Summary
Protokol, ters konfokal mikroskopi kullanarak intravital görüntülemeyi basitleştirmek için yeni bir araç sunar.
Abstract
Normal ve anormal in vivo hücre davranışlarını anlamak, hastalığın başlamasını ve ilerlemesini engellemek için klinik müdahaleler geliştirmek için gereklidir. Bu nedenle, doku yapısının ve bileşiminin bozulmadan kaldığı hücre dinamiklerinin yerinde gözlemlenmesini kolaylaştıran görüntüleme yaklaşımlarını optimize etmek çok önemlidir. Epidermis, vücudun en dış bariyeri ve aynı zamanda en yaygın insan kanserlerinin, yani kutanöz cilt karsinomlarının kaynağıdır. Cilt dokusunun erişilebilirliği, noninvaziv intravital mikroskopi kullanarak bozulmamış hayvanlarda epitelyal ve dermal hücre davranışlarını izlemek için eşsiz bir fırsat sunar. Bununla birlikte, bu sofistike görüntüleme yaklaşımı, öncelikle, çoğu araştırmacı için giriş için önemli bir engel teşkil eden dik çoklu foton mikroskopları kullanılarak elde edilmiştir. Bu çalışma, canlı transgenik farelerde kulak derisinin uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştıran, ters konfokal mikroskoplarla kullanıma uygun, özel olarak tasarlanmış, 3D baskılı bir mikroskop aşaması eki sunmaktadır. Ters mikroskop markasına ve tercih edilen modele uyacak şekilde özelleştirilebilen ve ek organ sistemlerini görüntülemek için uyarlanabilen bu çok yönlü buluşun, intravital mikroskopinin erişilebilirliğini önemli ölçüde artırarak daha büyük bilimsel araştırma topluluğu için paha biçilmez olacağına inanıyoruz. Bu teknolojik ilerleme, normal ve hastalık bağlamlarında canlı hücre dinamikleri hakkındaki anlayışımızı güçlendirmek için kritik öneme sahiptir.
Introduction
İntravital mikroskopi, hücre davranışlarının bozulmamış in vivo ortamlarında izlenmesini sağlayan güçlü bir araçtır. Bu benzersiz yöntem, akciğer1, beyin2, karaciğer3, meme bezi4, bağırsak5 ve cilt6 dahil olmak üzere karmaşık memeli organ sistemlerinin iç işleyişi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Ayrıca, bu yaklaşım, tümör gelişimi 7, yara iyileşmesi 8,9, inflamasyon 10 ve diğer çeşitli patolojiler sırasında hücre davranış değişikliklerini ortaya çıkarmıştır. Bu çalışmada, sağlam fare derisinde canlı epitelyal ve stromal dinamikleri görüntülemek için intravital mikroskopinin erişilebilirliğini artırmaya odaklandık. Memeli derisindeki hücre davranışlarını anlamak, bu dokunun olağanüstü rejeneratif ve tümörjenik kapasitesi nedeniyle yüksek klinik öneme sahiptir.
Farelerde intravital görüntüleme, doku derinliklerinde >100 μm11,12 yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlama yetenekleri nedeniyle öncelikle dik çoklu foton mikroskopları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu cihazlar, daha kullanıcı dostu ve uygun maliyetli olan, kültürlenmiş hücreleri görüntüleme yeteneği sağlayan, görüntü elde etme sırasında tam karanlık gerektirmeyen ve genellikle daha güvenli olan ters konfokal mikroskopların çok yönlülüğünden ve daha genel erişilebilirliğinden yoksundur13,14. Bu çalışmada, bu yaklaşımı ters konfokal mikroskoplar için uyarlayarak intravital görüntüleme erişilebilirliğini önemli ölçüde artıran yeni bir araç sunuyoruz.
