Summary
Hier diskutieren wir einen Arbeitsablauf zur Präparation, Sektion, Montage und Bildgebung von lebenden Explantatgehirnen aus Drosophila melanogaster-Larven des dritten Stadiums, um die zelluläre und subzelluläre Dynamik unter physiologischen Bedingungen zu beobachten.
Abstract
Drosophila-neurale Stammzellen (Neuroblasten, im Folgenden NBs) durchlaufen asymmetrische Teilungen, die den sich selbst erneuernden Neuroblasten regenerieren und gleichzeitig eine differenzierende Ganglienmutterzelle (GMC) bilden, die eine zusätzliche Teilung durchläuft, um zwei Neuronen oder Gliazellen entstehen zu lassen. Studien an NBs haben die molekularen Mechanismen aufgedeckt, die der Zellpolarität, der Spindelorientierung, der Selbsterneuerung neuraler Stammzellen und der Differenzierung zugrunde liegen. Diese asymmetrischen Zellteilungen sind durch Lebendzell-Bildgebung leicht zu beobachten, wodurch sich Larven-NBs ideal für die Untersuchung der räumlich-zeitlichen Dynamik der asymmetrischen Zellteilung in lebendem Gewebe eignen. Bei richtiger Präparation und Abbildung in nährstoffangereichertem Medium teilen sich NBs im Explantatgehirn 12-20 Stunden lang robust. Die zuvor beschriebenen Methoden sind technisch schwierig und können für Neulinge auf diesem Gebiet eine Herausforderung darstellen. Hier wird ein Protokoll für die Präparation, Präparation, Montage und Bildgebung von lebenden Larvenexplantaten des dritten Stadiums unter Verwendung von Fettkörperpräparaten beschrieben. Es werden auch mögliche Probleme diskutiert und Beispiele für den Einsatz dieser Technik gegeben.
Introduction
Asymmetrische Zellteilung (ACD) ist der Prozess, bei dem subzelluläre Komponenten wie RNA, Proteine und Organellen ungleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt werden 1,2. Dieser Prozess ist häufig bei Stammzellen zu beobachten, die ACD durchlaufen, um Tochterzellen mit unterschiedlichen Entwicklungsschicksalen hervorzubringen. Drosophila NBs teilen sich asymmetrisch und erzeugen eine NB, die ihre Stammform beibehält, und eine Ganglienmutterzelle (GMC). Das GMC durchläuft weitere Teilungen, um differenzierende Neuronen oder Gliazellenzu erzeugen 3. Asymmetrisch teilende NBs sind in den sich entwickelnden Gehirnen von Larven des dritten Stadiums reichlich vorhanden, die mit Hilfe der Mikroskopie leicht beobachtet werden können. Im Larvenstadium des dritten Stadiums sind in jedem zentralen Hirnlappen etwa 100 NBsvorhanden 3,4,5,6.
Die asymmetrische Zellteilung ist ein hochdynamischer Prozess. Lebendzell-Bildgebungsprotokolle wurden verwendet, um die Dynamik der Zellpolarität 7,8,9,10, der Spindelorientierung 11,12,13, der Dynamik des Aktomyosin-Kortex14,15,16,17,18, der Mikrotubuli- und Zentrosombiologie 19,20 zu messen und zu quantifizieren,21,22,23,24,25,26,27 und Membran 10,28 und Chromatindynamik 29. Qualitative und quantitative Beschreibungen von ACD basieren auf robusten Methoden und Protokollen, um NBs in intakten lebenden Gehirnen abzubilden. Das folgende Protokoll beschreibt Methoden zur Präparation, Sektion und Bildgebung von Larvengehirnen im dritten Stadium für die Bildgebung lebender Zellen in vivo unter Verwendung von zwei verschiedenen Montageansätzen. Diese Methoden eignen sich am besten für Forscher, die sich für die raumzeitliche Dynamik von Stammzellteilungen sowie für Teilungen in anderen Gehirnzellen interessieren, da sie kurz- und langfristige Beobachtungen zellulärer Ereignisse ermöglichen. Darüber hinaus sind diese Techniken für Neulinge auf diesem Gebiet leicht zugänglich. Wir demonstrieren die Effektivität und Anpassungsfähigkeit dieses Ansatzes mit Larvenhirnen, die fluoreszenzmarkierte Mikrotubuli und kortikale Fusionsproteine exprimieren. Darüber hinaus diskutieren wir Analysemethoden und Überlegungen zur Anwendung in anderen Studien.
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Protocol
HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die Materialien, die für die Durchführung dieser Studie erforderlich sind.
1. Überlegungen und Vorbereitungen für das Experiment
- Verhindern Sie, dass sich die Larven überfüllen.
HINWEIS: Die Qualität der Larvengehirne steht in direktem Zusammenhang mit der Gesundheit und Qualität der Larven vor der Sektion. Larven, die durch Überfüllung unterernährt sind, bringen im Allgemeinen Gehirne von geringerer Qualitäthervor 30.- Stellen Sie sicher, dass nicht mehr als 20-30 Larven pro Mahlzeit vorhanden sind, um eine Mangelernährung zu vermeiden. Beispiele hierfür sind in Abbildung 2 dargestellt.
