Summary
Hier bespreken we een workflow om levende explant-hersenen van Drosophila melanogaster derde instarlarven voor te bereiden, te ontleden, te monteren en in beeld te brengen om de cellulaire en subcellulaire dynamiek onder fysiologische omstandigheden te observeren.
Abstract
Drosophila neurale stamcellen (neuroblasten, NBs hierna) ondergaan asymmetrische delingen, regenereren de zelfvernieuwende neuroblast, terwijl ze ook een differentiërende ganglionmoedercel (GMC) vormen, die één extra deling zal ondergaan om aanleiding te geven tot twee neuronen of glia. Studies in NBs hebben de moleculaire mechanismen blootgelegd die ten grondslag liggen aan celpolariteit, spindeloriëntatie, neurale stamcelzelfvernieuwing en differentiatie. Deze asymmetrische celdelingen zijn gemakkelijk waarneembaar via live-cell imaging, waardoor larvale NB's bij uitstek geschikt zijn voor het onderzoeken van de spatiotemporale dynamiek van asymmetrische celdeling in levend weefsel. Wanneer ze op de juiste manier worden ontleed en afgebeeld in voedingssupplementen, delen NB's in explanthersenen zich robuust gedurende 12-20 uur. Eerder beschreven methoden zijn technisch moeilijk en kunnen een uitdaging zijn voor degenen die nieuw zijn in het veld. Hier wordt een protocol beschreven voor de voorbereiding, dissectie, montage en beeldvorming van levende derde-instar larvale hersenexplantaten met behulp van vetlichaamsupplementen. Ook worden mogelijke problemen besproken en worden voorbeelden gegeven van hoe deze techniek kan worden gebruikt.
Introduction
Asymmetrische celdeling (ACD) is het proces waarbij subcellulaire componenten zoals RNA, eiwitten en organellen ongelijk verdeeld worden tussen dochtercellen 1,2. Dit proces wordt vaak gezien in stamcellen, die ACD ondergaan om aanleiding te geven tot dochtercellen met verschillende ontwikkelingsloten. Drosophila NBs delen zich asymmetrisch om één NB te produceren, die zijn stam behoudt, en één ganglionmoedercel (GMC). De GMC ondergaat verdere divisies om differentiërende neuronen of glia3 te produceren. Asymmetrisch delende NB's zijn overvloedig aanwezig in de zich ontwikkelende hersenen van larven van derde instar, die gemakkelijk kunnen worden waargenomen via microscopie. In het derde instar larvale stadium zijn er ongeveer 100 NB's aanwezig in elke centrale hersenkwab 3,4,5,6.
Asymmetrische celdeling is een zeer dynamisch proces. Live-cell imaging protocollen zijn gebruikt om de dynamiek van celpolariteit 7,8,9,10, spindeloriëntatie 11,12,13, de dynamica van de actomyosine cortex 14,15,16,17,18, microtubule en centrosoombiologie 19,20 te meten en te kwantificeren,21,22,23,24,25,26,27, en membraan 10,28 en chromatinedynamica 29. Kwalitatieve en kwantitatieve beschrijvingen van ACD zijn gebaseerd op robuuste methoden en protocollen om delende NB's in intacte levende hersenen in beeld te brengen. Het volgende protocol schetst methoden om derde instar larvale hersenen voor te bereiden, te ontleden en in beeld te brengen voor live-cell imaging in vivo met behulp van twee verschillende montagebenaderingen. Deze methoden zijn het meest geschikt voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de spatiotemporele dynamiek van stamceldelingen, evenals delingen in andere hersencellen, omdat ze korte- en langetermijnobservaties van cellulaire gebeurtenissen mogelijk maken. Bovendien zijn deze technieken gemakkelijk toegankelijk voor nieuwkomers in het veld. We tonen de effectiviteit en het aanpassingsvermogen van deze aanpak aan met larvale hersenen die fluorescerend gelabelde microtubuli en corticale fusie-eiwitten tot expressie brengen. Daarnaast bespreken we analysemethoden en overwegingen voor toepassing in andere studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Figuur 1 toont de materialen die nodig zijn om dit onderzoek uit te voeren.
1. Overwegingen en voorbereidingen voor het experiment
- Voorkom dat de larven overvol raken.
OPMERKING: De kwaliteit van de hersenen van explantlarven is direct gerelateerd aan de gezondheid en kwaliteit van de larven voorafgaand aan de dissectie. Larven die ondervoed zijn door overbevolking zullen over het algemeen hersenen van lagere kwaliteit opleveren30.- Zorg ervoor dat er niet meer dan 20-30 larven aanwezig zijn per maaltijddopgerecht om ondervoeding te voorkomen. Voorbeelden hiervan zijn te zien in figuur 2.