Burada, ters konfokal bir mikroskopta fare kulağı derisinin stabil, uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştırmak için birkaç temel özelliği içeren 3D baskılı özel bir sahne eki tasarımı sunuyoruz (Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5). Bu özel özellikler, görüntüleme sırasında yetişkin bir farenin tüm gövdesinin tamamen düz durmasına izin veren bir ofset objektif deliği içerir. Bu, fare vücut hareketlerinin görüntüleme üzerindeki titreşimsel girişimini en aza indirir ve genellikle intravital görüntüleme ile birleştirilen bir uygulama olan solunumu azaltmak için ketamin ve ksilazin uygulama ihtiyacını ortadan kaldırır6. Ek olarak, kesici uçtaki köşe parantezleri, farenin yüzüyle hizalanacak şekilde bir izofluran burun konisini doğru şekilde konumlandırır, metal bir kulak klipsi, fare kulağını özel olarak oluşturulmuş bir lamel diskine sabitler ve isteğe bağlı çıkarılabilir kapalı döngü biofeedback ısı plakası, uzun görüntüleme oturumları sırasında fare vücut sıcaklığını desteklemek için ek parçanın içinde aynı hizada bulunur. Fare kafasının ve kulağının düz durması için gerekli olan düz bir yüzey sağlayan özel lamel diski, bir makine atölyesinde, genel bir lamel içeren hücre kültürü kabının duvarlarının kaldırılmasıyla üretildi. Lamel diski ve özel sahne eki ile birlikte 40x silikon yağına daldırma lensinin (1,25 sayısal açıklık [N.A.], 0,3 mm çalışma mesafesi) kullanılması, kulak dermisinin derinliklerinde >50 μm derinliğinde yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar.
Bu yeni ters çevrilmiş mikroskop aşaması ekinin işlevselliğini test etmek için, canlı bir transgenik K14-H2B-mCherry15 yetişkin farenin kulağında 3 saatlik bir zaman seyri boyunca tüm epidermal epitel katmanlarını kapsayan z-yığınlarını yakaladık (bu fare serisindeki epitel çekirdekleri kırmızı bir floresan etiketi içerir) (Şekil 6A-A'). Ayrıca, canlı bir transgenik Pdgfra-rtTA16'nın kulağında 3 saatlik bir zaman seyri boyunca cilt dermisi içindeki birkaç fibroblast tabakasını kapsayan z-yığınlarını yakaladık; pTRE-H2B-GFP17 yetişkin fare (bu fare serisindeki fibroblast çekirdekleri, doksisiklin indüksiyonunu takiben yeşil bir floresan etiketi içerir) (Şekil 6B-D'). Yüksek çözünürlüklü verilerimiz, x, y ve z düzlemlerinde sapma olmaması nedeniyle tutarlı bir kararlılık göstermekte ve böylece bu yeni intravital görüntüleme aracının ters mikroskoplarda kullanım için etkinliğini kanıtlamaktadır. Daha da önemlisi, bu 3D baskılı aşama ekinin boyutları, Ek Dosya 1, Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3'te açıklandığı gibi, herhangi bir ters çevrilmiş mikroskoba uyacak şekilde ayarlanabilir ve objektif açıklığın konumu, ilgilenilen belirli bir doku ve/veya hayvan modelinin görüntülenmesine daha iyi uyması için ek içindeki alternatif konumlara taşınabilir. Bu buluş, böylece bireysel laboratuvarları veya çekirdek tesis konfokal erişimi olan araştırmacıları, bu aracı benzersiz intravital görüntüleme ihtiyaçlarına uyarlamak için güçlendirebilir ve böylece çeşitli in vivo hücre biyolojisinin değerlendirilmesini kolaylaştırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu araştırma, Emory Üniversitesi ve Atlanta Gazi İşleri Tıp Merkezi hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Canlı görüntüleme ekinin ters mikroskop aşamasına takılması
- 3B boyutları ve tasarımı (bkz. Şekil 1 ve Şekil 2A), bir 3B yazıcıyı ve polilaktik asidi (PLA) belirten .stl dosyalarını (Ek Dosya 1, Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3) kullanarak eki oluşturun.
- Ek parçayı (Şekil 2B,C) büyük mikroskop tablası oluğuna dikkatlice yerleştirin (Şekil 2C ve Şekil 3A). Kesici ucun her bir köşesinde bulunan dört vida deliği aracılığıyla kesici ucu sabitlemek için vidaları kullanın (Şekil 2B-C).
