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Developmental Biology

आंख लेंस के कॉर्टेक्स और न्यूक्लियस से बंडलों और एकल फाइबर कोशिकाओं की तैयारी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65638
Automatic Translation
1, 1
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

Summary

यह प्रोटोकॉल जटिल सेल-टू-सेल इंटरडिजिटेशन और झिल्ली वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के लिए परिधीय, परिपक्व और परमाणु आंख लेंस फाइबर कोशिकाओं को तैयार करने के तरीकों का वर्णन करता है।

Abstract

लेंस आंख के पूर्ववर्ती कक्ष में एक पारदर्शी और दीर्घवृत्त अंग है जो एक स्पष्ट छवि बनाने के लिए रेटिना पर प्रकाश को बारीक केंद्रित करने के लिए आकार बदलता है। इस ऊतक के थोक में विशेष, विभेदित फाइबर कोशिकाएं शामिल होती हैं जिनमें एक हेक्सागोनल क्रॉस सेक्शन होता है और लेंस के पूर्ववर्ती से पीछे के ध्रुवों तक फैलता है। ये लंबी और पतली कोशिकाएं पड़ोसी कोशिकाओं के कसकर विरोध करती हैं और सेल की लंबाई के साथ जटिल इंटरडिजिटेशन होती हैं। लेंस के सामान्य बायोमेकेनिकल गुणों के लिए विशेष इंटरलॉकिंग संरचनाओं की आवश्यकता होती है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग करके बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है। यह प्रोटोकॉल इन जटिल आकार की कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन के विस्तृत स्थानीयकरण की अनुमति देने के लिए माउस लेंस फाइबर कोशिकाओं के साथ-साथ माउस लेंस फाइबर कोशिकाओं के बंडलों को संरक्षित और इम्यूनोस्टेन करने की पहली विधि को प्रदर्शित करता है। प्रतिनिधि डेटा लेंस के सभी क्षेत्रों में परिधीय, विभेदक, परिपक्व और परमाणु फाइबर कोशिकाओं का धुंधलापन दिखाता है। इस विधि का उपयोग संभावित रूप से अन्य प्रजातियों के लेंस से अलग फाइबर कोशिकाओं पर किया जा सकता है।

Introduction

लेंस आंख के पूर्ववर्ती कक्ष में एक स्पष्ट और ओवॉइड ऊतक है जो दो सेल प्रकारों, उपकला और फाइबर कोशिकाओं से बना है1 (चित्रा 1)। उपकला कोशिकाओं का एक मोनोलेयर है जो लेंस के पूर्ववर्ती गोलार्ध को कवर करता है। फाइबर कोशिकाओं को उपकला कोशिकाओं से अलग किया जाता है और लेंस का बड़ा हिस्सा बनाते हैं। अत्यधिक विशिष्ट फाइबर कोशिकाएं एक बढ़ाव, भेदभाव और परिपक्वता प्रोग्रामिंग से गुजरती हैं, जो लेंस परिधि से लेंस केंद्र2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 तक कोशिका झिल्ली आकृति विज्ञान में अलग-अलग परिवर्तनों द्वारा चिह्नित होती हैं।, लेंस नाभिक के रूप में भी जाना जाता है। रेटिना पर विभिन्न दूरी से आने वाले ठीक-फोकस प्रकाश के लिए लेंस का कार्य इसके बायोमैकेनिकल गुणों पर निर्भर करता है, जिसमें कठोरता और लोच 13,14,15,16,17,18,19 शामिल हैं। लेंस फाइबर के जटिल इंटरडिजिटेशन की परिकल्पना20,21 की गई है और हाल ही में लेंस कठोरता22,23 के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: लेंस शरीर रचना आरेख और लेंस फाइबर से प्रतिनिधि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) छवियां। कार्टून उपकला कोशिकाओं (हल्के नीले रंग में छायांकित) और लेंस फाइबर कोशिकाओं (सफेद) के पूर्वकाल मोनोलेयर का एक अनुदैर्ध्य (पूर्वकाल से पीछे तक) दृश्य दिखाता है। लेंस के केंद्र (गुलाबी रंग में छायांकित) को नाभिक के रूप में जाना जाता है और इसमें अत्यधिक कॉम्पैक्ट फाइबर कोशिकाएं शामिल होती हैं। दाईं ओर, एक क्रॉस-सेक्शन कार्टून लेंस फाइबर के लम्बी षट्भुज कोशिका आकार को प्रकट करता है जो एक मधुकोश पैटर्न में पैक किया जाता है। फाइबर कोशिकाओं में दो व्यापक पक्ष और चार छोटे पक्ष होते हैं। नीचे के साथ प्रतिनिधि एसईएम छवियां लेंस की विभिन्न गहराई पर लेंस फाइबर कोशिकाओं के बीच जटिल झिल्ली इंटरडिजिटेशन दिखाती हैं। दाईं ओर, लेंस परिधि पर नवगठित लेंस फाइबर में छोटे किनारों के साथ छोटे प्रोट्रूशियंस होते हैं और चौड़ी तरफ (लाल बक्से) के साथ बॉल-एंड-सॉकेट होते हैं। परिपक्वता के दौरान, लेंस फाइबर बड़े पैडल डोमेन विकसित करते हैं जो छोटे पक्षों (नीले बक्से) के साथ छोटे प्रोट्रूशियंस द्वारा सजाए जाते हैं। परिपक्व फाइबर कोशिकाओं में छोटे प्रोट्रूशियंस द्वारा चित्रित बड़े पैडल डोमेन होते हैं। ये इंटरलॉकिंग डोमेन लेंस बायोमैकेनिकल गुणों के लिए महत्वपूर्ण हैं। लेंस नाभिक में फाइबर कोशिकाओं में उनके छोटे किनारों के साथ कम छोटे प्रोट्रूशियंस होते हैं और जटिल जीभ-और-नाली इंटरडिजिटेशन (बैंगनी बक्से) होते हैं। कोशिका के व्यापक पक्ष एक गोलाकार झिल्ली आकृति विज्ञान प्रदर्शित करते हैं। कार्टूनको 22,32 से संशोधित किया गया था और पैमाने पर तैयार नहीं किया गया था। स्केल बार = 3 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