- Filtern und aliquotieren Sie das Schneider'sche Medium vor Gebrauch.
- Bereiten Sie für jede Dissektion ein frisches Bildgebungs- und Dissektionsmedium vor, indem Sie aliquotiertes Schneider's Insect Medium mit 1% Rinderwachstumsserum (BGS) ergänzen. Ein Volumen von 5 mL Präparier- und Bildgebungsmedium ist in der Regel für ein bildgebendes Experiment ausreichend.
- Erwärmen Sie das supplementierte Medium vor Gebrauch auf Raumtemperatur (RT).
- Berücksichtigen Sie die Länge des zu erfassenden Films und verwenden Sie diese, um die Ergänzung des Bildgebungsmediums, den Montageansatz und die Aufnahmeeinstellungen des Mikroskops zu berücksichtigen.
HINWEIS: Unter optimalen Bedingungen teilen sich NBs in Gehirnen, die nur mit BGS supplementiert wurden, über 3 Stunden lang robust.- Ergänzen Sie das Bildgebungsmedium, indem Sie dem Bildgebungsmedium Larvenfettgewebe hinzufügen, um bei der Durchführung von Experimenten, die längere Filme erfordern, Teilung nach 4 Stunden zu unterstützen.
HINWEIS: Fettkörper scheiden Mitogene aus, die die NB-Proliferation unterstützen31, und ganze Fettkörper von 10 Larven reichen aus, um vier bis fünf Gehirne zu unterstützen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Proben, die mit einem membrangebundenen Objektträger aufgenommen wurden, sich über 10 h teilen13,32, während Proben, die mit einem Multiwell-Objektträger aufgenommen wurden, sich in der Regel seltener teilen (unveröffentlichte Beobachtungen). - Implementieren Sie alternativ ein komplexeres Bildmedium für längere Filme, wie zuvor beschrieben33. Minimieren Sie Lichtschäden, indem Sie die Belichtungszeit, die Laserleistung und die Abtastfrequenz anpassen, um beste Ergebnisse zu erzielen.
- Ergänzen Sie das Bildgebungsmedium, indem Sie dem Bildgebungsmedium Larvenfettgewebe hinzufügen, um bei der Durchführung von Experimenten, die längere Filme erfordern, Teilung nach 4 Stunden zu unterstützen.
2. Stadien und Sammlung der Larven (Abbildung 2)
- Kreuzen Sie 1-5 Tage alte weibliche jungfräuliche Fliegen mit 1-7 Tage alten erwachsenen männlichen Fliegen, um Nachkommen mit dem gewünschten Genotyp zu erzeugen. Um einen optimalen Ertrag zu erzielen, kreuzen Sie 10-15 weibliche Jungfrauen mit 5-10 männlichen Sorten. Legen Sie diese Fliegen in einen Fliegenkäfig mit einer Mahlzeitkappe (Abbildung 2A-C) und inkubieren Sie sie bei 25 °C.
- Tauschen Sie die Mahlzeitkappe täglich aus. Dadurch wird verhindert, dass die Mehlkappen mit Larven überfüllt werden, was die Qualität der präparierten Gehirne verringert.
- Wenn der Mehlverschluss deutlich mit Larven bedeckt ist (z. B. >30), teilen Sie diesen Mehlverschluss in zwei Hälften und ersetzen Sie eine Hälfte durch einen frischen Mehlverschluss, der ebenfalls in zwei Hälften geschnitten wurde. Alternativ können Sie die Mahlzeitkappen häufiger austauschen (d. h. alle 12 Stunden statt alle 24 Stunden). Beispiele für überbevölkerte Mehlkappen sind in Abbildung 2E, F zu sehen.
- Inkubieren Sie den Mehldeckel mit Larven bei 25 °C, bis die Larven das gewünschte Alter erreicht haben.
3. Sektion des Larvenfettkörpers (Abbildung 3)
HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Präparation mit einer 3-Well-Dissektionsschale.
- Pipettieren Sie ~400 μl Dissektions- und Bildgebungsmedium in jede Vertiefung einer 3-Well-Dissektionsschale.
- Waschen Sie zehn 72-96 h alte, gut genährte Wildtyp-Larven, indem Sie sie vorsichtig mit einer Sezierzange halten und in die Sezierlösung in der untersten Vertiefung tauchen und wieder heraustauchen, bis alle Speisereste abgewaschen sind. Bewegen Sie die sauberen Larven nach dem Spülen in die mittlere Mulde.
- Halten Sie die Larve mit einer Pinzette an den Mundhaken fest. Reißen Sie mit der anderen Pinzette eine Seite der Nagelhaut der Larve auf.
- Dieser Riss führt dazu, dass die Fettkörper aus der Larve herauslaufen. Die Fettkörper sind cremefarben und halbdurchscheinend und haben eine gitterartige Struktur (Abbildung 3I). Die fetten Körper neigen auch dazu, an sich selbst und der Sezierpinzette zu kleben. Sobald Sie identifiziert sind, sammeln Sie so viel Fettkörper wie möglich von jeder Larve und übertragen Sie ihn mit der Pinzette in die oberste Vertiefung mit 400 μl RT-Dissektionsmedium.
