Summary
Rekombinant adeno-associeret virus (rAAV) anvendes i vid udstrækning til klinisk og præklinisk genlevering. En undervurderet anvendelse til rAAV'er er den robuste transduktion af dyrkede celler uden behov for oprensning. For forskere, der er nye inden for rAAV, leverer vi en protokol til transgen-kassettekloning, råvektorproduktion og transduktion af cellekultur.
Abstract
Rekombinante adeno-associerede virale vektorer (rAAV) kan opnå potent og holdbar transgenekspression uden integration i en bred vifte af vævstyper, hvilket gør dem til et populært valg til genlevering i dyremodeller og i kliniske omgivelser. Ud over terapeutiske anvendelser er rAAV'er et nyttigt laboratorieværktøj til levering af transgener, der er skræddersyet til forskerens eksperimentelle behov og videnskabelige mål i dyrkede celler. Nogle eksempler inkluderer eksogene reportergener, overekspressionskassetter, RNA-interferens og CRISPR-baserede værktøjer, herunder dem til genom-wide screens. rAAV-transduktioner er mindre skadelige for celler end elektroporation eller kemisk transfektion og kræver ikke noget specielt udstyr eller dyre reagenser at producere. Rå lysater eller konditionerede medier indeholdende rAAV'er kan tilsættes direkte til dyrkede celler uden yderligere oprensning for at transducere mange celletyper - et undervurderet træk ved rAAV'er. Her leverer vi protokoller til grundlæggende transgen-kassettekloning og demonstrerer, hvordan man producerer og anvender rå rAAV-præparater på dyrkede celler. Som bevis for princippet demonstrerer vi transduktion af tre celletyper, der endnu ikke er rapporteret i rAAV-applikationer: placentaceller, myoblaster og tyndtarmorganoider. Vi diskuterer passende anvendelser til rå rAAV-præparater, begrænsningerne af rAAV'er til genlevering og overvejelser om valg af capsid. Denne protokol skitserer en enkel, billig og effektiv metode for forskere til at opnå produktiv DNA-levering i cellekultur ved hjælp af rAAV uden behov for besværlige titrerings- og oprensningstrin.
Introduction
Belysning af de molekylære baser af cellulære funktioner kræver ofte ekspression af transgent DNA i cellekultur. For at blive udtrykt skal transgener trænge gennem en celles selektive membran og nå kernen 1,2. Derfor er evnen til effektivt at omgå cellens fysiske barrierer og manipulere dens centrale processer en nødvendighed for at anvende transgenese til at afdække nye biologiske fænomener. En tilgang udnytter virussens iboende evne til at levere og udtrykke fremmed DNA 3,4.
Adeno-associeret virus (AAV) er en af de mindste pattedyrvirus: dens 4,7 kilobase (kb), enkeltstrengede DNA-genom indeholder to gener, rep (for replikation) og cap (for capsid), pakket inde i et 60-mer icosahedral capsid, der måler 25 nm. Rep / cap-generne har flere promotorer, læserammer og splejsningsprodukter, der koder for mindst ni unikke proteiner, der kræves til viral replikation, produktion og emballering 5,6. Derudover indeholder begge ender af genomet sekundære strukturer kaldet inverterede terminale gentagelser (ITR'er), der er nødvendige for DNA-replikation, genompakning og nedstrømsbehandling under transduktion 7,8,9,10. ITR'erne er de eneste DNA-elementer, der kræves til emballering af genomet i kapsiden, og derfor kan AAV klones til transgenleveringsformål ved at erstatte de virale rep / cap-gener med en forskers valg af regulatoriske elementer og / eller gener af interesse6. Den resulterende rekombinante AAV (rAAV), med et konstrueret vektorgenom (VG), anvendes i vid udstrækning i klinikken for human genterapi og har samlet succeser11. En undervurderet brug af vektoren er i laboratoriet; rAAV'er kan effektivt opnå transgenekspression i dyrkede celler for at opfylde en forskers eksperimentelle behov12.
Den mest almindelige metode til fremstilling af rAAV er ved triple-plasmidtransfektion til HEK293- eller 293T-celler (figur 1). Det første plasmid, almindeligvis kaldet cis-plasmidet, indeholder det ønskede transgen flankeret af ITR'er (pAAV). Afhængigt af applikationen kan cisplasmider med fælles elementer, såsom stærke promotorer eller CRISPR-baserede værktøjer, købes. Den anden er pRep / Cap-plasmidet, der indeholder vildtype AAV-rep- og cap-gener, der leveres i trans - dvs. på et separat, ikke-ITR-indeholdende plasmid, der udtrykker regulatoriske og strukturelle elementer, der derefter interagerer med cis-plasmidet - og kaldes således transplasmidet. Ud over fysisk at omslutte VG påvirker kapsiden cellulær tropisme12,13. Ved at levere det serotype-specifikke cap-gen in-trans er forskere let i stand til at maksimere transduktionseffektiviteten ved at vælge en optimeret capsid-serotype til deres givne målcelle. Endelig kræver AAV som et Dependoparvovirus en hjælpervirus for at aktivere rep / cap-ekspression fra sine virale promotorer, opnået ved adenovirale hjælpergener, tilvejebragt på et tredje plasmid såsom pAdΔF614,15. Efter 72 timers triple-plasmidtransfektion kan vektoren frigives fra producentceller til kulturmediet ved gentagne fryse-/optøningscyklusser. Hele pladens indhold opsamles derefter, og store cellulære affald fjernes ved centrifugering; den resulterende mediesupernatant er et råt rAAV-præparat, der er klar til downstream-transduktioner.
Figur 1: Oversigt over produktion af rå rAAV-vektorer. Rå rAAV produktion og transduktion kan udføres inden for 5 dage. Klik her for at se en større version af denne figur.
rAAV kan være mere gunstig for transgenlevering sammenlignet med andre transfektionsmetoder, som almindeligvis er forbundet med cellulær toksicitet, lav effektivitet og dyre reagenser og udstyr, såsom til elektroporation eller kemisk / lipidbaseret transfektion16,17. rAAV omgår disse forhindringer og giver ofte potent transgenekspression med minimal toksicitet og minimal praktisk tid. Det er vigtigt, at produktion af rAAV og anvendelse af det i cellekultur er enkel og sjældent kræver rensning af vektoren fra kulturmediet (figur 1). Derudover integrerer rAAV ikke sin VG i værtsgenomet, i modsætning til lentiviral transgenlevering, og sænker dermed risikoen for insertionel mutagenese18. På trods af de potentielle fordele ved at bruge rAAV til transgenlevering skal begrænsninger overvejes. Det er vigtigt, at transgenets størrelse, herunder ITR'erne, ikke overstiger 4,9 kb på grund af kapsidets fysiske begrænsninger, hvilket begrænser en forskers evne til effektivt at levere store regulatoriske elementer og transgener. Da rAAV desuden er en ikke-integrerende virus, resulterer transduktion i forbigående transgenekspression i delende celler og er muligvis ikke praktisk til stabil ekspression. Imidlertid kan metoder, der bruger dobbelt rAAV-leveret Cas9 og homologi-rettet reparation (HDR) skabeloner, bruges til stabilt at indsætte sekvenser på specifikke genomiske loci, hvis en forsker ønsker19.