NOT: Ek parça çift yönlüdür ve mikroskop aşamasının ve anestezi aparatının yönüne bağlı olarak 180° döndürülebilir. - Isı plakasını geçme tapasına tarafı aşağı bakacak şekilde kaydırın (Şekil 2D), böylece ünite, fiş portu s'nin altından geçecek şekilde alt geçme oluklarının üzerine uzanır.tage (Şekil 3B).
- Ek parçadaki yivli dairesel açıklığı 40x silikon yağına daldırma objektifi ile hizalayın (Şekil 3C) ve objektifin ortasına silikon yağı uygulayın.
- Daha uzun sürelerde (>1 saat) görüntüleme yapıyorsanız, görüntüleme boyunca lamel / objektif arayüzünde kalacak bol miktarda yağ uygulayın. Lensin kenarlarına yağ dökülmesine izin vermeyin.
- Yivli dairesel açıklık boyunca az miktarda vakumlu gres uygulamak için bir şırınga kullanın ve ek parçaya sızdırmaz hale getirmek için lamel diskini üstüne yerleştirin (Şekil 3D).
NOT: Lamel diski, 35 mm x 10 mm'lik bir cam tabanlı hücre kültürü kabının (bir makine atölyesi tarafından gerçekleştirilir) duvarlarının çıkarılmasıyla oluşturulur. - 40x objektifi, yağ cam lamellerin altını öpene kadar yükseltin.
2. İzofluran konfigürasyonu ve fare hazırlığı
- Düşük akışlı elektronik buharlaştırıcı bileşenlerini (anestezi odası, hortum, buharlaştırıcı, kömür kabı) burun konisinin ve bağlı borunun ek parçaya ulaşmasını sağlayacak şekilde konumlandırın (Şekil 3A).
DİKKAT: İzofluran bir inhalasyon anestezisidir ve dökülmeleri önlemek ve insan maruziyetini en aza indirmek için dikkatli kullanılmalıdır. - Kullanmadan önce izofluran şişesinin ağırlığını ölçün ve kaydedin. Elektronik buharlaştırıcının kapağını izofluran şişesine takın.
- Güç kablosunu elektronik buharlaştırıcıya bağlayın. Mavi burun konisi klipslerini kapatın ve odadan kömür kutusuna hava akışına izin vermek için beyaz indüksiyon odası klipslerini açın. Hava akışına izin vermek için makinenin sol tarafındaki kırmızı ortam havası kapağını çıkarın.
- Sistemin 200 mL/dk (düşük akış) ve %2 izofluranda 5 dakika ısınmasına izin verin.
NOT: Burun konisi ayarı seçilse de mavi burun konisi çizgisi kapalı, beyaz indüksiyon odası çizgisi açık kalmalıdır. - Sistem uygun şekilde dengelendikten sonra, kalan izofluranı odadan çıkarmak için hatları temizleyin.
- Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve Yüksek Akış'ı seçin. Hayvanın vücudunu ek parçanın üzerine yerleştirmeden önce tüm fare hazırlığını (yani epilasyon, topikal ilaç dağıtımı, göz merhemi uygulaması vb.) tamamlayın. Ayak parmağı kıstırma refleks yöntemini kullanarak farenin tamamen uyuşturulduğunu onaylayın.
- Bacak uzatılmışken, fiziksel hasara neden olmadan ayak parmağını sıkıca sıkıştırmak için bir tırnağınızı kullanın. Fare uyarana pozitif bir tepki gösterirse (ör., bacak çekilmesi, ayak seğirmesi, vb.), Herhangi bir reaksiyon gözlenene kadar oda içinde anestezi uygulamaya devam edin. Uygun şekilde uyuşturulduktan sonra, fare solunum hızı dakikada ~ 55-65 nefese kadar yavaşlamalıdır18.
- Fare tamamen uyuşturulduğunda, izofluran iletimini durdurmak için tekrar Yüksek Akış'ı seçin. Açmadan önce hazneyi boşaltın ve burun konisinden izofluran vermek için klipsleri (mavi: açık; beyaz: kapalı) ayarlayın. İzofluran dağıtımına devam etmek için burun konisi fareye takılıyken Düşük Akış'ı seçin.
- Ekli burun konisi ile izofluran boruyu, ek parçadaki köşe boru braketinden geçirin (Şekil 3A ve Şekil 5).
