Summary
O protocolo apresenta uma nova ferramenta para simplificar a obtenção de imagens intravitais usando microscopia confocal invertida.
Abstract
A compreensão do comportamento celular in vivo normal e aberrante é necessária para desenvolver intervenções clínicas que impeçam o início e a progressão da doença. Portanto, é fundamental otimizar as abordagens de imagem que facilitem a observação da dinâmica celular in situ, onde a estrutura e a composição do tecido permanecem inalteradas. A epiderme é a barreira mais externa do corpo, bem como a fonte dos cânceres humanos mais prevalentes, ou seja, os carcinomas cutâneos de pele. A acessibilidade do tecido cutâneo apresenta uma oportunidade única para monitorar o comportamento das células epiteliais e dérmicas em animais intactos usando microscopia intravital não invasiva. No entanto, essa abordagem sofisticada de imagem tem sido realizada principalmente usando microscópios multifótons verticais, que representam uma barreira significativa de entrada para a maioria dos investigadores. Este estudo apresenta um microscópio impresso em 3D com design personalizado, inserido em estágio de microscópio adequado para uso com microscópios confocais invertidos, simplificando a imagem intravital a longo prazo da pele da orelha em camundongos transgênicos vivos. Acreditamos que esta invenção versátil, que pode ser personalizada para se ajustar à marca e ao modelo de microscópio invertido de escolha e adaptada para sistemas de órgãos adicionais de imagem, será inestimável para a maior comunidade de pesquisa científica, melhorando significativamente a acessibilidade da microscopia intravital. Esse avanço tecnológico é fundamental para reforçar nossa compreensão da dinâmica de células vivas em contextos normais e de doenças.
Introduction
A microscopia intravital é uma poderosa ferramenta que permite o monitoramento do comportamento celular em seus ambientes in vivo não perturbados. Este método único forneceu informações importantes sobre o funcionamento interno de sistemas orgânicos complexos de mamíferos, incluindo o pulmão1, cérebro2, fígado3, glândula mamária4, intestino5 e pele6. Além disso, essa abordagem tem revelado alterações comportamentais celulares durante o desenvolvimentotumoral7, cicatrização deferidas8,9, inflamação10 e outras diversas patologias in situ. Neste estudo, nos concentramos em melhorar a acessibilidade da microscopia intravital para obter imagens da dinâmica epitelial e estromal viva em pele intacta de camundongos. A compreensão do comportamento celular na pele de mamíferos é de grande importância clínica devido à notável capacidade regenerativa e tumorigênica deste tecido.
A imagem intravital em camundongos tem sido realizada principalmente usando microscópios multifótons verticais devido à sua capacidade de fornecer imagens de alta resolução em profundidades teciduais >100 μm11,12. No entanto, esses instrumentos carecem da versatilidade e acessibilidade mais geral dos microscópios confocais invertidos, que são mais fáceis de usar e econômicos, fornecem a capacidade de obter imagens de células cultivadas, não requerem escuridão completa durante a aquisição das imagens e geralmente são mais seguros, entre outras vantagens notáveis13,14. Neste trabalho, apresentamos uma nova ferramenta que melhora significativamente a acessibilidade de imagens intravitais, adaptando essa abordagem para microscópios confocais invertidos.
Aqui, apresentamos um design de inserção de estágio personalizado impresso em 3D que incorpora várias características importantes para facilitar imagens intravitais estáveis e de longo prazo da pele da orelha de camundongos em um microscópio confocal invertido (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5). Esses recursos especializados incluem um orifício objetivo deslocado que permite que o corpo inteiro de um mouse adulto fique totalmente plano durante a aquisição de imagens. Isso minimiza a interferência vibracional dos movimentos do corpo de camundongos nas imagens e elimina a necessidade de administrar cetamina e xilazina para atenuar a respiração, uma prática frequentemente associada a imagens intravitais6. Além disso, os suportes de canto na pastilha posicionam corretamente um cone nasal de isoflurano para se alinhar com a face do mouse, um clipe de orelha de metal imobiliza a orelha do mouse para um disco de deslizamento de capa personalizado e uma placa de calor de biofeedback de circuito fechado destacável opcional fica nivelada dentro da inserção para suportar a temperatura corporal do mouse durante longas sessões de imagem. O disco de deslizamento de capa personalizado, que fornece uma superfície plana essencial para a cabeça e a orelha do rato ficarem planas, foi gerado em uma oficina de máquinas removendo as paredes de um prato genérico de cultura celular contendo lamínula. O uso de uma lente de imersão em óleo de silicone de 40x (abertura numérica de 1,25 [N.A.], distância de trabalho de 0,3 mm) em conjunto com o disco de deslizamento de cobertura e inserção de estágio personalizada fornece imagens de alta resolução >50 μm de profundidade na derme da orelha.
