Summary
Здесь мы обсуждаем рабочий процесс подготовки, препарирования, монтажа и изображения живого мозга эксплантата личинок третьего возраста Drosophila melanogaster для наблюдения за клеточной и субклеточной динамикой в физиологических условиях.
Abstract
Нервные стволовые клетки дрозофилы (нейробласты, далее NB) подвергаются асимметричному делению, регенерируя самообновляющийся нейробласт, а также образуя дифференцирующую ганглионарную материнскую клетку (GMC), которая претерпевает одно дополнительное деление, чтобы дать начало двум нейронам или глии. Исследования NB раскрыли молекулярные механизмы, лежащие в основе полярности клеток, ориентации веретена, самообновления и дифференцировки нервных стволовых клеток. Эти асимметричные клеточные деления легко наблюдаются с помощью визуализации живых клеток, что делает личинки NB идеально подходящими для исследования пространственно-временной динамики асимметричного деления клеток в живой ткани. При правильном препарировании и визуализации в среде, обогащенной питательными веществами, NB в мозге эксплантата надежно делятся в течение 12-20 часов. Ранее описанные методы технически сложны и могут быть сложными для новичков в этой области. Здесь описан протокол подготовки, вскрытия, монтажа и визуализации живых эксплантатов личинок третьего возраста с использованием добавок жирового тела. Также обсуждаются потенциальные проблемы и приводятся примеры того, как можно использовать эту технику.
Introduction
Асимметричное деление клеток (ACD) - это процесс, при котором субклеточные компоненты, такие как РНК, белки и органеллы, неравномерно распределяются между дочерними клетками 1,2. Этот процесс обычно наблюдается в стволовых клетках, которые подвергаются ACD, чтобы дать начало дочерним клеткам с различными судьбами развития. Дрозофила NB делятся асимметрично, образуя один NB, который сохраняет свою стволовость, и одну ганглионарную материнскую клетку (GMC). GMC подвергается дальнейшим делениям с образованием дифференцирующих нейронов или глии3. Асимметрично делящиеся NB в изобилии присутствуют в развивающемся мозге личинок третьего возраста, которые легко наблюдаются с помощью микроскопии. На личиночной стадии третьего возраста в каждой центральной доле мозга присутствует примерно 100 NB 3,4,5,6.
Асимметричное деление клеток является высокодинамичным процессом. Протоколы визуализации живых клеток использовались для измерения и количественной оценки динамики полярности клеток 7,8,9,10, ориентации веретена 11,12,13, динамики коры актомиозина 14,15,16,17,18, биологии микротрубочек и центросом 19,20,21,22,23,24,25,26,27, а также мембрана 10,28 и динамика хроматина29. Качественные и количественные описания ACD основаны на надежных методах и протоколах для визуализации деления NB в интактном живом мозге. В следующем протоколе описываются методы подготовки, вскрытия и визуализации личиночной мозга третьего возраста для визуализации живых клеток in vivo с использованием двух различных подходов к монтажу. Эти методы лучше всего подходят для исследователей, заинтересованных в пространственно-временной динамике делений стволовых клеток, а также делений в других клетках мозга, поскольку они позволяют проводить краткосрочные и долгосрочные наблюдения за клеточными событиями. Кроме того, эти методы легко доступны для новичков в этой области. Мы демонстрируем эффективность и адаптивность этого подхода с личиночным мозгом, экспрессирующим флуоресцентно меченные микротрубочки и корковые слитые белки. Кроме того, мы обсуждаем методы анализа и соображения по применению в других исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показаны материалы, необходимые для проведения этого исследования.
1. Соображения и подготовка к эксперименту
- Не допускайте переполнения личинок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Качество мозга эксплантата личинок напрямую связано со здоровьем и качеством личинок до вскрытия. Личинки, которые недоедают из-за перенаселенности, обычно дают мозг более низкого качества30.- Убедитесь, что на одно блюдо с крышкой для еды приходится не более 20-30 личинок, чтобы избежать недоедания. Примеры этого можно увидеть на рисунке 2.