4. Dissektion des Larvengehirns (Abbildung 3)
- Waschen Sie die Versuchslarven wie oben beschrieben in Präparieren und Bildgebungsmedium, um sie von Speiseresten zu befreien. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, vermeiden Sie es, unpräparierte Larven in der Präparierlösung zu lagern. Dies führt dazu, dass die Larven "ertrinken" und sich negativ auf die Qualität der präparierten Gehirne auswirken.
- Halten Sie die Larve mit einer Pinzette an den Mundhaken fest. Schneiden Sie mit einer anderen Pinzette vorsichtig etwa 1/3 der Larve von der hinteren Seite ab (Abbildung 3A). Dies führt dazu, dass Elemente des Verdauungstrakts, der Fettkörper, des Bindegewebes und des Nervensystems aus der geplatzten Seite der Larve "platzen" (Abbildung 3B).
- Halten Sie die Larve mit einer Pinzette an den Mundhaken fest. Bürsten Sie mit der anderen Pinzette vorsichtig die Nagelhaut in Richtung der Mundhaken, während Sie mit der Pinzette, die die Mundhaken hält, nach innen "drücken", bis die gesamte Larve von innen nach außen gedreht ist. Diese Bewegung ähnelt dem Drehen einer Socke "von innen nach außen" (Abbildung 3C, D).
- Drehen Sie die Larve so um, dass das zentrale Nervensystem und andere Gewebe nach außen zeigen, während sie noch mit der Kutikula verbunden sind. Lokalisieren Sie in diesem Schritt das zentrale Nervensystem (ZNS), um eine versehentliche Entfernung zu vermeiden. Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das gesamte Nicht-ZNS-Gewebe, so dass nur das ZNS und das Gehirn an der Nagelhaut befestigt sind (Abbildung 3E).
- Das Gehirn wird über axonale Verbindungen mit der Kutikula verbunden. Schneiden Sie diese axonalen Verbindungen mit einer Mikrodissektionsschere ab, um das Gehirn von der Nagelhaut zu befreien. Schneiden Sie dazu zunächst vorsichtig unter die Hirnlappen (Abbildung 3F). Wiederholen Sie dies mit den Verbindungen unter dem ventralen Nervenstrang.
HINWEIS: Dieser Schritt kann mit einer Pinzette durchgeführt werden, wenn keine Mikrodissektionsschere verfügbar ist. Achten Sie bei der Verwendung einer Pinzette besonders darauf, dass das Hirngewebe bei der Entfernung aus der Nagelhaut nicht überdehnt wird, da sich mechanischer Stress negativ auf die Gesundheit des Gehirns auswirkt. - Überführen Sie das präparierte Gehirn in eine Vertiefung mit Präparations- und Bildgebungsmedium. Für bildgebende Experimente, die länger als 3 h dauern, verwenden Sie wie oben beschrieben ein mit Fettkörpern angereichertes Präparier- und Bildgebungsmedium. Sezieren Sie die Larven in Chargen, um die Sezierzeit unter 20 Minuten zu halten.
5. Montage und Belichtung (Abbildung 4)
- Für die Bildgebung mit einem membrangebundenen Objektträger34:
- Sammeln Sie sowohl präparierte Gehirne als auch isolierte Fettkörper in der letzten Vertiefung der Sezierschale.
- Montieren Sie die Hälfte des Objektträgers, indem Sie eine gasdurchlässige Membran über die Rückseite des Objektträgers legen, und drücken Sie den Spaltring in die Mitte, um ihn an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 4A-C).
- Übertragen Sie mit einer 200-μl-Mikropipette bis zu 10 präparierte Gehirne und so viel Fettkörper wie möglich (siehe oben) in ~130-140 μl Präparier- und Bildgebungsmedium auf die Membran. Achten Sie darauf, das Medium mit den Proben in der Mitte der gasdurchlässigen Membran abzuscheiden (Abbildung 4D, E).
- Richten Sie die Gehirne für die Population der abzubildenden NBs und für die Art des verwendeten Mikroskops aus (Abbildung 4E). Positionieren Sie die Probe so nah wie möglich am Objektiv des Mikroskops. Um beispielsweise NBs in den zentralen Hirnlappen abzubilden, richten Sie die Gehirne so aus, dass die Hirnlappen dem Ziel am nächsten sind (Abbildung 4H).
- Sobald die Gehirne ausgerichtet sind, legen Sie vorsichtig ein Glasdeckglas auf die Lösung auf der Membran. Dies führt dazu, dass sich die Lösung, die das Gehirn und die Fettkörper enthält, über die gesamte Membran verteilt (Abbildung 4F).