Para testar a funcionalidade desta nova inserção de estágio de microscópio invertido, capturamos pilhas z abrangendo todas as camadas epiteliais epidérmicas ao longo de um curso de tempo de 3 h na orelha de um camundongo adulto vivo transgênico K14-H2B-mCherry15 (núcleos epiteliais nesta linhagem de camundongo contêm uma etiqueta fluorescente vermelha) (Figura 6A-A'). Também capturamos pilhas-z abrangendo várias camadas de fibroblastos dentro da derme da pele durante um curso de tempo de 3 h na orelha de um Pdgfra-rtTA transgênico vivo16; Camundongos adultos pTRE-H2B-GFP17 (núcleos de fibroblastos nesta linhagem de camundongos contêm um rótulo fluorescente verde após indução de doxiciclina) (Figura 6B-D'). Nossos dados de alta resolução demonstram estabilidade consistente pela falta de deriva nos planos x, y e z, comprovando a eficácia desta nova ferramenta de imagem intravital para uso em microscópios invertidos. É importante ressaltar que as dimensões dessa inserção de estágio impressa em 3D podem ser ajustadas, conforme descrito em Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3, para caber em qualquer microscópio invertido, e o posicionamento da abertura objetiva pode ser movido para locais alternativos dentro da pastilha para melhor se adequar à imagem de um determinado tecido e/ou modelo animal de interesse. Esta invenção pode, assim, capacitar laboratórios individuais, ou investigadores com acesso confocal de instalações centrais, para adaptar esta ferramenta para suas necessidades únicas de imagem intravital, simplificando assim a avaliação de biologia celular in vivo diversa.
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Protocol
Esta pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes de cuidados e uso de animais da Emory University e Atlanta Veterans Affairs Medical Center e foi aprovada pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).
1. Instalação da inserção de imagem ao vivo no estágio do microscópio invertido
- Construa a inserção usando arquivos .stl (Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3) especificando as dimensões e o design 3D (consulte a Figura 1 e a Figura 2A), uma impressora 3D e ácido polilático (PLA).
- Coloque cuidadosamente a pastilha (Figura 2B,C) no sulco do estágio do microscópio grande (Figura 2C e Figura 3A). Use parafusos para fixar a pastilha através de quatro orifícios de parafusos localizados em cada canto da pastilha (Figura 2B-C).
NOTA: A inserção é bidirecional e pode ser girada 180° dependendo da orientação do estágio do microscópio e do aparelho de anestesia. - Deslize a placa de calor para o plugue de inserção de lado para baixo (Figura 2D) de modo que a unidade fique sobre os sulcos de inserção inferiores com a porta do plugue passando por baixo do estágio (Figura 3B).
- Alinhe a abertura circular ranhurada na pastilha com uma objetiva de imersão em óleo de silicone 40x (Figura 3C) e aplique óleo de silicone no centro da objetiva.
- Se a imagem for feita por períodos de tempo mais longos (>1 h), aplique um generoso pedaço de óleo que persistirá na interface coverslip/objetiva durante toda a imagem. Não permita que o óleo se derrame sobre as bordas da lente.
- Use uma seringa para aplicar uma pequena quantidade de graxa a vácuo ao longo da abertura circular ranhurada e coloque o disco deslizante sobre a tampa para selar a pastilha (Figura 3D).
