Summary
Aqui, discutimos um fluxo de trabalho para preparar, dissecar, montar e obter imagens de cérebros de explantes vivos de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster para observar a dinâmica celular e subcelular sob condições fisiológicas.
Abstract
As células-tronco neurais de Drosophila (neuroblastos, RNs doravante) sofrem divisões assimétricas, regenerando o neuroblasto auto-renovador, ao mesmo tempo em que formam uma célula-mãe do gânglio diferenciador (GMC), que sofrerá uma divisão adicional para dar origem a dois neurônios ou glia. Estudos em RNs descobriram os mecanismos moleculares subjacentes à polaridade celular, orientação fusiforme, auto-renovação e diferenciação de células-tronco neurais. Essas divisões celulares assimétricas são facilmente observáveis através de imagens de células vivas, tornando os RNs larvais ideais para investigar a dinâmica espaço-temporal da divisão celular assimétrica em tecidos vivos. Quando devidamente dissecados e imageados em meio suplementado com nutrientes, os RNs em cérebros explantes dividem-se robustamente por 12-20 h. Os métodos descritos anteriormente são tecnicamente difíceis e podem ser desafiadores para aqueles que estão começando na área. Aqui, um protocolo é descrito para a preparação, dissecção, montagem e imagem de explantes cerebrais de larvas de terceiro ínstar vivas usando suplementos de corpo gorduroso. Problemas potenciais também são discutidos, e exemplos são fornecidos de como essa técnica pode ser usada.
Introduction
A divisão celular assimétrica (DCA) é o processo pelo qual componentes subcelulares como RNA, proteínas e organelas são particionados desigualmente entre as células filhas 1,2. Esse processo é comumente visto em células-tronco, que sofrem DCA para dar origem a células-filhas com diferentes destinos de desenvolvimento. Drosófila Os RNs dividem-se assimetricamente para produzir um RN, que retém sua caule, e uma célula-mãe ganglionar (GMC). O GMC sofre novas divisões para produzir neurônios diferenciadores ou glia3. RNs em divisão assimétrica são abundantes no cérebro em desenvolvimento de larvas de terceiro ínstar, que são prontamente observados por microscopia. No estágio larval de terceiro ínstar, há cerca de 100 RNs presentes em cada lobo cerebral central3,4,5,6.
A divisão celular assimétrica é um processo altamente dinâmico. Protocolos de imagem de células vivas têm sido utilizados para medir e quantificar a dinâmica da polaridade celular 7,8,9,10, a orientação do fuso 11,12,13, a dinâmica do córtex da actomiosina14,15,16,17,18, a biologia dos microtúbulos e centrossomos 19,20,21,22,23,24,25,26,27, e membrana 10,28 e dinâmica da cromatina29. Descrições qualitativas e quantitativas de DCA baseiam-se em métodos e protocolos robustos para a divisão de imagens de RNs em cérebros vivos intactos. O protocolo a seguir descreve métodos para preparar, dissecar e obter imagens de cérebros de larvas de terceiro ínstar para imagens de células vivas in vivo usando duas abordagens de montagem diferentes. Esses métodos são mais adequados para pesquisadores interessados na dinâmica espaço-temporal de divisões de células-tronco, bem como divisões em outras células cerebrais, pois permitem observações de curto e longo prazo de eventos celulares. Além disso, essas técnicas são facilmente acessíveis aos recém-chegados ao campo. Nós demonstramos a eficácia e adaptabilidade desta abordagem com cérebros de larvas expressando microtúbulos fluorescentemente marcados e proteínas de fusão cortical. Além disso, discutimos métodos de análise e considerações para aplicação em outros estudos.
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Protocol
OBS: A Figura 1 mostra os materiais necessários para a realização deste estudo.
1. Considerações e preparativos para a experiência
- Evitar que as larvas se superlotem.
NOTA: A qualidade do cérebro das larvas de explantes está diretamente relacionada com a saúde e qualidade das larvas antes da dissecção. Larvas desnutridas por superlotação geralmente produzem cérebros de baixa qualidade30.- Certifique-se de que não mais do que 20-30 larvas estão presentes por prato de tampa de refeição para evitar a desnutrição. Exemplos disso podem ser vistos na Figura 2.