- Tupfen Sie überschüssige Lösung ab, indem Sie ein Labortuch nahe an den Rand des Deckglases halten. Die optimale Menge an Lösung wird erreicht, wenn das Gehirn das Deckglas berührt, ohne gequetscht zu werden. Wenn in diesem Schritt eine Neuorientierung erforderlich ist, bewegen Sie das Deckglas vorsichtig, um das Gehirn zu bewegen.
- Immobilisieren Sie das Deckglas, indem Sie geschmolzene Vaseline mit einem Pinsel entlang der Ränder des Deckglases auftragen. Lassen Sie das Gelee fest werden (Abbildung 4G).
- Für die Bildgebung mit einem Multi-Well-Objektträger (Abbildung 4):
- 400 μl Bildgebungsmedium werden in eine Vertiefung eines Multi-Well-Objektträgers gegeben (in dem hier durchgeführten Experiment wurde ein gekammerter 8-Well-Mikro[μ]-Objektträger verwendet; Abbildung 4I). Übertragen Sie die zuvor präparierten Fettkörper in diese Vertiefung (siehe Schritt 3.4).
- Legen Sie bis zu 10 Gehirne in einem Cluster in der Nähe der Mitte des Bohrlochs ab (Abbildung 4J).
- Richten Sie die Gehirne für die Population der abzubildenden NBs und für den verwendeten Mikroskoptyp aus, wie in Schritt 5.1.4 beschrieben (Abbildung 4K). Ordnen Sie die Proben so an, dass sie nahe beieinander liegen. Dadurch wird der Abstand minimiert, den der Tisch zwischen den Proben zurücklegen muss, wodurch die Probendrift während der Erfassung verringert wird.
- Sobald die Gehirne im Brunnen ausgerichtet sind, lassen Sie die Gehirne 2-5 Minuten ruhen. Dies erhöht ihre Stabilität während des Transports/der Bildgebung. Bereiten Sie das Mikroskop während dieser Zeit auf die Aufnahme vor.
- Decken Sie den μ-Objektträger mit der Objektträgerabdeckung ab und legen Sie ihn in das Mikroskop ein. Beginnen Sie die Aufnahme mit der geringstmöglichen Laserleistung und Belichtungszeit, um das Ausbleichen zu minimieren.
6. Best Practices für Datenverarbeitung und -verwaltung
- Verarbeiten Sie die Daten nach Bedarf gemäß der verfügbaren Analysesoftware.
- Speichern Sie für das hier gezeigte Beispiel die erfassten Daten mit der SlideBook-Software als SlideBook-Bilddatei (.sld).
- Um mit dem Imaris File Converter in den proprietären Dateityp Imaris (.ims) zu konvertieren, öffnen Sie den Imaris File Converter in einem separaten Fenster. Klicken Sie auf und ziehen Sie die .sld-Dateien in den Abschnitt "Eingabe" des Imaris File Converters.
- Bestimmen Sie den gewünschten Ausgabeort für die konvertierten Dateien und klicken Sie auf "Alle starten".
- Zeigen Sie die Daten nach der Konvertierung in der Imaris-Software an und kommentieren Sie sie.
HINWEIS: Anstelle von Imaris können Alternativen für die Bildanalyse verwendet werden, z. B. Fidschi (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html), Aivia (https://www.aivia-software.com/), Volocity (https://www.volocity4d.com/) oder andere.
- Bewahren Sie so viele Originaldaten wie möglich auf, um eine ordnungsgemäße Aufzeichnung zu gewährleisten. Wenn die Erfassungssoftware beispielsweise in einem Dateiformat gespeichert, aber für die Analyse in ein anderes Format konvertiert wird, behalten Sie die erfasste Version der Daten bei.
- Notieren Sie für die Datenanalyse so viele Details wie möglich über die Proben- und Erfassungseinstellungen. Zu den wichtigsten Informationen, die aufbewahrt werden müssen, gehören der Genotyp der präparierten Larven, das Alter der Larven vor der Sektion, der Zustand des Mehlverschlusses, in dem sie aufgezogen wurden, die während der Bildgebung verwendete Laserleistung, die Belichtungszeit, die Dauer der Aufnahme und die zeitliche Auflösung.
7. Beispielhafte Quantifizierung der Zellzykluslänge (Abbildung 5)
HINWEIS: In diesem Beispiel wurden Larven abgebildet, die den Polaritätsmarker Pins (Pins::EGFP16) und das Mikrotubuli-bindende Protein Jupiter25 (cherry::Jupiter13) exprimieren. Die anschließende Analyse erfolgte mit der Software Imaris.
- Öffnen Sie den Film mit der Bildanalysesoftware Ihrer Wahl. Scrollen Sie durch die Länge des Films, um trennende NBs zu identifizieren, und beschriften Sie sie zum späteren Nachschlagen. Identifizieren Sie die teilenden NBs anhand ihrer unterschiedlichen mitotischen Spindeln (Abbildung 5C-E).
- Identifizieren Sie ein Referenzzellzyklusstadium, um die Zellzykluslänge zu bestimmen. In diesem Beispiel wird die Metaphase als Referenz verwendet.