- Перед использованием отфильтруйте и аликвотируйте средство Schneider.
- Для каждого вскрытия подготовьте свежую среду для визуализации и вскрытия, дополнив аликвотированную среду насекомых Шнайдера 1% сывороткой роста крупного рогатого скота (BGS). Объем 5 мл среды для вскрытия и визуализации обычно достаточен для эксперимента с визуализацией.
- Перед использованием нагрейте добавленную среду до комнатной температуры (RT).
- Учитывайте продолжительность фильма, который необходимо собрать, и используйте ее для учета дополнения носителя изображения, подхода к монтажу и настроек сбора данных микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: В оптимальных условиях NB в мозге, дополненном только BGS, будут надежно делиться в течение более 3 часов.- Дополните среду визуализации, добавив ткани тела с личиночным жиром в среду для визуализации, чтобы поддерживать деление более 4 часов при проведении экспериментов, требующих более длинных фильмов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жировые тела выделяют митогены, которые поддерживают пролиферацию NB31, а цельных жировых тел из 10 личинок достаточно для поддержки четырех-пяти мозгов. Кроме того, было показано, что образцы, изображенные с помощью связанного с мембраной предметного стекла, делятся более 10 ч13,32, в то время как образцы, изображенные с помощью многолуночного предметного стекла, обычно делятся реже (неопубликованные наблюдения). - В качестве альтернативы можно реализовать более сложный носитель изображений для более длинных видеороликов, как описано ранее33. Минимизируйте фотоповреждения, регулируя время экспозиции, мощность лазера и частоту дискретизации для достижения наилучших результатов.
- Дополните среду визуализации, добавив ткани тела с личиночным жиром в среду для визуализации, чтобы поддерживать деление более 4 часов при проведении экспериментов, требующих более длинных фильмов.
2. Постановка и сбор личинок (рис. 2)
- Скрещивайте 1-5-дневных самок девственных мух с 1-7-дневными взрослыми самцами, чтобы получить потомство с желаемым генотипом. Для оптимального урожая скрещивайте 10-15 девственниц с 5-10 самцами. Поместите этих мух в клетку для мух с крышкой для еды (рис. 2A-C) и инкубируйте при 25 ° C.
- Ежедневно меняйте крышку от еды. Это предотвращает переполнение крышек еды личинками, что снижает качество рассеченного мозга.
- Если крышка для еды в значительной степени покрыта личинками (т. е. >30), разделите эту крышку для еды пополам и замените одну половину свежей крышкой для еды, которая также была разрезана пополам. В качестве альтернативы меняйте крышки для приема пищи на более частой основе (т.е. каждые 12 часов вместо каждых 24 часов). Примеры перенаселенных шапок для еды можно увидеть на рисунке 2E, F.
- Инкубируйте шапочку с личинками при температуре 25 °C, пока личинки не достигнут желаемого возраста.
3. Вскрытие жирового тела личинок (рис. 3)
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе описывается вскрытие с использованием 3-луночного вскрытия.
- Пипетка ~ 400 мкл среды для вскрытия и визуализации в каждую лунку 3-луночной диссекционной чашки.
- Вымойте десять 72-96-часовых сытых личинок дикого типа, осторожно удерживая их щипцами для рассечения и погружая и вынимая из раствора для вскрытия в самый нижний лунок, пока все частицы пищи не будут смыты. После полоскания переместите чистых личинок в среднюю лунку.
- С помощью одного набора пинцетов удерживайте личинку за крючки для рта. Другим набором пинцета разорвите одну сторону кутикулы личинки.
- Этот разрыв приведет к тому, что жировые тела выльются из личинки. Жировые тела грязно-белые и полупрозрачные и будут иметь решетчатую структуру (рис. 3I). Жировые тела также будут иметь тенденцию прилипать к себе и пинцету для рассечения. После идентификации соберите как можно больше жирового тела от каждой личинки и перенесите его щипцами в самую верхнюю лунку с 400 мкл среды для диссекции RT.