- Filter en aliquoteer schneider's medium voor gebruik.
- Bereid voor elke dissectie een nieuw beeldvormings- en dissectiemedium voor door het insectenmedium van Schneider aan te vullen met 1% rundergroeiserum (BGS). Een volume van 5 ml dissectie en beeldvormend medium is meestal voldoende voor een beeldvormend experiment.
- Verwarm het aangevulde medium voor gebruik tot kamertemperatuur (RT).
- Overweeg de lengte van de film die moet worden verzameld en gebruik die om rekening te houden met de suppletie van het beeldmedium, de montagebenadering en de acquisitie-instellingen van de microscoop.
OPMERKING: Onder optimale omstandigheden zullen NB's in hersenen aangevuld met alleen BGS zich gedurende meer dan 3 uur robuust delen.- Vul het beeldvormende medium aan door larvale vetweefsels aan het beeldvormingsmedium toe te voegen om delingen na 4 uur te ondersteunen bij het uitvoeren van experimenten die langere films vereisen.
OPMERKING: Vetlichamen scheiden mitogenen af die NB-proliferatie31 ondersteunen, en hele vetlichamen van 10 larven zijn voldoende om vier tot vijf hersenen te ondersteunen. Verder is aangetoond dat monsters die zijn afgebeeld met een membraangebonden dia zich gedurende meer dan 10 uur13,32 delen, terwijl monsters die zijn afgebeeld met een multi-well dia meestal minder vaak delen (ongepubliceerde waarnemingen). - U kunt ook een complexer beeldmedium implementeren voor langere films, zoals eerder beschreven33. Minimaliseer fotoschade door de belichtingstijd, het laservermogen en de bemonsteringsfrequentie aan te passen voor de beste resultaten.
- Vul het beeldvormende medium aan door larvale vetweefsels aan het beeldvormingsmedium toe te voegen om delingen na 4 uur te ondersteunen bij het uitvoeren van experimenten die langere films vereisen.
2. Enscenering en verzameling van larven (figuur 2)
- Kruis 1-5 dagen oude vrouwelijke maagdelijke vliegen met 1-7 dagen oude volwassen mannelijke vliegen om nakomelingen te produceren met het gewenste genotype. Voor een optimale opbrengst, kruis 10-15 vrouwelijke maagden met 5-10 mannetjes. Deponeer deze vliegen in een vliegenkooi met een maaltijddop (figuur 2A-C) en incuberen bij 25 °C.
- Verwissel de maaltijddop dagelijks. Dit voorkomt dat de maaltijddoppen overvol raken met larven, wat de kwaliteit van de ontleedde hersenen vermindert.
- Als de maaltijddop aanzienlijk bedekt is met larven (d.w.z. >30), splitst u deze maaltijddop in tweeën en vervangt u de ene helft door een verse maaltijddop die ook in tweeën is gesneden. U kunt ook de maaltijddoppen vaker verwisselen (d.w.z. elke 12 uur in plaats van elke 24 uur). Voorbeelden van overbevolkte maaltijddoppen zijn te zien in figuur 2E, F.
- Incubeer de maaltijddop met larven bij 25 °C totdat de larven de gewenste leeftijd bereiken.
3. Larvale vetlichaamsdissectie (figuur 3)
OPMERKING: Dit protocol beschrijft dissecties met behulp van een 3-well dissectieschotel.
- Pipetteer ~400 μL dissectie en beeldvormend medium in elke put van een 3-well dissectieschaal.
- Was tien 72-96-h oude goed gevoede wilde larven door ze voorzichtig vast te houden met een dissectietang en ze in en uit de dissectieoplossing in de onderste put te dopen totdat alle voedseldeeltjes zijn afgewassen. Verplaats na het spoelen de schone larven naar het midden.
- Houd met een pincet de larve bij de mondhaken. Scheur met het andere pincet één kant van de cuticula van de larve.
- Deze breuk zal ervoor zorgen dat de vetlichamen uit de larve morsen. De vetlichamen zijn gebroken wit en semi-doorschijnend en hebben een roosterachtige structuur (figuur 3I). De dikke lichamen zullen ook de neiging hebben om aan zichzelf en het dissectiepincet te blijven plakken. Eenmaal geïdentificeerd, verzamel zoveel mogelijk vetlichaam van elke larve en breng het met de tang over naar de bovenste put met 400 μL RT-dissectiemedium.
4. Larvale hersendissectie (figuur 3)
- Was de experimentele larven in dissectie en beeldvormend medium zoals hierboven om ze te bevrijden van voedselresten. Voor het beste resultaat, vermijd het opslaan van niet-ontlede larven in de dissectie-oplossing. Dit zal ervoor zorgen dat de larven "verdrinken" en zal de kwaliteit van de ontleedde hersenen negatief beïnvloeden.
- Houd met een pincet de larve bij de mondhaken. Snijd met een ander pincet ongeveer 1/3 van de larve voorzichtig af/scheur ongeveer 1/3 van de achterste zijde af (figuur 3A). Dit zal ervoor zorgen dat elementen van het spijsverteringskanaal, vetlichamen, bindweefsel en zenuwstelsel uit de gescheurde kant van de larve "barsten" (figuur 3B).
- Houd met een pincet de larve bij de mondhaken. Borstel met het andere pincet voorzichtig de nagelriem naar de mondhaken terwijl je naar binnen "duwt" met het pincet dat de mondhaken vasthoudt totdat de hele larve binnenstebuiten is gekeerd. Deze beweging is vergelijkbaar met het "binnenstebuiten" keren van een sok (figuur 3C, D).
- Keer de larve om, zodat het centrale zenuwstelsel en andere weefsels naar buiten gericht zijn terwijl ze nog steeds verbonden zijn met de cuticula. Zoek bij deze stap het centrale zenuwstelsel (CZS) om onbedoelde verwijdering te voorkomen. Verwijder met een pincet voorzichtig al het niet-CZS-weefsel, waardoor alleen het CZS en de hersenen aan de cuticula blijven zitten (figuur 3E).
- De hersenen worden via axonale verbindingen aan de nagelriem bevestigd. Knip met behulp van een microdissectieschaar deze axonale verbindingen om de hersenen uit de cuticula te bevrijden. Om dit te doen, snijdt u eerst voorzichtig onder de hersenkwabben (figuur 3F). Herhaal dit met de verbindingen onder het ventrale zenuwkoord.
OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd met een pincet als er geen microdissectieschaar beschikbaar is. Wees extra voorzichtig bij het gebruik van een pincet om ervoor te zorgen dat het hersenweefsel niet overbelast raakt tijdens het verwijderen van de nagelriem, omdat mechanische stress de gezondheid van de hersenen negatief zal beïnvloeden. - Breng de ontleedde hersenen over in een put met dissectie en beeldvormend medium. Gebruik voor beeldvormingsexperimenten langer dan 3 uur dissectie en beeldvormend medium aangevuld met vetlichamen zoals hierboven beschreven. Ontleed de larven in batches om de dissectietijd onder de 20 min te houden.
5. Montage en beeldvorming (figuur 4)
- Voor beeldvorming met een membraangebonden dia34:
- Verzamel zowel ontlede hersenen als geïsoleerde vetlichamen in de laatste put van de dissectieschaal.
- Monteer de helft van de dia door een gasdoorlatend membraan over de achterkant van de dia te plaatsen en druk de gespleten ring in het midden en houd deze op zijn plaats (figuur 4A-C).
- Breng met behulp van een micropipet van 200 μL tot 10 ontlede hersenen en zoveel mogelijk vetlichaam (zie hierboven) in ~ 130-140 μL dissectie en beeldvormend medium over naar het membraan. Zorg ervoor dat u het medium met de monsters in het midden van het gasdoorlatende membraan deponeert (figuur 4D, E).
- Oriënteer de hersenen voor de populatie van NBs die in beeld moeten worden gebracht en voor het type microscoop dat wordt gebruikt (figuur 4E). Plaats het monster zo dicht mogelijk bij het objectief van de microscoop. Om bijvoorbeeld NB's in de centrale hersenkwabben in beeld te brengen, oriënteer je de hersenen zodanig dat de hersenkwabben het dichtst bij het doel liggen (figuur 4H).
- Zodra de hersenen zijn georiënteerd, plaatst u voorzichtig een glazen afdekplaat bovenop de oplossing op het membraan. Dit zorgt ervoor dat de oplossing met de hersenen en vetlichamen zich over het hele membraan verspreidt (figuur 4F).
- Dep overtollige oplossing door een laboratoriumdoekje dicht bij de rand van de dekslip te houden. De optimale hoeveelheid oplossing wordt bereikt wanneer de hersenen de coverslip raken zonder te worden platgedrukt. Als bij deze stap heroriëntatie nodig is, beweeg dan voorzichtig de coverslip om de hersenen te bewegen.