Protocol
1. Plasmid erhvervelse
BEMÆRK: Denne protokol vil klone et gen af interesse (GOI) i et ITR-indeholdende plasmid med en cytomegalovirus (CMV) promotor og en SV40 poly-adenyleringssekvens (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40). Dette plasmid kan dog bruges uden yderligere kloning til fremstilling af rAAV'er og pakker en praktisk dobbelt EGFP- og Luciferase-reporter. Plasmider med forskellige regulatoriske elementer eller til forskellige applikationer, såsom til CRISPR-baserede eksperimenter, er tilgængelige online og vil følge lignende kloningstrin som dem nedenfor (se diskussion for yderligere kloningstrin). Derudover kan rep/cap eller transplasmider til forskellige serotyper bruges – denne protokol bruger rep/cap til AAV serotype 2.
- Køb bakteriestik, der indeholder et ITR-holdigt cis-plasmid , et adenovirushjælperplasmid, et rep/cap-plasmid og et plasmid, der indeholder en GOI. Stribe bakterierne på individuelle agarplader indeholdende antibiotika, der er specifikke for resistensen af hvert plasmid. Bakterierne inkuberes ved 30 °C natten over for at vokse.
BEMÆRK: Hvis et plasmid med en GOI ikke umiddelbart kan købes, kan et syntetisk DNA-fragment (se materialetabellen) købes online. Derudover kan et syntetisk DNA-fragment bruges til at springe hele PCR-processen over, hvis det ønskes. - Vælg en enkelt koloni fra hver plade og voks i 3 ml Luria Bertani (LB) buffer suppleret med det tilsvarende antibiotikum ved 30 ° C natten over, omrystning ved 180 o / min. 1 ml af bakterierne overføres til en steril 250 ml Erlenmeyerkolbe indeholdende 50 ml LB-buffer suppleret med det tilsvarende antibiotikum. Ryst ved 30 °C, 180 o/min natten over.
- Overfør bakterierne til et 50 ml konisk rør og centrifuger i 20 minutter ved 3.000 x g stuetemperatur. Kassér supernatanten. Isoler plasmidet ved hjælp af et endotoksin-lavt eller -frit midiprep-sæt i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: ITR'er er ustabile strukturer. For at forhindre ITR-deletioner eller mutationer bør bakterieceller dyrkes ved 30 °C for at bremse celledeling og afbøde replikationsfejl. For at øge plasmidudbyttet og renheden er et midiprep- eller maxiprep-sæt ideelt. Det anbefales at bruge et endotoksin-lavt eller -frit kit til at reducere nedstrøms endotoksinforurening af celler. Det er ikke nødvendigt at udføre plasmidisolering inde i en laminær strømningshætte, da kontaminering af plasmidpræparation ikke er sandsynlig, hvis den udføres på en standardbænk.
2. Kloning af gen af interesse i AAV ITR-indeholdende plasmid
- Åbn plasmidkortet, der indeholder GOI, i en DNA-visningssoftware.
BEMÆRK: Den fulde kassette, inklusive ITR'erne, bør ikke overstige 4,9 kb på grund af kapsidet fysiske emballagebegrænsninger. Derudover kan PCR-forstærkning ikke opnås gennem ITR'er på grund af sekundære strukturer. Som sådan anbefales Gibson-samling ikke til rAAV-transgenkloning.- Klik på fanen Sekvens for at afsløre plasmidets fulde sekvens. Rul til 5'-regionen i GOI-sekvensen, og klik på det første nukleotid , mens du trækker indad mod genkroppen for at skabe en fremadgående primer. Udslip, når smeltetemperaturen (Tm) på ~55 °C er nået.
- Klik på Forward Primer. Inkluder sekvensen manuelt for et EcoRI-begrænsningssted (5' GAATTC 3') i den 5' mest ende af primersekvensen. Derudover tilsættes seks ekstra tilfældige baser i 5' ende af dette restriktionssted for at give enzymet mulighed for effektivt at interagere med DNA'et. Klik på Tilføj primer. Se figur 2 for et repræsentativt eksempel.
- Kontroller primeren for at sikre, at den ikke kan danne hårnåle eller primerdimerer (undtagen begrænsningsstedet, der er palindromisk). Hvis hårnåle dannes, skal du ændre den tilfældige rækkefølge af de seks ekstra baser. Sørg desuden for, at primeren ikke binder andre steder på plasmidet.
- Gentag trinene for at skabe en omvendt primer i den 3' mest region af GOI indad til genkroppen. Klik på Reverse Primer og inkluder et NotI-begrænsningssted (5' GCGGCCGC 3').
BEMÆRK: GOI kan ikke indeholde EcoRI- eller NotI-restriktionssteder – hvis det er tilfældet, skal der anvendes forskellige restriktionsenzymer.
- GOI forstærkes i en 50 μL PCR-reaktion. Brug de nødvendige individuelle komponenter fra tabel 1.
- Placer reaktionen i en termocyklist, og følg cyklusparametrene fra tabel 2 for programmering. Hvis primere har forskellige T m, skal du bruge den nederste Tm til programmet.
- Kontroller amplifikation af korrekt PCR-fragment ved at tilsætte 1 μL gelbelastende farvestof (6x) til 5 μL PCR-reaktion. Kør en DNA-stige og PCR-blandingen på en 0,8% agarosegel indeholdende ethidiumbromid og visualiser med UV-lys.
FORSIGTIG: Ethidiumbromid er et kendt mutagen. - Hvis der vises et enkelt, specifikt bånd på gelen, skal du rense det resterende PCR-produkt i PCR-striprøret ved hjælp af et søjlebaseret PCR-oprydningssæt i henhold til producentens instruktioner. Hvis der vises flere bånd (på grund af ikke-specifik forstærkning), skal du punktafgifter det ønskede bånd og rense DNA'et ved hjælp af et gelekstraktionssæt i henhold til producentens instruktioner.
- Det rensede PCR-produkt og rygradsplasmidet pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 fordøjes i en 50 μL reaktion med de krævede individuelle komponenter fra tabel 3 i 1 time ved 37 °C. En større mængde pAAV-plasmid-DNA er påkrævet på grund af forventet ineffektiv genopretning efter gelekstraktion.
BEMÆRK: De anvendte restriktionsenzymer er high fidelity (HF) versioner. Regular NotI kan ikke bruges med CutSmart buffer. Hvis der anvendes forskellige enzymer, kan det være nødvendigt med en anden inkubationstemperatur og buffer.- Rens det fordøjede PCR-produkt med et søjlebaseret PCR-oprydningssæt i henhold til producentens instruktioner.
- Forbered det fordøjede pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 rygradsplasmid til gelelektroforese ved at tilsætte 10 μL gelbelastningsfarvestof (6x) til 50 μL fordøjelsesreaktion. Læg en DNA-stige, fordøjelsesreaktion og 250 ng ufordøjet plasmid (negativ kontrol) på en 0,8% agarosegel indeholdende ethidiumbromid med brønde med brede tænder. Visualiser med UV-lys, punktafgifter det ønskede fragment (~ 4.5 kb), og rens DNA'et ved hjælp af et gelekstraktionssæt i henhold til producentens anvisninger.
- Det fordøjede PCR-produkt og det fordøjede pAAV-backboneplasmid fyldes i en 20 μL ligeringsreaktion med de krævede individuelle komponenter fra tabel 4. For at beregne mængden af PCR-produkter, der er nødvendige, skal du bruge formel 1. Brug typisk et 3: 1 molært forhold mellem PCR-produkt (insert) og rygrad (pAAV) med en masse på 50 ng rygrad.
Formel 1 - Udfør en negativ kontrol ved at erstatte PCR-produktet med vand. Der inkuberes ligeringsreaktioner ved 16 °C natten over eller ved stuetemperatur i 2 timer.