4. Вскрытие личинок головного мозга (рис. 3)
- Вымойте экспериментальных личинок в среде для вскрытия и визуализации, как указано выше, чтобы освободить их от остатков пищи. Для достижения наилучших результатов избегайте хранения непрепарированных личинок в растворе для препарирования. Это приведет к тому, что личинки «утонут» и негативно скажется на качестве препарированного мозга.
- С помощью одного набора пинцетов удерживайте личинку за крючки для рта. Используя другой набор пинцета, аккуратно отрежьте/оторвите примерно 1/3 личинки с задней стороны (рис. 3A). Это приведет к тому, что элементы пищеварительного тракта, жировые тела, соединительная ткань и нервная система «вырвутся» из разорванной стороны личинки (рис. 3Б).
- С помощью одного набора пинцетов удерживайте личинку за крючки для рта. Другим набором пинцетов аккуратно расчешите кутикулу по направлению к крючкам для рта, «проталкивая» внутрь пинцетом, удерживая крючки для рта, пока вся личинка не будет вывернута наизнанку. Это движение похоже на выворачивание носка «наизнанку» (рис. 3C, D).
- Инвертируйте личинку так, чтобы центральная нервная система и другие ткани были обращены наружу, оставаясь при этом соединенными с кутикулой. На этом этапе найдите центральную нервную систему (ЦНС), чтобы избежать случайного удаления. С помощью пинцета аккуратно удалите всю ткань, не относящуюся к ЦНС, оставив только ЦНС и мозг, прикрепленные к кутикуле (рис. 3E).
- Мозг будет прикреплен к кутикуле с помощью аксональных соединений. Используя ножницы для микродиссекции, разрежьте эти аксональные связи, чтобы освободить мозг от кутикулы. Для этого сначала аккуратно прорежьте под ним доли мозга (рис. 3F). Повторите то же самое с соединениями под вентральным нервным тяжем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно выполнить пинцетом, если ножницы для микродиссекции недоступны. Будьте особенно осторожны при использовании пинцета, чтобы гарантировать, что мозговая ткань не будет чрезмерно растянута во время удаления кутикулы, потому что механический стресс негативно скажется на здоровье мозга. - Перенесите рассеченный мозг в лунку со средой для вскрытия и визуализации. Для экспериментов с визуализацией продолжительностью более 3 часов используйте среду для вскрытия и визуализации, дополненную жировыми телами, как описано выше. Препарируйте личинок партиями, чтобы время вскрытия не превышало 20 минут.
5. Монтаж и визуализация (рис. 4)
- Для визуализации с помощью мембранного предметного стекла34:
- Соберите как препарированные мозги, так и изолированные жировые тела в последнем лунке вскрытия.
- Соберите половину предметного стекла, поместив газопроницаемую мембрану на заднюю часть предметного стекла, и вдавите разъемное кольцо в центр, удерживая его на месте (рис. 4A-C).
- Используя микропипетку объемом 200 мкл, перенесите на мембрану до 10 рассеченных мозгов и как можно больше жирового тела (см. Выше) в ~130-140 мкл среды для вскрытия и визуализации. Убедитесь, что среда с образцами осаждается в центре газопроницаемой мембраны (рис. 4D, E).
- Ориентируйте мозг на популяцию NB, которые будут визуализироваться, и на тип используемого микроскопа (рис. 4E). Расположите образец как можно ближе к объективу микроскопа. Например, чтобы получить изображение NB в центральных долях мозга, сориентируйте мозг так, чтобы доли мозга были ближе всего к объективу (рис. 4H).
- Как только мозг сориентируется, аккуратно поместите стеклянное стекло поверх раствора на мембране. Это приведет к тому, что раствор, содержащий мозг и жировые тела, распространится по всей мембране (рис. 4F).
- Промокните излишки раствора, поднеся лабораторную ткань близко к краю покровного стекла. Оптимальное количество раствора достигается, когда мозги касаются покровного стекла, не раздавливаясь. Если на этом этапе требуется переориентация, осторожно переместите покровное стекло, чтобы переместить мозги.
- Обездвижите покровное стекло, нанеся расплавленный вазелин по краям покровного стекла кистью. Дайте желе застыть (рис. 4G).
