Summary
Qui, discutiamo di un flusso di lavoro per preparare, sezionare, montare e visualizzare cervelli di espianti vivi da larve di terzo stadio di Drosophila melanogaster per osservare le dinamiche cellulari e subcellulari in condizioni fisiologiche.
Abstract
Le cellule staminali neurali della Drosophila (neuroblasti, NB in seguito) subiscono divisioni asimmetriche, rigenerando il neuroblasto auto-rinnovante, formando anche una cellula madre gangliare differenziante (GMC), che subirà una divisione aggiuntiva per dare origine a due neuroni o glia. Studi in NB hanno scoperto i meccanismi molecolari alla base della polarità cellulare, dell'orientamento del fuso, dell'auto-rinnovamento delle cellule staminali neurali e della differenziazione. Queste divisioni cellulari asimmetriche sono facilmente osservabili tramite imaging di cellule vive, rendendo le NB larvali ideali per studiare le dinamiche spaziotemporali della divisione cellulare asimmetrica nei tessuti viventi. Se adeguatamente sezionati e ripresi in un mezzo integrato con sostanze nutritive, gli NB nei cervelli espiantati si dividono robustamente per 12-20 ore. I metodi descritti in precedenza sono tecnicamente difficili e possono essere impegnativi per chi è nuovo nel campo. Qui, viene descritto un protocollo per la preparazione, la dissezione, il montaggio e l'imaging di espianti cerebrali larvali vivi di terza stella utilizzando integratori per il corpo grasso. Vengono inoltre discussi i potenziali problemi e vengono forniti esempi su come questa tecnica può essere utilizzata.
Introduction
La divisione cellulare asimmetrica (ACD) è il processo mediante il quale componenti subcellulari come RNA, proteine e organelli sono partizionati in modo diseguale tra le cellule figlie 1,2. Questo processo è comunemente visto nelle cellule staminali, che subiscono ACD per dare origine a cellule figlie con diversi destini di sviluppo. Drosofila Le NB si dividono asimmetricamente per produrre una NB, che mantiene la sua staminalità, e una cellula madre gangliare (GMC). Il GMC subisce ulteriori divisioni per produrre neuroni differenzianti o glia3. Le NB che si dividono asimmetricamente sono abbondanti nei cervelli in via di sviluppo delle larve di terzo stadio, che sono facilmente osservabili al microscopio. Al terzo stadio larvale instar, ci sono circa 100 NB presenti in ogni lobo cerebrale centrale 3,4,5,6.
La divisione cellulare asimmetrica è un processo altamente dinamico. I protocolli di imaging delle cellule vive sono stati utilizzati per misurare e quantificare la dinamica della polarità cellulare 7,8,9,10, l'orientamento del fuso 11,12,13, la dinamica della corteccia dell'attomiosina14,15,16,17,18, la biologia dei microtubuli e dei centrosomi 19,20,21,22,23,24,25,26,27, e membrana 10,28 e dinamica della cromatina 29. Le descrizioni qualitative e quantitative dell'ACD si basano su metodi e protocolli robusti per la divisione delle immagini NB in cervelli viventi intatti. Il seguente protocollo delinea i metodi per preparare, sezionare e visualizzare cervelli larvali di terzo stadio per l'imaging di cellule vive in vivo utilizzando due diversi approcci di montaggio. Questi metodi sono più adatti per i ricercatori interessati alle dinamiche spaziotemporali delle divisioni delle cellule staminali, nonché alle divisioni in altre cellule cerebrali, in quanto consentono osservazioni a breve e lungo termine di eventi cellulari. Inoltre, queste tecniche sono facilmente accessibili ai nuovi arrivati sul campo. Dimostriamo l'efficacia e l'adattabilità di questo approccio con cervelli larvali che esprimono microtubuli marcati in modo fluorescente e proteine di fusione corticale. Discutiamo inoltre i metodi di analisi e le considerazioni per l'applicazione in altri studi.
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Protocol
NOTA: la Figura 1 mostra i materiali necessari per eseguire questo studio.
1. Considerazioni e preparativi per l'esperimento
- Evitare che le larve si sovraffollano.
NOTA: La qualità del cervello larvale espiantato è direttamente correlata alla salute e alla qualità delle larve prima della dissezione. Le larve che sono malnutrite dal sovraffollamento produrranno generalmente cervelli di qualità inferiore30.- Assicurarsi che non siano presenti più di 20-30 larve per piatto di tappo del pasto per evitare la malnutrizione. Esempi di questi possono essere visti nella Figura 2.
- Filtrare e aliquote il mezzo Schneider prima dell'uso.
- Per ogni dissezione, preparare un nuovo mezzo di imaging e dissezione integrando il mezzo di insetto aliquotato di Schneider con siero di crescita bovina all'1% (BGS). Un volume di 5 ml di dissezione e mezzo di imaging è di solito sufficiente per un esperimento di imaging.
- Riscaldare il mezzo integrato a temperatura ambiente (RT) prima dell'uso.
- Considerare la lunghezza del filmato da raccogliere e utilizzarla per tenere conto dell'integrazione del mezzo di imaging, dell'approccio di montaggio e delle impostazioni di acquisizione del microscopio.
NOTA: In condizioni ottimali, gli NB nel cervello integrati con solo BGS si divideranno robustamente per un massimo di 3 ore.- Integrare il mezzo di imaging aggiungendo tessuti corporei di grasso larvale al mezzo di imaging per supportare le divisioni oltre le 4 ore quando si conducono esperimenti che richiedono filmati più lunghi.
NOTA: I corpi grassi secernono mitogeni che supportano la proliferazione NB31 e i corpi grassi interi di 10 larve sono sufficienti per sostenere da quattro a cinque cervelli. Inoltre, i campioni ripresi con un vetrino legato a membrana hanno dimostrato di dividersi per oltre 10 ore13,32, mentre i campioni ripresi con un vetrino multi-pozzetto di solito si dividono meno spesso (osservazioni non pubblicate). - In alternativa, implementare un supporto di imaging più complesso per i filmati più lunghi, come descritto in precedenza33. Riduci al minimo il fotodanneggiamento regolando il tempo di esposizione, la potenza del laser e la frequenza di campionamento per ottenere i migliori risultati.
- Integrare il mezzo di imaging aggiungendo tessuti corporei di grasso larvale al mezzo di imaging per supportare le divisioni oltre le 4 ore quando si conducono esperimenti che richiedono filmati più lunghi.
2. Stadiazione e raccolta delle larve (Figura 2)
- Incrociare mosche vergini femmine di 1-5 giorni con mosche maschi adulte di 1-7 giorni per produrre progenie con il genotipo desiderato. Per una resa ottimale, incrociare 10-15 vergini femmine con 5-10 maschi. Depositare queste mosche in una gabbia per mosche con un tappo per il pasto (Figura 2A-C) e incubare a 25 °C.
- Scambia il tappo del pasto ogni giorno. Ciò impedisce che i tappi dei pasti diventino sovraffollati di larve, il che riduce la qualità del cervello sezionato.
- Se il tappo del pasto è significativamente coperto di larve (cioè >30), dividere questo tappo del pasto a metà e sostituirne metà con un tappo per pasto fresco che è stato anche tagliato a metà. In alternativa, scambiare i tappi pasto su base più frequente (cioè ogni 12 ore invece di ogni 24 ore). Esempi di tappi pasto sovrappopolati possono essere visti nella Figura 2E, F.
- Incubare il cappuccio del pasto con le larve a 25 °C fino a quando le larve raggiungono l'età desiderata.
3. Dissezione del corpo grasso larvale (Figura 3)
NOTA: questo protocollo descrive le dissezioni utilizzando un piatto di dissezione a 3 pozzetti.
- Pipettare ~400 μL di dissezione e mezzo di imaging in ciascun pozzetto di un piatto di dissezione a 3 pozzetti.
- Lavare dieci larve selvatiche ben nutrite di 72-96 ore tenendole delicatamente con una pinza da dissezione e immergendole dentro e fuori dalla soluzione di dissezione nel pozzo più basso fino a quando tutte le particelle di cibo sono state lavate via. Dopo il risciacquo, spostare le larve pulite nel mezzo del pozzo.
- Usando una serie di pinzette, tieni la larva per i ganci della bocca. Con l'altra serie di pinzette, rompere un lato della cuticola della larva.
- Questa rottura causerà la fuoriuscita dei corpi grassi dalla larva. I corpi grassi sono bianchi sporchi e semi-traslucidi e avranno una struttura reticolare (Figura 3I). I corpi grassi tenderanno anche ad attaccarsi a se stessi e alle pinzette di dissezione. Una volta identificato, raccogliere quanto più grasso possibile da ciascuna larva e trasferirlo con la pinza al pozzo più alto con 400 μL di terreno di dissezione RT.
4. Dissezione cerebrale larvale (Figura 3)
- Lavare le larve sperimentali in dissezione e mezzo di imaging come sopra per liberarle dai residui di cibo. Per ottenere i migliori risultati, evitare di conservare le larve non sezionate nella soluzione di dissezione. Ciò causerà l'"annegamento" delle larve e avrà un impatto negativo sulla qualità dei cervelli sezionati.
- Usando una serie di pinzette, tieni la larva per i ganci della bocca. Utilizzando un'altra serie di pinzette, tagliare/strappare delicatamente circa 1/3 della larva dal lato posteriore (Figura 3A). Ciò farà sì che elementi del tratto digestivo, corpi grassi, tessuto connettivo e sistema nervoso "scoppino" dal lato rotto della larva (Figura 3B).
- Usando una serie di pinzette, tieni la larva per i ganci della bocca. Con l'altra serie di pinzette, spazzolare delicatamente la cuticola verso i ganci della bocca mentre "spingere" verso l'interno con le pinzette che tengono i ganci della bocca fino a quando l'intera larva è capovolta. Questo movimento è simile a girare un calzino "al rovescio" (Figura 3C, D).
- Capovolgere la larva in modo che il sistema nervoso centrale e altri tessuti siano rivolti verso l'esterno pur essendo ancora collegati alla cuticola. A questo punto, individuare il sistema nervoso centrale (SNC) per evitare la rimozione accidentale. Usando una pinzetta, rimuovere delicatamente tutto il tessuto non SNC, lasciando solo il SNC e il cervello attaccati alla cuticola (Figura 3E).
- Il cervello sarà attaccato alla cuticola tramite connessioni assonali. Usando le forbici da microdissezione, taglia queste connessioni assonali per liberare il cervello dalla cuticola. Per fare questo, prima tagliare delicatamente sotto i lobi cerebrali (Figura 3F). Ripetere con le connessioni sotto il cordone nervoso ventrale.
NOTA: Questo passaggio può essere eseguito con una pinzetta se non sono disponibili forbici per microdissezione. Prestare particolare attenzione quando si utilizzano le pinzette per assicurarsi che il tessuto cerebrale non sia eccessivamente teso durante la rimozione dalla cuticola perché lo stress meccanico influenzerà negativamente la salute del cervello. - Trasferire il cervello sezionato in un pozzo con dissezione e mezzo di imaging. Per esperimenti di imaging più lunghi di 3 ore, utilizzare la dissezione e il mezzo di imaging integrati con corpi grassi come descritto sopra. Sezionare le larve in lotti per mantenere il tempo di dissezione inferiore a 20 minuti.
5. Montaggio e imaging (Figura 4)
- Per l'imaging con un vetrino legato a membrana34:
- Raccogli sia i cervelli sezionati che i corpi grassi isolati nell'ultimo pozzetto del piatto di dissezione.
- Assemblare metà della diapositiva posizionando una membrana permeabile al gas sul retro della diapositiva e premere l'anello diviso al centro, tenendolo in posizione (Figura 4A-C).
- Utilizzando una micropipetta da 200 μL, trasferire fino a 10 cervelli sezionati e quanto più corpo grasso possibile (vedi sopra) in ~ 130-140 μL di dissezione e mezzo di imaging alla membrana. Assicurarsi di depositare il mezzo con i campioni al centro della membrana permeabile ai gas (Figura 4D, E).
- Orientare il cervello per la popolazione di NB da visualizzare e per il tipo di microscopio utilizzato (Figura 4E). Posizionare il campione il più vicino possibile all'obiettivo del microscopio. Ad esempio, per visualizzare le NB nei lobi cerebrali centrali, orientare il cervello in modo tale che i lobi cerebrali siano più vicini all'obiettivo (Figura 4H).
- Una volta che il cervello è orientato, posizionare delicatamente un vetrino di vetro sopra la soluzione sulla membrana. Ciò farà sì che la soluzione contenente il cervello e i corpi grassi si diffonda su tutta la membrana (Figura 4F).
- Tamponare la soluzione eccessiva tenendo un fazzoletto di laboratorio vicino al bordo del coprifoglio. La quantità ottimale di soluzione si ottiene quando il cervello tocca il coprislip senza essere schiacciato. Se in questa fase è necessario un riorientamento, spostare con attenzione il coprislip per spostare il cervello.
- Immobilizzare il coprivetrino applicando vaselina fusa lungo i bordi del coprivetrino con un pennello. Lasciare che la gelatina si solidifichi (Figura 4G).
- Per l'imaging con una diapositiva multipozzetto (Figura 4):
- Aggiungere 400 μL di mezzo di imaging a un pozzetto di un vetrino multi-pozzetto (nell'esperimento eseguito qui, è stato utilizzato un micro[μ]-slide a 8 pozzetti camerato; Figura 4I). Trasferire i corpi grassi precedentemente sezionati in questo pozzetto (vedere il passaggio 3.4).
- Deposita fino a 10 cervelli in un cluster vicino al centro del pozzo (Figura 4J).
- Orientare il cervello per la popolazione di NB da visualizzare e per il tipo di microscopio utilizzato, come descritto nella fase 5.1.4 (Figura 4K). Disporre i campioni in modo che siano vicini l'uno all'altro. Ciò ridurrà al minimo la distanza che lo stadio deve spostare tra i campioni, riducendo la deriva del campione durante l'acquisizione.
- Una volta che i cervelli sono stati orientati nel pozzo, lasciare che il cervello si stabilizzi per 2-5 minuti. Ciò aumenta la loro stabilità durante il trasporto/imaging. Preparare il microscopio per l'acquisizione durante questo periodo.
- Coprire il vetrino μ con il coperchio del vetrino e trasferirlo al microscopio. Inizia l'acquisizione con la potenza laser e il tempo di esposizione più bassi possibili per ridurre al minimo il fotosbiancamento.
6. Best practice per l'elaborazione e la gestione dei dati
- Elaborare i dati secondo necessità in base al software di analisi disponibile.
- Per l'esempio mostrato qui, salvare i dati acquisiti con il software SlideBook come file immagine SlideBook (.sld).
- Per convertire nel tipo di file proprietario di Imaris (.ims) utilizzando Imaris File Converter, aprire Imaris File Converter in una finestra separata. Fare clic e trascinare i file .sld nella sezione "input" di Imaris File Converter.
- Determina la posizione di output desiderata per i file convertiti e fai clic su "Inizia tutto".
- Dopo la conversione, visualizzare e annotare i dati nel software Imaris.
NOTA: Le alternative per l'analisi delle immagini possono essere utilizzate al posto di Imaris, come Fiji (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html), Aivia (https://www.aivia-software.com/), Volocity (https://www.volocity4d.com/) o altri.
- Conservare il maggior numero possibile di dati originali per una corretta tenuta dei registri. Ad esempio, se il software di acquisizione viene salvato in un formato di file ma viene convertito in un formato diverso per l'analisi, conservare la versione acquisita dei dati.
- Per l'analisi dei dati, mantenere un record del maggior numero possibile di dettagli sul campione e sulle impostazioni di acquisizione. Le informazioni chiave da conservare includono il genotipo delle larve sezionate, l'età delle larve prima della dissezione, lo stato del cappuccio del pasto in cui sono state allevate, la potenza laser utilizzata durante l'imaging, il tempo di esposizione, la durata dell'acquisizione e la risoluzione temporale.
7. Esempio di quantificazione della lunghezza del ciclo cellulare (Figura 5)
NOTA: in questo esempio, sono state visualizzate larve che esprimono i Pin marcatori di polarità (Pins::EGFP16) e la proteina legante i microtubuli Jupiter25 (cherry::Jupiter13). L'analisi successiva è stata eseguita utilizzando il software Imaris.
- Aprire il filmato utilizzando il software di analisi delle immagini preferito. Scorri la lunghezza del filmato per identificare i NB divisivi ed etichettali per riferimento futuro. Identificare gli NB divisori in base ai loro distinti fusi mitotici (Figura 5C-E).
- Identificare una fase del ciclo cellulare di riferimento per determinare la lunghezza del ciclo cellulare. In questo esempio, la metafase viene utilizzata come riferimento.
- Determinare manualmente il numero di fotogrammi tra le metafasi successive e convertirlo in minuti o ore per determinare il tempo impiegato per completare un ciclo di celle.
- A tale scopo, prendere la risoluzione temporale del filmato e moltiplicarla per il numero di fotogrammi tra le metafasi. Ad esempio, se la risoluzione temporale del filmato è di un fotogramma ogni 5 minuti e le metafasi sono osservate nel fotogramma 13 e nel fotogramma 35, il tempo tra queste metafasi sarebbe di 110 minuti ([35 − 13] × 5).
- Tracciare i dati con qualsiasi software appropriato. I dati mostrati qui sono stati tracciati utilizzando il software PRISM.
8. Esempio di quantificazione dell'allineamento del mandrino cellulare (Figura 5)
NOTA: in questo esempio, l'analisi viene eseguita utilizzando il software Imaris.
- Apri il file del filmato in Imaris o in un altro software di scelta. Scorri la lunghezza del filmato per identificare i NB divisivi ed etichettali per riferimento futuro.
- Determinare il vettore formato dai poli del fuso utilizzando i centrosomi apicali e basali (rappresentati da m), come segue:
dove Ax, Ay e Az sono le coordinate del centrosoma apicale, e Bx, By e Bz sono le coordinate del centrosoma basale. Allo stesso modo, l'asse del vettore di divisione (rappresentato da n) è formato dal punto medio della mezzaluna apicale::EGFP e dalla corteccia basale:
dove Ax, Ay e Az sono le coordinate del punto medio della mezzaluna dei Pini::EGFP, e Bx, By e Bz sono le coordinate del punto medio della corteccia basale. - Determinare la grandezza dei vettori m e n:
Magnitudo di m:
Magnitudine di n:
- Determinare il prodotto punto (rappresentato da k) di m e n:
- Utilizzando il prodotto del punto k e le magnitudini vettoriali m e n, determinare l'angolo tra i vettori:
- Tracciare i dati nel software preferito. I dati mostrati qui sono stati preparati in Microsoft Excel e visualizzati in PRISM.
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Representative Results
Dissezione e imaging del lobo cerebrale centrale NB che esprimono Pins::EGFP e Cherry::Giove
Per mostrare questo protocollo, le larve esprimono Cherry::Jupiter13 guidato da UAS e Pins etichettati in modo endogeno::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; I pin::EGFP/TM6B, Tb) sono stati ripresi per 4 ore utilizzando il protocollo descritto utilizzando vetrini di imaging multi-pozzetto (Figura 5C,D). Ulteriori dati sono stati presi da larve che esprimono Cherry guidato da UAS::Jupiter13 e marcati endogenamente Miranda::EGFP (w; worGal4, UAS-cherry::Zeus/CyO; UAS-Miranda::GFP/TM6B), che sono state riprese per 10 ore utilizzando un vetrino legato a membrana (Figura 5E,F). Le larve sono state allevate in gabbia come descritto nella sezione 1 del presente protocollo. Al raggiungimento di 72-96 ore di età, le larve sono state sezionate (Figura 3), montate (Figura 4) e fotografate. Per gli esperimenti eseguiti qui, è stato utilizzato un laser a 561 nm al 10% di potenza laser con 100 ms di tempo di esposizione e un laser a 488 nm è stato utilizzato al 15% di potenza laser con 100 ms di tempo di esposizione. Gli stack Z (41 μm) sono stati acquisiti con una dimensione del passo di 1 μm. Le immagini sono state acquisite ogni 5 minuti presso RT su un sistema confocale a disco rotante Intelligent Imaging Innovations (3i), costituito da un'unità disco rotante Yokogawa CSU-W1 e due fotocamere CMOS Prime 95B Scientific. Per l'imaging è stato utilizzato un obiettivo ad immersione in olio 60x/1.4NA montato su un microscopio Nikon Eclipse Ti. I voxel di imaging dal vivo erano 0,22 μm x 0,22 μm x 0,75 μm (disco rotante 60x/1.4NA).
Coerentemente con i precedenti rapporti16, i Perni formavano una mezzaluna apicale pronunciata nel dividere le NB durante la mitosi e i fusi mitotici erano costantemente allineati a questa mezzaluna apicale (Figura 5C). La lunghezza del ciclo cellulare è stata determinata misurando il tempo tra le successive metafasi dei singoli NB (Figura 5D,F).
Nei campioni che sono stati ripresi su un vetrino di imaging multi-pozzetto per 4 ore senza integrazione di corpo grasso, la lunghezza del ciclo cellulare è aumentata con l'aumentare del tempo di imaging (Figura 5C, D). I campioni che sono stati ripresi in un mezzo integrato con corpo grasso su un vetrino legato alla membrana non hanno mostrato un aumento della lunghezza del ciclo cellulare (Figura 5E, F). Inoltre, sono stati osservati NB con quattro divisioni sul vetrino legato alla membrana di 10 ore (Figura 5D vs. Figura5F).
Infine, l'angolo tra l'asse di divisione e il mandrino mitotico è stato determinato utilizzando come riferimento i Pin con tag GFP (schema mostrato in Figura 5G). L'asse di divisione è stato determinato identificando il punto medio della mezzaluna apicale formata dai Perni nella mitosi e tagliando in due la cellula a metà (Figura 5G, linea tratteggiata rossa). Come descritto in precedenza, i NB wild-type mostravano mandrini mitotici orientati a non più di 30° dall'asse di divisione (Loyer e Januschke36 e Figura 5H).
Figura 1: Materiali. (A) Microscopio da dissezione. (B) Gabbia di raccolta contenente mosche del genotipo desiderato e un tappo per farine con larve in crescita. (C) Dissezione e mezzo di imaging, 5 ml. (D) Tappi per pasti con larve provenienti da tre diverse collezioni. (E,E') Strumenti di microdissezione, da sinistra a destra: forbici da microdissezione, pinze. (F,F') Piatto di dissezione. (G) Un vetrino a 8 pozzetti per μ per l'imaging dei campioni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Esempio di tappi per pasti. (A) Due fiale con mosche maschio e femmina da incrociare, una gabbia vuota per la raccolta degli embrioni e un tappo per pasti freschi. (B) La parte inferiore della gabbia per la raccolta degli embrioni con il nuovo cappuccio per i pasti (a sinistra) e la parte superiore della gabbia con le mosche (a destra). (C) La gabbia per mosche completamente assemblata. (D) Un esempio di tappo da pasto ben messo in scena con larve per la dissezione. Si noti che il cibo è disturbato dalle larve, ma non eccessivamente disturbato. (E,F) Due esempi di tappi pasto sovraffollati di 4 giorni. Si noti che quel cibo ora ha una consistenza simile a una zuppa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Dissezione . (A) Vista dorsale di una terza larva instar. La linea rossa sull'estremità posteriore della larva indica dove dovrebbe essere fatto il primo taglio. (B) Vista dorsale della larva dopo aver rimosso l'estremità posteriore. (C) Diagramma che mostra come invertire la larva. Usando una serie di pinze, tenere la larva per la cuticola vicino a dove è stato effettuato il primo taglio. Usando l'altra pinza, premere nell'estremità anteriore della larva per invertire. Le frecce nere indicano la direzione della pinza, con una che "spinge" le larve dal lato anteriore e l'altra che sposta l'estremità posteriore tagliata verso l'estremità anteriore. La freccia rossa più piccola indica un cartone animato di corpi grassi. (D) Vista di una larva invertita con i corpi grassi e il tubo digerente ancora attaccati. (E) Vista di una larva invertita con il tessuto non SNC rimosso. La linea tratteggiata rossa delinea il cervello ancora attaccato. (F) Schema che mostra come rimuovere il cervello dalla cuticola. La linea tratteggiata rossa indica il percorso da tagliare con le forbici da microdissezione per liberare il cervello dalla cuticola invertita, e le frecce nere indicano la rimozione del cervello dalla cuticola. (G) Una vista del cervello invertito che è ancora attaccato alla cuticola da un piccolo numero di connessioni assonale sotto il cordone nervoso ventrale (VNC). (H) Un cervello larvale isolato. I lobi cerebrali sono delineati con linee arancioni tratteggiate. (I) Corpi grassi isolati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Montaggio e imaging. (A) Vista dei componenti per il montaggio di una slitta metallica legata a membrana. (B) Schema dei componenti della slitta legata a membrana e loro assemblaggio. (C) Vista laterale della membrana inserita nel vetrino metallico, tenuta in posizione dall'anello metallico spaccato. (D) Vista dall'alto del vetrino di immagini assemblato senza vetrino. Il mezzo di dissezione e imaging contenente corpi grassi e cervelli sezionati è stato posizionato sulla membrana. (E) Vista ingrandita dei corpi grassi e del cervello nella