- Optø et hætteglas med kompetente, rekombinationsmangelfulde bakterieceller (såsom Stbl3-celler) på is og læg 50 μL i et 1,5 ml rør. Tilsæt 3 μL af ligeringsreaktionen direkte på cellerne og inkuber på is i 30 minutter.
BEMÆRK: ITR'er er ustabile strukturer og kræver derfor rekombinationsmangelfulde bakteriestammer for at begrænse ITR-sletning og rekombinationshændelser. DH5α-celler kan anvendes intermitterende til formering (en eller to gange), men anbefales ikke til langvarig brug. ITR-integritet bør kontrolleres regelmæssigt efter midiprep-rensning.- Varmechok bakterierne i et 42 °C vandbad i 30 sek. og overfør derefter straks til is i 2 min. Der tilsættes 200 μL LB-buffer og rystes i 1 time ved 30 °C, 180 omdr./min.
- 125 μL af blandingen spredes på en agarplade med det tilsvarende antibiotikum og inkuberes natten over (~18 timer) ved 30 °C. Vælg flere kloner og læg hver i et sterilt plastkulturrør med 3 ml LB indeholdende det tilsvarende antibiotikum. Der inkuberes under omrystning natten over ved 30 °C, 180 o/min.
BEMÆRK: For at forhindre ITR-deletioner eller mutationer skal bakterieceller dyrkes ved 30 ° C for at bremse cellulær deling og afbøde fejl i replikation. Derudover bør mindre kolonier vælges, da de uden ITR'er kan have en vækstfordel i forhold til andre. - Der pipetteres 1,8 ml af hver kultur i et 2 ml rør og centrifugeres ved 6.000 x g i 3 minutter ved stuetemperatur. Isoler DNA'et ved hjælp af et miniprep-sæt. Opbevar de resterende 1,2 ml kultur ved 4 °C. Kontroller korrekte kloner ved DNA-sekventering eller diagnostisk restriktionsenzymfordøjelse.
BEMÆRK: Sanger-sekventering af skæret anbefales, men processivitet gennem ITR'er kan ikke opnås ved standardmetoder. ITR'er bør verificeres ved restriktionsfordøjelse som beskrevet nedenfor. - Der tilsættes 50 ml LB-buffer indeholdende det tilsvarende antibiotikum til en steril 250 ml Erlenmeyerkolbe. Der tilsættes 500 μL af den resterende kultur til kolben og rystes ved 30 °C, 180 o/min., indtil en OD600 på 0,2-0,5 er nået (~18 timer). Overfør bakterierne til et 50 ml konisk rør og centrifuger i 20 minutter ved 3.000 x g, 4 °C. Isoler DNA'et ved hjælp af et endotoksin-lavt eller -frit midiprep-sæt.
- Kontroller ITR-integriteten med 20 μL diagnostisk restriktionsenzymfordøjelse ved hjælp af XmaI (eller SmaI). Forbered en reaktion indeholdende 500 ng plasmid, 0,5 μL enzym og 1x buffer; Der inkuberes i 1 time ved 37 °C. Kør reaktionen på en 0,8% agarose-gel. Hvis ITR'er er intakte, vil fordøjelsen give et bånd på ~ 2.9 kb og et andet bånd på størrelse med kassetten. Hvis dette særskilte bånd ikke overholdes, er ITR muligvis ikke intakt, og kloning skal gøres om.
BEMÆRK: Plasmider, der indeholder XmaI (eller SmaI ) begrænsningssteder (ud over dem i ITR'erne), vil have yderligere bånd på gelen.
Formel 1
Figur 2: Repræsentativt eksempel på primerdesign. Fremad og omvendt primerdesign til et mScarlet transgen (repræsentativt eksempel). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Beløb | Komponent |
| X μL | Skabelon DNA (25 NG) |
| 1 μL | F-primer (10 μM) |
| 1 μL | R-primer (10 μM) |
| 1 μL | dNTP (10 mM) |
| 10 μL | Phusion buffer (5x) |
| 1 μL | Phusion Polymerase |
| X μL | Vand |
| 50 μL | Sidste bind |
Tabel 1: PCR-amplifikationsreagenser. De nødvendige komponenter til en vellykket PCR-reaktion.
| Skridt | Temperatur | Tidspunkt |
| Indledende denaturering | 98 °C | 1 min |
| 30 cyklusser | 98 °C | 10 sek. |
| Tm af primer | 30 s | |
| 72 °C | 30 sek. pr. KB | |
| Endelig forlængelse | 72 °C | 10 minutter |
| Holde | 4 °C | Uendeligt |
Tabel 2: Programmering af PCR-forstærkning. De nødvendige cykelparametre for en vellykket PCR-reaktion.
| Beløb | Komponent |
| X μL | PCR-produkt (1μg) eller pAAV-plasmid (3μg) |
| 5 μL | Buffer (10x) |
| 1 μL | EcoRI-HF |
| 1 μL | NotI-HF |
| X μL | Vand |
| 50 μL | Sidste bind |
Tabel 3: Nedbrydningsreagenser. De nødvendige komponenter til en vellykket fordøjelsesreaktion.
| Beløb | Komponent |
| X μL | Indsæt (X ng) |
| X μL | Rygrad (50 NG) |
| 2 μL | T4 DNA-ligasebuffer (10x) |
| 1 μL | T4 DNA-ligase |
| X μL | Vand |
| 20 μL | Sidste bind |
Tabel 4: Ligeringsreagenser. De nødvendige komponenter til en vellykket ligeringsreaktion.
3. Vektorproduktion med triple-plasmidtransfektion
BEMÆRK: Følgende værdier er optimeret for en enkelt brønd i en 6-brønds plade, der giver et endeligt råforberedelsesvolumen på 2 ml. Alle værdier kan skaleres op med 10x for en 15 cm plade, der giver et endeligt volumen på 20 ml eller skaleres ned med 4x for en 24-brønds plade med et slutvolumen på 500 μL.
- Lav en 1 μg / μL bestand af polyethylenaminhydrochlorid (PEI) MAX ved at opløse 100 mg PEI MAX i 100 ml destilleret vand. Juster pH til 7,1 med NaOH. Filtersteriliser blandingen med et 0,22 μm filter og frys 1 ml alikvoter ved -20 °C til langtidsopbevaring. Når reagenset er optøet, opbevares det i 1 måned ved 4 °C.
- Frø 3 x 10 5 HEK293 eller HEK293T celler i en 6-brønds plade med forvarmet Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM,4,5 g / L glucose, 110 mg / L natriumpyruvat) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). Voks til ~ 75% -90% sammenløb i en inkubator indstillet til 37 ° C og 5% CO2 (figur 3).
BEMÆRK: Celler dyrket med penicillin / streptomycin (P / S) er blevet observeret for at reducere vektorproduktionsudbyttet. Brug af korrekt steril teknik omgår behovet for at bruge P/S, og det anbefales derfor ikke at dyrke HEK293-celler med antibiotikum20. Hvis P/S er påkrævet i downstream-transduktioner, anbefales det at tilsætte P/S til råpræparatet efter høst. - I et 2 ml glas fremstilles en blanding indeholdende 1,3 μg pAAV2/2 (Rep/Cap, serotype 2), 1,3 μg pAAV.GOI, 2,6 μg pAdΔF6 og serumfri (SF) DMEM (4,5 g/l glucose, 110 mg/l natriumpyruvat) i et samlet volumen på 100 μL (se supplerende tabel 1 for praktiske beregninger).
- Forbered en negativ kontrol i et separat rør ved at erstatte pRep/Cap med et eventuelt ikke-relateret plasmid. Den negative kontrol tegner sig for uemballeret pAAV.GOI-plasmid, der er til stede i det rå præparat, og som muligvis kan transfektere celler under transduktion, selvom det er sjældent.