- Для визуализации с помощью многолуночного предметного стекла (рис. 4):
- Добавьте 400 мкл визуализирующей среды в лунку многолуночного предметного стекла (в эксперименте, проведенном здесь, использовался камерный 8-луночный микро[μ]-слайд; Рисунок 4I). Перенесите в эту лунку ранее рассеченные жировые тела (см. шаг 3.4).
- Поместите до 10 мозгов в кластер недалеко от центра скважины (рис. 4J).
- Сориентируйте мозг для популяции NB, подлежащих визуализации, и для типа используемого микроскопа, как описано на шаге 5.1.4 (рис. 4K). Расположите образцы так, чтобы они были близко друг к другу. Это минимизирует расстояние, на которое столик должен перемещаться между образцами, что уменьшает дрейф образца во время сбора.
- После того, как мозг сориентировался в лунке, дайте мозгу успокоиться в течение 2-5 минут. Это повышает их стабильность во время транспортировки / визуализации. Подготовьте микроскоп к съемкам в течение этого времени.
- Накройте μ-предметное стекло крышкой предметного стекла и перенесите его на микроскоп. Начните сбор данных с минимально возможной мощности лазера и времени экспозиции, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание.
6. Лучшие практики обработки и управления данными
- Обрабатывайте данные по мере необходимости в соответствии с доступным программным обеспечением для анализа.
- В приведенном здесь примере сохраните полученные данные с помощью программного обеспечения SlideBook в виде файла изображения SlideBook (.sld).
- Чтобы преобразовать файл в проприетарный тип файла Imaris (.ims) с помощью конвертера файлов Imaris, откройте конвертер файлов Imaris в отдельном окне. Нажмите и перетащите файлы .sld в раздел «Ввод» конвертера файлов Imaris.
- Определите желаемое место вывода преобразованных файлов и нажмите «Начать все».
- После преобразования просмотрите и аннотируйте данные в программном обеспечении Imaris.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо ImaRIS можно использовать альтернативы для анализа изображений, такие как Fiji (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html), Aivia (https://www.aivia-software.com/), Volocity (https://www.volocity4d.com/) или другие.
- Сохраняйте как можно больше исходных данных для правильного ведения учета. Например, если программное обеспечение для сбора данных сохранено в одном формате файла, но преобразовано в другой формат для анализа, сохраните полученную версию данных.
- Для анализа данных ведите учет как можно большего количества сведений о выборке и параметрах сбора данных. Ключевая информация, которую необходимо сохранить, включает генотип препарированных личинок, возраст личинок до вскрытия, состояние шапки для еды, в которой они были выращены, мощность лазера, используемую во время визуализации, время экспозиции, продолжительность сбора и временное разрешение.
7. Пример количественной оценки длины клеточного цикла (рис. 5)
ПРИМЕЧАНИЕ: в этом примере были изображены личинки, экспрессирующие маркер полярности Pins (Pins::EGFP16) и связывающий микротрубочки белок Jupiter25 (cherry::Jupiter13). Последующий анализ проводился с помощью программного обеспечения Imaris.
- Откройте фильм с помощью выбранного программного обеспечения для анализа изображений. Прокрутите фильм по длине, чтобы определить разделительные NB, и пометьте их для дальнейшего использования. Определите делительные NB по их отчетливым митотическим веретенам (рис. 5C-E).
- Определите эталонную стадию клеточного цикла, чтобы определить длину клеточного цикла. В этом примере метафаза используется в качестве эталона.
- Вручную определите количество кадров между последовательными метафазами и преобразуйте его в минуты или часы, чтобы определить время, необходимое для завершения одного клеточного цикла.
- Сделайте это, взяв временное разрешение фильма и умножив его на количество кадров между метафазами. Например, если временное разрешение фильма составляет один кадр каждые 5 минут, а метафазы наблюдаются в кадре 13 и кадре 35, время между этими метафазами будет составлять 110 минут ([35 − 13] × 5).
- Нанесите данные на график с помощью любого соответствующего программного обеспечения. Данные, показанные здесь, были построены с использованием программного обеспечения PRISM.