- Filtre e alíquota o meio de Schneider antes de usar.
- Para cada dissecção, preparar imagens frescas e meio de dissecção suplementando o meio de inseto de Schneider com 1% de soro de crescimento bovino (BGS). Um volume de 5 mL de dissecção e meio de imagem geralmente é suficiente para um experimento de imagem.
- Aquecer o meio suplementado à temperatura ambiente (TR) antes de usar.
- Considere a duração do filme a ser coletado e use-a para fatorar a suplementação do meio de imagem, a abordagem de montagem e as configurações de aquisição do microscópio.
NOTA: Em condições ideais, os RNs em cérebros suplementados apenas com BGS se dividirão robustamente por mais de 3 h.- Complemente o meio de imagem adicionando tecidos corporais de gordura larval ao meio de imagem para suportar divisões após 4 h ao conduzir experimentos que exigem filmes mais longos.
NOTA: Os corpos gordos secretam mitógenos que suportam a proliferação NB31, e os corpos gordurosos inteiros de 10 larvas são suficientes para suportar quatro a cinco cérebros. Além disso, amostras fotografadas com uma lâmina ligada à membrana foram mostradas para se dividir por mais de 10 h13,32, enquanto amostras fotografadas com uma lâmina de vários poços geralmente se dividem com menos frequência (observações não publicadas). - Alternativamente, implemente um meio de imagem mais complexo para filmes mais longos, como descrito anteriormente33. Minimize os fotodanos ajustando o tempo de exposição, a potência do laser e a frequência de amostragem para obter melhores resultados.
- Complemente o meio de imagem adicionando tecidos corporais de gordura larval ao meio de imagem para suportar divisões após 4 h ao conduzir experimentos que exigem filmes mais longos.
2. Estadiamento e coleta das larvas (Figura 2)
- Cruzar moscas virgens fêmeas de 1-5 dias com moscas adultas adultas de 1-7 dias para produzir progênie com o genótipo desejado. Para um rendimento ideal, cruze 10-15 virgens fêmeas com 5-10 machos. Deposite essas moscas em uma gaiola de moscas com uma tampa de refeição (Figura 2A-C) e incube a 25 °C.
- Troque a tampa da refeição diariamente. Isso evita que as tampas das refeições fiquem superlotadas de larvas, o que reduz a qualidade dos cérebros dissecados.
- Se a tampa da refeição estiver significativamente coberta de larvas (ou seja, >30), divida essa tampa de refeição ao meio e substitua uma metade por uma tampa de refeição fresca que também tenha sido cortada ao meio. Alternativamente, troque as tampas das refeições com mais frequência (ou seja, a cada 12 h em vez de a cada 24 h). Exemplos de tampas de refeição superpovoadas podem ser vistos na Figura 2E, F.
- Incubar a tampa da farinha com as larvas a 25 °C até que as larvas atinjam a idade desejada.
3. Dissecção do corpo adiposo larval (Figura 3)
NOTA: Este protocolo descreve dissecações usando uma placa de dissecção de 3 poços.
- Pipetar ~400 μL de dissecção e meio de imagem em cada poço de uma placa de dissecção de 3 poços.
- Lave dez larvas selvagens de 72-96 h bem alimentadas, segurando-as suavemente com pinças de dissecção e mergulhando-as dentro e fora da solução de dissecção no poço mais inferior até que todas as partículas alimentares tenham sido lavadas. Após o enxágue, mova as larvas limpas para o meio bem.
- Usando uma pinça, segure a larva pelos ganchos da boca. Com o outro conjunto de pinças, rompa um lado da cutícula da larva.
- Essa ruptura fará com que os corpos gordurosos se espalhem para fora da larva. Os corpos gordurosos são esbranquiçados e semitranslúcidos e terão estrutura em forma de rede (Figura 3I). Os corpos gordos também tenderão a grudar em si mesmos e nas pinças de dissecção. Uma vez identificado, colete o máximo de gordura possível de cada larva e transfira-o com a pinça para o poço superior com 400 μL de meio de dissecção RT.
