Summary
Aquí, discutimos un flujo de trabajo para preparar, diseccionar, montar y obtener imágenes de cerebros de explante vivos de larvas del tercer estadio de Drosophila melanogaster para observar la dinámica celular y subcelular en condiciones fisiológicas.
Abstract
Las células madre neurales de Drosophila (neuroblastos, NB en adelante) experimentan divisiones asimétricas, regenerando el neuroblasto autorrenovador, al tiempo que forman una célula madre ganglionar diferenciadora (GMC), que sufrirá una división adicional para dar lugar a dos neuronas o glía. Los estudios en NB han descubierto los mecanismos moleculares subyacentes a la polaridad celular, la orientación del huso, la autorrenovación de las células madre neurales y la diferenciación. Estas divisiones celulares asimétricas son fácilmente observables a través de imágenes de células vivas, lo que hace que las larvas sean ideales para investigar la dinámica espaciotemporal de la división celular asimétrica en el tejido vivo. Cuando se diseccionan adecuadamente y se obtienen imágenes en un medio suplementado con nutrientes, los NB en los cerebros de explante se dividen robustamente durante 12-20 h. Los métodos descritos anteriormente son técnicamente difíciles y pueden ser desafiantes para aquellos nuevos en el campo. Aquí, se describe un protocolo para la preparación, disección, montaje e imágenes de explantes cerebrales larvales vivos del tercer estadio utilizando suplementos corporales gordos. También se discuten los problemas potenciales y se proporcionan ejemplos de cómo se puede utilizar esta técnica.
Introduction
La división celular asimétrica (ACD) es el proceso por el cual los componentes subcelulares como el ARN, las proteínas y los orgánulos se dividen de manera desigual entre las células hijas 1,2. Este proceso se ve comúnmente en las células madre, que se someten a ACD para dar lugar a células hijas con diferentes destinos de desarrollo. Drosophila Los NB se dividen asimétricamente para producir un NB, que conserva su tallo, y una célula madre ganglionar (GMC). El GMC sufre más divisiones para producir neuronas diferenciadoras o glía3. Los NB que se dividen asimétricamente son abundantes en los cerebros en desarrollo de las larvas del tercer estadio, que se observan fácilmente a través de la microscopía. En la tercera etapa larvaria del estadio, hay aproximadamente 100 NB presentes en cada lóbulo cerebral central 3,4,5,6.
La división celular asimétrica es un proceso altamente dinámico. Se han utilizado protocolos de imagen de células vivas para medir y cuantificar la dinámica de la polaridad celular 7,8,9,10, la orientación del huso 11,12,13, la dinámica de la corteza de actomiosina 14,15,16,17,18, la biología de microtúbulos y centrosomas 19,20,21,22,23,24,25,26,27, y membrana 10,28 y dinámica de la cromatina 29. Las descripciones cualitativas y cuantitativas de ACD se basan en métodos y protocolos robustos para dividir imágenes NB en cerebros vivos intactos. El siguiente protocolo describe métodos para preparar, diseccionar y obtener imágenes de cerebros larvales del tercer estadio para obtener imágenes de células vivas in vivo utilizando dos enfoques de montaje diferentes. Estos métodos son más adecuados para investigadores interesados en la dinámica espaciotemporal de las divisiones de células madre, así como las divisiones en otras células cerebrales, ya que permiten observaciones a corto y largo plazo de eventos celulares. Además, estas técnicas son fácilmente accesibles para los recién llegados al campo. Demostramos la efectividad y adaptabilidad de este enfoque con cerebros larvales que expresan microtúbulos marcados fluorescentemente y proteínas de fusión cortical. Además, discutimos los métodos de análisis y las consideraciones para su aplicación en otros estudios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: La figura 1 muestra los materiales necesarios para realizar este estudio.
1. Consideraciones y preparativos para el experimento
- Evite que las larvas se hacinen.
NOTA: La calidad de los cerebros larvales explante está directamente relacionada con la salud y la calidad de las larvas antes de la disección. Las larvas que están desnutridas por el hacinamiento generalmente producirán cerebros de menor calidad30.- Asegúrese de que no haya más de 20-30 larvas presentes por plato de tapa de comida para evitar la desnutrición. Ejemplos de estos se pueden ver en la Figura 2.
- Filtrar y alícuota el medio de Schneider antes de usarlo.
- Para cada disección, prepare nuevas imágenes y medio de disección complementando el medio de insectos de Schneider con suero de crecimiento bovino (BGS) al 1%. Un volumen de 5 ml de disección y medio de imagen suele ser suficiente para un experimento de imagen.
- Caliente el medio suplementado a temperatura ambiente (RT) antes de usarlo.
- Considere la duración de la película que se recopilará y utilícela para factorizar la suplementación del medio de imagen, el enfoque de montaje y los ajustes de adquisición del microscopio.
NOTA: En condiciones óptimas, los NB en cerebros suplementados solo con BGS se dividirán robustamente durante más de 3 h.- Complemente el medio de imagen agregando tejidos corporales grasos larvales al medio de imagen para soportar divisiones pasadas 4 h cuando realice experimentos que requieran películas más largas.
NOTA: Los cuerpos grasos secretan mitógenos que apoyan la proliferación de NB31, y los cuerpos enteros de grasa de 10 larvas son suficientes para soportar de cuatro a cinco cerebros. Además, se ha demostrado que las muestras fotografiadas con un portaobjetos unido a la membrana se dividen durante más de 10 h13,32, mientras que las muestras fotografiadas con un portaobjetos de múltiples pocillos generalmente se dividen con menos frecuencia (observaciones no publicadas). - Alternativamente, implemente un medio de imagen más complejo para películas más largas, como se describió anteriormente33. Minimice el fotodaño ajustando el tiempo de exposición, la potencia del láser y la frecuencia de muestreo para obtener mejores resultados.
- Complemente el medio de imagen agregando tejidos corporales grasos larvales al medio de imagen para soportar divisiones pasadas 4 h cuando realice experimentos que requieran películas más largas.
2. Estadificación y recolección de larvas (Figura 2)
- Cruce moscas vírgenes hembras de 1-5 días de edad con moscas macho adultas de 1-7 días de edad para producir progenie con el genotipo deseado. Para un rendimiento óptimo, cruce 10-15 vírgenes hembras con 5-10 machos. Depositar estas moscas en una jaula para moscas con un gorro de comida (Figura 2A-C) e incubar a 25 °C.
- Cambie la tapa de comida diariamente. Esto evita que las tapas de comida se llenen de larvas, lo que reduce la calidad de los cerebros disecados.
- Si la tapa de comida está cubierta significativamente de larvas (es decir, >30), divida esta tapa de comida por la mitad y reemplace una mitad con una tapa de comida nueva que también se haya cortado por la mitad. Alternativamente, cambie las tapas de comida con mayor frecuencia (es decir, cada 12 h en lugar de cada 24 h). Se pueden ver ejemplos de tapas de comida superpobladas en la Figura 2E, F.
- Incubar el tapón de comida con larvas a 25 °C hasta que las larvas alcancen la edad deseada.
3. Disección del cuerpo graso larval (Figura 3)
NOTA: Este protocolo describe las disecciones utilizando una placa de disección de 3 pocillos.
- Pipetear ~400 μL de disección y medio de imagen en cada pocillo de una placa de disección de 3 pocillos.
- Lave diez larvas de tipo silvestre de 72-96 h de edad bien alimentadas sosteniéndolas suavemente con pinzas de disección y sumergiéndolas dentro y fuera de la solución de disección en el pozo inferior hasta que se hayan lavado todas las partículas de alimentos. Después de enjuagar, mueva las larvas limpias al pozo medio.
- Usando un juego de pinzas, sostenga la larva por los ganchos bucales. Con el otro juego de pinzas, rompe un lado de la cutícula de la larva.
- Esta ruptura hará que los cuerpos gordos se derramen fuera de la larva. Los cuerpos grasos son blanquecinos y semitranslúcidos y tendrán una estructura en forma de celosía (Figura 3I). Los cuerpos gordos también tenderán a adherirse a sí mismos y a las pinzas de disección. Una vez identificado, recolecte la mayor cantidad posible de cuerpo graso de cada larva y transfiéralo con los fórceps al pozo superior con 400 μL de medio de disección RT.
4. Disección larvaria del cerebro (Figura 3)
- Lave las larvas experimentales en disección y medio de imagen como el anterior para liberarlas de residuos de alimentos. Para obtener los mejores resultados, evite almacenar larvas no disecadas en la solución de disección. Esto hará que las larvas se "ahoguen" y tendrá un impacto negativo en la calidad de los cerebros disecados.
- Usando un juego de pinzas, sostenga la larva por los ganchos bucales. Usando otro juego de pinzas, corta/arranca suavemente aproximadamente 1/3 de la larva del lado posterior (Figura 3A). Esto hará que elementos del tracto digestivo, cuerpos grasos, tejido conectivo y sistema nervioso "estallen" del lado roto de la larva (Figura 3B).
- Usando un juego de pinzas, sostenga la larva por los ganchos bucales. Con el otro juego de pinzas, cepille suavemente la cutícula hacia los ganchos bucales mientras "empuja" hacia adentro con las pinzas que sostienen los ganchos bucales hasta que toda la larva esté al revés. Este movimiento es similar a girar un calcetín "de adentro hacia afuera" (Figura 3C, D).
- Invierta la larva para que el sistema nervioso central y otros tejidos miren hacia afuera mientras aún están conectados a la cutícula. En este paso, localice el sistema nervioso central (SNC) para evitar la extirpación accidental. Usando pinzas, retire suavemente todo el tejido que no sea del SNC, dejando solo el SNC y el cerebro unidos a la cutícula (Figura 3E).
- El cerebro se unirá a la cutícula a través de conexiones axonales. Usando tijeras de microdisección, corte estas conexiones axonales para liberar el cerebro de la cutícula. Para hacer esto, primero corte suavemente debajo de los lóbulos cerebrales (Figura 3F). Repita con las conexiones debajo del cordón nervioso ventral.
NOTA: Este paso se puede hacer con pinzas si las tijeras de microdisección no están disponibles. Tenga especial cuidado al usar pinzas para asegurarse de que el tejido cerebral no se estire demasiado durante la extracción de la cutícula porque el estrés mecánico afectará negativamente la salud del cerebro. - Transfiera el cerebro diseccionado a un pozo con disección y medio de imagen. Para experimentos de imágenes de más de 3 h, use disección y medio de imagen suplementado con cuerpos grasos como se describió anteriormente. Diseccionar las larvas en lotes para mantener el tiempo de disección por debajo de 20 min.
5. Montaje e imágenes (Figura 4)
- Para obtener imágenes con una diapositiva34 unida a la membrana:
- Recolecte cerebros disecados y cuerpos grasos aislados en el último pocillo de la placa de disección.
- Ensamble la mitad del portaobjetos colocando una membrana permeable al gas sobre la parte posterior del portaobjetos y presione el anillo dividido en el centro, manteniéndolo en su lugar (Figura 4A-C).
- Usando una micropipeta de 200 μL, transfiera hasta 10 cerebros disecados y la mayor cantidad posible de cuerpo graso (ver arriba) en ~130-140 μL de disección y medio de imagen a la membrana. Asegúrese de depositar el medio con las muestras en el centro de la membrana permeable al gas (Figura 4D, E).
- Orientar los cerebros para la población de RNs a ser fotografiada y para el tipo de microscopio que se utiliza (Figura 4E). Coloque la muestra lo más cerca posible del objetivo del microscopio. Por ejemplo, para obtener imágenes de NB en los lóbulos centrales del cerebro, oriente los cerebros de tal manera que los lóbulos cerebrales estén más cerca del objetivo (Figura 4H).
- Una vez que los cerebros estén orientados, coloque suavemente un cubreobjetos de vidrio sobre la solución en la membrana. Esto hará que la solución que contiene los cerebros y los cuerpos grasos se extienda sobre la totalidad de la membrana (Figura 4F).
- Seque la solución excesiva sosteniendo un tejido de laboratorio cerca del borde del cubreobjetos. La cantidad óptima de solución se logra cuando los cerebros tocan el cubreobjetos sin ser aplastados. Si se requiere reorientación en este paso, mueva con cuidado el cubreobjetos para mover los cerebros.
- Inmovilice el cubreobjetos aplicando vaselina derretida a lo largo de los bordes del cubreobjetos con un pincel. Permita que la gelatina se solidifique (Figura 4G).
- Para obtener imágenes con una diapositiva de imágenes de múltiples pocillos (Figura 4):
- Agregue 400 μL de medio de imagen a un pocillo de un portaobjetos de múltiples pocillos (en el experimento realizado aquí, se utilizó un micro[μ] portaobjetos de 8 pocillos con cámara; Figura 4I). Transfiera los cuerpos grasos previamente diseccionados a este pocillo (ver paso 3.4).
- Depositar hasta 10 cerebros en un grupo cerca del centro del pozo (Figura 4J).
- Orientar los cerebros para la población de RN que se va a obtener imágenes y para el tipo de microscopio que se utiliza, como se describe en el paso 5.1.4 (Figura 4K). Organice las muestras de manera que estén cerca una de la otra. Esto minimizará la distancia que la etapa debe moverse entre las muestras, lo que reduce la deriva de la muestra durante la adquisición.
- Una vez que los cerebros se hayan orientado en el pozo, permita que los cerebros se asienten durante 2-5 minutos. Esto aumenta su estabilidad durante el transporte / imagen. Prepare el microscopio para la adquisición durante este tiempo.
- Cubra el portaobjetos μ con la cubierta del portaobjetos y transfiéralo al microscopio. Comience la adquisición con la menor potencia láser y tiempo de exposición posible para minimizar el fotoblanqueo.
6. Mejores prácticas de procesamiento y gestión de datos
- Procese los datos según sea necesario de acuerdo con el software de análisis disponible.
- Para el ejemplo que se muestra aquí, guarde los datos adquiridos con el software SlideBook como un archivo de imagen de SlideBook (.sld).
- Para convertir al tipo de archivo propietario de Imaris (.ims) utilizando el convertidor de archivos de Imaris, abra el convertidor de archivos de Imaris en una ventana separada. Haga clic y arrastre los archivos .sld a la sección "entrada" del convertidor de archivos Imaris.
- Determine la ubicación de salida deseada para los archivos convertidos y haga clic en "Iniciar todo".
- Después de la conversión, vea y anote los datos en el software Imaris.
NOTA: Se pueden usar alternativas para el análisis de imágenes en lugar de Imaris, como Fiji (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html), Aivia (https://www.aivia-software.com/), Volocity (https://www.volocity4d.com/) u otros.
- Conserve la mayor cantidad posible de datos originales para el mantenimiento adecuado de registros. Por ejemplo, si el software de adquisición se guarda en un formato de archivo pero se convierte a un formato diferente para su análisis, conserve la versión adquirida de los datos.
- Para el análisis de datos, mantenga un registro de tantos detalles como sea posible sobre la muestra y la configuración de adquisición. La información clave para retener incluye el genotipo de las larvas disecadas, la edad de las larvas antes de la disección, el estado de la tapa de comida en la que fueron criadas, la potencia del láser utilizada durante la obtención de imágenes, el tiempo de exposición, la duración de la adquisición y la resolución temporal.
7. Ejemplo de cuantificación de la duración del ciclo celular (Figura 5)
NOTA: en este ejemplo, se obtuvieron imágenes de larvas que expresan el marcador de polaridad Pins (Pins::EGFP16) y la proteína de unión a microtúbulos Júpiter25 (cereza::Júpiter13). El análisis posterior se realizó utilizando el software Imaris.
- Abra la película utilizando el software de análisis de imágenes de su elección. Desplácese por la longitud de la película para identificar los NB divididos y etiquételos para referencia futura. Identifique los RN divisorios por sus distintos husos mitóticos (Figura 5C-E).
- Identifique una etapa del ciclo celular de referencia para determinar la duración del ciclo celular. En este ejemplo, metaphase se utiliza como referencia.
- Determine manualmente el número de fotogramas entre metafases sucesivas y conviértalo en minutos u horas para determinar el tiempo necesario para completar un ciclo celular.
- Haga esto tomando la resolución temporal de la película y multiplicándola por el número de fotogramas entre metafases. Por ejemplo, si la resolución temporal de la película es de un fotograma cada 5 minutos, y las metafases se observan en el fotograma 13 y el fotograma 35, el tiempo entre estas metafases sería de 110 min ([35 − 13] × 5).
- Trazar los datos con cualquier software apropiado. Los datos que se muestran aquí se trazaron utilizando el software PRISM.
8. Ejemplo de cuantificación de la alineación del huso celular (Figura 5)
NOTA: En este ejemplo, el análisis se realiza utilizando el software Imaris.
- Abra el archivo de película en Imaris u otro software de su elección. Desplácese por la longitud de la película para identificar los NB divididos y etiquételos para referencia futura.
- Determine el vector formado por los polos del huso utilizando los centrosomas apical y basal (representados por m), de la siguiente manera:
donde Ax, Ay, y Az son las coordenadas del centrosoma apical, y Bx, By y Bz son las coordenadas del centrosoma basal. Del mismo modo, el eje del vector de división (representado por n) está formado por el punto medio de los pines apicales::EGFP media luna y la corteza basal:
donde Ax, Ay, y Az son las coordenadas del punto medio de los Pines::EGFP media luna, y Bx, By, y Bz son las coordenadas del punto medio de la corteza basal. - Determina la magnitud de los vectores m y n:
Magnitud de m:
Magnitud de n:
- Determine el producto punto (representado por k) de m y n:
- Usando el producto de puntos k y las magnitudes vectoriales m y n, determina el ángulo entre los vectores:
- Trazar los datos en el software de su elección. Los datos que se muestran aquí fueron preparados en Microsoft Excel y visualizados en PRISM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disección e imágenes del lóbulo central del cerebro NBs que expresan Pins::EGFP y Cherry::Júpiter
Para mostrar este protocolo, las larvas que expresan Cherry::Jupiter13 y Pins endógenamente etiquetados::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pins::EGFP/TM6B, Tb) se obtuvieron imágenes durante 4 h utilizando el protocolo descrito utilizando diapositivas de imágenes de múltiples pocillos (Figura 5C, D). Se tomaron datos adicionales de larvas que expresaban cereza impulsada por UAS::Júpiter13 y se marcaron endógenamente Miranda::EGFP (w; worGal4, UAS-cherry::Zeus/CyO; UAS-Miranda::GFP/TM6B), que fueron fotografiados durante 10 h usando un portaobjetos unido a la membrana (Figura 5E,F). Las larvas fueron criadas en jaulas como se describe en la sección 1 de este protocolo. Al llegar a las 72-96 h de edad, las larvas fueron disecadas (Figura 3), montadas (Figura 4) y fotografiadas. Para los experimentos realizados aquí, se utilizó un láser de 561 nm al 10% de potencia láser con 100 ms de tiempo de exposición, y un láser de 488 nm a una potencia láser del 15% con 100 ms de tiempo de exposición. Las pilas Z (41 μm) se adquirieron con un tamaño de paso de 1 μm. Las imágenes se adquirieron cada 5 minutos en RT en un sistema confocal de disco giratorio de Intelligent Imaging Innovations (3i), que consiste en una unidad de disco giratorio Yokogawa CSU-W1 y dos cámaras CMOS Prime 95B Scientific. Se utilizó un objetivo de inmersión en aceite 60x/1.4NA montado en un microscopio Nikon Eclipse Ti para la obtención de imágenes. Los vóxeles de imágenes en vivo fueron de 0,22 μm x 0,22 μm x 0,75 μm (disco giratorio de 60x/1,4NA).
De acuerdo con informes anteriores16, los Pines formaron una media luna apical pronunciada en la división de NBs durante la mitosis, y los husos mitóticos se alinearon consistentemente con esta media luna apical (Figura 5C). La duración del ciclo celular se determinó midiendo el tiempo entre las metafases sucesivas de los RN individuales (Figura 5D, F).
En muestras que se obtuvieron imágenes en un portaobjetos de imágenes de múltiples pocillos durante 4 h sin suplementos de cuerpo graso, la duración del ciclo celular aumentó con el aumento del tiempo de imagen (Figura 5C, D). Las muestras que se obtuvieron imágenes en medio suplementado con cuerpo graso en un portaobjetos unido a la membrana no mostraron un aumento en la longitud del ciclo celular (Figura 5E, F). Además, se observaron RN con cuatro divisiones en el portaobjetos unido a la membrana de 10 h (Figura 5D vs. Figura 5F).
Por último, el ángulo entre el eje de división y el husillo mitótico se determinó utilizando Pines marcados con GFP como referencia (esquema que se muestra en la Figura 5G). El eje de división se determinó identificando el punto medio de la media luna apical formada por los Pines en la mitosis y dividiendo la célula por la mitad (Figura 5G, línea discontinua roja). Como se describió anteriormente, los NB de tipo salvaje mostraban husos mitóticos que estaban orientados a no más de 30° del eje de división (Loyer y Januschke36 y Figura 5H).
Figura 1: Materiales. (A) Microscopio de disección. (B) Jaula de recolección que contiene moscas del genotipo deseado y una tapa de comida con larvas en crecimiento. (C) Disección y medio de imagen, 5 mL. (D) Tapas de comida con larvas de tres colecciones diferentes. (E,E') Herramientas de microdisección, de izquierda a derecha: tijeras de microdisección, fórceps. (F,F') Plato de disección. (G) Un portaobjetos de μ de 8 pocillos para obtener imágenes de las muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplo de tapas de comida. (A) Dos viales con moscas macho y hembra para cruzar, una jaula vacía de recolección de embriones y una tapa de comida fresca. (B) La parte inferior de la jaula de recolección de embriones con la nueva tapa de comida (izquierda) y la parte superior de la jaula con moscas (derecha). (C) La jaula de mosca completamente ensamblada. (D) Un ejemplo de una tapa de comida bien escalonada con larvas para disección. Tenga en cuenta que la comida es perturbada por las larvas, pero no demasiado perturbada. (E,F) Dos ejemplos de tapas de comida abarrotadas de 4 días. Tenga en cuenta que esa comida ahora tiene una consistencia similar a la sopa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Disección . (A) Vista dorsal de una larva del tercer estadio. La línea roja en el extremo posterior de la larva denota dónde se debe hacer el primer corte. (B) Vista dorsal de la larva después de retirar el extremo posterior. (C) Diagrama que muestra cómo invertir la larva. Usando un conjunto de fórceps, sostenga la larva por la cutícula cerca de donde se hizo el primer corte. Usando los otros fórceps, presione en el extremo anterior de la larva para invertir. Las flechas negras denotan la dirección de los fórceps, con uno "empujando" las larvas desde el lado anterior y el otro moviendo el extremo posterior cortado hacia el extremo anterior. La flecha roja más pequeña denota una caricatura de cuerpos gordos. (D) Vista de una larva invertida con los cuerpos grasos y el tracto digestivo todavía unidos. (E) Vista de una larva invertida con el tejido no SNC eliminado. La línea discontinua roja delinea el cerebro aún unido. (F) Esquema que muestra cómo extraer el cerebro de la cutícula. La línea discontinua roja indica el camino para cortar con tijeras de microdisección para liberar el cerebro de la cutícula invertida, y las flechas negras denotan la eliminación del cerebro de la cutícula. (G) Una vista del cerebro invertido que todavía está unido a la cutícula por un pequeño número de conexiones axonales debajo del cordón nervioso ventral (VNC). (H) Un cerebro larvario aislado. Los lóbulos cerebrales están delineados con líneas discontinuas de color naranja. (I) Cuerpos grasos aislados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Montaje e imágenes. (A) Vista de los componentes para ensamblar un portaobjetos metálico unido a la membrana. (B) Esquema de los componentes de la diapositiva unida a la membrana y su ensamblaje. (C) Vista lateral de la membrana insertada en el portaobjetos metálico, mantenida en su lugar por el anillo metálico dividido. (D) Vista superior de la diapositiva de imágenes ensamblada sin un cubreobjetos. El medio de disección e imagen que contiene cuerpos grasos y cerebros disecados se ha colocado en la membrana. (E) Vista ampliada de los cuerpos gordos y cerebros en la gota de medio. (F) Vista superior de la corredera de metal después de agregar el cubreobjetos de vidrio. (G) Vista superior de la diapositiva ensamblada con el cubreobjetos de vidrio fijado a la diapositiva con vaselina fundida. Cubrir los bordes del cubreobjetos con vaselina también evita la evaporación del medio. (H) Esquema del portaobjetos de membrana ensamblado con cerebros orientados para la observación en un microscopio invertido. Los círculos azules denotan NBs en los lóbulos centrales del cerebro y VNC. (I) Vista de una diapositiva vacía de varios pozos. (J) Vista ampliada de un pozo de la diapositiva de imágenes de múltiples pocillos. (K) Esquema que muestra la orientación del cerebro para obtener imágenes de los lóbulos centrales del cerebro en un microscopio invertido con un portaobjetos de múltiples pocillos. Los círculos azules denotan NBs en los lóbulos centrales del cerebro y VNC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cuantificación de la duración del ciclo celular . (A) Diagrama de un cerebro larvario del tercer estadio, destacando los lóbulos cerebrales, el lóbulo óptico (OL, gris oscuro), el cordón nervioso ventral (VNC), NBs (azul oscuro), GMCs (azul claro) y neuronas (púrpura) dentro de los lóbulos centrales del cerebro y VNC. (B) Esquema de las divisiones NB y GMC. (C) Serie de imágenes de un NB de tipo salvaje con microtúbulos marcados en blanco (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) y pines apicales (Pins::EGFP en verde) fotografiados en un portaobjetos de múltiples pocillos sin suplementación corporal grasa durante 4 h. Las imágenes combinadas y el árbol de linaje correspondiente con el tiempo del ciclo celular se muestran a continuación. Barra de escala = 10 μm. (D) Cuantificación de la duración del ciclo celular (metafase - metafase) para la primera, segunda y tercera división en muestras fotografiadas en un portaobjetos de múltiples pocillos sin cuerpos grasos. (E) Serie de imágenes de un NB de tipo salvaje con microtúbulos marcados en blanco (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) fotografiados con un portaobjetos unido a la membrana con suplementos corporales grasos durante 10 h con el árbol de linaje correspondiente y el tiempo del ciclo celular que se muestra a continuación. Barra de escala = 10 μm. (F) Cuantificación de la duración del ciclo celular (metafase - metafase) para la primera, segunda, tercera y cuarta división en muestras fotografiadas en un portaobjetos unido a la membrana con cuerpos gordos. (G) Esquema de cómo se determinó el ángulo entre el eje del huso (línea discontinua naranja) y el eje de división (θ, línea discontinua roja). (H) Cuantificación de θ a partir de 10 células fotografiadas utilizando un portaobjetos de múltiples pocillos sin cuerpos gordos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo describe un enfoque para la obtención de imágenes de cerebros de explante vivos de larvas de Drosophila melanogaster . El protocolo descrito aquí permite observar cerebros de explante durante 12-20 h en las condiciones experimentales adecuadas. Se debe prestar especial atención a la preparación de muestras y al diseño de los experimentos deseados. Como se mencionó anteriormente, uno de los factores más críticos que determina la calidad del tejido disecado es la salud de las larvas. Para lograr la mayor calidad posible, uno debe asegurarse de que las larvas estén bien alimentadas antes de la recolección. Las larvas no saludables se originan más comúnmente por el hacinamiento. Para abordar esto, uno debe asegurarse de que se minimice el hacinamiento, ya sea aumentando la frecuencia de la cosecha o dividiendo los platos con huevos recién puestos con un plato vacío.
Otro elemento crítico de este protocolo es el método de disección para aislar el tejido cerebral. El cerebro y los RN dentro de ellos son extremadamente sensibles a factores externos, como la temperatura del medio de disección y la invasividad de la disección en sí. El medio demasiado frío tenderá a despolimerizar los microtúbulos. Del mismo modo, una disección que estira o rompe el cerebro tendrá efectos perjudiciales en la calidad de los RN. Para evitar esto, uno debe evitar tirar del tejido cerebral directamente y en su lugar anclar las herramientas de disección en la cutícula u otro tejido. Las tijeras de microdisección ayudan enormemente en este sentido, ya que tiran mínimamente del tejido cerebral. Si las tijeras no están disponibles, se pueden usar pinzas para eliminar cuidadosamente el tejido de conexión entre el cordón nervioso ventral y la cutícula.
Este protocolo presenta dos métodos para montar cerebros larvales para microscopía confocal. Desde un punto de vista técnico, montar muestras en un portaobjetos de varios pocillos es más sencillo que montar en un portaobjetos unido a la membrana. Sin embargo, cada método es más adecuado para diferentes tipos de experimentos. Los datos que se muestran aquí demuestran que para películas más cortas (es decir, menos de 4 h) o películas con alta resolución temporal (es decir, adquirir una pila z cada 10 s), las imágenes en una diapositiva de múltiples pocillos son suficientes para observar múltiples divisiones en el cerebro central larval. Para ventanas de adquisición más largas, el montaje en una diapositiva unida a la membrana es ideal, ya que las muestras preparadas de esta manera se dividen con mayor frecuencia a lo largo de la película. Normalmente, las larvas de tipo salvaje NB se dividen una vez cada 40-90 min13. Aunque los portaobjetos de múltiples pocillos se pueden usar para películas largas (> 4 h), se ha observado un aumento en la duración del ciclo celular y una disminución en la proliferación de NB en esta condición (Figura 5D). Por lo tanto, el método utilizado para montar muestras y el tipo de datos a medir deben considerarse al diseñar experimentos.
Este protocolo recomienda obtener imágenes de múltiples cerebros en un pozo o diapositiva, ya que esto aumenta la eficiencia de la recopilación de datos para cualquier experimento dado. Sin embargo, la orientación y la colocación de los cerebros dentro del pozo afectarán la cantidad de cambios que ocurren a lo largo de la película debido a la etapa que se mueve entre las posiciones del cerebro. Agrupar los cerebros en un lugar centralizado en un pozo minimiza este problema. Sin embargo, algunos cambios pueden ocurrir en el transcurso de películas más largas en experimentos con diapositivas de múltiples pocillos. En muchos casos, el cambio observado en estas películas más largas es mínimo y puede corregirse durante el análisis. El movimiento cerebral también se puede prevenir mediante el uso de una configuración de diapositiva de metal porque las fuerzas capilares evitan que los cerebros diseccionados se desplacen.
Con una diapositiva de múltiples pocillos, es técnicamente posible realizar experimentos de imágenes de múltiples pocillos. Sin embargo, esto requiere ajustes en el tamaño de la pila y la resolución temporal para tener en cuenta el tiempo adicional que pasa el microscopio moviéndose entre posiciones. Esto puede ser beneficioso para experimentos de detección genética a gran escala, donde se pueden obtener imágenes de múltiples genotipos en diferentes pozos.
Hay casos en los que los cerebros mostrarán poco o ningún NB divisorio en el transcurso de un experimento. Esto probablemente se deba a varios factores que dependen de la naturaleza de la muestra que se está fotografiando, la calidad del alimento utilizado para criar las larvas, la calidad de la disección y los ajustes de adquisición utilizados para generar los datos. Aunque es aconsejable eliminar la mayor cantidad de tejido posible cuando se preparan cerebros larvales para la obtención de imágenes, no es aconsejable podar demasiado el cerebro para minimizar el estrés mecánico, ya que esto puede afectar negativamente la calidad de los datos. Además, la exposición frecuente a potentes láseres de imágenes tendrá un impacto negativo en la salud de los neuroblastos. Por lo tanto, se debe considerar ajustar la potencia del láser, el tiempo de exposición y la frecuencia de imagen al recopilar los datos de imagen.
Para el montaje de muestras, se pueden utilizar métodos alternativos. Por ejemplo, los cerebros de explante se pueden montar en una matriz sólida37. La disponibilidad de diferentes protocolos de montaje brinda la oportunidad de obtener imágenes de explantes de cerebro larvales en una amplia variedad de microscopios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen divulgaciones financieras que declarar.
Acknowledgments
Esta investigación cuenta con el apoyo de R35GM148160 (C. C.) y una subvención de capacitación T32 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) GM007270 (R. C. S)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
References
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division. Development. 147 (13), (2020).
- Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions. Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).
- Loyer, N., Januschke, J. Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts. Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).
- Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages. Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).
- Oon, C. H., Prehoda, K. Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle. eLife. 8, e45815 (2019).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Oon, C. H., Prehoda, K. E. Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle. eLife. 10, e66574 (2021).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle. Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).
- Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway. Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).
- Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts. Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).
- Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N. Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).
- Montembault, E., et al. Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage. Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).
- Roubinet, C., et al. Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells. Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C.
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Lerit, D. A., et al. Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function. Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).
- Gallaud, E., et al. Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry. PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).
- Ramdas Nair, A., et al. The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).
- Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells. Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).
- Sunchu, B., et al. Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo. Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).
- Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation. Developmental Biology. 475, 256-264 (2021).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).
- Lee, C. -Y., et al. Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation. Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).
- Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages. PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules. Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
