовой обтекатель на мыши (рис. 4B, C и рис. 5). При необходимости используйте скотч для дополнительной фиксации угла и положения носового обтекателя.
- Вставьте анальный зонд и отрегулируйте температуру контроллера до тех пор, пока температура тела мыши не станет стабильной на уровне ~36 °C (рис. 4A,B). После того, как мышь будет правильно расположена, при необходимости используйте полиэтиленовую пищевую пленку, чтобы удерживать тепло и поддерживать соответствующую температуру тела (рис. 4C).
- Расположите мышь так, чтобы головка совпала с покровным диском, и иммобилизуйте ухо по центру стеклянного покровного стекла с помощью металлического зажима для ушей (Рисунок 5A, B) или ленты (Рисунок 5C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Давление металлического зажима на ухо можно отрегулировать, ослабив винт, который крепит зажим к вкладышу. Металлическая пружина может быть добавлена для повышения гибкости затяжки клипсы.- Чтобы изменить положение ушного зажима, открутите болт шестигранным ключом на 2,5 мм и перенесите его на вторичное место (рис. 2B, C). При повторной сборке ушного зажима приложите зажим к вкладышу, а затем шайбу сверху. Используйте болт, чтобы надежно закрепить зажим с небольшим усилием, чтобы повернуть зажим.
- Отрегулируйте z-положение объектива до тех пор, пока ячейки не окажутся в фокусном месте (рис. 6A, D). Установите параметры z-стека и интервальной съемки в соответствии с целями эксперимента и приступайте к получению изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если достигнута правильная настройка, ухо мыши можно визуализировать в течение не менее 3 часов подряд (Рисунок 6A',D').- После того, как границы z-стека установлены, отрегулируйте мощность и усиление лазера, чтобы убедиться, что z-плоскость не перенасыщена, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание. Определите параметры интервальной съемки, используя общую толщину z-стека, количество шагов (рекомендуется выборка по Найквисту) и временные интервалы.
- Определите параметры визуализации (временные интервалы, общее время визуализации и т. д.), используя множество факторов, включая жизнеспособность животных под наркозом, лазерно-индуцированное фотообесцвечивание/фототоксичность и цель визуализации в реальном времени (т. е. динамика деления клеток, межклеточные взаимодействия и т. д.).
4. Прекращение визуализации
- Включите грелку с циркуляцией воды и установите режим непрерывного цикла и температуру 35 °C не менее чем за 30 минут до завершения получения изображения.
- После завершения визуализации выберите низкий расход на электронном испарителе, чтобы остановить подачу изофлурана, и переместите мышь на грелку до тех пор, пока она не станет амбулаторной.
- После пробуждения переместите мышь обратно в контейнер для переноса, продолжая держать ее на грелке до тех пор, пока она полностью не станет самостоятельной. Постоянно следите за мышью, пока она не начнет реагировать.
- На электронном испарителе нажмите «Выбрать меню» > « Управление анестезией» > «Пусто». Извлеките флакон с изофлураном из системы и снова наденьте на него крышку производителя.
- Измерьте вес бутылки с изофлураном и канистры с древесным углем и введите вес в журнал. Как только канистра с углем будет весить на 50 г больше базового измерения, утилизируйте канистру и замените ее новой единицей. Верните изофлуран в сейф.
- Снимите защитный диск и протрите его бумагой для линз и раствором для линз. Храните правильно, чтобы избежать царапин при повторном использовании.
- Снимите трубку для анестезии с кронштейна вкладыша и отвинтите вкладыш от предметного столика микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Правильная сборка вставки с изображением в реальном времени на инвертированном конфокальном микроскопе и правильная ориентация трансгенной мыши на вставке подтверждается путем получения z-стеков флуоресцентно меченной живой ушной ткани в течение ≥1 ч с минимальными признаками дрейфа по осям x, y и z. Изображения должны быть получены через определенные промежутки времени (время интервала будет зависеть от биологического вопроса, силы флуоресцентного сигнала и т. д.), чтобы можно было отслеживать динамику клеток и дрейф изображения с течением времени. На протяжении всего времени наблюдение за отдельными z-плоскостями, чтобы убедиться, что они остаются в фокусе, показывает, влияет ли движение животного на стабильность изображения. На рисунке 6 показан пример одиночных z-плоскостей, которые остаются в фокусе в течение длительного времени с использованием вставки изображения в реальном времени.