BEMÆRK: Endotoksin-lav eller -fri maxiprep eller midiprep plasmid er ideel til tredobbelt transfektion og producerer generelt højere titervektor sammenlignet med miniprep DNA, selvom miniprep DNA kan bruges til hurtig og beskidt foreløbig test. - Tilsæt 5,2 μL PEI MAX til plasmidblandingen; dette er en plasmid: PEI-blanding med et forhold på 1: 1. Bland godt ved at pulsere 10-15 gange på en hvirvelblander indstillet til 7. Hvis der fremstilles flere vektorpræparater, tilsættes PEI til hver plasmidblanding med forskudte tidsintervaller på 1 min (dvs. præparat 1 ved t = 0 min, præparat 2 ved t = 1 min osv.) for at muliggøre tilstrækkelig timing til at aspirere brønde og fortynde reaktionen i de følgende trin.
BEMÆRK: Et 1: 1-forhold mellem plasmid: PEI er blevet observeret at være optimalt. Individuelle brugere kan dog optimere dette forhold for maksimal effektivitet. Se diskussionen for, hvordan du udfører PEI-optimering (se også supplerende tabel 2). - Hvert glas inkuberes i nøjagtigt 15 minutter, og reaktionen fortyndes derefter med 1,9 ml SF DMEM (4,5 g/l glucose, 110 mg/l natriumpyruvat) i et slutvolumen på 2 ml. Afpipetter forsigtigt 2x for at blande. Overblanding vil forstyrre plasmid / PEI-komplekser og resultere i lavere transfektionseffektivitet.
- Aspirer medier fra brønden og tilsæt plasmid: PEI-blanding forsigtigt på brøndsiderne for at forhindre cellulær løsrivelse. Inkuber celler i 72 timer ved 37 °C og 5% CO2. Cellelyse og løsrivelse under inkubation er en normal proces med rAAV-produktion (figur 4).
Figur 3: HEK293-celler klar til transfektion. Den ideelle sammenflugt (75% -90%) af HEK293-celler, der er nødvendige for triple-plasmidtransfektion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: HEK293-celler efter transfektion. Udseendet af HEK293-celler før og efter 1, 2 eller 3 dage efter transfektion med pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2, pAdΔF6 og 1: 1-forholdet mellem plasmid: PEI . Skalabjælker: 400 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Høstning af rå vektorpræparater
- Hele pladen af transfekterede celler fryses i 30 minutter ved -80 °C, efterfulgt af optøning i 30 minutter ved 37 °C. Gentag i alt tre fryse-/optøningscyklusser. Fjern ikke låget – pladen skal forblive steril indeni. Pladerne kan forblive ved -80 °C, indtil de er klar til at gå videre til næste trin.
BEMÆRK: En ikke-befugtet inkubator fungerer bedst til optøning, hvilket minimerer kondens på ydersiden af plader, der kan føre til utilsigtet forurening. - Udfør følgende to trin i en laminær flowhætte ved hjælp af aseptiske teknikker. Bland hvert hul ved pipettering for at sikre maksimal forstyrrelse af cellerne. Overfør lysat til et 2 ml rør og centrifuger i 15 minutter ved 15.000 x g, stuetemperatur for at fjerne celleaffald.
- Supernatanten overføres forsigtigt til et nyt 2 ml glas. Dette rå præparat kan anvendes straks uden titrering eller rensning. Vector kan opbevares ved 4 °C i flere måneder eller -20 °C i årevis.
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, kan titere beregnes ved kvantitativ PCR (qPCR) ved at kvantificere antallet af vektorgenomer (VG) inde i DNase-resistente partikler. Som sådan angives titere i enheder af VG / ml. Vektor, der opbevares i flere måneder ved 4 °C, bør titreres igen før brug, da vektor kan samle og/eller binde rørvægge og reducere præparatets titer.
5. Transduktion
- Plade den ønskede celletype (f.eks. Huh7) i en 96-brønds plade ved en målsammenløb på 50% -75%, afhængigt af transduktionens varighed. Større sammenløb kan resultere i reduceret AAV-transduktionseffektivitet.
- Tilføj vektor (f.eks. CMV.mScarlet) til celler uden at kende titeren af det rå præparat til applikationer, hvor dosis ikke er relevant, såsom test af et panel af kapsider til transduktion i en ny celletype. Udfør en 1:3 fortyndingsserie af råpræparatet i serumfrie medier (SF) for at opnå den optimale mængde vektor, der kræves til applikationen. Opsug medier fra 96-brøndpladen, og tilsæt 50-100 μL fortyndet råpræparat til hullerne. Inkuber celler ved 37 °C og 5% CO2.
BEMÆRK: Serum kan indeholde antistoffer, der kan neutralisere AAV-vektoren og reducere transduktionseffektiviteten. Imidlertid kan serum anvendes under transduktion til følsomme celletyper. - Fjern vektor efter 48 timer efter transduktion (hpt) og vask celler en gang med forvarmet fosfatbufret saltvand (PBS). Vektorer kan også fjernes og erstattes med serumholdige medier så hurtigt som 2 hpt til følsomme celletyper. For mange applikationer skal du udføre inkubation natten over for at transducere celler og erstatte brønde med friske serumholdige medier om morgenen. Robuste celletyper, såsom Huh7 og U2-OS, kræver ikke medieændring.
- Transduktionen afsluttes ved at fiksere celler i 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 min. Forskellige termineringsmetoder kan også anvendes baseret på applikationen (f.eks. Lysis). For de fleste celletyper forekommer topekspression med 48 hpt og er således et almindeligt eksperimentelt endepunkt.
6. Variationer i transduktionsmetode efter celletype
BEMÆRK: Forskellige celletyper kræver forskellige dyrkningsbetingelser. Derfor bør tilsætning af vektor til transduktion optimeres ud fra celletypens behov. Nedenfor er meget specifikke transduktionsprotokoller for de celletyper, der er inkluderet i de repræsentative resultater, hvilket illustrerer nogle variationer af transduktionsprotokoller, som en forsker måske ønsker at prøve til deres egne behov.
- Mus tyndtarmsorganoider
- Udled tyndtarmsorganoider (mSIO'er med mus) fra en tyndtarmskryptpræparat fra C57BL/6J-mus. Organoider indlejres i 90% kældermembranmatrix og kultur i plader med 24 brønde, der indeholder enten organoidvækstmedium (uden antibiotika) eller prætransduktionsmedium (50% Wnt3a-konditioneret medium [produceret internt ved hjælp af L Wnt-3A-celler i organoidvækstmedium], 10 mM nikotinamid, 10 μM ROCK-hæmmer og 2,5 μM CHIR99021) i en passage (5-7 dage) før transduktion ved 37 °C og 5% CO2.
- Før transduktion skylles organoider med D-PBS, kældermembranmatrixkupler forstyrres ved pipettering, og organoider dissocieres i småcelleklynger ved at inkubere dem i dissociationsmedium i 10 minutter ved 37 °C og yderligere pipettering.
- Stop celledissociationsprocessen ved at tilføje 5% FBS i DMEM / F-12 med 15 mM HEPES, overfør celleklynger til centrifugerør og opsaml celleklynger ved centrifugering i 5 minutter ved 1000 x g, stuetemperatur.
- Celleklyngerne resuspenderes i transduktionsmedium (prætransduktionsmedium indeholdende 10 μg/ml polybren eller organoid vækstmedium indeholdende 10 μg/ml polybren) og overføres til plader med 48 huller, efterfulgt af tilsætning af AAV-råpræparater, der emballerer CMV.mScarlet til transduktion.