NOTA: O disco de deslizamento de cobertura é criado removendo as paredes de uma placa de cultura de células com fundo de vidro de 35 mm x 10 mm (realizada por uma oficina mecânica). - Levante a objetiva de 40x até que o óleo beije o fundo da tampa de vidro.
2. Configuração do isoflurano e preparação do mouse
- Posicione os componentes do vaporizador eletrônico de baixo fluxo (câmara de anestesia, tubulação, vaporizador, vasilhame de carvão) para permitir que o cone nasal e a tubulação acoplada alcancem a inserção (Figura 3A).
CUIDADO: O isoflurano é um anestésico inalatório e deve ser manuseado com cuidado para evitar derramamentos e minimizar a exposição humana. - Medir o peso do frasco de isoflurano antes da utilização e registar. Fixe a tampa do vaporizador eletrônico ao frasco de isoflurano.
- Conecte o cabo de alimentação ao vaporizador eletrônico. Feche os clipes do cone do nariz azul e abra os clipes brancos da câmara de indução para permitir o fluxo de ar através da câmara para o recipiente de carvão. Remova a tampa de ar ambiente vermelha do lado esquerdo da máquina para permitir o fluxo de ar.
- Deixar o sistema aquecer por 5 min a 200 mL/min (fluxo baixo) e isoflurano a 2%.
NOTA: Embora a configuração do cone do nariz esteja selecionada, a linha do cone do nariz azul deve permanecer fechada e a linha da câmara de indução branca deve permanecer aberta. - Uma vez que o sistema esteja devidamente equilibrado, purge as linhas para remover o isoflurano restante da câmara.
- Coloque o mouse na câmara de indução e selecione Alto fluxo. Complete toda a preparação do rato (ou seja, depilação, entrega tópica de drogas, aplicação de pomada ocular, etc.) antes de colocar o corpo do animal sobre a inserção. Confirme se o mouse está totalmente anestesiado usando o método do reflexo de pinça dos dedos.
- Com a perna estendida, use uma unha para apertar firmemente o dedo do pé sem causar danos físicos. Se o camundongo apresentar uma reação positiva ao estímulo (i.e., retração da perna, contração do pé, etc.), continue administrando anestésico dentro da câmara até que nenhuma reação seja observada. Uma vez adequadamente anestesiado, a frequência respiratória do camundongo deve diminuir para ~55-65 respirações por minuto18.
- Quando o mouse estiver totalmente anestesiado, selecione Alto fluxo novamente para interromper a administração de isoflurano. Limpe a câmara antes de abrir e ajuste os clipes (azul: aberto; branco: fechado) para entregar isoflurano através do cone nasal. Selecione Baixo fluxo enquanto o cone do nariz está conectado ao mouse para continuar a administração de isoflurano.
- Tubo de rosca de isoflurano com o cone nasal acoplado através do suporte de tubo de canto no inserto (Figura 3A e Figura 5).
3. Posicionamento do mouse na inserção para aquisição de imagens intravitais
- Conecte a placa de calor ao controlador (contendo uma sonda anal conectada), ligue e deixe a placa atingir 36 °C (Figura 4A).
- Remova o camundongo anestesiado da câmara de indução e coloque-o sobre a placa de calor (Figura 4B e Figura 5A). Realize a transferência da câmara para inserir rapidamente para minimizar o tempo em que o mouse fica ativo sem anestesia inalante.
- Fixe o cone nasal no mouse (Figura 4B,C e Figura 5). Se necessário, use fita adesiva para fixar ainda mais o ângulo e o posicionamento do cone nasal.
- Insira a sonda anal e ajuste a temperatura do controlador até que a temperatura do corpo do mouse esteja estável em ~36 °C (Figura 4A,B). Depois que o mouse estiver posicionado corretamente, use filme plástico aderente para reter o calor, se necessário, para suportar ainda mais a temperatura corporal apropriada (Figura 4C).
- Posicione o mouse de forma que a cabeça fique alinhada com o disco deslizante e imobilize a orelha no centro da lamínula de vidro usando um clipe auricular de metal (Figura 5A,B) ou fita adesiva (Figura 5C).