Изображения из четырех 60-минутных временных точек, показанных на рисунке 6A', были выбраны из 3-часового интервального видеоролика эпидермальных клеток mCherry+ в ухе 3-месячного взрослого самца мыши K14-H2B-mCherry (~30 г), снятых с интервалом в 2 минуты с шагом z 0,246 мкм для достижения выборки по методу Найквиста на общей глубине z 24 мкм (99 изображений стека z, полученных за один момент времени).
Изображения из четырех 60-минутных временных точек, показанных на рисунке 6D', были выбраны из 3-часового интервального видеоролика с дермальными фибробластами GFP+ в ухе 8-месячной взрослой самки Pdgfra:rtTA; Мышь pTRE:H2B-GFP (~30 г; Рисунок 6Б). Они были получены с интервалом в 5 минут с шагом по оси z в 2 мкм для получения выборки по методу Найквиста на общей глубине 54 мкм (28 изображений стека z, полученных за один момент времени). Эту мышь лечили 2 мг доксициклина через день в течение 6 дней (четыре процедуры, всего 8 мг) перед визуализацией (рис. 6C).
Рисунок 1: Индивидуальный дизайн вставки сцены, напечатанный на 3D-принтере. (A,B) Конструкция и размеры изготовленной на 3D-принтере вставки с отверстием нагревательной пластины (A), а также нижним держателем нагревательной пластины (B), который печатается отдельно, а затем ввинчивается во вкладыш (см. соответствующий Дополнительный файл 1, Дополнительный файл 2 и Дополнительный файл 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Новая вставка столика оптимизирует прижизненную визуализацию на инвертированных конфокальных микроскопах . (A) Вставка изготавливается с помощью 3D-принтера. (B) Простая вставная модель без нагревательного устройства; Вкладыш для получения изображений в реальном времени содержит четыре винтовых узла (синие стрелки) для крепления предметного столика микроскопа. Металлический ушной зажим сплющивает и обездвиживает ухо на пластиковом диске шириной 35 мм, содержащем стеклянный покровный стеклопакет шириной 20 мм. Вкладыш содержит два варианта размещения ушного зажима, чтобы обеспечить гибкость ориентации мыши. Ассиметричное расположение отверстия объектива позволяет взрослой мыши лежать ровно. Боковые кронштейны выравнивают и обездвиживают носовой обтекатель изофлурана для облегчения крепления мыши. Упрощенная модель требует размещения небольшой грелки (или альтернативного источника тепла) под мышью, чтобы помочь регулировать температуру тела. (C) Усовершенствованная модель вставки со встроенной нагревательной пластиной. (D) Нагревательная пластина устанавливается путем вставки с канавками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Вставка для прижизненной визуализации, установленная на столике инвертированного микроскопа . (A) Вкладыш, установленный на предметном столике лазерного сканирующего инвертированного конфокального микроскопа. Близость испарителя изофлурана и камеры позволяет продевать трубку носового конуса через вставной кронштейн. (B) Штекер нагревательной пластины проходит под столиком микроскопа для подключения к контроллеру. (C) Отверстие для вставки совмещено с силиконовым объективом с 40-кратным увеличением. (D) Пластиковый диск (диаметром 35 мм), содержащий стеклянный защитный стекло (диаметр 20 мм), укладывается на рифленое отверстие вставки столика и герметизируется вакуумной смазкой. Покровный диск был создан путем удаления стенок чашки для клеточных культур со стеклянным дном размером 35 мм x 10 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Мониторинг температуры тела животного с помощью контроллера нагревательной пластины . (A) Контроллер нагревательной пластины, который можно настроить для стабилизации температуры тела мыши на оптимальном уровне 36 °C в течение всего сеанса прижизненной визуализации. (B) Анальный зонд используется для контроля температуры тела мыши после того, как мышь положена на нагревательную пластину. (C) Пластиковая пищевая пленка может быть использована для удержания тепла, чтобы еще больше повысить температуру тела мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Расположение мыши на вставке для прижизненной визуализации . (A) Корпус мыши расположен вдоль верхней части нагревательной пластины, ухо расположено по центру стеклянного покровного стекла и обездвижено металлическим ушным зажимом. Кронштейн позиционирует носовой обтекатель изофлурана для крепления мыши. (B) Увеличенная область (A), показывающая иммобилизацию уха мыши с помощью металлического ушного зажима на стеклянном покровном стекле и крепления носового конуса изофлурана к мыши. (C) Лента может быть использована в качестве альтернативного метода иммобилизации уха на стеклянном покровном стекле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Специальная вставка обеспечивает стабильную долгосрочную прижизненную визуализацию эпидермиса и фибробластов уха мыши. (A) Одна z-плоскость, полученная при выполнении прижизненной визуализации эпидермального эпителия уха 3-месячного взрослого самца K14-H2B-mCherry трансгенной мыши. Пунктирная рамка обозначает увеличенную область, показанную на рисунке (A'). Масштабная линейка = 50 мкм. (A') Увеличенная область (A), показывающая изображения каждый час в течение 3-часового видеоролика. Масштабная линейка = 10 мкм. (B) Схема доксициклин-индуцируемой трансгенной системы, используемой для стимуляции in vivo мечения GFP ядер дермальных фибробластов. (C) График инъекций доксициклина. (D) Проекция максимальной интенсивности (представляющая собой общую z-глубину 54 мкм) дермальных фибробластов, полученных при выполнении прижизненной визуализации уха 8-месячной самки Pdgfra:rtTA, получившей докс-инъекцию; pTRE: трансгенная мышь H2B-GFP. Пунктирной рамкой обозначена увеличенная область, показанная на рисунке (D'). Масштабная линейка = 50 мкм. (D') Увеличенная область (D), показывающая изображения каждый час в течение 3-часового видеоролика. Масштабная линейка = 10 мкм. Эти временные интервалы демонстрируют стабильность долгосрочной прижизненной визуализации с использованием специального вкладыша, напечатанного на 3D-принтере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Файл проекта для напечатанной на 3D-принтере вставки с отверстием нагревательной пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 2: Файл дизайна нижнего держателя нагревательной пластины, напечатанного на 3D-принтере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 3: Проектный файл для напечатанной на 3D-принтере вставки без отверстия нагревательной пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы представляем новый инструмент, который обеспечивает стабильную, долгосрочную прижизненную визуализацию интактного эпителия кожи мышей на инвертированных конфокальных микроскопах. Это изобретение изготовлено из PLA, который является наиболее распространенным и недорогим материалом для 3D-печати; Все затраты на 3D-печать этой вставки составляют <$5. Два отдельных вкладыша (Рисунок 1, Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2) могут быть легко собраны с помощью установочных винтов (см. Таблицу материалов). Примечательно, что предоставленные файлы .stl также могут быть использованы для заказа этой вставки коммерческими способами. Дополнительной опцией является использование станка с числовым программным управлением (ЧПУ) для изготовления пластины из анодированного алюминия, хотя это значительно дороже.
Чтобы обеспечить надежную и эффективную визуализацию в течение длительного времени с помощью этого нового инструмента, очень важно правильно подобрать размер вставки для обработки изображений в реальном времени в соответствии с моделью микроскопа пользователя. Предоставленные Дополнительный файл 1, Дополнительный файл 2 и Дополнительный файл 3 могут быть адаптированы для отражения соответствующих размеров пластины, совместимых с выбранным микроскопом до 3D-печати. Точные размеры пластины с иммобилизованным покровным скользящим диском сводят к минимуму позиционный (x/y) и фокальный (z) дрейф в течение каждого сеанса визуализации. Также важно убедиться, что глубина пластины достаточна для прохождения отверстия заглушки нагревательной пластины под столиком.
Перед визуализацией важно убедиться, что мышь полностью обезболина, температура ее тела остается стабильной на уровне ~36 °C, измеренной с помощью анального термометра, а ухо надежно обездвижено, чтобы избежать движения из-за дыхания. При использовании металлического ушного зажима для крепления уха к покровному вкладышу следует предотвратить прерывание нормального кровообращения, следя за тем, чтобы ушной зажим не был завинчен слишком туго. Также очень важно контролировать и пополнять запасы глазной мази на мыши, когда это необходимо для поддержания влажности глаз во время длительных сеансов визуализации.