- Immobiliseer de coverslip door gesmolten vaseline langs de randen van de coverslip aan te brengen met een kwast. Laat de gelei stollen (figuur 4G).
- Voor beeldvorming met een multi-well imaging slide (figuur 4):
- Voeg 400 μL beeldvormend medium toe aan een put van een multi-well slide (in het experiment dat hier werd uitgevoerd, werd een 8-well micro[μ]-slide gebruikt; Figuur 4I). Breng de eerder ontleedde vetlichamen over naar deze put (zie stap 3.4).
- Zet tot 10 hersenen af in een cluster nabij het midden van de put (figuur 4J).
- Oriënteer de hersenen voor de populatie van NBs die in beeld moeten worden gebracht en voor het type microscoop dat wordt gebruikt, zoals beschreven in stap 5.1.4 (figuur 4K). Schik de monsters zo dat ze dicht bij elkaar staan. Dit minimaliseert de afstand die de fase tussen monsters moet verplaatsen, wat de monsterdrift tijdens de acquisitie vermindert.
- Zodra de hersenen in de put zijn georiënteerd, laat je de hersenen 2-5 minuten bezinken. Dit verhoogt hun stabiliteit tijdens transport/beeldvorming. Bereid de microscoop voor op acquisitie gedurende deze tijd.
- Bedek de μ-dia met de diakap en breng deze over naar de microscoop. Begin met de aanschaf met het laagst mogelijke laservermogen en de belichtingstijd om fotobleking te minimaliseren.
6. Beste praktijken op het gebied van gegevensverwerking en -beheer
- Verwerk de gegevens indien nodig volgens de beschikbare analysesoftware.
- Voor het hier getoonde voorbeeld slaat u de verkregen gegevens op met SlideBook-software als een SlideBook-afbeeldingsbestand (.sld).
- Om te converteren naar het eigen bestandstype van Imaris (.ims) met behulp van de Imaris File Converter, opent u de Imaris File Converter in een apart venster. Klik op en sleep de .sld-bestanden naar het gedeelte "invoer" van de Imaris File Converter.
- Bepaal de gewenste uitvoerlocatie voor de geconverteerde bestanden en klik op "Alles starten".
- Bekijk en annoteer na de conversie de gegevens in de Imaris-software.
OPMERKING: Alternatieven voor beeldanalyse kunnen worden gebruikt in plaats van Imaris, zoals Fiji (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html), Aivia (https://www.aivia-software.com/), Volocity (https://www.volocity4d.com/) of anderen.
- Bewaar zoveel mogelijk van de originele gegevens voor een goede registratie. Als de acquisitiesoftware bijvoorbeeld in één bestandsindeling is opgeslagen, maar voor analyse naar een andere indeling is geconverteerd, behoudt u de verkregen versie van de gegevens.
- Houd voor gegevensanalyse zoveel mogelijk details bij over de steekproef- en acquisitie-instellingen. Belangrijke informatie om te behouden omvat het genotype van de ontlede larven, de leeftijd van de larven voorafgaand aan dissectie, de staat van de maaltijddop waarin ze werden grootgebracht, het laservermogen dat tijdens de beeldvorming werd gebruikt, de blootstellingstijd, de duur van de verwerving en de temporele resolutie.
7. Voorbeeld kwantificering van de lengte van de celcyclus (figuur 5)
OPMERKING: in dit voorbeeld werden larven afgebeeld die de polariteitsmarker Pins (Pins::EGFP16) en het microtubule-bindende eiwit Jupiter25 (cherry::Jupiter13) uitdrukken. De daaropvolgende analyse werd uitgevoerd met behulp van Imaris-software.
- Open de film met de beeldanalysesoftware van uw keuze. Blader door de lengte van de film om delende NB's te identificeren en label ze voor toekomstig gebruik. Identificeer de delende NB's aan de hand van hun verschillende mitotische spindels (figuur 5C-E).
- Identificeer een referentiecelcyclusfase om de lengte van de celcyclus te bepalen. In dit voorbeeld wordt metafase als referentie gebruikt.
- Bepaal handmatig het aantal frames tussen opeenvolgende metafasen en converteer dit naar minuten of uren om de tijd te bepalen die nodig is om één celcyclus te voltooien.
- Doe dit door de temporele resolutie van de film te nemen en deze te vermenigvuldigen met het aantal frames tussen metafasen. Als de temporele resolutie van de film bijvoorbeeld één frame per 5 minuten is en metafasen worden waargenomen in frame 13 en frame 35, is de tijd tussen deze metafasen 110 min ([35 − 13] × 5).
- Plot de gegevens met de juiste software. De hier getoonde gegevens zijn geplot met behulp van PRISM-software.
8. Voorbeeld kwantificering van de uitlijning van de celspil (figuur 5)
OPMERKING: In dit voorbeeld wordt de analyse uitgevoerd met behulp van Imaris-software.
- Open het filmbestand in Imaris of een andere software naar keuze. Blader door de lengte van de film om delende NB's te identificeren en label ze voor toekomstig gebruik.
- Bepaal de vector gevormd door de spindelpolen met behulp van de apicale en basale centrosomen (weergegeven door m), als volgt:
waarbij Ax, Ay en Az de coördinaten van het apicale centrosoom zijn en Bx, By en Bz de coördinaten van het basale centrosoom. Op dezelfde manier wordt de as van de delingsvector (weergegeven door n) gevormd door het middelpunt van de apicale pinnen::EGFP-halve maan en de basale cortex:
waarbij Ax, Ay en Az de coördinaten zijn van het middelpunt van de Pins::EGFP halve maan, en Bx, By en Bz de coördinaten van het middelpunt van de basale cortex. - Bepaal de grootte van de vectoren m en n:
Grootte van m:
Grootte van n:
- Bepaal het puntproduct (weergegeven door k) van m en n:
- Bepaal met behulp van het puntproduct k en de vectorgrootten m en n de hoek tussen de vectoren:
- Plot de gegevens in de software van uw keuze. De hier getoonde gegevens zijn voorbereid in Microsoft Excel en gevisualiseerd in PRISM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dissectie en beeldvorming van centrale hersenkwab NBs die pins uitdrukken::EGFP en Cherry::Jupiter
Om dit protocol te demonstreren, larven die UAS-gedreven Cherry::Jupiter13 tot expressie brengen en endogeen getagde Pins::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pinnen::EGFP/TM6B, Tb) werden gedurende 4 uur in beeld gebracht met behulp van het beschreven protocol met behulp van multi-well imaging slides (Figuur 5C,D). Aanvullende gegevens werden genomen van larven die UAS-aangedreven Cherry::Jupiter13 tot expressie brachten en endogeen gelabeld Miranda::EGFP (w; worGal4, UAS-cherry::Zeus/CyO; UAS-Miranda::GFP/TM6B), die gedurende 10 uur werden afgebeeld met behulp van een membraangebonden dia (figuur 5E,F). Larven werden grootgebracht in kooien zoals beschreven in sectie 1 van dit protocol. Bij het bereiken van 72-96 uur oud werden de larven ontleed (figuur 3), gemonteerd (figuur 4) en afgebeeld. Voor de experimenten die hier werden uitgevoerd, werd een 561 nm-laser gebruikt met 10% laservermogen met 100 ms belichtingstijd en een 488 nm-laser werd gebruikt bij 15% laservermogen met 100 ms belichtingstijd. Z-stacks (41 μm) werden verkregen met een stapgrootte van 1 μm. Beelden werden elke 5 minuten bij RT verkregen op een Intelligent Imaging Innovations (3i) spinning disc confocaal systeem, bestaande uit een Yokogawa CSU-W1 spinning disc unit en twee Prime 95B Scientific CMOS camera's. Een 60x/1.4NA olie dompelobjectief gemonteerd op een Nikon Eclipse Ti microscoop werd gebruikt voor beeldvorming. De live imaging voxels waren 0,22 μm x 0,22 μm x 0,75 μm (60x/1,4NA draaiende schijf).
In overeenstemming met eerdere rapporten16 vormden de pinnen een uitgesproken apicale halve maan bij het verdelen van NB's tijdens mitose, en de mitotische spindels consequent uitgelijnd met deze apicale halve maan (figuur 5C). De lengte van de celcyclus werd bepaald door de tijd tussen opeenvolgende metafasen van de afzonderlijke NBs te meten (figuur 5D,F).
In monsters die gedurende 4 uur op een multi-well imaging slide werden afgebeeld zonder vetlichaamssuppletie, nam de lengte van de celcyclus toe met toenemende beeldvormingstijd (figuur 5C, D). Monsters die werden afgebeeld in vet lichaam aangevuld medium op een membraangebonden dia vertoonden geen toename van de lengte van de celcyclus (figuur 5E, F). Verder werden NB's met vier delingen waargenomen op de 10 h membraangebonden dia (figuur 5D vs. figuur5F).