8. Пример количественного определения выравнивания шпинделя ячеек (рис. 5)
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере анализ выполняется с помощью программного обеспечения Imaris.
- Откройте файл фильма в Imaris или другом программном обеспечении по вашему выбору. Прокрутите фильм по длине, чтобы определить разделительные NB, и пометьте их для дальнейшего использования.
- Определите вектор, образованный полюсами веретена, используя апикальную и базальную центросомы (представленные m), следующим образом:
где Ax, Ay и Az — координаты апикальной центросомы, а Bx, By и Bz — координаты базальной центросомы. Точно так же ось вектора деления (представленная n) образована средней точкой апикального полумесяца Pins::EGFP и базальной корой:
где Ax, Ay и Az — координаты средней точки полумесяца Pins::EGFP, а Bx, By и Bz — координаты средней точки базальной коры. - Определим величину векторов m и n:
Магнитуда м:
Величина n:
- Определите скалярное произведение (представленное k) m и n:
- Используя скалярное произведение k и векторные величины m и n, определите угол между векторами:
- Нанесите данные на график в выбранном программном обеспечении. Данные, показанные здесь, были подготовлены в Microsoft Excel и визуализированы в PRISM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Вскрытие и визуализация НБ центральной доли мозга, экспрессирующих Pins::EGFP и Cherry::Jupiter
Чтобы продемонстрировать этот протокол, личинки экспрессируют управляемый UAS Cherry::Jupiter13 и эндогенно помеченные Pins::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pins::EGFP/TM6B, Tb) визуализировали в течение 4 ч с использованием описанного протокола с использованием многолуночных слайдов визуализации (рис. 5C, D). Дополнительные данные были взяты из личинок, экспрессирующих управляемый UAS Cherry::Jupiter13 и эндогенно помеченных Miranda::EGFP (w; worGal4, UAS-cherry::Zeus/CyO; UAS-Miranda::GFP/TM6B), которые визуализировали в течение 10 часов с использованием связанного с мембраной предметного стекла (рис. 5E, F). Личинки выращивали в клетках, как описано в разделе 1 настоящего протокола. По достижении возраста 72-96 ч личинки были препарированы (рис. 3), установлены (рис. 4) и сфотографированы. Для проведенных здесь экспериментов использовался лазер с длиной волны 561 нм при мощности лазера 10% при времени экспозиции 100 мс, а лазер с длиной волны 488 нм использовался при мощности лазера 15% при времени экспозиции 100 мс. Z-стеки (41 мкм) были получены с шагом 1 мкм. Изображения получались каждые 5 минут на RT с помощью конфокальной системы с вращающимся диском Intelligent Imaging Innovations (3i), состоящей из блока вращающихся дисков Yokogawa CSU-W1 и двух КМОП-камер Prime 95B Scientific. Для получения изображений использовался масляный иммерсионный объектив 60x/1.4NA, установленный на микроскопе Nikon Eclipse Ti. Воксели живого изображения составляли 0,22 мкм x 0,22 мкм x 0,75 мкм (вращающийся диск 60x / 1,4NA).
В соответствии с предыдущими отчетами16, булавки образовывали ярко выраженный апикальный полумесяц при делении NB во время митоза, а митотические веретена последовательно выравнивались по этому апикальному полумесяцу (рис. 5C). Продолжительность клеточного цикла определяли путем измерения времени между последовательными метафазами отдельных НБ (рис. 5D, F).
В образцах, которые были изображены на многолуночном предметном стекле в течение 4 часов без добавления жировых тел, длина клеточного цикла увеличивалась с увеличением времени визуализации (рис. 5C, D). Образцы, которые были изображены в среде, дополненной жировым телом, на предметном стекле, связанном с мембраной, не показали увеличения длины клеточного цикла (рис. 5E, F). Кроме того, на 10-часовом предметном стекле, связанном с мембраной, наблюдались NB с четырьмя делениями (рис. 5D против рис.5F).