4. Dissecção cerebral larval (Figura 3)
- Lavar as larvas experimentais em dissecção e meio de imagem como acima para libertá-las de resíduos alimentares. Para melhores resultados, evite armazenar larvas não dissecadas na solução de dissecção. Isso fará com que as larvas "se afoguem" e afetará negativamente a qualidade dos cérebros dissecados.
- Usando uma pinça, segure a larva pelos ganchos da boca. Com outro conjunto de pinças, corte/rasgue suavemente aproximadamente 1/3 da larva do lado posterior (Figura 3A). Isso fará com que elementos do trato digestivo, corpos adiposos, tecido conjuntivo e sistema nervoso "estourem" do lado rompido da larva (Figura 3B).
- Usando uma pinça, segure a larva pelos ganchos da boca. Com o outro conjunto de pinças, escove suavemente a cutícula em direção aos ganchos da boca enquanto "empurra" para dentro com a pinça segurando os ganchos da boca até que toda a larva seja virada do avesso. Esse movimento é semelhante a virar uma meia "do avesso" (Figura 3C, D).
- Inverta a larva para que o sistema nervoso central e outros tecidos fiquem voltados para fora enquanto ainda estão conectados à cutícula. Nesta etapa, localize o sistema nervoso central (SNC) para evitar a remoção acidental. Com o uso de uma pinça, remova suavemente todo o tecido não pertencente ao SNC, deixando apenas o SNC e o cérebro presos à cutícula (Figura 3E).
- O cérebro será ligado à cutícula através de conexões axonais. Usando tesouras de microdissecção, corte essas conexões axonais para liberar o cérebro da cutícula. Para fazer isso, primeiro corte suavemente abaixo dos lobos cerebrais (Figura 3F). Repita com as conexões sob o cordão nervoso ventral.
NOTA: Esta etapa pode ser feita com pinças se a tesoura de microdissecção não estiver disponível. Tome cuidado especial ao usar pinças para garantir que o tecido cerebral não seja esticado demais durante a remoção da cutícula, porque o estresse mecânico afetará negativamente a saúde do cérebro. - Transfira o cérebro dissecado para um poço com dissecção e meio de imagem. Para experimentos de imagem com mais de 3 h, use dissecção e meio de imagem suplementado com corpos gordurosos como descrito acima. Dissecar as larvas em lotes para manter o tempo de dissecção inferior a 20 min.
5. Montagem e geração de imagens (Figura 4)
- Para aquisição de imagens com uma lâmina34 ligada à membrana:
- Coletar cérebros dissecados e corpos gordurosos isolados no último poço da placa de dissecação.
- Monte metade da lâmina colocando uma membrana permeável a gás sobre a parte de trás da lâmina e pressione o anel dividido no centro, mantendo-o no lugar (Figura 4A-C).
- Usando uma micropipeta de 200 μL, transfira até 10 cérebros dissecados e o máximo de corpo gordo possível (veja acima) em ~130-140 μL de dissecção e meio de imagem para a membrana. Certifique-se de depositar o meio com as amostras no centro da membrana permeável a gás (Figura 4D, E).
- Orientar os cérebros para a população de RNs a serem imageados e para o tipo de microscópio a ser utilizado (Figura 4E). Posicione a amostra o mais próximo possível da objetiva do microscópio. Por exemplo, para obter imagens de RNs nos lobos cerebrais centrais, oriente os cérebros de tal forma que os lobos cerebrais estejam mais próximos da objetiva (Figura 4H).
- Uma vez que os cérebros estão orientados, coloque suavemente uma tampa de vidro em cima da solução na membrana. Isso fará com que a solução contendo os cérebros e corpos gordurosos se espalhe por toda a membrana (Figura 4F).
- Limpe a solução excessiva segurando um tecido de laboratório perto da borda da lamínula. A quantidade ideal de solução é alcançada quando os cérebros tocam a lamínula sem serem esmagados. Se a reorientação for necessária nesta etapa, mova cuidadosamente a tampa para mover os cérebros.
- Imobilize a lamínula aplicando vaselina derretida ao longo das bordas da lamínula com um pincel. Deixe a geleia solidificar (Figura 4G).
- Para aquisição de imagens com uma lâmina de imagem de vários poços (Figura 4):
- Adicionar 400 μL de meio de imagem a um poço de uma lâmina de vários poços (no experimento aqui realizado, uma micro[μ]-lâmina de câmara de 8 poços foi usada; Figura 4I). Transferir os corpos gordurosos previamente dissecados para este poço (ver passo 3.4).
- Deposite até 10 cérebros em um aglomerado próximo ao centro do poço (Figura 4J).
- Orientar os cérebros para a população de RNs a serem imageados e para o tipo de microscópio utilizado, conforme descrito no passo 5.1.4 (Figura 4K). Organize as amostras de modo que fiquem próximas umas das outras. Isso minimizará a distância que o estágio deve se mover entre as amostras, o que reduz a deriva da amostra durante a aquisição.
- Uma vez que os cérebros foram orientados no poço, permita que os cérebros se acomodem por 2-5 min. Isso aumenta sua estabilidade durante o transporte/imagem. Preparar o microscópio para aquisição durante este tempo.
- Cubra a μ-slide com a tampa da lâmina e transfira-a para o microscópio. Comece a aquisição com a menor potência de laser e tempo de exposição possível para minimizar o fotoclareamento.
6. Melhores práticas de processamento e gerenciamento de dados
- Processar os dados conforme necessário de acordo com o software de análise disponível.
- Para o exemplo mostrado aqui, salve os dados adquiridos com o software SlideBook como um arquivo de imagem do SlideBook (.sld).
- Para converter em tipo de arquivo proprietário do Ismiris (.ims) usando o Imaris File Converter, abra o Imaris File Converter em uma janela separada. Clique e arraste os arquivos .sld para a seção "entrada" do Imaris File Converter.
- Determine o local de saída desejado para os arquivos convertidos e clique em "Iniciar tudo".
- Após a conversão, visualize e anote os dados no software Imaris.
NOTA: Alternativas para análise de imagens podem ser usadas no lugar de Imaris, como Fiji (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html), Aivia (https://www.aivia-software.com/), Volocity (https://www.volocity4d.com/), ou outros.
- Retenha o máximo possível dos dados originais para manter registros adequados. Por exemplo, se o software de aquisição for salvo em um formato de arquivo, mas for convertido em um formato diferente para análise, mantenha a versão adquirida dos dados.
- Para análise de dados, mantenha um registro do maior número possível de detalhes sobre a amostra e as configurações de aquisição. As principais informações a serem retidas, incluem o genótipo das larvas dissecadas, a idade das larvas antes da dissecção, o estado da tampa da refeição em que foram criadas, a potência do laser usada durante a imagem, o tempo de exposição, o tempo de aquisição e a resolução temporal.
7. Exemplo de quantificação do comprimento do ciclo celular (Figura 5)
NOTA: neste exemplo, larvas expressando o marcador de polaridade Pins (Pins::EGFP16) e a proteína de ligação a microtúbulos Júpiter25 (cereja::Júpiter13) foram fotografadas. A análise subsequente foi realizada utilizando-se o software Imaris.
- Abra o filme usando o software de análise de imagem de sua escolha. Percorra a duração do filme para identificar NBs em divisão e rotule-os para referência futura. Identificar os RNs em divisão por seus distintos fusos mitóticos (Figura 5C-E).
- Identifique um estágio do ciclo celular de referência para determinar o comprimento do ciclo celular. Neste exemplo, a metáfase é usada como referência.
- Determine manualmente o número de quadros entre metáfases sucessivas e converta-o em minutos ou horas para determinar o tempo necessário para completar um ciclo celular.
- Faça isso pegando a resolução temporal do filme e multiplicando-a pelo número de quadros entre as metáfases. Por exemplo, se a resolução temporal do filme é de um quadro a cada 5 min, e as metáfases são observadas no quadro 13 e no quadro 35, o tempo entre essas metáfases seria de 110 min ([35 − 13] × 5).
- Plote os dados com qualquer software apropriado. Os dados aqui apresentados foram plotados utilizando o software PRISM.
8. Exemplo de quantificação do alinhamento do fuso celular (Figura 5)
Observação : neste exemplo, a análise é executada usando o software Imaris.
- Abra o arquivo de filme no Imaris ou em outro software de sua preferência. Percorra a duração do filme para identificar NBs em divisão e rotule-os para referência futura.
- Determinar o vetor formado pelos polos do fuso utilizando os centrossomos apicais e basais (representados por m), da seguinte forma:
onde Ax, Ay e Az são as coordenadas do centrossomo apical, e Bx, By e Bz são as coordenadas do centrossomo basal. Da mesma forma, o eixo do vetor de divisão (representado por n) é formado pelo ponto médio dos pinos apicais::EGFP crescente e o córtex basal:
onde Ax, Ay e Az são as coordenadas do ponto médio dos Pinos::EGFP crescente, e Bx, By e Bz são as coordenadas do ponto médio do córtex basal. - Determine a magnitude dos vetores m e n:
Magnitude de m:
Magnitude de n:
- Determine o produto ponto (representado por k) de m e n:
- Usando o produto ponto k e as magnitudes vetoriais m e n, determine o ângulo entre os vetores:
- Plote os dados no software de escolha. Os dados aqui apresentados foram preparados no Microsoft Excel e visualizados no PRISM.
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Representative Results
Dissecção e imagem de NBs do lobo cerebral central expressando Pins::EGFP e Cherry::Jupiter
Para mostrar este protocolo, larvas expressando Cherry::Jupiter13 e endogenamente marcadas Pins::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pinos::EGFP/TM6B, Tb) foram fotografados por 4 h usando o protocolo descrito usando lâminas de imagem de múltiplos poços (Figura 5C,D). Dados adicionais foram obtidos de larvas expressando Cherry::Jupiter13 e endogenamente marcadas Miranda::EGFP (w; worGal4, UAS-cherry::Zeus/CyO; UAS-Miranda::GFP/TM6B), que foram fotografadas por 10 h usando uma lâmina ligada à membrana (Figura 5E,F). As larvas foram criadas em gaiolas conforme descrito na seção 1 deste protocolo. Ao atingir 72-96 h de idade, as larvas foram dissecadas (Figura 3), montadas (Figura 4) e imageadas. Para os experimentos aqui realizados, utilizou-se um laser de 561 nm a 10% de potência do laser com 100 ms de tempo de exposição, e um laser de 488 nm a 15% de potência do laser com 100 ms de tempo de exposição. Pilhas Z (41 μm) foram adquiridas com um tamanho de passo de 1 μm. As imagens foram adquiridas a cada 5 min no RT em um sistema confocal de disco giratório Intelligent Imaging Innovations (3i), consistindo de uma unidade de disco giratório Yokogawa CSU-W1 e duas câmeras Prime 95B Scientific CMOS. Uma objetiva de imersão em óleo de 60x/1,4NA montada em microscópio Nikon Eclipse Ti foi usada para a obtenção de imagens. Os voxels de imagem ao vivo foram 0,22 μm x 0,22 μm x 0,75 μm (disco giratório de 60x/1,4NA).
Consistente com relatos anteriores16, os Pinos formaram um crescente apical pronunciado na divisão dos RNs durante a mitose, e os fusos mitóticos consistentemente alinhados a esse crescente apical (Figura 5C). O comprimento do ciclo celular foi determinado medindo-se o tempo entre as metáfases sucessivas dos RNs individuais (Figura 5D,F).
