Gestroomlijnde intravitale beeldvormingsbenadering voor langetermijnmonitoring van de dynamiek van epitheelweefsel op een omgekeerde confocale microscoop

Summary

Het protocol presenteert een nieuw hulpmiddel om intravitale beeldvorming te vereenvoudigen met behulp van omgekeerde confocale microscopie.

Abstract

Het begrijpen van normaal en afwijkend in vivo celgedrag is noodzakelijk om klinische interventies te ontwikkelen om het ontstaan en de progressie van de ziekte te dwarsbomen. Het is daarom van cruciaal belang om beeldvormingsbenaderingen te optimaliseren die de observatie van celdynamiek in situ vergemakkelijken, waarbij de weefselstructuur en -samenstelling onverstoord blijven. De epidermis is de buitenste barrière van het lichaam en de bron van de meest voorkomende vormen van kanker bij de mens, namelijk huidcarcinomen. De toegankelijkheid van huidweefsel biedt een unieke kans om het gedrag van epitheel- en dermale cellen bij intacte dieren te volgen met behulp van niet-invasieve intravitale microscopie. Desalniettemin is deze geavanceerde beeldvormingsbenadering voornamelijk bereikt met behulp van rechtopstaande multifotonmicroscopen, die voor de meeste onderzoekers een belangrijke toetredingsdrempel vormen. Deze studie presenteert een op maat ontworpen, 3D-geprinte microscooptafel die geschikt is voor gebruik met omgekeerde confocale microscopen, waardoor de intravitale beeldvorming op lange termijn van de oorhuid bij levende transgene muizen wordt gestroomlijnd. Wij zijn van mening dat deze veelzijdige uitvinding, die kan worden aangepast aan het merk en model van de omgekeerde microscoop naar keuze en kan worden aangepast om extra orgaansystemen in beeld te brengen, van onschatbare waarde zal zijn voor de grotere wetenschappelijke onderzoeksgemeenschap door de toegankelijkheid van intravitale microscopie aanzienlijk te verbeteren. Deze technologische vooruitgang is van cruciaal belang voor het versterken van ons begrip van de dynamiek van levende cellen in normale en ziektecontexten.

Introduction

Intravitale microscopie is een krachtig hulpmiddel waarmee het gedrag van cellen in hun onverstoorbare in vivo omgevingen kan worden gevolgd. Deze unieke methode heeft belangrijke inzichten opgeleverd in de innerlijke werking van complexe orgaansystemen van zoogdieren, waaronder de long¹, de hersenen², de lever³, de borstklier⁴, de darm⁵ en de huid⁶. Bovendien heeft deze aanpak veranderingen in het celgedrag tijdens de ontwikkeling van tumoren⁷, wondgenezing^8,9, ontsteking¹⁰ en andere uiteenlopende pathologieën in situ aan het licht gebracht. In deze studie richten we ons op het verbeteren van de toegankelijkheid van intravitale microscopie om levende epitheliale en stromale dynamiek in intacte muizenhuid in beeld te brengen. Het begrijpen van celgedrag in de huid van zoogdieren is van groot klinisch belang vanwege de opmerkelijke regeneratieve en tumorigene capaciteit van dit weefsel.

Intravitale beeldvorming bij muizen is voornamelijk uitgevoerd met behulp van rechtopstaande multifotonenmicroscopen vanwege hun vermogen om beeldvorming met hoge resolutie te bieden op weefseldiepten >100 μm^11,12. Desalniettemin missen deze instrumenten de veelzijdigheid van het werkpaard en de meer algemene toegankelijkheid van omgekeerde confocale microscopen, die gebruiksvriendelijker en kosteneffectiever zijn, de mogelijkheid bieden om gekweekte cellen in beeld te brengen, geen volledige duisternis vereisen tijdens beeldacquisitie en over het algemeen veiliger zijn, naast andere opmerkelijke voordelen^13,14. In deze studie presenteren we een nieuw hulpmiddel dat de toegankelijkheid van intravitale beeldvorming aanzienlijk verbetert door deze benadering aan te passen voor omgekeerde confocale microscopen.