Ten slotte werd de hoek tussen de delingsas en de mitotische spil bepaald met behulp van GFP-gelabelde pinnen als referentie (schema weergegeven in figuur 5G). De delingsas werd bepaald door het middelpunt van de apicale halve maan gevormd door de pinnen in mitose te identificeren en de cel in tweeën te snijden (figuur 5G, rode stippellijn). Zoals eerder beschreven, vertoonden de wild-type NB's mitotische spindels die niet meer dan 30° van de delingsas waren georiënteerd (Loyer en Januschke36 en Figuur 5H).
Figuur 1: Materialen. (A) Dissectiemicroscoop. B) Verzamelkooi met vliegen van het gewenste genotype en een meeldop met groeiende larven. (C) Dissectie en beeldvormend medium, 5 ml. (D) Meeldoppen met larven uit drie verschillende collecties. (E,E') Microdissectiegereedschappen, van links naar rechts: microdissectieschaar, tang. (F,F') Dissectieschotel. (G) Een 8-welled μ-slide voor het afbeelden van de monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeld maaltijddoppen. (A) Twee injectieflacons met mannelijke en vrouwelijke vliegen die moeten worden gekruist, een lege embryoverzamelkooi en een verse maaltijddop. (B) De bodem van de embryokooi met de nieuwe maaltijddop (links) en de bovenkant van de kooi met vliegen (rechts). (C) De volledig geassembleerde vliegenkooi. (D) Een voorbeeld van een goed geënsceneerde maaltijddop met larven voor dissectie. Merk op dat het voedsel wordt verstoord door de larven, maar niet overdreven gestoord. (E,F) Twee voorbeelden van 4 dagen oude, overvolle maaltijddoppen. Merk op dat dat voedsel nu een soepachtige consistentie heeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Dissectie . (A) Dorsale weergave van een derde instarlarve. De rode lijn aan het achterste uiteinde van de larve geeft aan waar de eerste snede moet worden gemaakt. (B) Dorsale weergave van de larve na verwijdering van het achterste uiteinde. (C) Diagram dat laat zien hoe de larve kan worden omgekeerd. Houd met een tang de larve bij de cuticula bij de plaats waar de eerste snee is gemaakt. Druk met de andere tang in het voorste uiteinde van de larve om te keren. De zwarte pijlen geven de richting van de tang aan, waarbij de ene vanaf de voorste kant in de larven "duwt" en de andere het afgesneden achterste uiteinde naar het voorste uiteinde beweegt. De kleinere rode pijl duidt op een cartoon van dikke lichamen. (D) Zicht op een omgekeerde larve met de vetlichamen en het spijsverteringskanaal nog bevestigd. (E) Zicht op een omgekeerde larve met het niet-CZS-weefsel verwijderd. De rode stippellijn schetst het nog steeds hechte brein. (F) Schema dat laat zien hoe de hersenen uit de cuticula kunnen worden verwijderd. De rode stippellijn geeft het pad aan om met een microdissectieschaar te knippen om de hersenen uit de omgekeerde cuticula te bevrijden, en de zwarte pijlen geven de verwijdering van de hersenen uit de cuticula aan. (G) Een weergave van de omgekeerde hersenen die nog steeds aan de cuticula is bevestigd door een klein aantal axonale verbindingen onder het ventrale zenuwkoord (VNC). (H) Een geïsoleerd larvaal brein. De hersenkwabben zijn omlijnd met onderbroken oranje lijnen. (I) Geïsoleerde vetlichamen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Montage en beeldvorming. (A) Weergave van de componenten voor het assembleren van een membraangebonden metalen dia. (B) Schema van de onderdelen van de membraangebonden plaat en hun samenstelling. (C) Zijaanzicht van het membraan dat in de metalen schuif is gestoken en op zijn plaats wordt gehouden door de gespleten metalen ring. (D) Bovenaanzicht van de geassembleerde beelddia zonder afdekplaat. Het dissectie- en beeldvormingsmedium met vetlichamen en ontleedde hersenen is op het membraan geplaatst. (E) Ingezoomde weergave van de dikke lichamen en hersenen in de druppel medium. (F) Bovenaanzicht van de metalen dia na het toevoegen van de glazen afdekplaat. (G) Bovenaanzicht van de geassembleerde dia met de glazen dekplaat bevestigd aan de dia met gesmolten vaseline. Het bedekken van de randen van de coverslip met vaseline voorkomt