Несмотря на то, что эта уникальная конструкция вставки обеспечивает новый подход к прижизненной визуализации, она имеет несколько заметных ограничений. Из-за низкого расположения пластины в предметном столике микроскопа перемещение предметного столика в плоскостях X и Y должно быть очень ограничено после того, как объектив будет позиционирован, а покровный скользящий диск запечатан на место. Такое ограниченное движение имеет решающее значение для того, чтобы не повредить цель. Кроме того, следует отметить, что стеклянный покровный диск в настоящее время не является коммерчески доступным. Для воссоздания диска покровного скольжения, использованного в данном исследовании, может потребоваться сотрудничество с механическим цехом.
Хотя мы демонстрируем, что этот метод на основе конфока может обеспечить стабильную долговременную визуализацию глубоко в интактных тканях, следует отметить, что многофотонные микроскопы вызывают меньше фотоповреждений и проникают на большую глубину по сравнению с конфокальными инструментами19. Таким образом, полезность этого инструмента зависит от силы флуоресцентного сигнала в выбранной трансгенной животной модели, а также от глубины ткани, необходимой для достижения экспериментальных целей. Поэтому мы рекомендуем использовать минимально возможную мощность лазера, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание при достижении желаемого разрешения. Также важно, чтобы объектив, используемый с этой вставкой, имел высокое N.A. для оптимального разрешения, а также большое рабочее расстояние, чтобы она могла достигать покровного диска. Следует отметить, что этот подход не предназначен для замены хорошо проверенного метода вертикальной многофотонной прижизненной визуализации, описанного в работе Pineda et al. 6. Этот новый инструмент призван стать эффективной альтернативой лабораториям, которые не имеют доступа к многофотонному оборудованию, предпочитают менее громоздкую систему и/или владеют инвертированным микроскопом.
Наш новый инструмент прекрасно настраивается в соответствии с индивидуальными экспериментальными требованиями и предпочтениями. Эту вставку можно использовать как с нагревательной пластиной, так и без нее, так как некоторые альтернативные варианты включают размещение тонкой грелки под мышью, оборачивание нагревателя объектива вокруг туловища и/или улавливание тепла путем накрытия мыши полиэтиленовой пищевой пленкой (рис. 4C). Кроме того, тейп может использоваться в сочетании с ушным зажимом или вместо него, чтобы обеспечить оптимальную иммобилизацию тканей (Рисунок 5C). Ориентация вставки столика является реверсивной, поэтому пользователь может решить, с какой стороны лучше ориентировать отверстие объектива: справа или слева. Кроме того, вкладыш имеет встроенные альтернативные варианты размещения ушного зажима и трубки с изофлураном, чтобы обеспечить максимальную гибкость в зависимости от желаемой ориентации мыши (визуализация правого или левого уха), расположения установки изофлурана и конкретных конфигураций микроскопа (рис. 2C). Вставка легко устанавливается и снимается, имеет упрощенную конструкцию, предназначенную для удобства пользователя, чтобы сделать прижизненную визуализацию доступной даже для начинающих микроскопистов. Кроме того, асимметрично локализованное отверстие объектива позволяет получать изображения различных моделей животных, а также органов разного размера.
Мы намерены использовать это изобретение для расширения применения прижизненной микроскопии в отдельных лабораториях, а также микрокопий, содержащих инвертированные конфокальные инструменты. Этот легкодоступный и настраиваемый инструмент предоставит исследователям свободу визуализации динамики живых клеток в различных системах органов, чтобы выявить важные биологические идеи клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Благодарим Валентину Греко за мышей K14-mCherry-H2B. Мы благодарны механическому цеху физического факультета Университета Эмори за создание стеклянных покровных дисков. Эта работа была профинансирована премией Career Development Award #IK2 BX005370 от Министерства по делам ветеранов США BLRD Service to LS, NIH Awards RF1-AG079269 и R56-AG072473 для MJMR и I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award для MJMR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
References
- Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
- Nal Chen,, et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy. Cells. 11 (14), 2196 (2022).
- Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).
- Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J.
- Fischer, M., Edelblum, K. L. Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration. Current Protocols. 2 (8), (2022).
- Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin. Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).
- Pal Arndt,, et al. A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system. Frontiers in Physiology. 13, 980787 (2022).
- Oal Yam, A., et al. Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy. Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).
- Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).
- Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008 (2011).
- Tauer, U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).
- Yoshitake, T., et al. Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue. Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021 (2016).
- Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool. Nature. 522, 94-97 (2015).
- Ral Li,, et al. Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response. eLife. 7, (2018).
- Tal Tumbar,, et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563 (2011).
- Sanderson, J.