- Transduktion af organoider udføres ved centrifugering af pladen i 1 time ved 600 x g og 37 °C og inkuberes derefter ved 37 °C i yderligere 6 timer. Opsaml transducerede organoider i 1,5 ml mikrocentrifugerør, centrifuger i 5 minutter ved 1000 x g, stuetemperatur og læg dem på is.
- Efter fjernelse af supernatanten resuspenderes transducerede organoider i 90 % kældermembranmatrix i prætransduktionsmedium eller organoidt vækstmedium og frødråber på 20 μL i en hul i et forvarmet kammerdækglas.
- Efter inkubation i 10 minutter i inkubatoren anbringes dråben i 350 μL prætransduktionsmedium eller organoid vækstmedium og inkuberes ved 37 °C i inkubatoren. Bestem transduktionseffektiviteten 2-5 dage efter transduktion ved at afbilde de transducerede organoider på et konfokalmikroskop og estimere procentdelen af røde fluorescerende celler pr. Organoid.
- BeWo-celler
- Ved 24 timer før transduktion, plade human placenta choriocarcinom BeWo celler ved 10.000 celler pr. brønd af 96-brønd plade. Fortynd rå AAV-præparater, der emballerer CMV.mScarlet til 1:1 i serumfrit F12-K BeWo-medium op til et samlet volumen på 50 μL pr. hul. Opsug mediet fra brønden og udskift med 50 μL fortyndet AAV pr. hul.
- Inkuber celler ved 37 °C natten over (~18 timer), og tilsæt derefter 100 μL F12-K BeWo-medium indeholdende 10% FBS for at bringe det samlede volumen op til 150 μL. Inkuber celler i yderligere 6 timer i alt 24 timer efter transduktion (hpt).
- Til billeddannelse pletter levende celler med Hoechst-farvestof i 30 minutter i F12-K-medium, og ombyt derefter substratet med phenolfrit DMEM indeholdende 10% FBS, 1x glutamax supplement og 1x natriumpyruvattilskud til billeddannelse. Levende cellebilleder foretages på et konfokalmikroskop ved hjælp af DAPI- (til Hoechst-billeddannelse) og mCherry-filtersæt (til mScarlet-billeddannelse) med 37 °C og 5 % CO2.
- Hepa1-6 og Huh7 celler
- Plademurine Hepa1-6 leverceller og humane Huh7 leverceller i DMEM (4,5 g / L glucose, 110 mg / L natriumpyruvat, 10% FBS) ved 5.000 celler pr. Hul af en 96-brøndplade 24 timer før transduktion.
- Der tilsættes 50 μL ufortyndede rå AAV-præparater, der emballerer CMV.mScarlet, direkte til cellerne og inkuberes ved 37 °C i 48 timer. Cellerne vaskes én gang i PBS, fikseres i 4 % PFA, og der bejdes dem med Hoechst-farvestof i 10 minutter. Der foretages billeddannelse på et konfokalmikroskop ved hjælp af filtersættene DAPI (til Hoechst-billeddannelse) og mCherry (til mScarlet-billeddannelse).
- C2C12- og HSkMC-celler
- Plade udifferentieret murin C2C12 myoblaster og udifferentierede humane primære skeletmuskelceller (HSkMC) myoblaster ved 5.000 celler pr. Brønd i en 96-brøndplade, 72 timer før transduktion.
- Fortynd rå AAV-præparater, der pakker CMV.mScarlet til 1: 1 i DMEM (4,5 g / L glucose, Penn / Strep, 20% FBS) til C2C12 myoblaster eller skeletmuskulatur vækstmedier til HSkMC myoblaster. Differentier HSkMC myoblaster til myorør ved at ændre medierne til differentieringsmedier.
- Myoblaster og myorør inkuberes i fortyndede AAV-præparater i 24 timer ved 37 °C. Plet levende celler med Hoechst-farvestof i 10 minutter og billede på et konfokalmikroskop ved hjælp af filtersættene DAPI (til Hoechst-billeddannelse) og mCherry (til mScarlet-billeddannelse).
Representative Results
Find optimal capsid til transducering af dyrkede celler af interesse
En række celletyper blev transduceret for at bestemme tropismen af forskellige capsidserotyper (figur 5). De naturlige serotyper AAV214, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV9 24 og de konstruerede capsidvarianter Anc80 25, DJ 26, LK0327 ogKP1 28 blev pakket med et vektorgenom, der udtrykker mScarlet under en CMV-promotor, klonet ved hjælp af metoderne i denne protokol. Utitrerede rå vektorpræparater blev fortyndet i de relevante dyrkningsmedier, og celler blev transduceret i 24+ timer og afbildet (figur 5B). Transduktionseffektiviteten blev beregnet ved andelen af samlede celler, der var mScarlet+, eller andelen af celler i et enkelt z-plan, der var mScarlet+ (for tyndtarmsorganoider hos mus; Figur 5C). Transduktionseffektivitet (mScarlet+ celler) er ikke tilvejebragt for differentierede C2C12 og HSkMC myorør, men snarere for udifferentierede C2C12 og HSkMC myoblaster (figur 5A).
AAV2 og KP1 var de mest potente serotyper på tværs af cellelinjer, der blev testet (figur 5A). Det blev også observeret, at lignende celletyper, der stammer fra forskellige arter, transduceres med varierende effektivitet. For eksempel udviser Hepa1-6 (en murinafledt levercellelinje) et markant fald i transduktion sammenlignet med Huh7 (en humanafledt levercellelinje), når der anvendes AAV2 (figur 5B). Desuden spiller forskellige medieforhold en vigtig rolle under transduktion. Tyndtarmsorganoider (mSIO'er med mus), der dyrkes i prætransduktionsmedier, transduceres mindre effektivt sammenlignet med dem, der dyrkes i organoide vækstmedier (figur 5C). Derudover transducerer AAV2 effektivt udifferentierede HSkMC-myoblaster og differentierede HSkMC-myorør (figur 5B), selvom kvantitativ analyse af myorør er vanskelig og derfor ikke leveres.
Den høje transduktionseffektivitet, der er observeret for forskellige celletyper i figur 5 , viser, at rå vektorpræparater kan anvendes effektivt til at transducere en række celletyper uden yderligere trin såsom oprensning og titrering. Imidlertid bør der tages nøje hensyn til, når du vælger et capsid for at maksimere transgenlevering. Mange andre cellelinjer og kapsider er tidligere blevet testet og er offentliggjort, dog med oprensede vektorpræparater12.
En vektorpartikeluafhængig effekt af medieforhold kan påvirke effektiviteten af transduktion. Det er imidlertid generelt accepteret, at tropisme (dvs. celletypespecifik optagelse og ekspression af vektor) er en egenskab, der er kapsidspecifik29. En sammenligning mellem dosismatchede rå og oprensede præparater er endnu ikke blevet observeret for at påvirke cellulær tropisme. Derfor kan rå vektorpræparater anvendes på samme måde som rensede vektorer i cellekultur.