Наконец, угол между осью деления и митотическим шпинделем был определен с использованием штифтов, помеченных GFP, в качестве эталона (схема показана на рисунке 5G). Ось деления определяли путем определения средней точки апикального полумесяца, образованного булавками при митозе, и разделения клетки пополам (рис. 5G, красная пунктирная линия). Как было описано ранее, NB дикого типа имели митотические веретена, которые были ориентированы не более чем на 30° от оси деления (Loyer and Januschke36 и рис. 5H).
Рисунок 1: Материалы. (А) Диссекционный микроскоп. (B) Клетка для сбора, содержащая мух желаемого генотипа и шапочку для еды с растущими личинками. (C) Среда для вскрытия и визуализации, 5 мл. (D) Шапки для муки с личинками из трех различных коллекций. (Э,Э') Инструменты для микродиссекции, слева направо: микродиссекционные ножницы, щипцы. (Ф,Ф') Препарирующая чашка. (G) 8-скважинный μ-слайд для визуализации образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пример крышек для еды. (A) Два флакона с самцами и самками мух, подлежащих скрещиванию, пустая клетка для сбора эмбрионов и крышка для свежей еды. (B) Нижняя часть клетки для сбора эмбрионов с новой крышкой для еды (слева) и верхняя часть клетки с мухами (справа). (C) Полностью собранная клетка для мух. (D) Пример хорошо подготовленной шапки для еды с личинками для вскрытия. Учтите, что питание нарушается личинками, но не перетревожено. (Е,Ж) Два примера 4-дневных, переполненных шапок для еды. Обратите внимание, что эта пища теперь имеет консистенцию, похожую на суп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Вскрытие . (A) Дорсальный вид личинки третьего возраста. Красная линия на заднем конце личинки обозначает, где должен быть сделан первый срез. (B) Дорсальный вид личинки после удаления заднего конца. (C) Схема, показывающая, как инвертировать личинку. Используя один набор щипцов, удерживайте личинку за кутикулу рядом с тем местом, где был сделан первый разрез. Используя другие щипцы, надавите на передний конец личинки, чтобы перевернуть. Черные стрелки обозначают направление щипцов, при этом одна из них «проталкивает» личинок с передней стороны, а другая перемещает разрезанный задний конец к переднему концу. Меньшая красная стрелка обозначает карикатуру на толстые тела. (D) Вид перевернутой личинки с прикрепленными жировыми телами и пищеварительным трактом. (E) Вид перевернутой личинки с удаленной тканью, не относящейся к ЦНС. Красная пунктирная линия обрисовывает все еще прикрепленный мозг. (F) Схема, показывающая, как удалить мозг из кутикулы. Красная пунктирная линия обозначает путь, который нужно разрезать ножницами микродиссекции, чтобы освободить мозг от перевернутой кутикулы, а черные стрелки обозначают удаление мозга из кутикулы. (G) Вид перевернутого мозга, который все еще прикреплен к кутикуле небольшим количеством аксональных связей под вентральным нервным мозгом (VNC). (H) Изолированный личиночной мозг. Доли мозга очерчены пунктирными оранжевыми линиями. (I) Изолированные жировые тела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Монтаж и визуализация. А) Вид компонентов для сборки металлического предметного стекла, связанного мембраной. (B) Схема компонентов мембранного суппорта и их сборки. (C) Вид сбоку мембраны, вставленной в металлический суппорт, удерживаемой на месте разъемным металлическим кольцом. (D) Вид сверху на собранный слайд изображения без покровного стекла. Среда для вскрытия и визуализации, содержащая жировые тела и препарированный мозг, была помещена на мембрану. (E) Увеличенный вид жировых тел и мозгов в капле среды. (F) Вид сверху на металлический предметный стеколь после добавления стеклянного покровного стекла. (G) Вид сверху на собранное предметное стекло со стеклянным покровным стеклом, прикрепленным к предметному стеклу с расплавленным вазелином. Покрытие краев покровного стекла вазелином также предотвращает испарение среды. (H) Схема собранного мембранного