NOTA: A pressão do clipe auricular de metal na orelha pode ser ajustada soltando o parafuso que prende o clipe à inserção. Uma mola de metal pode ser adicionada para maior flexibilidade de aperto do grampo.- Para alterar a localização do clipe auricular, desaparafuse o parafuso com uma chave Allen de 2,5 mm e transfira para o local secundário (Figura 2B,C). Ao remontar o clipe auricular, coloque-o contra a pastilha, seguido da arruela por cima. Use um parafuso para prender o clipe com segurança com leve força para girar o clipe.
- Ajustar o posicionamento z da objetiva até que as células estejam dentro do ponto focal (Figura 6A,D). Defina os parâmetros z-stack e time-lapse de acordo com os objetivos experimentais e inicie a aquisição da imagem.
NOTA: Se a configuração correta for obtida, a orelha do mouse pode ser fotografada por pelo menos 3 h consecutivas (Figura 6A',D').- Uma vez que os limites da pilha z estejam definidos, ajuste a potência e o ganho do laser para garantir que nenhum plano z esteja saturado demais para minimizar o fotoclareamento. Determine os parâmetros de lapso de tempo usando a espessura total da pilha z, números de passo (amostragem de Nyquist recomendada) e intervalos de tempo.
- Determine os parâmetros de imagem (intervalos de tempo, tempo total de imagem, etc.) usando múltiplos fatores, incluindo viabilidade animal sob anestesia, fotoclareamento/fototoxicidade induzida por laser e o objetivo de imagens ao vivo (ou seja, dinâmica de divisão celular, interações célula-célula, etc.).
4. Término da imagem
- Ligue a almofada térmica circulante de água e ajuste para Ciclo Contínuo e 35 °C por pelo menos 30 minutos antes do término da aquisição da imagem.
- Após a conclusão da imagem, selecione Baixo fluxo no vaporizador eletrônico para interromper a administração de isoflurano e mova o mouse para uma almofada térmica até o deambulação.
- Uma vez acordado, mova o mouse de volta para o recipiente de transferência enquanto continua a manter em uma almofada térmica até que seja totalmente deambulado. Monitore consistentemente o mouse enquanto estiver na almofada térmica até que ele responda.
- No vaporizador eletrônico, clique em Selecionar menu > Controle anestésico > Vazio. Retire o frasco de isoflurano do sistema e coloque a tampa do fabricante de volta no frasco.
- Meça o peso do frasco de isoflurano e do botijão de carvão e insira os pesos no log. Uma vez que o botijão de carvão pese 50 g sobre a medição inicial, elimine o botijão e substitua-o por uma nova unidade. Devolva o isoflurano ao cofre.
- Remova o disco de deslizamento da tampa e limpe com papel de lente e solução de lente. Armazenar corretamente para evitar riscos para reutilização.
- Remova a tubulação de anestesia do suporte de inserção e desaparafuse a inserção do estágio do microscópio.
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Representative Results
A montagem adequada da inserção de imagem ao vivo em um microscópio confocal invertido e a orientação apropriada de um camundongo transgênico sobre a inserção são validadas pela aquisição de pilhas z de tecido auditivo vivo marcado fluorescentemente ao longo de um curso de tempo ≥1 h com evidência mínima de deriva nos eixos x, y e z. As imagens devem ser capturadas em intervalos consistentes (o tempo de intervalo dependerá da questão biológica, da força do sinal de fluorescência, etc.) para que a dinâmica celular e a deriva da imagem possam ser rastreadas ao longo do tempo. Ao longo do curso de tempo, o monitoramento de planos z individuais para garantir que eles permaneçam em foco revela se o movimento dos animais interfere na estabilidade da imagem. Um exemplo de planos z únicos que permanecem em foco durante um curso de tempo prolongado usando a inserção de imagem ao vivo é mostrado na Figura 6.