3. İntravital görüntüleme için ek parçaya fare yerleşimi
- Isı plakasını kontrolöre (ekli bir anal prob içeren) takın, gücü açın ve plakanın 36 °C'ye ulaşmasını bekleyin (Şekil 4A).
- Anestezi uygulanmış fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve ısı plakasının üzerine yerleştirin (Şekil 4B ve Şekil 5A). Farenin inhalan anestezi olmadan aktif olduğu süreyi en aza indirmek için hazneden yerleştirmeye hızlı bir şekilde transfer edin.
- Burun konisini fareye sabitleyin (Şekil 4B,C ve Şekil 5). Gerekirse, burun konisinin açısını ve konumunu daha da sabitlemek için bant kullanın.
- Anal probu takın ve fare vücut sıcaklığı ~36 °C'de sabit olana kadar kontrolör sıcaklığını ayarlayın (Şekil 4A,B). Fare uygun şekilde yerleştirildikten sonra, uygun vücut sıcaklığını daha fazla desteklemek için gerekirse ısıyı hapsetmek için plastik streç film kullanın (Şekil 4C).
- Fareyi, kafa lamel diskiyle hizalanacak şekilde konumlandırın ve metal bir kulak klipsi (Şekil 5A,B) veya bant (Şekil 5C) kullanarak kulağı cam lamellerin ortasına sabitleyin.
NOT: Metal kulak klipsinin kulak üzerindeki basıncı, klipsi ek parçaya sabitleyen vida gevşetilerek ayarlanabilir. Klips sıkma esnekliğini artırmak için metal bir yay eklenebilir.- Kulak klipsi konumunu değiştirmek için cıvatayı 2.5 mm Alyen anahtarıyla sökün ve ikincil bölgeye aktarın (Şekil 2B,C). Kulak klipsini yeniden monte ederken, klipsi ek parçaya ve ardından rondelayı üstüne yerleştirin. Klipsi döndürmek için hafif bir kuvvetle klipsi güvenli bir şekilde sabitlemek için bir cıvata kullanın.
- Hücreler odak noktasına gelene kadar objektif z konumlandırmasını ayarlayın (Şekil 6A,D). Deneysel hedeflere göre z-stack ve time-lapse parametrelerini ayarlayın ve görüntü alımına başlayın.
NOT: Doğru kurulum sağlanırsa, fare kulağı en az 3 ardışık saat boyunca görüntülenebilir (Şekil 6A',D').- Z-yığını sınırları ayarlandıktan sonra, foto ağartmayı en aza indirmek için hiçbir z-düzleminin aşırı doygun olmadığından emin olmak için lazer gücünü ve kazancını ayarlayın. z yığınının toplam kalınlığını, adım numaralarını (Nyquist örneklemesi önerilir) ve zaman aralıklarını kullanarak hızlandırılmış parametreleri belirleyin.
- Anestezi altında hayvan canlılığı, lazerle indüklenen fotoağartma/fototoksisite ve canlı görüntülemenin amacı (yani hücre bölünmesi dinamikleri, hücre-hücre etkileşimleri vb.) dahil olmak üzere birden fazla faktörü kullanarak görüntüleme parametrelerini (zaman aralıkları, toplam görüntüleme süresi vb.) belirleyin.
4. Görüntülemenin sonlandırılması
- Su sirkülasyonlu ısı yastığını açın ve görüntü alımının sonlandırılmasından en az 35 dakika önce Sürekli Döngü ve 30 °C'ye ayarlayın.
- Görüntüleme tamamlandıktan sonra, izofluran iletimini durdurmak için elektronik buharlaştırıcıda Düşük Akış'ı seçin ve fareyi ambulatuvar olana kadar bir ısı yastığına taşıyın.
- Uyandıktan sonra, tamamen yürüyene kadar bir ısı yastığı üzerinde tutmaya devam ederken fareyi transfer kabına geri getirin. Yanıt verene kadar ısı yastığı üzerindeyken fareyi sürekli olarak izleyin.
- Elektronik buharlaştırıcıda, Menü Seç'e > Anestezik Kontrol'e tıklayın > Boş'a tıklayın. İzofluran şişesini sistemden çıkarın ve üreticinin kapağını şişeye geri yerleştirin.