Nas amostras que foram obtidas em lâmina multipoço por 4 h sem suplementação de corpo gorduroso, o comprimento do ciclo celular aumentou com o aumento do tempo de aquisição de imagens (Figura 5C,D). As amostras que foram fotografadas em meio de corpo gorduroso suplementado em uma lâmina ligada à membrana não mostraram um aumento no comprimento do ciclo celular (Figura 5E, F). Além disso, foram observados RNs com quatro divisões na lâmina de 10 h ligada à membrana (Figura 5D vs. Figura5F).
Por fim, o ângulo entre o eixo de divisão e o fuso mitótico foi determinado usando Pinos marcados com GFP como referência (esquema mostrado na Figura 5G). O eixo de divisão foi determinado identificando-se o ponto médio do crescente apical formado pelos pinos em mitose e bissetrizando-se a célula ao meio (Figura 5G, linha tracejada vermelha). Como descrito anteriormente, os RNs selvagens exibiam fusos mitóticos orientados a não mais de 30° do eixo de divisão (Loyer e Januschke36 e Figura 5H).
Figura 1: Materiais. (A) Microscópio de dissecção. (B) Gaiola de coleta contendo moscas do genótipo desejado e tampa de farinha com larvas em crescimento. (C) Dissecção e meio de imagem, 5 mL. (D) Tampas de farinha com larvas de três coleções diferentes. (E,E') Ferramentas de microdissecção, da esquerda para a direita: tesoura de microdissecção, pinças. (F,F') Placa de dissecação. (G) Uma lâmina de μ de 8 poços para obtenção de imagens das amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplo de tampas de refeição. (A) Dois frascos para injetáveis com moscas machos e fêmeas a cruzar, uma gaiola de recolha de embriões vazia e uma tampa de refeição fresca. (B) O fundo da gaiola de coleta de embriões com a nova tampa de refeição (esquerda) e o topo da gaiola com moscas (direita). (C) A gaiola de mosca totalmente montada. (D) Um exemplo de uma tampa de refeição bem encenada com larvas para dissecção. Observe que o alimento é perturbado pelas larvas, mas não superperturbado. (E,F) Dois exemplos de tampas de refeição superlotadas de 4 dias de idade. Note que esse alimento agora tem uma consistência semelhante a uma sopa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Dissecção . (A) Vista dorsal de uma larva de terceiro ínstar. A linha vermelha na extremidade posterior da larva indica onde o primeiro corte deve ser feito. (B) Vista dorsal da larva após a remoção da extremidade posterior. (C) Diagrama mostrando como inverter a larva. Usando um conjunto de pinças, segure a larva pela cutícula perto de onde o primeiro corte foi feito. Usando a outra pinça, pressione a extremidade anterior da larva para inverter. As setas pretas denotam a direção da pinça, com uma "empurrando" as larvas pelo lado anterior e a outra movendo a extremidade posterior do corte em direção à extremidade anterior. A seta vermelha menor denota um desenho animado de corpos gordos. (D) Vista de uma larva invertida com os corpos gordurosos e trato digestivo ainda aderidos. (E) Vista de uma larva invertida com o tecido não pertencente ao SNC removido. A linha tracejada vermelha delineia o cérebro ainda ligado. (F) Esquema mostrando como remover o cérebro da cutícula. A linha tracejada vermelha indica o caminho a ser cortado com tesoura de microdissecção para liberar o cérebro da cutícula invertida, e as setas pretas denotam a remoção do cérebro da cutícula. (G) Visão do cérebro invertido que ainda está aderido à cutícula por um pequeno número de conexões axonais sob o cordão nervoso ventral (CNV). (H) Um cérebro larval isolado. Os lóbulos cerebrais são delineados com linhas laranjas tracejadas. (I) Corpos gordurosos isolados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Montagem e geração de imagens. (A) Vista dos componentes para montagem de uma lâmina metálica ligada à membrana. (B) Esquema dos componentes da lâmina ligada à membrana e sua montagem. (C) Vista lateral da membrana inserida na lâmina metálica, mantida no lugar pelo anel metálico bipartido. (D) Vista superior da lâmina de imagem montada sem uma lamínula. O meio de dissecção e imagem contendo corpos gordurosos e cérebros dissecados foi colocado sobre a membrana. (E) Visão ampliada dos corpos gordos e cérebros na gota do meio. (F) Vista