- Bestimmen Sie manuell die Anzahl der Frames zwischen aufeinanderfolgenden Metaphasen und konvertieren Sie sie in Minuten oder Stunden, um die Zeit zu bestimmen, die zum Abschließen eines Zellzyklus benötigt wird.
- Nehmen Sie dazu die zeitliche Auflösung des Films und multiplizieren Sie sie mit der Anzahl der Bilder zwischen den Metaphasen. Wenn z. B. die zeitliche Auflösung des Films alle 5 Minuten ein Bild beträgt und Metaphasen in Bild 13 und Bild 35 beobachtet werden, beträgt die Zeit zwischen diesen Metaphasen 110 Minuten ([35 − 13] × 5).
- Zeichnen Sie die Daten mit einer geeigneten Software auf. Die hier gezeigten Daten wurden mit der PRISM-Software grafisch dargestellt.
8. Beispielhafte Quantifizierung der Ausrichtung der Zellspindel (Abbildung 5)
HINWEIS: In diesem Beispiel wird die Analyse mit der Imaris-Software durchgeführt.
- Öffnen Sie die Filmdatei in Imaris oder einer anderen Software Ihrer Wahl. Scrollen Sie durch die Länge des Films, um trennende NBs zu identifizieren, und beschriften Sie sie zum späteren Nachschlagen.
- Bestimmen Sie den von den Spindelpolen gebildeten Vektor mit den apikalen und basalen Zentrosomen (dargestellt durch m) wie folgt:
wobei Ax, Ay und Az die Koordinaten des apikalen Zentrosoms und Bx, By und Bz die Koordinaten des basalen Zentrosoms sind. In ähnlicher Weise wird die Achse des Teilungsvektors (dargestellt durch n) durch den Mittelpunkt der apikalen Pins::EGFP-Sichel und des basalen Kortex gebildet:
wobei Ax, Ay und Az die Koordinaten des Mittelpunkts der Pins::EGFP-Sichel und Bx, By und Bz die Koordinaten des Mittelpunkts des basalen Kortex sind. - Bestimmen Sie den Betrag der Vektoren m und n:
Magnitude von m:
Magnitude von n:
- Bestimmen Sie das Skalarprodukt (dargestellt durch k) von m und n:
- Bestimmen Sie mit dem Skalarprodukt k und den Vektorgrößen m und n den Winkel zwischen den Vektoren:
- Zeichnen Sie die Daten in der Software Ihrer Wahl. Die hier gezeigten Daten wurden in Microsoft Excel aufbereitet und in PRISM visualisiert.
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Representative Results
Dissektion und Bildgebung von zentralen Hirnlappen-NBs, die Pins::EGFP und Cherry::Jupiter exprimieren
Um dieses Protokoll zu demonstrieren, wurden Larven, die UAS-getriebenes Cherry::Jupiter13 exprimieren und endogen mit Pins::EGFP16 markiert sind (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Die Pins::EGFP/TM6B, Tb) wurden 4 h lang mit dem beschriebenen Protokoll unter Verwendung von Multi-Well-Imaging-Objektträgern abgebildet (Abbildung 5C,D). Zusätzliche Daten wurden von Larven entnommen, die UAS-getriebenen Cherry::Jupiter13 exprimieren und endogen mit Miranda::EGFP markiert wurden (w; worGal4, UAS-cherry::Zeus/CyO; UAS-Miranda::GFP/TM6B), die 10 h lang mit einem membrangebundenen Objektträger abgebildet wurden (Abbildung 5E,F). Die Larven wurden in Käfigen aufgezogen, wie in Abschnitt 1 dieses Protokolls beschrieben. Im Alter von 72-96 h wurden die Larven präpariert (Abbildung 3), montiert (Abbildung 4) und abgebildet. Für die hier durchgeführten Experimente wurde ein 561 nm Laser mit 10% Laserleistung bei 100 ms Belichtungszeit und ein 488 nm Laser mit 15% Laserleistung mit 100 ms Belichtungszeit verwendet. Z-Stapel (41 μm) wurden mit einer Schrittweite von 1 μm erfasst. Die Bilder wurden alle 5 Minuten bei RT mit einem konfokalen Spinning-Disc-System von Intelligent Imaging Innovations (3i) aufgenommen, das aus einer Yokogawa CSU-W1 Spinning-Disc-Einheit und zwei Prime 95B Scientific CMOS-Kameras besteht. Für die Bildgebung wurde ein 60x/1.4NA Ölimmersionsobjektiv verwendet, das auf einem Nikon Eclipse Ti Mikroskop montiert war. Die Live-Imaging-Voxel betrugen 0,22 μm x 0,22 μm x 0,75 μm (60x/1.4NA Spinning Disc).
In Übereinstimmung mit früheren Berichten16 bildeten die Pins eine ausgeprägte apikale Sichel bei der Teilung von NBs während der Mitose, und die mitotischen Spindeln richteten sich konsequent auf diese apikale Sichel aus (Abbildung 5C). Die Zellzykluslänge wurde durch Messung der Zeit zwischen aufeinanderfolgenden Metaphasen der einzelnen NBs bestimmt (Abbildung 5D,F).