предметного стекла с мозгом, ориентированным для наблюдения на перевернутом микроскопе. Синие круги обозначают NB в центральных долях мозга и VNC. (I) Вид пустого многолуночного предметного стекла. (J) Увеличенный вид одной из скважин предметного стекла с многолуночными изображениями. (K) Схема, показывающая ориентацию мозга для визуализации центральных долей мозга на перевернутом микроскопе с многолуночным предметным стеклом. Синие круги обозначают NB в центральных долях мозга и VNC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Количественная оценка длины клеточного цикла . (A) Диаграмма личиночной мозга третьего возраста, выделяющая доли мозга, зрительную долю (OL, темно-серый), вентральный нервный мозг (VNC), NB (темно-синий), GMC (светло-синий) и нейроны (фиолетовый) в центральных долях мозга и VNC. (B) Схема подразделений NB и GMC. (C) Серия изображений NB дикого типа с микротрубочками, помеченными белым цветом (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) и апикальными штифтами (Pins::EGFP зеленого цвета), изображенными на многолуночном предметном стекле без добавления жировых тел в течение 4 часов. Объединенные изображения и соответствующее дерево родословной с синхронизацией клеточного цикла показаны ниже. Масштабная линейка = 10 мкм. (D) Количественная оценка длины клеточного цикла (метафаза - метафаза) для первого, второго и третьего делений в образцах, изображенных на многолуночном предметном стекле без жировых тел. (E) Серия изображений NB дикого типа с микротрубочками, помеченными белым цветом (MTs, UAS-Cherry::Jupiter), изображенная с помощью связанного с мембраной предметного стекла с добавлением жирового тела в течение 10 часов с соответствующим деревом происхождения и временем клеточного цикла, показанными ниже. Масштабная линейка = 10 мкм. (F) Количественная оценка длины клеточного цикла (метафаза - метафаза) для первого, второго, третьего и четвертого делений в образцах, изображенных на связанном с мембраной предметном стекле с жировыми телами. (G) Схема определения угла между осью шпинделя (оранжевая пунктирная линия) и осью деления (θ, красная пунктирная линия). (H) Количественное определение θ из 10 клеток, визуализированных с использованием многолуночного предметного стекла без жировых тел. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе изложен один из подходов к визуализации живого мозга эксплантатов личинок Drosophila melanogaster . Описанный здесь протокол позволяет наблюдать за мозгом эксплантата в течение 12-20 часов в правильных экспериментальных условиях. Особое внимание должно быть уделено подготовке образцов и планированию желаемых экспериментов. Как уже говорилось выше, одним из наиболее важных факторов, определяющих качество рассеченной ткани, является здоровье личинок. Чтобы добиться максимально возможного качества, необходимо убедиться, что личинки хорошо накормлены перед сбором. Нездоровые личинки чаще всего возникают из-за перенаселенности. Чтобы решить эту проблему, необходимо свести к минимуму перенаселенность, либо увеличив частоту сбора урожая, либо разделив блюда со свежеснесенными яйцами на пустую тарелку.
Другим важным элементом этого протокола является метод вскрытия для изоляции мозговой ткани. Мозг и НБ внутри них чрезвычайно чувствительны к внешним факторам, таким как температура диссекционной среды и инвазивность самой диссекции. Слишком холодная среда будет иметь тенденцию к деполимеризации микротрубочек. Точно так же рассечение, которое растягивает или разрывает мозг, окажет пагубное влияние на качество NB. Чтобы предотвратить это, следует избегать прямого натяжения мозговой ткани и вместо этого закреплять инструменты для рассечения на кутикуле или другой ткани. Ножницы для микродиссекции очень помогают в этом отношении, так как они минимально натягивают ткани мозга. Если ножницы недоступны, можно использовать пинцет, чтобы аккуратно удалить соединительную ткань между вентральным нервным мозгом и кутикулой.