goccia del mezzo. (F) Vista dall'alto del vetrino metallico dopo aver aggiunto il vetrino. (G) Vista dall'alto del vetrino assemblato con il vetrino di vetro fissato al vetrino con vaselina fusa. Coprire i bordi del coprislip con vaselina impedisce anche l'evaporazione del mezzo. (H) Schema del vetrino a membrana assemblato con cervelli orientati per l'osservazione su un microscopio invertito. I cerchi blu indicano NB nei lobi centrali del cervello e VNC. (I) Vista di una diapositiva vuota a più pozzetti. (J) Vista ingrandita di un pozzetto della diapositiva di imaging multipozzetto. (K) Schema che mostra l'orientamento del cervello per l'imaging dei lobi centrali del cervello su un microscopio invertito con un vetrino multi-pozzetto. I cerchi blu indicano NB nei lobi centrali del cervello e VNC. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Quantificazione della lunghezza del ciclo cellulare . (A) Diagramma di un terzo cervello larvale instar, evidenziando i lobi cerebrali, il lobo ottico (OL, grigio scuro), il cordone nervoso ventrale (VNC), NB (blu scuro), GMC (azzurro) e neuroni (viola) all'interno dei lobi centrali del cervello e VNC. (B) Schema delle divisioni NB e GMC. (C) Serie di immagini di un NB wild-type con microtubuli marcati in bianco (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) e Pin apicali (Pins::EGFP in verde) ripresi in un vetrino multi-pozzetto senza supplementazione di corpo grasso per 4 ore. Le immagini unite e l'albero di lignaggio corrispondente con temporizzazione del ciclo cellulare sono mostrati di seguito. Barra di scala = 10 μm. (D) Quantificazione della lunghezza del ciclo cellulare (metafase - metafase) per la prima, seconda e terza divisione in campioni ripresi su un vetrino multi-pozzetto senza corpi grassi. (E) Serie di immagini di un NB wild-type con microtubuli marcati in bianco (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) ripresi con un vetrino legato alla membrana con supplementazione di corpo grasso per 10 ore con il corrispondente albero di lignaggio e i tempi del ciclo cellulare mostrati di seguito. Barra di scala = 10 μm. (F) Quantificazione della lunghezza del ciclo cellulare (metafase - metafase) per la prima, seconda, terza e quarta divisione in campioni ripresi su un vetrino legato alla membrana con corpi grassi. (G) Schema di come è stato determinato l'angolo tra l'asse del mandrino (linea tratteggiata arancione) e l'asse di divisione (θ, linea tratteggiata rossa). (H) Quantificazione di θ da 10 cellule ripresi utilizzando un vetrino multi-pozzetto senza corpi grassi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo delinea un approccio per l'imaging di cervelli vivi espiantati da larve di Drosophila melanogaster . Il protocollo qui descritto consente di osservare cervelli espiantati per 12-20 ore nelle giuste condizioni sperimentali. Particolare attenzione deve essere data alla preparazione dei campioni e alla progettazione degli esperimenti desiderati. Come accennato in precedenza, uno dei fattori più critici che determina la qualità del tessuto sezionato è la salute delle larve. Per ottenere la massima qualità possibile, è necessario assicurarsi che le larve siano ben nutrite prima della raccolta. Le larve malsane provengono più comunemente dal sovraffollamento. Per affrontare questo problema, è necessario garantire che il sovraffollamento sia ridotto al minimo, aumentando la frequenza della raccolta o dividendo i piatti con uova appena deposte con un piatto vuoto.
Un altro elemento critico di questo protocollo è il metodo di dissezione per isolare il tessuto cerebrale. Il cervello e le NB al loro interno sono estremamente sensibili a fattori esterni, come la temperatura del mezzo di dissezione e l'invasività della dissezione stessa. Il mezzo troppo freddo tenderà a depolimerizzare i microtubuli. Allo stesso modo, una dissezione che allunga o rompe il cervello avrà effetti dannosi sulla qualità degli NB. Per evitare ciò, si dovrebbe evitare di tirare direttamente il tessuto cerebrale e invece ancorare gli strumenti di dissezione sulla cuticola o altro tessuto. Le forbici da microdissezione aiutano notevolmente in questo senso, poiché tirano minimamente il tessuto cerebrale. Se le forbici non sono disponibili, è possibile utilizzare una pinzetta per rimuovere con cura il tessuto di collegamento tra il cordone nervoso ventrale e la cuticola.