Figur 5: Rå vektortransduktion af forskellige celletyper . (A) Procentdel af mScarlet+ efter tilføjelse af forskellige AAV-vektorer, der indeholder et mScarlet-transgen . B) Celler, der udtrykker mScarlet leveret fra AAV serotype 2. Skalabjælker: 100 μm (Hepa1-6, Huh7, C2C12 og HSkMC), 200 μm (BeWo), 20 μm (mSIO). Forkortelser: hpt = timer efter transduktion. (C) Tyndtarmsorganoider med mus (mSIO'er) blev enten rAAV behandlet i prætransduktionsmedier eller organoide vækstmedier. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel 1: Regneark med tredobbelt plasmidtransfektion. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 2: PEI-optimeringsark. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Kloning
Kloningsprotokollen er ikke begrænset til plasmidet pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, der anvendes ovenfor, og kan let ændres baseret på en forskers eksperimentelle behov. Mange ITR-holdige plasmider er let tilgængelige online til køb. For eksempel er plasmider indeholdende både Cas9 og et sgRNA-kloningssted tilgængelige, men kræver få yderligere trin såsom oligonukleotidglødning og PNK-behandling30. Derudover kan plasmider, der indeholder et multipelt kloningssted (MCS) med kun ITR'er og ingen indre reguleringselementer, findes31. Hvis forskellige plasmider skal anvendes, er restriktionsenzymerne (RE), der anvendes til fordøjelsen, typisk de eneste elementer, der muligvis skal ændres i denne protokol. En begrænsning af rAAV er dog dens begrænsede lastkapacitet. På grund af kapsidet fysiske begrænsninger bør vektorgenomet ikke overstige 4,9 kb, inklusive ITR'erne.
Ved isolering af plasmid fra bakterier er det afgørende at anvende et endotoksin-lavt eller -frit midiprep- eller maxiprep-kit til at afbøde skade på celler under triple-plasmidtransfektion eller transduktion. Plasmid fra miniprep-sæt indeholder ofte højere urenheder, reducerede koncentrationer og færre supercoiled DNA, som alle kan påvirke downstream-produktionen af rAAV og anbefales derfor ikke.
Det er afgørende at forstå ITR's struktur og egenskaber under kloning. For det første er det ekstremt vanskeligt at bruge PCR gennem ITR. Kloningsdesign, der kræver PCR-forstærkning gennem ITR'er, bør undgås og desuden begrænse brugen af Gibson-samlingskloningsteknikken. Som sådan er restriktionsenzymkloning den foretrukne metode til kloning i ITR-holdige plasmider. Desuden er visse primere til Sanger-sekventering muligvis ikke kompatible, hvis det sekventerede område indeholder ITR. I stedet anbefales det at bruge primere, der sekvenserer væk fra ITR'erne og ind i vektorgenomlegemet for at få mere præcise sekventeringsresultater. For det andet er ITR'er tilbøjelige til deletioner, omlejringer og mutationer, når de omdannes til bakterier til plasmidamplifikation32,33. For at afbøde disse hændelser anbefales det at anvende kompetente bakteriestammer, såsom Stbl3, med rekombinationsmangel og inkubere dem ved 30 °C for at bremse celledelinger. Endelig er det blevet observeret, at mindre kolonier kan korrespondere med kloner uden omlejringer eller sletninger, da de uden ITR kan give en vækstfordel og være større. Derfor anbefales det at vælge kolonier, der er små.
Vektor produktion
Den vellykkede produktion af rAAV-vektor kan påvirkes af flere elementer. En kritisk faktor er sundheden for HEK293- eller 293T-celler, der anvendes til transfektion. Generelt er lave passagetal ideelle, da stærkt passerede celler kan udvise genotypiske og fænotypiske varianser, der kan reducere rAAV-titere. Derudover bør tætheden af de frøede celler være 75% -90% sammenløb for effektiv produktion. Sparsomme celler genererer lave vektorudbytter, fordi der er færre celler til rådighed til at producere vektorer, mens tilgroede celler ikke vil blive effektivt transfekteret.
Variationer mellem reagenspartier, cellebestande og generel lab-to-lab-variabilitet bidrager til forskelle i transfektionseffektivitet og produktionstiter. En optimerelig faktor, der kan føre til titerforbedringer, er plasmid: PEI-forholdet i transfektionsreaktioner. Det er vigtigt at bruge frisk (<1 måned gammel) PEI MAX. Det anbefales, at et plasmid:PEI-forhold på 1:1 anvendes som udgangspunkt, og hvis transfektions- eller transduktionseffektiviteten synes dårlig, skal du teste flere forskellige forhold. Titeroptimering er nemmest, hvis du bruger et transgen med en visuel aflæsning, såsom CMV.Luc.IRES.EGFP reporter trangen, der anvendes heri som udgangsmateriale til kloning. For at udføre optimeringen skal du følge protokoltrin 3 ved hjælp af en 12-brøndplade og nedskalere plasmidmasserne og reagensvolumenerne med to (den endelige plasmidmasse er 2,6 μg). Juster PEI-volumenet i overensstemmelse hermed, så det svarer til forhold fra 1: 0.75 til 1: 3, med stigende trin på 0.25 (figur 6). Hver reaktion fortyndes med 950 μL SF-medier efter 15 min. For nemheds skyld kan en masterblanding indeholdende de tredobbelte plasmider fremstilles og pipetteres individuelt i 1,5 ml rør, inden PEI tilsættes - se supplerende fil 2. Høst vektoren, transducerceller af interesse og billede. Brønden med den højeste transduktionseffektivitet (andel af GFP + celler) svarer til den højeste titer og mest optimale ratio af PEI:DNA.
Figur 6: Arbejdsproces for optimering af PEI. Skematisk over de trin, der kræves til PEI-optimering. Flere forhold mellem plasmid: PEI testes for at bestemme det optimale forhold. Klik her for at se en større version af denne figur.
Overvejelser om høst og titer
Fryse-/optøningsteknikken, der anvendes til at høste rAAV-vektor, lyserer effektivt HEK293-celler på en måde, der er forenelig med den direkte anvendelse af det klarede lysat til transduce dyrkede celler. Visse rAAV-serotyper, såsom AAV1, AAV8 og AAV9, frigives fra celler under vektorproduktion og kan høstes fra det dyrkede cellemedium uden fryse-/optøningscyklusser34. Den her beskrevne metode giver typisk titere i størrelsesordenen 1 x 10 10 VG/ml ved brug af AAV2-kapsider og 1 x10 11 VG/ml for AAV8. Mens højere titere kan opnås ved vaskemiddel eller anden kemisk baseret lysis, er disse skadelige for celler i downstream-brug og kræver, at rAAV'er renses yderligere fra lysatet. Lavere titer er en afvejning, som en forsker bør overveje, når han bestemmer, om rå præparater er egnede til deres forskningsbehov, men de marginalt lavere titere produceret ved de metoder, der er beskrevet her, kan transducere mange celletyper meget godt (se repræsentative resultater). Ud over transfektionseffektivitet og cellesundhed varierer vektortitere afhængigt af kapsiden, der anvendes under rAAV-produktion og størrelsen og sekvensen af transgenet inden for VG35.
Ved høst af rå vektorpræparater kan plasmid-DNA, der blev anvendt under triple-plasmidtransfektion, være til stede, og selvom det er sjældent, resultere i nedstrøms transfektion under transduktion. Desuden kan uemballerede VG'er binde sig til ydersiden af kapsider og påberåbe sig et medfødt immunrespons på nøgen og fremmed enkeltstrenget DNA36,37. Derfor kan følsomme celletyper kræve, at vektorpræparater fordøjes og renses for at fjerne uemballerede VG'er og plasmid.