Bei Proben, die 4 h lang ohne Fettkörpersupplementierung auf einem Multiwell-Objektträger abgebildet wurden, nahm die Zellzykluslänge mit zunehmender Bildgebungszeit zu (Abbildung 5C, D). Proben, die in fettem, körperergänzendem Medium auf einem membrangebundenen Objektträger abgebildet wurden, zeigten keine Zunahme der Zellzykluslänge (Abbildung 5E, F). Des Weiteren wurden NBs mit vier Teilung auf dem 10 h membrangebundenen Objektträger beobachtet (Abbildung 5D vs. Abbildung 5F).
Schließlich wurde der Winkel zwischen der Teilungsachse und der mitotischen Spindel unter Verwendung von GFP-markierten Pins als Referenz bestimmt (schematisch in Abbildung 5G dargestellt). Die Teilungsachse wurde bestimmt, indem der Mittelpunkt der apikalen Sichel identifiziert wurde, die von den Pins in der Mitose gebildet wird, und die Zelle in zwei Hälften halbiert wurde (Abbildung 5G, rote gestrichelte Linie). Wie bereits beschrieben, wiesen die Wildtyp-NBs mitotische Spindeln auf, die nicht mehr als 30° von der Teilungsachse entfernt waren (Loyer und Januschke36 und Abbildung 5H).
Abbildung 1: Materialien. (A) Präpariermikroskop. (B) Sammelkäfig mit Fliegen des gewünschten Genotyps und einem Mehldeckel mit heranwachsenden Larven. (C) Präparier- und Bildgebungsmedium, 5 ml. (D) Mehlkappen mit Larven aus drei verschiedenen Sammlungen. (E,E') Mikrodissektionswerkzeuge, von links nach rechts: Mikrodissektionsschere, Pinzette. (F,F') Schale sezieren. (G) Ein 8-Welle-μ-Objektträger für die Abbildung der Proben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Beispiel für Mahlzeitkapseln. (A) Zwei Fläschchen mit männlichen und weiblichen Fliegen, die gekreuzt werden sollen, ein leerer Embryonensammelkäfig und ein frischer Mahlzeitverschluss. (B) Die Unterseite des Embryonensammelkäfigs mit der neuen Mahlzeitkappe (links) und die Oberseite des Käfigs mit Fliegen (rechts). (C) Der komplett montierte Fliegenkäfig. (D) Ein Beispiel für eine gut inszenierte Mehlkappe mit Larven zum Sezieren. Beachten Sie, dass das Futter durch die Larven gestört, aber nicht übermäßig gestört wird. (E,F) Zwei Beispiele für 4 Tage alte, überfüllte Mahlzeitkappen. Beachten Sie, dass dieses Essen jetzt eine suppenartige Konsistenz hat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Präparation . (A) Dorsale Ansicht einer Larve im dritten Stadium. Die rote Linie am hinteren Ende der Larve zeigt an, wo der erste Schnitt gemacht werden sollte. (B) Dorsale Ansicht der Larve nach Entfernung des hinteren Endes. (C) Diagramm, das zeigt, wie man die Larve umdreht. Halten Sie die Larve mit einer Pinzette an der Nagelhaut in der Nähe der Stelle, an der der erste Schnitt gemacht wurde. Drücken Sie mit der anderen Pinzette in das vordere Ende der Larve, um sie umzudrehen. Die schwarzen Pfeile zeigen die Richtung der Pinzette an, wobei einer von der vorderen Seite in die Larven "hineindrückt" und der andere das abgeschnittene hintere Ende in Richtung des vorderen Endes bewegt. Der kleinere rote Pfeil kennzeichnet eine Karikatur von dicken Körpern. (D) Ansicht einer umgedrehten Larve, an der die Fettkörper und der Verdauungstrakt noch befestigt sind. (E) Ansicht einer invertierten Larve, bei der das Nicht-ZNS-Gewebe entfernt wurde. Die rote gestrichelte Linie umreißt das noch anhaftende Gehirn. (F) Schematische Darstellung der Entfernung des Gehirns aus der Nagelhaut. Die rote gestrichelte Linie zeigt den Weg an, der mit einer Mikrodissektionsschere geschnitten werden muss, um das Gehirn von der umgekehrten Nagelhaut zu befreien, und die schwarzen Pfeile zeigen die Entfernung des Gehirns aus der Nagelhaut an. (G) Eine Ansicht des umgekehrten Gehirns, das immer noch durch eine kleine Anzahl von axonalen Verbindungen unter dem ventralen Nervenstrang (VNC) mit der Kutikula verbunden ist. (H) Ein isoliertes Larvengehirn. Die Hirnlappen sind mit gestrichelten orangefarbenen Linien umrandet. (I) Isolierte Fettkörper. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Montage und Belichtung. (A) Ansicht der Bauteile für die Montage eines membrangebundenen Metallschiebers. (B) Schematische Darstellung der Bestandteile des membrangebundenen Objektträgers und ihrer Montage. (C) Seitenansicht der in den Metallschieber eingesetzten Membran, die durch den geteilten Metallring an Ort und Stelle gehalten wird. (D) Draufsicht auf den zusammengebauten Objektträger ohne Deckglas. Das Präparations- und Bildgebungsmedium mit Fettkörpern und präparierten Gehirnen wurde auf die Membran aufgebracht. (E) Vergrößerte Ansicht der Fettkörper und Gehirne im Tropfen des Mediums. (F) Draufsicht auf den Metallschieber nach dem Hinzufügen des Glasdeckglases. (G) Draufsicht auf den zusammengebauten Objektträger mit dem Glasdeckglas, das mit geschmolzener Vaseline am Objektträger befestigt ist. Das Abdecken der Ränder des Deckglases mit Vaseline verhindert zudem die Verdunstung des Mediums. (H) Schematische Darstellung des zusammengebauten Objektträgers mit Gehirnen, die für die Beobachtung auf einem inversen Mikroskop ausgerichtet sind. Die blauen Kreise kennzeichnen NBs in den zentralen Hirnlappen und VNC. (I) Ansicht eines leeren Multi-Well-Objektträgers. (J) Vergrößerte Ansicht einer Vertiefung des Multi-Well-Objektträgers. (K) Schematische Darstellung der Gehirnorientierung für die Abbildung der zentralen Hirnlappen auf einem inversen Mikroskop mit einem Multi-Well-Objektträger. Die blauen Kreise kennzeichnen NBs in den zentralen Hirnlappen und VNC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Quantifizierung der Zellzykluslänge . (A) Diagramm eines Larvengehirns im dritten Stadium, das die Hirnlappen, den Sehlappen (OL, dunkelgrau), den ventralen Nervenstrang (VNC), NBs (dunkelblau), GMCs (hellblau) und Neuronen (violett) innerhalb der zentralen Hirnlappen und VNC hervorhebt. (B) Schematische Darstellung der NB- und GMC-Abteilungen. (C) Bildserie eines Wildtyp-NB mit weiß markierten Mikrotubuli (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) und apikalen Pins (Pins::EGFP in grün), abgebildet in einem Multiwell-Objektträger ohne Fettkörpersupplementierung für 4 h. Zusammengeführte Bilder und der entsprechende Abstammungsbaum mit Zellzyklus-Timing sind unten dargestellt. Maßstabsbalken = 10 μm. (D) Quantifizierung der Zellzykluslänge (Metaphase - Metaphase) für die erste, zweite und dritte Teilung in Proben, die auf einem Multiwell-Objektträger ohne Fettkörper abgebildet wurden. (E) Bildserie eines Wildtyp-NB mit weiß markierten Mikrotubuli (MTs, UAS-Cherry::Jupiter), abgebildet mit einem membrangebundenen Objektträger mit Fettkörpersupplementierung für 10 h mit dem entsprechenden Linienbaum und Zellzyklus-Timing. Maßstabsbalken = 10 μm. (F) Quantifizierung der Zellzykluslänge (Metaphase - Metaphase) für die erste, zweite, dritte und vierte Teilung in Proben, die auf einem membrangebundenen Objektträger mit Fettkörpern abgebildet wurden. (G) Schematische Darstellung der Bestimmung des Winkels zwischen Spindelachse (orange gestrichelte Linie) und Teilungsachse (θ, rote gestrichelte Linie). (H) Quantifizierung von θ aus 10 Zellen, die mit einem Multi-Well-Objektträger ohne Fettkörper abgebildet wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz für die Bildgebung von lebenden Explantatgehirnen aus Drosophila melanogaster-Larven . Das hier beschriebene Protokoll erlaubt es, Explantatgehirne für 12-20 Stunden unter den richtigen experimentellen Bedingungen zu beobachten. Besonderes Augenmerk muss auf die Vorbereitung der Proben und das Design der gewünschten Experimente gelegt werden. Wie bereits erwähnt, ist einer der kritischsten Faktoren, der die Qualität des präparierten Gewebes bestimmt, die Gesundheit der Larven. Um die höchstmögliche Qualität zu erreichen, muss sichergestellt werden, dass die Larven vor dem Sammeln gut gefüttert werden. Ungesunde Larven entstehen am häufigsten durch Überfüllung. Um dem entgegenzuwirken, muss sichergestellt werden, dass die Überbelegung minimiert wird, entweder durch eine Erhöhung der Erntehäufigkeit oder durch das Teilen von Schalen mit frisch gelegten Eiern mit einer leeren Schüssel.
Ein weiteres wichtiges Element dieses Protokolls ist die Methode der Dissektion zur Isolierung des Hirngewebes. Das Gehirn und die darin befindlichen NBs reagieren extrem empfindlich auf äußere Faktoren, wie z. B. die Temperatur des Dissektionsmediums und die Invasivität der Dissektion selbst. Zu kaltes Medium neigt dazu, die Mikrotubuli zu depolymerisieren. In ähnlicher Weise wirkt sich eine Dissektion, bei der das Gehirn gedehnt oder aufgebrochen wird, nachteilig auf die Qualität der NBs aus. Um dies zu verhindern, sollte man es vermeiden, direkt am Hirngewebe zu ziehen, und stattdessen die Sezierwerkzeuge an der Nagelhaut oder anderem Gewebe verankern. Mikrodissektionsscheren sind dabei sehr hilfreich, da sie nur minimal am Hirngewebe ziehen. Wenn keine Schere zur Verfügung steht, kann mit einer Pinzette das Bindegewebe zwischen ventralem Nervenstrang und Kutikula vorsichtig entfernt werden.