ook verdamping van het medium. (H) Schema van de geassembleerde membraanplaat met hersenen georiënteerd voor observatie op een omgekeerde microscoop. De blauwe cirkels duiden op NBs in de centrale hersenkwabben en VNC. (I) Weergave van een lege multi-well dia. (J) Ingezoomde weergave van één put van de multi-well imaging slide. (K) Schema met de hersenoriëntatie voor het in beeld brengen van de centrale hersenkwabben op een omgekeerde microscoop met een multi-well dia. De blauwe cirkels duiden op NBs in de centrale hersenkwabben en VNC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Kwantificering van de lengte van de celcyclus. (A) Diagram van een derde instar larvaal brein, met de nadruk op de hersenkwabben, de optische kwab (OL, donkergrijs), het ventrale zenuwkoord (VNC), NBs (donkerblauw), GMC's (lichtblauw) en neuronen (paars) in de centrale hersenkwabben en VNC. (B) Schema van de NB- en GMC-divisies. (C) Beeldreeks van een wild-type NB met microtubuli gelabeld in wit (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) en apicale pins (Pins::EGFP in groen) afgebeeld in een multi-well slide zonder vetlichaamssuppletie gedurende 4 uur. Samengevoegde afbeeldingen en de bijbehorende stamboom met celcyclustiming worden hieronder weergegeven. Schaalbalk = 10 μm. (D) Kwantificering van de lengte van de celcyclus (metafase - metafase) voor de eerste, tweede en derde deling in monsters die zijn afgebeeld op een multi-well dia zonder vetlichamen. (E) Beeldreeks van een wild-type NB met microtubuli gelabeld in wit (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) afgebeeld met een membraangebonden dia met vetlichaamssuppletie gedurende 10 uur met de overeenkomstige afstammingsboom en celcyclustiming hieronder weergegeven. Schaalbalk = 10 μm. (F) Kwantificering van de lengte van de celcyclus (metafase - metafase) voor de eerste, tweede, derde en vierde deling in monsters afgebeeld op een membraangebonden dia met vetlichamen. (G) Schema van hoe de hoek tussen de spindelas (oranje stippellijn) en de delingsas (θ, rode stippellijn) werd bepaald. (H) Kwantificering van θ van 10 cellen afgebeeld met behulp van een multi-well dia zonder vetlichamen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol schetst een benadering voor de beeldvorming van levende explantatiehersenen van Drosophila melanogaster-larven . Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om explantatiehersenen gedurende 12-20 uur onder de juiste experimentele omstandigheden te observeren. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de voorbereiding van monsters en het ontwerp van de gewenste experimenten. Zoals hierboven vermeld, is een van de meest kritische factoren die de kwaliteit van het ontleedde weefsel bepaalt, de gezondheid van de larven. Om de hoogst mogelijke kwaliteit te bereiken, moet men ervoor zorgen dat larven goed worden gevoed voordat ze worden verzameld. Ongezonde larven komen meestal voort uit overbevolking. Om dit aan te pakken, moet men ervoor zorgen dat overbevolking wordt geminimaliseerd, hetzij door de frequentie van de oogst te verhogen of door gerechten met vers gelegde eieren te splitsen met een lege schaal.
Een ander cruciaal element van dit protocol is de methode van dissectie om het hersenweefsel te isoleren. De hersenen en de NB's daarin zijn extreem gevoelig voor externe factoren, zoals de temperatuur van het dissectiemedium en de invasiviteit van de dissectie zelf. Medium dat te koud is, heeft de neiging om de microtubuli te depolymeriseren. Evenzo zal een dissectie die de hersenen uitrekt of scheurt nadelige effecten hebben op de kwaliteit van de NB's. Om dit te voorkomen, moet men voorkomen dat men direct aan het hersenweefsel trekt en in plaats daarvan de dissectie-instrumenten op de cuticula of ander weefsel verankeren. Microdissectiescharen helpen in dit opzicht enorm, omdat ze minimaal aan het hersenweefsel trekken. Als er geen schaar beschikbaar is, kan een pincet worden gebruikt om het verbindingsweefsel tussen het ventrale zenuwkoord en de nagelriem voorzichtig te verwijderen.