Questo protocollo presenta due metodi per montare cervelli larvali per la microscopia confocale. Da un punto di vista tecnico, il montaggio dei campioni in una slitta multipozzetto è più semplice rispetto al montaggio su una guida legata a membrana. Tuttavia, ogni metodo è più adatto per diversi tipi di esperimenti. I dati mostrati qui dimostrano che per filmati più brevi (cioè meno di 4 ore) o film con alta risoluzione temporale (cioè l'acquisizione di uno z-stack ogni 10 s), l'imaging in una diapositiva multi-pozzetto è sufficiente per osservare più divisioni nel cervello centrale larvale. Per finestre di acquisizione più lunghe, il montaggio su una guida legata a membrana è l'ideale, poiché i campioni preparati in questo modo si dividono più frequentemente nel corso del film. Normalmente, le NB larvali wild-type si dividono una volta ogni 40-90 min13. Sebbene i vetrini multi-pozzetto possano essere utilizzati per filmati lunghi (> 4 ore), in questa condizione è stato osservato un aumento della lunghezza del ciclo cellulare e una diminuzione delle NB proliferanti (Figura 5D). Pertanto, il metodo utilizzato per montare i campioni e il tipo di dati da misurare devono essere considerati quando si progettano esperimenti.
Questo protocollo raccomanda l'imaging di più cervelli in un pozzetto o vetrino, in quanto ciò aumenta l'efficienza della raccolta dei dati per ogni dato esperimento. Tuttavia, l'orientamento e il posizionamento del cervello all'interno del pozzo influenzeranno la quantità di spostamento che si verifica durante il film a causa del passaggio del palcoscenico tra le posizioni del cervello. Raggruppare i cervelli insieme in un punto centralizzato in un pozzo riduce al minimo questo problema. Tuttavia, alcuni spostamenti possono verificarsi nel corso di filmati più lunghi negli esperimenti che utilizzano diapositive multi-pozzetto. In molti casi, lo spostamento osservato in questi filmati più lunghi è minimo e può essere corretto durante l'analisi. Il movimento del cervello è anche prevenibile utilizzando una configurazione a slitta metallica perché le forze capillari impediscono ai cervelli sezionati di spostarsi.
Con un vetrino multi-pozzetto, è tecnicamente possibile eseguire esperimenti di imaging multi-pozzetto. Tuttavia, ciò richiede aggiustamenti nella dimensione dello stack e nella risoluzione temporale per tenere conto del tempo extra trascorso dal microscopio spostandosi tra le posizioni. Ciò può essere utile per esperimenti di screening genetico su larga scala, in cui è possibile visualizzare più genotipi in pozzi diversi.
Ci sono casi in cui i cervelli mostreranno poco o nessun NB divisorio nel corso di un esperimento. Ciò è probabilmente dovuto a diversi fattori che dipendono dalla natura del campione visualizzato, dalla qualità del cibo utilizzato per allevare le larve, dalla qualità della dissezione e dalle impostazioni di acquisizione utilizzate per generare i dati. Sebbene sia consigliabile rimuovere quanto più tessuto possibile quando si preparano cervelli larvali per l'imaging, è sconsigliato potare eccessivamente il cervello per ridurre al minimo lo stress meccanico, poiché ciò potrebbe influire negativamente sulla qualità dei dati. Inoltre, l'esposizione frequente a potenti laser di imaging avrà un impatto negativo sulla salute dei neuroblasti. Pertanto, si dovrebbe prendere in considerazione la regolazione della potenza del laser, del tempo di esposizione e della frequenza di imaging durante la raccolta dei dati di imaging.
Per il montaggio dei campioni possono essere utilizzati metodi alternativi. Ad esempio, i cervelli espiantati possono essere montati in una matrice solida37. La disponibilità di diversi protocolli di montaggio offre l'opportunità di visualizzare gli espianti di cervello larvale su un'ampia varietà di microscopi.
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Disclosures
Gli autori non hanno informazioni finanziarie da dichiarare.
Acknowledgments
Questa ricerca è supportata da R35GM148160 (C. C.) e da un National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R. C. S)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
References
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