- İzofluran şişesinin ve kömür bidonunun ağırlığını ölçün ve ağırlıkları kütüğe girin. Kömür bidonunun ağırlığı temel ölçümün 50 g üzerinde olduğunda, bidonu atın ve yeni bir ünite ile değiştirin. İzofluranı kilitli kutuya geri koyun.
- Lamel diskini çıkarın ve lens kağıdı ve lens solüsyonu ile silerek temizleyin. Yeniden kullanım için çizikleri önlemek için uygun şekilde saklayın.
- Anestezi tüpünü insert braketinden çıkarın ve insert parçayı mikroskop aşamasından sökün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Canlı görüntüleme ekinin ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop üzerine uygun şekilde monte edilmesi ve ek parçanın üzerine transgenik bir farenin uygun şekilde yönlendirilmesi, ≥1 saatlik bir süre boyunca floresan etiketli, canlı kulak dokusunun z-yığınlarının elde edilmesiyle doğrulanır ve x, y- ve z eksenlerinde minimum sapma kanıtı vardır. Görüntüler tutarlı aralıklarla yakalanmalıdır (aralık süresi biyolojik soruya, floresan sinyalinin gücüne vb. bağlı olacaktır), böylece hücre dinamikleri ve görüntü kayması zaman içinde izlenebilir. Zaman boyunca, odakta kaldıklarından emin olmak için bireysel z-düzlemlerini izlemek, hayvan hareketinin görüntüleme stabilitesine müdahale edip etmediğini ortaya çıkarır. Canlı görüntüleme eki kullanılarak uzun bir süre boyunca odakta kalan tek z-düzlemlerinin bir örneği Şekil 6'da gösterilmektedir.
Şekil 6A'da görüntülenen dört adet 60 dakikalık zaman noktasından alınan görüntüler, 3 aylık yetişkin bir erkek K14-H2B-mCherry farenin (~30 g) kulağındaki mCherry + epidermal hücrelerin 3 saatlik hızlandırılmış filminden seçilmiştir ve toplam 24 μm z derinliğinde (zaman noktası başına 99 z-yığını görüntüsü elde edilir) Nyquist örneklemesi elde etmek için 0,246 μm'lik bir z-adımı kullanılarak 2 dakikalık aralıklarla yakalanmıştır.
Şekil 6D'de görüntülenen dört adet 60 dakikalık zaman noktasından alınan görüntüler, 8 aylık yetişkin bir dişi Pdgfra:rtTA'nın kulağındaki GFP + dermal fibroblastların 3 saatlik hızlandırılmış filminden seçildi; pTRE:H2B-GFP fare (~30 g; Şekil 6B). Bunlar, toplam 54 μm'lik bir z-derinliği (zaman noktası başına elde edilen 28 z-yığını görüntüsü) boyunca Nyquist örneklemesi elde etmek için 2 μm'lik bir z-adımı kullanılarak 5 dakikalık aralıklarla yakalandı. Bu fare, görüntülemeden önce 6 gün boyunca (dört tedavi, toplam 8 mg) her gün 2 mg doksisiklin ile tedavi edildi (Şekil 6C).