В этом протоколе представлены два метода установки личиночной мозга для конфокальной микроскопии. С технической точки зрения монтаж образцов в многолуночном суппорте проще, чем монтаж на мембранном суппорте. Однако каждый метод лучше всего подходит для разных типов экспериментов. Данные, показанные здесь, показывают, что для более коротких фильмов (т. е. менее 4 ч) или фильмов с высоким временным разрешением (т. е. получения z-стека каждые 10 с) визуализации на многолуночном слайде достаточно для наблюдения нескольких делений в личиночном центральном мозге. Для более длительных окон съемки идеально подходит монтаж на мембранный слайд, так как образцы, подготовленные таким образом, чаще делятся на протяжении всего фильма. В норме личинки дикого типа НБ делятся раз в 40-90 мин13. Хотя многолуночные слайды можно использовать для длинных (> 4 ч) фильмов, в этом состоянии наблюдалось увеличение длины клеточного цикла и уменьшение пролиферирующих NB (рис. 5D). Поэтому при планировании экспериментов необходимо учитывать метод, используемый для монтажа образцов, и тип данных, подлежащих измерению.
Этот протокол рекомендует визуализировать несколько мозгов в одной лунке или слайде, так как это повышает эффективность сбора данных для любого данного эксперимента. Тем не менее, ориентация и расположение мозга в колодце будут влиять на то, насколько сильно сдвиг происходит на протяжении всего фильма из-за перемещения сцены между положениями мозга. Объединение мозгов в одном централизованном месте в колодце сводит к минимуму эту проблему. Тем не менее, некоторое смещение может произойти в ходе более длинных фильмов в экспериментах с использованием многолуночных слайдов. Во многих случаях смещение, наблюдаемое в этих более длинных фильмах, минимально и может быть исправлено во время анализа. Движение мозга также можно предотвратить с помощью металлического слайда, потому что капиллярные силы предотвращают смещение рассеченного мозга.
С помощью многолуночного предметного стекла технически возможно проводить эксперименты с многолуночной визуализацией. Однако это требует корректировки размера стека и временного разрешения, чтобы учесть дополнительное время, затрачиваемое микроскопом на перемещение между положениями. Это может быть полезно для крупномасштабных экспериментов по генетическому скринингу, когда можно визуализировать несколько генотипов в разных лунках.
Бывают случаи, когда мозг будет демонстрировать мало или вообще не отображать делящиеся NB в ходе эксперимента. Вероятно, это связано с несколькими факторами, которые зависят от характера образца, качества пищи, используемой для выращивания личинок, качества вскрытия и настроек сбора, используемых для получения данных. Несмотря на то, что при подготовке мозга личинок к визуализации желательно удалить как можно больше ткани, не рекомендуется чрезмерно обрезать мозг, чтобы свести к минимуму механическое напряжение, так как это может негативно повлиять на качество данных. Кроме того, частое воздействие мощных лазеров для визуализации негативно скажется на здоровье нейробластов. Таким образом, следует рассмотреть возможность регулировки мощности лазера, времени экспозиции и частоты изображения при сборе данных изображения.
Для монтажа образцов могут быть использованы альтернативные методы. Например, мозги эксплантата могут быть смонтированы в твердотельную матрицу37. Наличие различных протоколов монтажа дает возможность визуализировать эксплантаты личинок мозга на самых разных микроскопах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет финансовой информации, которую они могли бы декларировать.
Acknowledgments
Это исследование поддерживается R35GM148160 (C.C.) и Национальным институтом здравоохранения (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R.C.S.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
References
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division. Development. 147 (13), (2020).
- Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions. Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).
- Loyer, N., Januschke, J. Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts. Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).
- Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages. Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).
- Oon, C. H., Prehoda, K. Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle. eLife. 8, e45815 (2019).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Oon, C. H., Prehoda, K. E. Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle. eLife. 10, e66574 (2021).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle. Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).
- Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway. Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).
- Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts. Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).
- Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N. Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).
- Montembault, E., et al. Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage. Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).
- Roubinet, C., et al. Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells. Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C.
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Lerit, D. A., et al. Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function. Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).
- Gallaud, E., et al. Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry. PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).
- Ramdas Nair, A., et al. The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).
- Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells. Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).
- Sunchu, B., et al. Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo. Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).
- Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation. Developmental Biology. 475, 256-264 (2021).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).
- Lee, C. -Y., et al. Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation. Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).
- Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages. PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules. Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