Dieses Protokoll stellt zwei Methoden vor, um Larvengehirne für die konfokale Mikroskopie zu montieren. Aus technischer Sicht ist die Einbettung von Proben auf einen Multiwell-Objektträger einfacher als die Montage auf einem membrangebundenen Objektträger. Jede Methode eignet sich jedoch am besten für unterschiedliche Arten von Experimenten. Die hier gezeigten Daten zeigen, dass für kürzere Filme (d. h. weniger als 4 h) oder Filme mit hoher zeitlicher Auflösung (d. h. Erfassung eines Z-Stapels alle 10 s) die Bildgebung in einem Multi-Well-Objektträger ausreicht, um mehrere Teilungen im Zentralhirn der Larve zu beobachten. Für längere Aufnahmefenster ist die Montage auf einem membrangebundenen Objektträger ideal, da sich die auf diese Weise vorbereiteten Proben im Laufe des Films häufiger teilen. Normalerweise teilen sich die NBs der Wildtyplarven alle 40-90 Minuten13. Obwohl Multi-Well-Objektträger für lange Filme (> 4 h) verwendet werden können, wurde in diesem Zustand eine Zunahme der Zellzykluslänge und eine Abnahme der proliferierenden NBs beobachtet (Abbildung 5D). Daher müssen bei der Planung von Experimenten die Methode zur Probenmontage und die Art der zu messenden Daten berücksichtigt werden.
Dieses Protokoll empfiehlt, mehrere Gehirne in einer Vertiefung oder einem Objektträger abzubilden, da dies die Effizienz der Datenerfassung für ein bestimmtes Experiment erhöht. Die Ausrichtung und Platzierung der Gehirne innerhalb des Brunnens wirkt sich jedoch darauf aus, wie stark sich die Gehirnpositionen im Laufe des Films verschieben, da sich die Phase zwischen den Gehirnpositionen bewegt. Die Bündelung der Gehirne an einem zentralen Ort in einem Brunnen minimiert dieses Problem. Bei längeren Filmen kann es jedoch bei Experimenten mit Multi-Well-Objektträgern zu Verschiebungen kommen. In vielen Fällen ist die Verschiebung, die in diesen längeren Filmen beobachtet wird, minimal und kann während der Analyse korrigiert werden. Gehirnbewegungen können auch durch die Verwendung eines Metallschiebers verhindert werden, da die Kapillarkräfte verhindern, dass sich die präparierten Gehirne verschieben.
Mit einem Multi-Well-Objektträger ist es technisch möglich, Multi-Well-Imaging-Experimente durchzuführen. Dies erfordert jedoch Anpassungen der Stapelgröße und der zeitlichen Auflösung, um die zusätzliche Zeit zu berücksichtigen, die das Mikroskop für die Bewegung zwischen den Positionen aufwendet. Dies kann für groß angelegte genetische Screening-Experimente von Vorteil sein, bei denen man mehrere Genotypen in verschiedenen Vertiefungen abbilden kann.
Es gibt Fälle, in denen Gehirne im Laufe eines Experiments wenig oder gar keine teilenden NBs zeigen. Dies ist wahrscheinlich auf mehrere Faktoren zurückzuführen, die von der Art der abgebildeten Probe, der Qualität des Futters, das zur Aufzucht der Larven verwendet wird, der Qualität der Präparation und den Erfassungseinstellungen, die zur Erzeugung der Daten verwendet werden, abhängen. Obwohl es ratsam ist, bei der Vorbereitung von Larvengehirnen für die Bildgebung so viel Gewebe wie möglich zu entfernen, ist es nicht ratsam, das Gehirn zu stark zu beschneiden, um die mechanische Belastung zu minimieren, da sich dies negativ auf die Qualität der Daten auswirken kann. Darüber hinaus wirkt sich die häufige Exposition gegenüber leistungsstarken bildgebenden Lasern negativ auf die Gesundheit der Neuroblasten aus. Daher sollte man bei der Erfassung der Bilddaten in Betracht ziehen, die Laserleistung, die Belichtungszeit und die Abbildungsfrequenz anzupassen.
Für die Einbettung von Proben können alternative Methoden verwendet werden. Beispielsweise können Explantatgehirne in einer festen Matrix37 montiert werden. Die Verfügbarkeit verschiedener Montageprotokolle bietet die Möglichkeit, Larvenhirnexplanate auf einer Vielzahl von Mikroskopen abzubilden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine finanziellen Angaben zu machen.
Acknowledgments
Diese Forschung wird durch R35GM148160 (C. C.) und einen National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R. C. S) unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
References
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