Şekil 1: Özelleştirilmiş 3D baskılı sahne eki tasarımı. (A,B) Isı plakası açıklığına (A) sahip özel, 3D baskılı bir ek parçanın yanı sıra ayrı olarak yazdırılan ve daha sonra ek parçaya vidalanan bir ısı plakası alt tutucusunun (B) tasarımı ve boyutları (bkz. ilgili Ek Dosya 1, Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yeni aşama eki, ters konfokal mikroskoplarda intravital görüntülemeyi kolaylaştırır . (A) Bir 3D yazıcı kullanılarak oluşturuluyor. (B) Isıtma cihazı olmayan basit kesici uç modeli; Canlı görüntüleme eki, mikroskop tablası bağlantısı için dört vida bölgesi (mavi oklar) içerir. Metal kulak klipsi, kulağı düzleştirir ve 20 mm genişliğinde bir cam lamel içeren 35 mm genişliğinde plastik bir diske sabitler. Ek parça, fare yönünde esneklik sağlamak için kulak klipsi yerleşimi için iki seçenek içerir. Objektif deliğinin asimetrik yerleşimi, yetişkin farenin düz durmasını sağlar. Yan braketler, farenin takılmasını kolaylaştırmak için izofluran burun konisini hizalar ve hareketsiz hale getirir. Basitleştirilmiş model, vücut ısısını düzenlemeye yardımcı olmak için farenin altına küçük bir ısıtma yastığının (veya alternatif ısı kaynağının) yerleştirilmesini gerektirir. (C) Yerleşik ısı plakasına sahip gelişmiş kesici uç modeli. (D) Isı plakası, ek parçanın yivli bir açıklığına kaydırılarak monte edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ters çevrilmiş bir mikroskop tablasına monte edilmiş intravital görüntüleme eki . (A) Lazer taramalı ters konfokal mikroskop tablasına monte edilmiş kesici uç. İzofluran buharlaştırıcının ve haznenin yakınlığı, burun konisi borusunun ekleme braketinden geçirilmesine izin verir. (B) Isı plakası fişi, kontrolöre bağlanmak için mikroskop aşamasının altına uzanır. (C) Ekleme deliği, 40x silikon objektifle hizalanır. (D) Sahne ekinin yivli açıklığının üzerine bir cam lamel (35 mm çapında) içeren plastik bir disk (20 mm çapında) yerleştirilir ve vakum gresi ile yerine kapatılır. Lamel diski, 35 mm x 10 mm'lik cam tabanlı hücre kültürü kabının duvarlarının kaldırılmasıyla oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Bir ısı plakası kontrolörü kullanarak hayvan vücut sıcaklığının izlenmesi. (A) İntravital görüntüleme seansı boyunca fare vücut sıcaklığını optimum 36 °C'de sabitlemek için ayarlanabilen ısı plakası kontrolörü. (B) Fare ısı plakasının üzerine yerleştirildikten sonra fare vücut sıcaklığını izlemek için bir anal prob kullanılır. (C) Fare vücut ısısını daha da yükseltmek için ısıyı hapsetmek için plastik streç film kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: İntravital görüntüleme ekinde fare konumlandırması . (A) Fare gövdesi, kulak cam lamel üzerinde ortalanmış ve metal bir kulak klipsi ile hareketsiz hale getirilmiş olarak ısı plakasının üst kısmı boyunca yayılmıştır. Braket, fare bağlantısı için izofluran burun konisini konumlandırır. (B) (A)'nın yakınlaştırılmış bölgesi, cam lamel üzerinde metal bir kulak klipsi ve fareye izofluran burun konisi bağlantısı ile fare kulağı immobilizasyonunu gösterir. (C) Bant, cam lamel üzerine alternatif bir kulak immobilizasyonu yöntemi olarak kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Özel insert, fare kulağı epidermisi ve fibroblastlarının stabil uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştırır. (A) 3 aylık yetişkin bir erkek K14-H2B-mCherry transgenik farenin kulak epidermal epiteli üzerinde intravital görüntüleme yapılmasından elde edilen tek bir z-düzlemi. Noktalı kutu, (A') ile gösterilen yakınlaştırılmış bölgeyi gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. (A') (A) 'nın yakınlaştırılmış bölgesi, 3 saatlik bir film boyunca her saat başı görüntüleri gösterir. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) Dermal fibroblast çekirdeklerinin in vivo GFP etiketlemesini teşvik etmek için kullanılan doksisiklin ile indüklenebilir transgenik sistemin şeması. (C) Doksisiklin enjeksiyonlarının zaman çizelgesi. (D) Dox enjekte edilen 8 aylık bir dişi Pdgfra:rtTA'nın kulağında intravital görüntüleme yapılarak yakalanan dermal fibroblastların maksimum yoğunluk projeksiyonu (toplam 54 μm z-derinliğini temsil eder); pTRE: H2B-GFP transgenik fare. Noktalı kutu, (D') ile gösterilen yakınlaştırılmış bölgeyi gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. (D') 3 saatlik bir film boyunca her saat başı görüntüleri gösteren yakınlaştırılmış (D) bölgesi. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu zaman kursları, 3D baskılı özel ek kullanılarak uzun süreli intravital görüntülemenin stabilitesini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Isı plakası açıklığına sahip 3D baskılı ek parça için tasarım dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 2: 3D baskılı ısı plakası alt tutucusu için tasarım dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 3: Isı plakası açıklığı olmayan 3D yazdırılmış ek parça için tasarım dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, inverted konfokal mikroskoplarda sağlam fare derisi epitelinin stabil, uzun süreli intravital görüntülemesini kolaylaştıran yeni bir araç sunuyoruz. Bu buluş, en yaygın ve ucuz 3D yazdırılabilir malzeme olan PLA'dan yapılmıştır; Bu ek parça için tüm şirket içi 3D baskı maliyetleri 5 < tutarındadır. İki ayrı kesici uç parçası (Şekil 1, Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2) ayar vidaları kullanılarak kolayca monte edilebilir (bkz. Malzeme Tablosu). Özellikle, sağlanan .stl dosyaları, bu eki ticari yollarla sipariş etmek için de kullanılabilir. Ek bir seçenek, anodize alüminyumdan ek parça oluşturmak için bir bilgisayarlı sayısal kontrol (CNC) makinesi kullanmaktır, ancak bu önemli ölçüde daha maliyetlidir.