Hier presenteren we een 3D-geprint ontwerp van een op maat gemaakt inzetstuk dat verschillende belangrijke kenmerken bevat om stabiele, langdurige intravitale beeldvorming van de huid van muizenoren op een omgekeerde confocale microscoop mogelijk te maken (Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4 en Figuur 5). Deze gespecialiseerde functies omvatten een offset-objectiefgat waardoor het volledige lichaam van een volwassen muis volledig plat kan liggen tijdens beeldvorming. Dit minimaliseert de trillingsinterferentie van lichaamsbewegingen van muizen op beeldvorming en elimineert de noodzaak om ketamine en xylazine toe te dienen om de ademhaling te dempen, een praktijk die vaak gepaard gaat met intravitale beeldvorming⁶. Bovendien positioneren hoekbeugels op het inzetstuk een isofluraanneuskegel correct om uit te lijnen met het gezicht van de muis, immobiliseert een metalen oorclip het muisoor op een op maat gemaakte dekglaasje en ligt een optionele afneembare biofeedback-warmteplaat met gesloten lus vlak in het inzetstuk om de lichaamstemperatuur van de muis te ondersteunen tijdens lange beeldvormingssessies. De op maat gemaakte dekglaasjeschijf, die een plat oppervlak biedt dat essentieel is voor het hoofd en het oor van de muis om plat te liggen, werd gegenereerd in een machinewerkplaats door de wanden van een generiek dekglaasje met celkweekschaal te verwijderen. Het gebruik van een 40x siliconen olie-immersielens (1,25 numerieke apertuur [N.A.], 0,3 mm werkafstand) in combinatie met de dekglaasjesschijf en het op maat gemaakte podiuminzetstuk zorgt voor beelden met een hoge resolutie >50 μm diep in de oordermis.

Om de functionaliteit van dit nieuwe omgekeerde microscooptafelinzetstuk te testen, hebben we z-stacks vastgelegd die alle epidermale epitheellagen overspannen gedurende een tijdsverloop van 3 uur in het oor van een levende transgene K14-H2B-mCherry¹⁵ volwassen muis (epitheelkernen in deze muislijn bevatten een rood fluorescerend label) (Figuur 6A-A‘). We hebben ook z-stacks vastgelegd die verschillende fibroblastlagen in de huiddermis overspannen gedurende een tijdsverloop van 3 uur in het oor van een levende transgene Pdgfra-rtTA¹⁶; pTRE-H2B-GFP¹⁷ volwassen muis (fibroblastkernen in deze muizenlijn bevatten een groen fluorescerend label na doxycycline-inductie) (Figuur 6B-D‘). Onze gegevens met hoge resolutie tonen een consistente stabiliteit aan door gebrek aan drift in de x-, y- en z-vlakken, en bewijzen zo de effectiviteit van dit nieuwe intravitale beeldvormingsinstrument voor gebruik op omgekeerde microscopen. Belangrijk is dat de afmetingen van dit 3D-geprinte podiuminzetstuk kunnen worden aangepast, zoals beschreven in Aanvullend bestand 1, Aanvullend bestand 2 en Aanvullend bestand 3, zodat het op elke omgekeerde microscoop past, en dat de positionering van de objectiefopening kan worden verplaatst naar alternatieve locaties binnen het inzetstuk om beter geschikt te zijn voor het afbeelden van een bepaald weefsel en/of diermodel van belang. Deze uitvinding kan dus individuele laboratoria, of onderzoekers met confocale toegang tot kernfaciliteiten, in staat stellen dit instrument aan te passen aan hun unieke intravitale beeldvormingsbehoeften, waardoor de evaluatie van diverse in vivo celbiologie wordt gestroomlijnd.

Protocol

Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierenverzorging en -gebruik van Emory University en Atlanta Veterans Affairs Medical Center en is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Het live beeldvormingsinzetstuk installeren op de omgekeerde microscooptafel Construeer het inlegvel met behulp van .stl-bestanden (aanvullend bestand 1, aanvullend bestand 2 en aanvullend bestand 3) met verm…

Representative Results

De juiste montage van het live imaging-inzetstuk op een omgekeerde confocale microscoop en de juiste oriëntatie van een transgene muis bovenop het inzetstuk wordt gevalideerd door het verkrijgen van z-stapels fluorescerend gelabeld, levend oorweefsel gedurende een tijdsverloop ≥1 uur met minimaal bewijs van drift in de x-, y- en z-as. Beelden moeten met consistente tussenpozen worden vastgelegd (intervaltijd hangt af van de biologische vraag, sterkte van het fluorescentiesignaal, enz.), zodat celdynamiek en beelddrift…

Discussion

In deze studie presenteren we een nieuw hulpmiddel dat stabiele, langdurige intravitale beeldvorming van intacte epitheel van de huid van muizen mogelijk maakt op omgekeerde confocale microscopen. Deze uitvinding is gemaakt van PLA, het meest voorkomende en goedkope 3D-printbare materiaal; alle in-house 3D-printkosten voor deze insert bedragen <$5. De twee afzonderlijke insteekstukken (afbeelding 1, aanvullende vijl 1 en aanvullende vijl 2) kunnen eenvoudig …

Materials

3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller – Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging