Aquí, discutimos un flujo de trabajo para preparar, diseccionar, montar y obtener imágenes de cerebros de explante vivos de larvas del tercer estadio de Drosophila melanogaster para observar la dinámica celular y subcelular en condiciones fisiológicas.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Imágenes de células vivas de cerebros larvales del tercer estadio de Drosophila melanogaster
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células madre neurales de Drosophila (neuroblastos, NB en adelante) experimentan divisiones asimétricas, regenerando el neuroblasto autorrenovador, al tiempo que forman una célula madre ganglionar diferenciadora (GMC), que sufrirá una división adicional para dar lugar a dos neuronas o glía. Los estudios en NB han descubierto los mecanismos moleculares subyacentes a la polaridad celular, la orientación del huso, la autorrenovación de las células madre neurales y la diferenciación. Estas divisiones celulares asimétricas son fácilmente observables a través de imágenes de células vivas, lo que hace que las larvas sean ideales para investigar la dinámica espaciotemporal de la división celular asimétrica en el tejido vivo. Cuando se diseccionan adecuadamente y se obtienen imágenes en un medio suplementado con nutrientes, los NB en los cerebros de explante se dividen robustamente durante 12-20 h. Los métodos descritos anteriormente son técnicamente difíciles y pueden ser desafiantes para aquellos nuevos en el campo. Aquí, se describe un protocolo para la preparación, disección, montaje e imágenes de explantes cerebrales larvales vivos del tercer estadio utilizando suplementos corporales gordos. También se discuten los problemas potenciales y se proporcionan ejemplos de cómo se puede utilizar esta técnica.
Introducción
La división celular asimétrica (ACD) es el proceso por el cual los componentes subcelulares como el ARN, las proteínas y los orgánulos se dividen de manera desigual entre las células hijas 1,2. Este proceso se ve comúnmente en las células madre, que se someten a ACD para dar lugar a células hijas con diferentes destinos de desarrollo. Drosophila Los NB se dividen asimétricamente para producir un NB, que conserva su tallo, y una célula madre ganglionar (GMC). El GMC sufre más divisiones para producir neuronas diferenciadoras o glía3. Los NB que se dividen asimétricamente son abu....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
NOTA: La figura 1 muestra los materiales necesarios para realizar este estudio.
1. Consideraciones y preparativos para el experimento
- Evite que las larvas se hacinen.
NOTA: La calidad de los cerebros larvales explante está directamente relacionada con la salud y la calidad de las larvas antes de la disección. Las larvas que están desnutridas por el hacinamiento generalmente producirán cerebros de menor calidad30.- Asegúrese de que no haya más de 20-30 larvas presentes por plato de tapa de comida para evitar la desnutrición. Ejemplos de estos se pueden ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Disección e imágenes del lóbulo central del cerebro NBs que expresan Pins::EGFP y Cherry::Júpiter
Para mostrar este protocolo, las larvas que expresan Cherry::Jupiter13 y Pins endógenamente etiquetados::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pins::EGFP/TM6B, Tb) se obtuvieron imágenes durante 4 h utilizando el protocolo descrito utilizando diapositivas de imágenes de múltiples pocillos (Figura 5C, D). .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo describe un enfoque para la obtención de imágenes de cerebros de explante vivos de larvas de Drosophila melanogaster . El protocolo descrito aquí permite observar cerebros de explante durante 12-20 h en las condiciones experimentales adecuadas. Se debe prestar especial atención a la preparación de muestras y al diseño de los experimentos deseados. Como se mencionó anteriormente, uno de los factores más críticos que determina la calidad del tejido disecado es la salud de las larvas. Para lograr la .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen divulgaciones financieras que declarar.
Agradecimientos
Esta investigación cuenta con el apoyo de R35GM148160 (C. C.) y una subvención de capacitación T32 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) GM007270 (R. C. S)
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,22 y micro; m membrana de polietersulfona (PES) Filtros | Genesee | 25-231 | accionados por vacío |
| Agar | Genesee | 20-248 | agar granulado |
| Ordenador analítico | CPU Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 con dos procesadores de 3,80 GHz que ejecutan Windows 10 en un sistema operativo de 64 bits |
| Suero de crecimiento bovino | HyClone | SH30541.02 | |
| Portaobjetos de | imagen con cámaraIbidi | 80826 | |
| Microscopio Confocal | Nikon | NA | |
| Portaobjetos metálicos mecanizados a medida | NA | NA | Ver Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) para las especificaciones |
| Platos de disección | Fisher Scientific | 5024343 | placa micro spot de porcelana de 3 pocillos |
| Pinzas de disección | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Microscopio de disección | Leica | NA | |
| Tijeras de disección | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Jaula de recolección de embriones | Genesee | 59-100 | |
| Flypad con acceso a CO2 para anestesiar moscas adultas | Genesee | 59-172 | |
| Membrana permeable al gas | YSI | 98095 | Membrana permeable al gas |
| Cubierta de vidrio Portaobjetos | Microscopía Electrónica Ciencias | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm cubreobjetos de vidrio |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternativas: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Levadura | instantánea Saf-Instant | NA | |
| Melaza | Genesee | 62-117 | |
| Placa de Petri | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Placa de Petri |
| Vaselina | Vaselina | NA | |
| Medio de insectos de Schneider con L-glutamina y bicarbonato de sodio | líquido Millipore Sigma | S0146 | |
| Software de adquisición de SlideBook | 3i | NA | |
| Unidad de filtración accionada por vacío con un 0,22 &; y micro; m Filtro de membrana PES | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
Referencias
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