Imagens de quatro pontos de tempo de 60 min mostradas na Figura 6A' foram selecionadas de um filme de lapso de tempo de 3 h de células epidérmicas mCherry+ na orelha de um camundongo K14-H2B-mCherry adulto de 3 meses de idade (~30 g) capturado em intervalos de 2 min usando um passo z de 0,246 μm para obter amostragem de Nyquist em uma profundidade z total de 24 μm (99 imagens z-stack adquiridas por ponto de tempo).
Imagens de quatro momentos de 60 min exibidas na Figura 6D' foram selecionadas de um filme de lapso de tempo de 3 h de fibroblastos dérmicos GFP+ na orelha de uma fêmea adulta de 8 meses de idade Pdgfra:rtTA; pTRE: H2B-GFP rato (~30 g; Figura 6B). Estes foram capturados em intervalos de 5 min usando um passo z de 2 μm para obter amostragem de Nyquist em uma profundidade z total de 54 μm (28 imagens z-stack adquiridas por ponto de tempo). Este camundongo foi tratado com 2 mg de doxiciclina em dias alternados por 6 dias (quatro tratamentos, 8 mg no total) antes da aquisição de imagens (Figura 6C).
Figura 1: Design personalizado de pastilhas de palco impressas em 3D. (A,B) Concepção e dimensões de uma pastilha personalizada impressa em 3D com uma abertura de placa de calor (A), bem como de um suporte inferior de placa de calor (B), que é impresso separadamente e depois parafusado na pastilha (ver Ficheiro Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3 correspondentes). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A nova inserção de estágio simplifica a obtenção de imagens intravitais em microscópios confocais invertidos . (A) Inserto sendo construído usando uma impressora 3D. (B) Modelo de pastilha simples sem dispositivo de aquecimento; A inserção de imagem ao vivo contém quatro locais de parafuso (setas azuis) para fixação do estágio do microscópio. O clipe auricular de metal achata e imobiliza a orelha em um disco plástico de 35 mm de largura contendo uma tampa de vidro de 20 mm de largura. A inserção contém duas opções para a colocação do clipe de ouvido para fornecer flexibilidade com a orientação do mouse. O posicionamento assimétrico do orifício objetivo permite que o camundongo adulto fique plano. Os braquetes laterais alinham e imobilizam o cone nasal de isoflurano para facilitar a fixação do mouse. O modelo simplificado requer a colocação de uma pequena almofada de aquecimento (ou fonte de calor alternativa) sob o mouse para ajudar a regular a temperatura corporal. (C) Modelo de pastilha avançado com placa de calor integrada. (D) A placa de calor é instalada deslizando para uma abertura ranhurada do inserto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Inserção de imagem intravital instalada em um estágio de microscópio invertido. (A) Inserção montada no palco de um microscópio confocal invertido de varredura a laser. A proximidade do vaporizador e da câmara do isoflurano permite a rosqueamento da tubulação do cone nasal através do suporte de inserção. (B) O plugue da placa de calor se estende abaixo do estágio do microscópio para se conectar ao controlador. (C) O orifício da inserção se alinha com uma objetiva de silicone de 40x. (D) Um disco de plástico (35 mm de diâmetro) contendo uma lamínula de vidro (20 mm de diâmetro) é colocado sobre a abertura ranhurada da pastilha do palco e selado no local com graxa a vácuo. O disco de lamínula foi criado removendo-se as paredes de uma placa de cultura de células com fundo de vidro de 35 mm x 10 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Monitoramento da temperatura corporal do animal utilizando um controlador de placas de calor. (A) Controlador de placas de calor, que pode ser ajustado para estabilizar a temperatura corporal do mouse nos 36 °C ideais durante toda a sessão de imagem intravital. (B) Uma sonda anal é usada para monitorar a temperatura corporal do camundongo uma vez que o mouse é colocado sobre a placa de calor. (C) O filme plástico aderente pode ser usado para reter o calor para elevar ainda mais a temperatura do corpo do rato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Posicionamento do mouse na inserção de imagem intravital . (A) O corpo do rato é espalhado ao longo da parte superior da placa de calor, com a orelha centrada na lamínula de vidro e imobilizado com um clipe auricular de metal. O braquete posiciona o cone nasal de isoflurano para fixação do rato. (B) Região ampliada de (A) mostrando imobilização da orelha do camundongo com um clipe auricular de metal na tampa de vidro e a fixação do cone nasal de isoflurano ao mouse. (C) A fita pode ser usada como um método alternativo de imobilização da orelha sobre a lamínula de vidro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: A inserção personalizada facilita imagens intravitais estáveis a longo prazo da epiderme e fibroblastos da orelha de camundongos. (A) Um único plano z capturado da realização de imagens intravitais no epitélio epidérmico da orelha de um camundongo transgênico K14-H2B-mCherry adulto de 3 meses de idade. A caixa pontilhada indica a região ampliada mostrada em (A'). Barra de escala = 50 μm. (A') Região ampliada de (A) mostrando imagens a cada hora durante um filme de 3 horas. Barra de escala = 10 μm. (B) Esquema do sistema transgênico induzível por doxiciclina usado para promover a marcação in vivo de GFP de núcleos de fibroblastos dérmicos. (C) Linha do tempo das injeções de doxiciclina. (D) Projeção de intensidade máxima (representando uma profundidade z total de 54 μm) de fibroblastos dérmicos capturados pela realização de imagens intravitais na orelha de uma fêmea de 8 meses de idade Pdgfra:rtTA, injetada com dox; pTRE: camundongo transgênico H2B-GFP. A caixa pontilhada indica a região ampliada mostrada em (D'). Barra de escala = 50 μm. (D') Região ampliada de (D) mostrando imagens a cada hora durante um filme de 3 horas. Barra de escala = 10 μm. Esses cursos de tempo demonstram a estabilidade da imagem intravital de longo prazo usando a inserção personalizada impressa em 3D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: Arquivo de design para o inserto impresso em 3D com uma abertura de placa de calor. Clique aqui para fazer o download deste arquivo.
Arquivo suplementar 2: Arquivo de projeto para o suporte inferior da placa de calor impresso em 3D. Clique aqui para fazer o download deste arquivo.
Arquivo suplementar 3: Arquivo de design para a pastilha impressa em 3D sem abertura da placa de calor. Clique aqui para fazer o download deste arquivo.
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Discussion
Neste estudo, apresentamos uma nova ferramenta que facilita imagens intravitais estáveis e de longo prazo de epitélios intactos da pele de camundongos em microscópios confocais invertidos. Esta invenção é feita de PLA, que é o material mais comum e barato imprimível em 3D; todos os custos internos de impressão 3D para esta inserção totalizam < $5. As duas peças de inserção separadas (Figura 1, Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2) podem ser facilmente montadas usando parafusos ajustados (consulte Tabela de Materiais). Notavelmente, os arquivos .stl fornecidos também podem ser usados para solicitar essa inserção por meios comerciais. Uma opção adicional é usar uma máquina de controle numérico computadorizado (CNC) para gerar a pastilha de alumínio anodizado, embora isso seja significativamente mais caro.
Para garantir imagens confiáveis e eficientes durante um período de tempo usando essa nova ferramenta, é fundamental dimensionar adequadamente a inserção de imagem ao vivo de acordo com o estágio do microscópio do usuário. O Arquivo Suplementar 1, o Arquivo Suplementar 2 e o Arquivo Suplementar 3 fornecidos podem ser adaptados para refletir as dimensões apropriadas da inserção que são compatíveis com o microscópio de escolha antes da impressão 3D. Dimensões precisas da pastilha com um disco deslizante imobilizado minimizam a deriva posicional (x/y) e focal (z) ao longo de cada sessão de imagem. Também é importante garantir que a profundidade da pastilha seja suficiente para passar a porta do plugue da placa de calor abaixo do estágio.
Antes da aquisição de imagens, é essencial confirmar que o camundongo está totalmente anestesiado, sua temperatura corporal permanece estável em ~36 °C medida com a sonda do termômetro anal e a orelha está firmemente imobilizada para evitar movimentos devido à respiração. Ao usar o clipe de orelha de metal para prender a orelha à tampa, deve-se evitar cortar a circulação sanguínea normal, garantindo que a pinça da orelha não seja aparafusada com muita força. Também é crucial monitorar e reabastecer a pomada ocular no mouse quando necessário para manter a umidade ocular durante longas sessões de imagem.