Hvis man ønsker at beregne titeren for et råpræparat, kan qPCR udføres for at kvantificere antallet af emballerede VG inde i DNase-resistente partikler (DRP). Kort fortalt fordøjes en lille mængde råpræparat DNase-fordøjet for at fjerne plasmid-DNA, forurenende nukleinsyrer eller delvist pakket VG. Prøven udsættes derefter for qPCR, og den beskyttede VG inde i DRP'er kvantificeres, hvilket resulterer i en titer med enheder af vektorgenom pr. ml råpræparat38. Det anbefales ikke at udføre vektortitrering ved hjælp af ELISA-baserede assays, der kvantificerer capsidtitere. Sammenlignet med vildtype AAV-virus lider rAAV af en andel tomme og delvist emballerede kapsider39. ELISA vil kvantificere alle kapsider uanset deres genomindhold og vil overvurdere de transducible enheder, der er til stede i et præparat, hvilket kræver en pakket VG.
Overvejelser om transduktion
Mange faktorer påvirker rAAV-transduktioner, og der bør tages passende hensyn til ethvert nyt eksperiment. Afhængigt af promotoren, der driver transgenekspression, kan ekspressionsdebut forekomme så tidligt som 4 timer efter transduktion (hpt), og topekspression opnås typisk med 48 hkt. Det er vigtigt at huske varigheden af tiden fra den indledende såning af celler til det eksperimentelle endepunkt. Dette er for at estimere cellernes startsammenløb og sikre, at de ikke vokser over ved afslutningen af eksperimentet. Hvis celler bliver oversammenflydende, kan cellulær adfærd ændres på grund af et stressrespons og kan forvirre eksperimentelle resultater. Nogle celletyper, som U2-OS, kan tolerere overvækst / kontakthæmning ganske godt. Derudover kan de modstå lange perioder (48 timer +) i serumfrit konditioneret medium - produktet af denne produktionsprotokol. Imidlertid kan følsomme celletyper kræve serumtilsætning eller fortynding af det rå præparat med specielt vækstmedium for at opretholde helbredet under transduktion. En let reduceret transduktionseffektivitet ved brug af serumholdige medier er en potentiel afvejning for cellesundhed og bør overvejes af forskeren.
For hurtigt delende celler er en startsammenløb på omkring 50% typisk optimal til applikationer, der afsluttes 48 hpt. Imidlertid kan sammenløbet justeres i overensstemmelse hermed baseret på eksperimentets behov. Det anbefales ikke at transducere udødeliggjorte cellelinjer af monolagstypen over 75% sammenløb på grund af nedsat transduktionseffektivitet. De fleste dyrkede celletyper transduceres med succes og sunde efter inkubation natten over med rå rAAV-præparater, efterfulgt af en ændring til friske serumholdige medier om morgenen.
Capsidserotype er en vigtig faktor at overveje, når der produceres rAAV til transducering af en målcelle, da kapsiden er den primære determinant for cellulær tropisme og efterfølgende transgenekspression13. AAV2 er en meget anvendt serotype på grund af dens evne til effektivt at transducere mange typer dyrkede celler12. Denne egenskab ved AAV2 kan tilskrives heparinsulfatproteoglycaner (HSPG'er), der tjener som den primære bindingsfaktor for AAV2 og de høje niveauer af HSPG'er på dyrkede celler fra tilpasningen til dyrkning i en skål40. Andre kapsider, såsom AAV9, er mindre effektive til at transducere brede celletyper og kan forklares ved deres afhængighedstilknytningsfaktorer, der ikke udtrykkes i denne indstilling41. Derfor anbefaler vi AAV2 som førstevalgskapsid i dyrkede celler, hvis en ønsket målcelle ikke tidligere er testet med rAAV i litteraturen.
Bemærk, at en væsentlig begrænsning ved rå vektorpræparater er, at de er uegnede til transducering af dyremodeller. In vivo-undersøgelser kræver, at præparaterne renses og underkastes en kvalitetsvurdering.
Transgenekspression og overvejelser om potentiel integration
rAAV'er resulterer ikke pålideligt i permanent ekspression af transgenet. Over tid kan VG'er blive tavse, og transgene udtryk kan lukkes ned efter flere passager42. Derudover forbliver størstedelen af VG'er episomale og rAAV'er indeholder ikke de virale Rep-proteiner, der ville formidle hyppig integration i værtsgenomet som i en vildtype viral lysogen infektion eller fremme replikation af VG'er43. Som et resultat vil episomer i transducerede celler til sidst blive fortyndet ud blandt datterceller gennem divisioner.
Integration på basalniveau er en mulighed for alt leveret transgent DNA-materiale. Imidlertid er ITR-holdige VG'er tilbøjelige til integration med en højere frekvens44. Derfor kan permanent ekspression af et transgen observeres i en lille delmængde af celler. Brugere bør overveje denne mulighed, især når de bruger rAAV til at levere DNA-skærende enzymer, såsom Cas9, da dobbeltstrengede brud kan resultere i en endnu større hyppighed af integration og permanent ekspression45. Selvom dette gør rAAV til en god kandidat til at levere homologirettede reparationsskabeloner til endogen mærkning eller gentilføjelse, bør muligheden for Cas9-indsættelse overvejes 19,46.
Disclosures
A.C.M. er konsulent for Janssen Pharmaceuticals og sidder i SAB for NewBiologix. Alle de andre forfattere har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Vi takker Robert Tjian og Xavier Darzacq for deres støtte og brug af laboratorieudstyr. Vi takker Mark Kay for hans gave af KP1 og LK03 rep / cap plasmider, og Luk Vandenberghe for AAV4 rep / cap plasmid. Finansieringen blev ydet af Howard Hughes Medical Institute (34430, RT) og California Institute for Regenerative Medicine Training Program EDUC4-12790. N.W. anerkender finansiering fra Berkeley Stem Cell Center via et Siebel postdoc-stipendium og fra German Research Foundation (DFG) via et Walter Benjamin-stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Snapgene DNA viewing sofrware | Snapgene | ||
| pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 | AddGene | 105533 | |
| pAAV2/2 (Rep/Cap) | AddGene | 104963 | |
| pAdΔF6 | AddGene | 112867 | |
| LB Agar Carbenicillin | Sigma-Aldrich | L0418 | |
| Boekel Scientific Economy Digital Incubator | Boekel Scientific | 133000 | |
| LB medium, powder | MP Biomedicals | 113002042 | |
| Carbencillin (Disodium) | GoldBio | C-103-5 | |
| New Brunswick I26 Shaker | Eppendorf | M1324-0000 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22627040 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit | Qiagen | 12945 | |
| PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPS | USA Scientific | 1402-3900 | |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6333000022 | |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| 5x Phusion Buffer | NEB | B0518S | Provided with purchase of Phusion Polymerase |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Gel Loading Dye, Orange (6X) | NEB | B7022S | |
| DNA Clean & Concentrator-100 | Zymo | D4029 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo | D4001 | |
| NotI-HF | NEB | R3189S | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| CutSmart Buffer (10x) | NEB | B6004S | Provided with purchase of restriction enzyme |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500100 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with purchase of T4 Ligase |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Precision Microprocessor Water Bath | Thermo Scientific | 51221046 | |
| Sterile Plastic Culture Tubes | Fisher Scientific | 149566B | |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tube | Thomas Scientific | 1149Y01 | |
| ZR Plasmid Miniprep - Classic | Zymo | D4015 | |
| Xma1 | NEB | R0180S | |
| Sma1 | NEB | R0141S | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Falcon 6-well | Corning | 353046 | |
| Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo-Fisher | 11995065 | |
| Sanyo MCO-18AIC(UV) CO2 Incubator | Marshall Scientific | MCO-18AIC | |
| PEI MAX (Polyethylenimine Hydrochloride) | Polysciences | 24765-100 | |
| Mixer Vortex Genie 2 | Electron Microscopy Sciences | 102091-234 | |
| Sanyo Ultra Low Freezer | Sanyo | 14656-15267-16219 | |
| INCU-Line IL 10 with transparent window | VWR | 390-0384 | |
| Eppendorf Microcentrifuges | Eppendorf | 05-400-005 | |
| Falcon 96-well | Corning | 353072 | |
| C57BL/6J mice | JAX | strain #000664 | |
| organoid growth medium | STEMCELL Technologies | 6005 | |
| L Wnt-3A cells | ATCC | CRL-2647 | |
| nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72052 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane | Fisher | 356231 | |
| 24-well plate | Fisher | 08-772-1 | |
| D-PBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| TrypLE Express | Fisher | 12604013 | |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| polybrene | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-3D | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Fisher | 12-565-470 | |
| BeWo cells | ATCC | CCL-98 | |
| F-12K Medium | ATCC | 30-2004 | |
| Hepa1-6 | ATCC | CRL-1830 | |
| Huh7 | UC Berkeley BSD Cell Culture Facility | HUH-7 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| HSkMC | ATCC | PCS-950-010 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium | Sigma | C-23060 | |
| Skeletal Muscle Differentiation Medium | Sigma | C-23061 | |
| Invitrogen EVOS Digital Color Fluorescence Microscope | Fisher Scientific | 12-563-340 | |
| Perkin Elmer Opera Phenix | Perkin Elmer | HH14001000 | |
| PhenoPlate 96-well | Perkin Elmer | 6055302 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Thermo-Fisher | 31053028 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo-Fisher | 35050079 | |
| Sodium Pyruvate | Thermo-Fisher | 11360070 | |
| pAAV2/5 (Rep/Cap) | Addgene | 104964 | |
| pAAV2/8 (Rep/Cap) | Addgene | 112864 | |
| pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap) | Addgene | 130878 | |
| pAAV2/9n (Rep/Cap) | Addgene | 112865 | |
| pAnc80L65AAP | Addgene | 92307 | |
| KP1 (rep/cap) | gifted by Professor Mark Kay (Stanford University) | ||
| LK03 (rep/cap) | gifted by Professor Mark Kay (Stanford University) | ||
| pAAV4 (rep/cap) | gifted by Professor Luk Vandenberghe (Harvard Medical School) | ||
| pAAV.Cas9.sgRNA | Addgene | 61591 | |
| pAAV.MCS | Addgene | 46954 | |
| gBlock (synthetic DNA fragement) | IDT |
References
- Pillay, S., et al. Corrigendum: An essential receptor for adeno-associated virus infection. Nature. 539 (7629), 456 (2016).
- Nicolson, S. C., Samulski, R. J. Recombinant adeno-associated virus utilizes host cell nuclear import machinery to enter the nucleus. Journal of Virology. 88 (8), 4132-4144 (2014).
- Lundstrom, K.
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).
- Ling, C., et al. The Adeno-Associated Virus Genome Packaging Puzzle. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 9 (3), 175 (2015).
- Maurer, A. C., Weitzman, M. D. Adeno-Associated Virus Genome Interactions Important for Vector Production and Transduction. Human Gene Therapy. 31 (9-10), 499-511 (2020).
- Srivastava, A. Replication of the adeno-associated virus DNA termini in vitro. Intervirology. 27 (3), 138-147 (1987).
- Wang, X. S., Ponnazhagan, S., Srivastava, A. Rescue and replication of adeno-associated virus type 2 as well as vector DNA sequences from recombinant plasmids containing deletions in the viral inverted terminal repeats: selective encapsidation of viral genomes in progeny virions. Journal of Virology. 70 (3), 1668-1677 (1996).
- Earley, L. F., et al. Adeno-Associated Virus Serotype-Specific Inverted Terminal Repeat Sequence Role in Vector Transgene Expression. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 151-162 (2020).
- Yang, J., et al. Concatamerization of adeno-associated virus circular genomes occurs through intermolecular recombination. Journal of Virology. 73 (11), 9468-9477 (1999).
- Au, H. K. E., Isalan, M., Mielcarek, M. Gene Therapy Advances: A Meta-Analysis of AAV Usage in Clinical Settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118 (2021).
- Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M.
- Meier, A. F., Fraefel, C., Seyffert, M. The Interplay between Adeno-Associated Virus and its Helper Viruses. Viruses. 12 (6), 662 (2020).
- Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Molecular Biotechnology. 28 (1), 21-32 (2004).
- Batista Napotnik, T., Polajzer, T., Miklavcic, D. Cell death due to electroporation - A review. Bioelectrochemistry. 141, 107871 (2021).
- McCarty, D. M., Young, S. M. Jr, Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
- Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nature Biotechnology. 34 (3), 334-338 (2016).
- Stacey, G. N.
- Parks, W. P., Melnick, J. L., Rongey, R., Mayor, H. D. Physical assay and growth cycle studies of a defective adeno-satellite virus. Journal of Virology. 1 (1), 171-180 (1967).
- Bantel-Schaal, U., zur Hausen, H. Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site. Virology. 134 (1), 52-63 (1984).
- Gao, G. P., et al. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 99 (18), 11854-11859 (2002).
- Gao, G., et al. Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. Journal of Virology. 78 (12), 6381-6388 (2004).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Reports. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. Journal of Virology. 82 (12), 5887-5911 (2008).
- Lisowski, L., et al. Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model. Nature. 506 (7488), 382-386 (2014).
- Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. JCI Insight. 4 (22), e131610 (2019).
- Colon-Thillet, R., Jerome, K. R., Stone, D. Optimization of AAV vectors to target persistent viral reservoirs. Virology Journal. 18 (1), 85 (2021).
- Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
- Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. The Journal of Cell Biology. 202 (3), 579-595 (2013).
- Bi, X., Liu, L. F. DNA rearrangement mediated by inverted repeats. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 93 (2), 819-823 (1996).
- Samulski, R. J., Berns, K. I., Tan, M., Muzyczka, N. Cloning of adeno-associated virus into pBR322: rescue of intact virus from the recombinant plasmid in human cells. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 79 (6), 2077-2081 (1982).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Molecular Therapy. 7 (1), 122-128 (2003).
- Zhu, J., Huang, X., Yang, Y. The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adeno-associated virus gene therapy vectors in mice. The Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2388-2398 (2009).
- Wagner, H., Bauer, S. All is not Toll: new pathways in DNA recognition. The Journal of Experimental Medicine. 203 (2), 265-268 (2006).
- Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. Quantitative and Digital Droplet-Based AAV Genome Titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
- Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Therapy. 6 (7), 1322-1330 (1999).
- Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. Journal of Virology. 72 (2), 1438-1445 (1998).
- Bell, C. L., et al. The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2427-2435 (2011).
- McCown, T. J., Xiao, X., Li, J., Breese, G. R., Samulski, R. J. Differential and persistent expression patterns of CNS gene transfer by an adeno-associated virus (AAV) vector. Brain Research. 713 (1-2), 99-107 (1996).
- Weitzman, M. D., Kyostio, S. R., Kotin, R. M., Owens, R. A. Adeno-associated virus (AAV) Rep proteins mediate complex formation between AAV DNA and its integration site in human DNA. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 91 (13), 5808-5812 (1994).
- Miller, D. G., Petek, L. M., Russell, D. W. Adeno-associated virus vectors integrate at chromosome breakage sites. Nature Genetics. 36 (7), 767-773 (2004).
- Hanlon, K. S., et al. High levels of AAV vector integration into CRISPR-induced DNA breaks. Nature Communications. 10 (1), 4439 (2019).
- Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 23 (10), 3558-3565 (2003).