superior da lâmina de metal após a adição da tampa de vidro. (G) Vista superior da lâmina montada com a tampa de vidro fixada à lâmina com vaselina derretida. Cobrir as bordas da lamínula com vaselina também evita a evaporação do meio. (H) Esquema da lâmina de membrana montada com cérebros orientados para observação em microscópio invertido. Os círculos azuis denotam RNs nos lobos cerebrais centrais e CNV. (I) Vista de um slide vazio de vários poços. (J) Vista ampliada de um poço da lâmina de imagem de vários poços. (K) Esquema mostrando a orientação do cérebro para obtenção de imagens dos lobos cerebrais centrais em microscópio invertido com lâmina de múltiplos poços. Os círculos azuis denotam RNs nos lobos cerebrais centrais e CNV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Quantificação do comprimento do ciclo celular . (A) Diagrama de um cérebro larval de terceiro ínstar, destacando os lobos cerebrais, o lobo óptico (OL, cinza escuro), o cordão nervoso ventral (VNC), NBs (azul escuro), GMCs (azul claro) e neurônios (roxo) dentro dos lobos cerebrais centrais e VNC. (B) Esquema das divisões NB e GMC. (C) Série de imagens de um RN selvagem com microtúbulos marcados em branco (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) e pinos apicais (Pins::EGFP em verde) fotografados em uma lâmina de poço múltiplo sem suplementação de corpo gorduroso por 4 h. Imagens mescladas e a árvore de linhagem correspondente com o tempo do ciclo celular são mostradas abaixo. Barra de escala = 10 μm. (D) Quantificação do comprimento do ciclo celular (metáfase - metáfase) para a primeira, segunda e terceira divisões em amostras fotografadas em lâmina de poço múltiplo sem corpos gordurosos. (E) Série de imagens de um RN selvagem com microtúbulos marcados em branco (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) fotografada com uma lâmina ligada à membrana com suplementação de corpo gorduroso por 10 h com a árvore de linhagem correspondente e o tempo do ciclo celular mostrados abaixo. Barra de escala = 10 μm. (F) Quantificação do comprimento do ciclo celular (metáfase - metáfase) para a primeira, segunda, terceira e quarta divisões em amostras fotografadas em uma lâmina ligada à membrana com corpos adiposos. (G) Esquema de como foi determinado o ângulo entre o eixo do fuso (linha tracejada laranja) e o eixo da divisão (θ, linha tracejada vermelha). (H) Quantificação de θ a partir de 10 células fotografadas usando uma lâmina de poço múltiplo sem corpos gordurosos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve uma abordagem para a obtenção de imagens de cérebros vivos de explantes de larvas de Drosophila melanogaster . O protocolo aqui descrito permite que cérebros de explantes sejam observados por 12-20 h sob as condições experimentais adequadas. Atenção especial deve ser dada à preparação das amostras e ao planejamento dos experimentos desejados. Como mencionado acima, um dos fatores mais críticos que determinam a qualidade do tecido dissecado é a saúde das larvas. Para alcançar a mais alta qualidade possível, deve-se garantir que as larvas sejam bem alimentadas antes da coleta. Larvas insalubres originam-se mais comumente da superlotação. Para resolver isso, é preciso garantir que a superlotação seja minimizada, seja aumentando a frequência de colheita ou dividindo pratos com ovos recém-postos com um prato vazio.
Outro elemento crítico deste protocolo é o método de dissecção para isolar o tecido cerebral. O cérebro e os RNs dentro deles são extremamente sensíveis a fatores externos, como a temperatura do meio de dissecção e a invasividade da própria dissecção. Meio muito frio tenderá a despolimerizar os microtúbulos. Da mesma forma, uma dissecção que estica ou rompe o cérebro terá efeitos prejudiciais sobre a qualidade dos RNs. Para evitar isso, deve-se evitar puxar o tecido cerebral diretamente e, em vez disso, ancorar as ferramentas de dissecção na cutícula ou outro tecido. As tesouras de microdissecção auxiliam muito nesse sentido, pois puxam minimamente o tecido cerebral. Se a tesoura não estiver disponível, uma pinça pode ser usada para remover cuidadosamente o tecido de conexão entre o cordão nervoso ventral e a cutícula.
Este protocolo apresenta dois métodos para montagem de cérebros larvais para microscopia confocal. Do ponto de vista técnico, a montagem de amostras em uma lâmina de vários poços é mais simples do que a montagem em uma lâmina ligada à membrana. No entanto, cada método é mais adequado para diferentes tipos de experimentos. Os dados mostrados aqui demonstram que, para filmes mais curtos (isto é, menos de 4 h) ou filmes com alta resolução temporal (isto é, adquirindo uma pilha z a cada 10 s), a imagem em uma lâmina de vários poços é suficiente para observar múltiplas divisões no cérebro central da larva. Para janelas de aquisição mais longas, a montagem em uma lâmina ligada à membrana é ideal, pois as amostras preparadas dessa forma se dividem com mais frequência ao longo do filme. Normalmente, os RNs larvais selvagens dividem-se uma vez a cada 40-90 min13. Embora lâminas de poços múltiplos possam ser usadas para filmes longos (> 4 h), um aumento na duração do ciclo celular e uma diminuição na proliferação de RNs têm sido observados nessa condição (Figura 5D). Portanto, o método usado para montar amostras e o tipo de dados a serem medidos devem ser considerados ao projetar experimentos.
Esse protocolo recomenda a obtenção de imagens de vários cérebros em um poço ou lâmina, pois isso aumenta a eficiência da coleta de dados para qualquer experimento. No entanto, a orientação e a colocação dos cérebros dentro do poço afetarão o quanto a mudança ocorre ao longo do filme devido ao estágio se movendo entre as posições cerebrais. Agrupar os cérebros em um local centralizado em um poço minimiza esse problema. No entanto, algumas mudanças podem ocorrer ao longo de filmes mais longos em experimentos usando slides de vários poços. Em muitos casos, o deslocamento observado nesses filmes mais longos é mínimo e pode ser corrigido durante a análise. O movimento cerebral também é evitável usando uma configuração de lâmina de metal porque as forças capilares impedem que os cérebros dissecados se desloquem.
Com uma lâmina de vários poços, é tecnicamente possível realizar experimentos de imagem de vários poços. No entanto, isso requer ajustes no tamanho da pilha e na resolução temporal para levar em conta o tempo extra gasto pelo microscópio movendo-se entre as posições. Isso pode ser benéfico para experimentos de triagem genética em larga escala, onde se pode obter imagens de vários genótipos em diferentes poços.
Há casos em que os cérebros exibirão pouca ou nenhuma divisão de NBs ao longo de um experimento. Isso provavelmente se deve a vários fatores que dependem da natureza da amostra a ser fotografada, da qualidade do alimento usado para criar as larvas, da qualidade da dissecção e das configurações de aquisição usadas para gerar os dados. Embora seja aconselhável remover o máximo de tecido possível ao preparar cérebros larvais para exames de imagem, é desaconselhável podar o cérebro em excesso para minimizar o estresse mecânico, pois isso pode afetar negativamente a qualidade dos dados. Além disso, a exposição frequente a poderosos lasers de imagem terá um impacto negativo na saúde dos neuroblastos. Assim, deve-se considerar o ajuste da potência do laser, do tempo de exposição e da frequência da imagem ao coletar os dados da imagem.
Para a montagem de amostras, podem ser utilizados métodos alternativos. Por exemplo, cérebros de explantes podem ser montados em uma matriz sólida37. A disponibilidade de diferentes protocolos de montagem oferece uma oportunidade para obter imagens de explantes cerebrais de larvas em uma ampla variedade de microscópios.
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Disclosures
Os autores não têm divulgações financeiras a declarar.
Acknowledgments
Esta pesquisa é apoiada por R35GM148160 (C. C.) e um National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R. C. S)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
References
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