Embora este design de inserção exclusivo forneça uma nova abordagem para imagens intravitais, ele tem algumas limitações notáveis. Devido ao baixo posicionamento da inserção no estágio do microscópio, o movimento do estágio nos planos x e y deve ser muito limitado após a objetiva ser posicionada e o disco deslizante de cobertura ser selado no lugar. Esse movimento limitado é fundamental para evitar danos ao objetivo. Além disso, deve-se notar que o disco de vidro não está atualmente disponível comercialmente. Para recriar o disco de capa usado neste estudo, pode ser necessária a colaboração com uma oficina mecânica.
Embora demonstremos que esse método baseado em foco pode obter imagens estáveis a longo prazo profundamente no tecido intacto, deve-se notar que microscópios multifótons causam menos fotodano e penetram em maiores profundidades em comparação com instrumentos confocais19. Portanto, a utilidade desta ferramenta depende da força do sinal de fluorescência no modelo animal transgênico de escolha, bem como da profundidade tecidual necessária para atingir os objetivos experimentais. Portanto, recomendamos usar a menor potência de laser possível para minimizar o fotoclareamento e alcançar a resolução desejada. Também é importante que a lente objetiva usada com esta pastilha tenha um N.A. alto para uma resolução ideal, bem como uma longa distância de trabalho para que possa alcançar o disco de deslizamento de cobertura. Deve-se notar que essa abordagem não pretende substituir o método de imagem intravital baseado em multifótons vertical bem validado descrito em Pineda et al. 6. Em vez disso, esta nova ferramenta pretende fornecer uma alternativa eficaz aos laboratórios que não têm acesso a equipamentos multifótons, preferem um sistema menos pesado e/ou possuem um microscópio invertido.
Nossa nova ferramenta é notavelmente personalizável para requisitos e preferências experimentais individualizadas. Esta pastilha pode ser usada com ou sem uma placa de calor, pois algumas opções alternativas incluem a colocação de uma fina almofada de aquecimento sob o mouse, envolvendo um aquecedor de lente objetiva em torno de seu tronco e/ou aprisionando o calor cobrindo o mouse com filme plástico aderente (Figura 4C). Além disso, a fita pode ser usada em conjunto ou no lugar do clipe auricular para proporcionar a imobilização tecidual ideal (Figura 5C). A orientação da inserção do palco é reversível, para que o usuário possa decidir se é ideal orientar o orifício objetivo no lado direito ou esquerdo. Além disso, a pastilha tem opções alternativas de colocação embutidas para o clipe auricular e tubo de isoflurano para fornecer a máxima flexibilidade com base na orientação desejada do mouse (imagem da orelha direita versus esquerda), localização da instalação do isoflurano e configurações específicas do microscópio (Figura 2C). A pastilha é facilmente instalável e removível, com um design simplificado destinado a ser altamente fácil de usar para que a imagem intravital possa ser acessível até mesmo a microscopistas iniciantes. Além disso, o orifício objetivo assimetricamente localizado fornece a capacidade de obter imagens de diversos modelos animais, bem como de órgãos de tamanhos variados.
Pretendemos com esta invenção melhorar a aplicação da microscopia intravital dentro de laboratórios individuais, bem como núcleos de microcópias que contêm instrumentos confocais invertidos. Esta ferramenta altamente acessível e personalizável fornecerá aos investigadores a liberdade de visualizar a dinâmica de células vivas em diversos sistemas de órgãos para revelar insights biológicos celulares significativos.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a Valentina Greco pelos ratos K14-mCherry-H2B. Somos gratos à Oficina de Máquinas do Departamento de Física da Universidade de Emory por gerar os discos de vidro de cobertura. Este trabalho foi financiado pelo Career Development Award #IK2 BX005370 do US Department of Veterans Affairs BLRD Service para LS, NIH Awards RF1-AG079269 e R56-AG072473 para MJMR, e I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award para MJMR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
References
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