Bu yeni aracı kullanarak belirli bir süre boyunca güvenilir ve verimli görüntüleme sağlamak için, canlı görüntüleme ekini kullanıcının mikroskop aşamasına göre uygun şekilde boyutlandırmak çok önemlidir. Sağlanan Ek Dosya 1, Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3, 3D baskıdan önce tercih edilen mikroskopla uyumlu uygun kesici uç boyutlarını yansıtacak şekilde uyarlanabilir. Hareketsiz bir lamel disk ile doğru kesici uç boyutları, her görüntüleme oturumu boyunca konumsal (x/y) ve odak (z) kaymasını en aza indirir. Kesici uç derinliğinin, ısı plakası fiş bağlantı noktasını sahnenin altından geçirmek için yeterli olduğundan emin olmak da önemlidir.
Görüntülemeden önce, farenin tamamen uyuşturulduğunu, vücut sıcaklığının anal termometre probu ile ölçüldüğü gibi ~36 °C'de sabit kaldığını ve nefes alma nedeniyle hareketi önlemek için kulağın sıkıca hareketsiz hale getirildiğini doğrulamak önemlidir. Kulağı lamel ile sabitlemek için metal kulak klipsi kullanırken, kulak kelepçesinin çok sıkı vidalanmadığından emin olarak normal kan dolaşımının kesilmesi önlenmelidir. Uzun görüntüleme seansları sırasında oküler nemi korumak için gerektiğinde fare üzerindeki göz merhemini izlemek ve yenilemek de çok önemlidir.
Bu benzersiz kesici uç tasarımı, intravital görüntüleme için yeni bir yaklaşım sağlarken, birkaç önemli sınırlaması vardır. Ek parçanın mikroskop aşamasındaki düşük konumu nedeniyle, objektif konumlandırıldıktan ve lamel diski yerine kapatıldıktan sonra x ve y düzlemlerindeki aşama hareketi çok sınırlı olmalıdır. Bu sınırlı hareket, hedefe zarar vermemek için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, cam lamel diskinin şu anda ticari olarak mevcut olmadığına dikkat edilmelidir. Bu çalışmada kullanılan lamel diski yeniden oluşturmak için bir makine atölyesi ile işbirliği yapılması gerekebilir.
Bu konfokal tabanlı yöntemin sağlam dokunun derinliklerinde stabil uzun süreli görüntüleme sağlayabileceğini göstersek de, çoklu foton mikroskoplarının konfokal aletlere kıyasla daha az fotohasara neden olduğu ve daha derinlere nüfuz ettiği unutulmamalıdır19. Bu nedenle, bu aracın faydası, tercih edilen transgenik hayvan modelindeki floresan sinyalinin gücüne ve deneysel hedeflere ulaşmak için gereken doku derinliğine dayanır. Bu nedenle, istenen çözünürlüğü elde ederken foto ağartmayı en aza indirmek için mümkün olan en düşük lazer gücünü kullanmanızı öneririz. Bu ek parça ile kullanılan objektif merceğin optimum çözünürlük için yüksek bir N.A.'ya ve ayrıca lamel diske ulaşabilmesi için uzun bir çalışma mesafesine sahip olması da önemlidir. Bu yaklaşımın, Pineda ve ark.'da açıklanan iyi doğrulanmış dik multifoton tabanlı intravital görüntüleme yönteminin yerini alması amaçlanmadığına dikkat edilmelidir. 6. Bunun yerine, bu yeni araç, çoklu foton ekipmanına erişimi olmayan, daha az hantal bir sistemi tercih eden ve/veya ters çevrilmiş bir mikroskoba sahip olan laboratuvarlara etkili bir alternatif sağlamayı amaçlamaktadır.