Dit protocol presenteert twee methoden om larvale hersenen te monteren voor confocale microscopie. Vanuit technisch oogpunt is het monteren van monsters in een multi-well dia eenvoudiger dan montage op een membraangebonden dia. Elke methode is echter het meest geschikt voor verschillende soorten experimenten. De hier getoonde gegevens tonen aan dat voor kortere films (d.w.z. minder dan 4 uur) of films met een hoge temporele resolutie (d.w.z. het verkrijgen van een z-stack om de 10 s), beeldvorming in een multi-well dia voldoende is om meerdere delingen in de larvale centrale hersenen waar te nemen. Voor langere acquisitievensters is montage op een membraangebonden dia ideaal, omdat monsters die op deze manier zijn voorbereid, vaker door de film worden verdeeld. Normaal gesproken delen wild-type larvale NB's eens in de 40-90 min13. Hoewel multi-well dia's kunnen worden gebruikt voor lange (> 4 uur) films, is een toename van de lengte van de celcyclus en een afname van prolifererende NBs waargenomen in deze toestand (figuur 5D). Daarom moet bij het ontwerpen van experimenten rekening worden gehouden met de methode die wordt gebruikt om monsters te monteren en het type gegevens dat moet worden gemeten.
Dit protocol beveelt aan om meerdere hersenen in één put of dia in beeld te brengen, omdat dit de efficiëntie van gegevensverzameling voor een bepaald experiment verhoogt. De oriëntatie en plaatsing van de hersenen in de put zal echter van invloed zijn op hoeveel verschuivingen er gedurende de film plaatsvinden als gevolg van het stadium dat tussen hersenposities beweegt. Het clusteren van de hersenen op één gecentraliseerde plek in een put minimaliseert dit probleem. Er kan echter enige verschuiving optreden in de loop van langere films in experimenten met multi-well dia's. In veel gevallen is de verschuiving die in deze langere films wordt waargenomen minimaal en kan deze tijdens de analyse worden gecorrigeerd. Hersenbewegingen zijn ook te voorkomen door een metalen dia-opstelling te gebruiken, omdat de capillaire krachten voorkomen dat de ontleedde hersenen verschuiven.
Met een multi-well slide is het technisch mogelijk om multi-well imaging experimenten uit te voeren. Dit vereist echter aanpassingen in de stapelgrootte en temporele resolutie om rekening te houden met de extra tijd die de microscoop besteedt aan het bewegen tussen posities. Dit kan gunstig zijn voor grootschalige genetische screeningsexperimenten, waarbij men meerdere genotypen in verschillende putten in beeld kan brengen.
Er zijn gevallen waarin hersenen in de loop van een experiment weinig of geen delende NB's vertonen. Dit is waarschijnlijk te wijten aan verschillende factoren die afhankelijk zijn van de aard van het monster dat wordt afgebeeld, de kwaliteit van het voedsel dat wordt gebruikt om de larven groot te brengen, de kwaliteit van de dissectie en de acquisitie-instellingen die worden gebruikt om de gegevens te genereren. Hoewel het raadzaam is om zoveel mogelijk weefsel te verwijderen bij het voorbereiden van larvale hersenen voor beeldvorming, is het onverstandig om de hersenen te veel te snoeien om mechanische stress te minimaliseren, omdat dit de kwaliteit van de gegevens negatief kan beïnvloeden. Bovendien zal frequente blootstelling aan krachtige beeldvormende lasers een negatieve invloed hebben op de gezondheid van de neuroblasten. Men moet dus overwegen om het laservermogen, de belichtingstijd en de beeldfrequentie aan te passen bij het verzamelen van de beeldgegevens.
Voor de montage van monsters kunnen alternatieve methoden worden gebruikt. Explant-hersenen kunnen bijvoorbeeld worden gemonteerd in een vaste matrix37. De beschikbaarheid van verschillende montageprotocollen biedt de mogelijkheid om larvale hersenexplantaten op een breed scala aan microscopen in beeld te brengen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen financiële informatie te melden.
Acknowledgments
Dit onderzoek wordt ondersteund door R35GM148160 (C. C.) en een National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R. C. S)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
References
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division. Development. 147 (13), (2020).
- Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions. Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).
- Loyer, N., Januschke, J. Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts. Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).
- Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages. Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).
- Oon, C. H., Prehoda, K. Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle. eLife. 8, e45815 (2019).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Oon, C. H., Prehoda, K. E. Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle. eLife. 10, e66574 (2021).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle. Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).
- Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway. Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).
- Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts. Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).
- Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N. Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).
- Montembault, E., et al. Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage. Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).
- Roubinet, C., et al. Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells. Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C.
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Lerit, D. A., et al. Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function. Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).
- Gallaud, E., et al. Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry. PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).
- Ramdas Nair, A., et al. The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).
- Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells. Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).
- Sunchu, B., et al. Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo. Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).
- Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation. Developmental Biology. 475, 256-264 (2021).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).
- Lee, C. -Y., et al. Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation. Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).
- Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages. PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules. Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