Yeni aracımız, kişiselleştirilmiş deneysel gereksinimler ve tercihler için son derece özelleştirilebilir. Bazı alternatif seçenekler arasında farenin altına ince bir ısıtma yastığının yerleştirilmesi, gövdesinin etrafına bir objektif lens ısıtıcısının sarılması ve/veya farenin plastik streç filmle kaplanarak ısısının hapsedilmesi yer aldığından, bu ek parça ısı plakalı veya ısısız olarak kullanılabilir (Şekil 4C). Ayrıca, optimal doku immobilizasyonunu sağlamak için kulak klipsi ile birlikte veya kulak klipsi yerine bant kullanılabilir (Şekil 5C). Sahne alanı ekinin yönü tersine çevrilebilir, böylece kullanıcı objektif deliğini sağ veya sol tarafa yönlendirmenin en uygun olup olmadığına karar verebilir. Ayrıca, ek parça, istenen fare yönüne (sağ ve sol kulağın görüntülenmesi), izofluran kurulumunun konumuna ve özel mikroskop konfigürasyonlarına bağlı olarak maksimum esneklik sağlamak için kulak klipsi ve izofluran tüpü için yerleşik alternatif yerleştirme seçeneklerine sahiptir (Şekil 2C). Ek parça, son derece kullanıcı dostu olması amaçlanan basitleştirilmiş bir tasarımla kolayca takılabilir ve çıkarılabilir, böylece intravital görüntüleme acemi mikroskopistler için bile ulaşılabilir hale getirilebilir. Ek olarak, asimetrik olarak lokalize objektif deliği, çeşitli hayvan modellerinin yanı sıra farklı boyutlardaki organları görüntüleme kapasitesi sağlar.
Bu buluşun, bireysel laboratuvarlarda intravital mikroskopi uygulamasının yanı sıra ters konfokal aletler içeren mikrokopi çekirdeklerini geliştirmesini amaçlıyoruz. Bu son derece erişilebilir ve özelleştirilebilir araç, araştırmacılara önemli hücre biyolojik içgörülerini ortaya çıkarmak için çeşitli organ sistemlerindeki canlı hücre dinamiklerini görselleştirme özgürlüğü sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
K14-mCherry-H2B fareleri için Valentina Greco'ya teşekkür ederiz. Emory Üniversitesi Fizik Bölümü Makine Atölyesi'ne cam lamel diskleri ürettiği için minnettarız. Bu çalışma, ABD Gazi İşleri Bakanlığı BLRD Hizmeti'nden LS'ye Kariyer Geliştirme Ödülü #IK2 BX005370, MJMR'ye NIH Ödülleri RF1-AG079269 ve R56-AG072473 ve MJMR'ye I3 Emory SOM/GT Hesaplama ve Veri Analizi Ödülü ile finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
References
- Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
- Nal Chen,, et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy. Cells. 11 (14), 2196 (2022).
- Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).
- Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J.
- Fischer, M., Edelblum, K. L. Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration. Current Protocols. 2 (8), (2022).
- Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin. Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).
- Pal Arndt,, et al. A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system. Frontiers in Physiology. 13, 980787 (2022).
- Oal Yam, A., et al. Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy. Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).
- Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).
- Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008 (2011).
- Tauer, U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).
- Yoshitake, T., et al. Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue. Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021 (2016).
- Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool. Nature. 522, 94-97 (2015).
- Ral Li,, et al. Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response. eLife. 7, (2018).
- Tal Tumbar,, et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563 (2011).
- Sanderson, J.