लेंस फाइबर24,25 की पिछली पीढ़ियों के शीर्ष पर नई फाइबर कोशिकाओं के गोले जोड़कर बढ़ता है। फाइबर कोशिकाओं में दो व्यापक पक्षों और चार छोटे पक्षों के साथ एक लम्बी, हेक्सागोनल क्रॉस सेक्शन आकार होता है। ये कोशिकाएं लेंस के पूर्ववर्ती से पीछे के ध्रुव तक फैली हुई हैं, और प्रजातियों के आधार पर, लेंस फाइबर लंबाई में कई मिलीमीटर हो सकते हैं। इन लम्बी और पतली कोशिकाओं की संरचना का समर्थन करने के लिए, व्यापक और छोटे पक्षों के साथ विशेष इंटरडिजिटेशन लेंस आकार और बायोमैकेनिकल गुणों को बनाए रखने के लिए इंटरलॉकिंग संरचनाएं बनाते हैं। फाइबर सेल भेदभाव और परिपक्वता के दौरान कोशिका झिल्ली के आकार में परिवर्तन को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम)अध्ययन 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 द्वारा बड़े पैमाने पर प्रलेखित किया गया है।. नवगठित फाइबर कोशिकाओं में उनके छोटे किनारों के साथ बहुत छोटे प्रोट्रूशियंस के साथ बॉल-एंड-सॉकेट होते हैं, जबकि परिपक्व फाइबर में उनके छोटे किनारों के साथ इंटरलॉकिंग प्रोट्रूशियंस और पैडल होते हैं। परमाणु फाइबर जीभ-और-नाली इंटरडिजिटेशन और गोलाकार झिल्ली आकृति विज्ञान प्रदर्शित करते हैं। इन जटिल इंटरलॉकिंग झिल्ली के लिए आवश्यक प्रोटीन के बारे में बहुत कम जानकारी है। फाइबर कोशिकाओं में प्रोटीन स्थानीयकरण पर पिछले अध्ययनों ने लेंस ऊतक वर्गों पर भरोसा किया है, जो जटिल सेल आर्किटेक्चर के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति नहीं देते हैं।

इस काम ने जटिल आकृति विज्ञान को संरक्षित करने और कोशिका झिल्ली और साइटोप्लाज्म के भीतर प्रोटीन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग की अनुमति देने के लिए लेंस फाइबर कोशिकाओं के एकल और बंडलों को ठीक करने के लिए एक नई विधि बनाई और परिपूर्ण की है। यह विधि ईएम अध्ययनों के डेटा के बराबर सेल झिल्ली वास्तुकला को ईमानदारी से संरक्षित करती है, और विशिष्ट प्रोटीन के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने की अनुमति देती है। हमारे पास पहले इम्यूनोस्टेन्ड कॉर्टिकल लेंस फाइबर हैं जो भेदभाव और परिपक्वता22,23 से गुजर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल में, लेंस न्यूक्लियस से फाइबर कोशिकाओं को दागने का एक नया तरीका भी है। यह प्रोटोकॉल फाइबर सेल परिपक्वता और लेंस न्यूक्लियस संघनन के दौरान झिल्ली इंटरडिजिटेशन में गठन और परिवर्तन के लिए तंत्र को समझने के लिए दरवाजा खोलता है।

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Protocol

इंडियाना विश्वविद्यालय ब्लूमिंगटन में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के आधार पर चूहों की देखभाल की गई है। प्रतिनिधि डेटा उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले चूहे सी 57बीएल 6 / जे पृष्ठभूमि में नियंत्रण (जंगली-प्रकार) जानवर, मादा और 8-12 सप्ताह के थे। इस प्रयोग के लिए नर और मादा दोनों चूहों का उपयोग किया जा सकता है, क्योंकि चूहों का लिंग प्रयोग के परिणाम को प्रभावित करने की बहुत संभावना नहीं है।

1. लेंस विच्छेदन और डीकैप्सुलेशन

  1. नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के "प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड" के साथ-साथ संस्थान द्वारा अनुमोदित पशु उपयोग प्रोटोकॉल के बाद चूहों को इच्छामृत्यु दें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, चूहों को एक अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल (इंडियाना विश्वविद्यालय) के अनुसार गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ2 ओवरडोज द्वारा इच्छामृत्यु दी गई थी।
  2. आंखों को सॉकेट से बाहर निकालने के लिए बल के एक तरफ से आंखों के चारों ओर के ऊतकों को दबाकर घुमावदार बल का उपयोग करके चूहों से आंखों को अलग किया जाता है। इसके बाद, आंख के नीचे बल बंद करें और सॉकेट से आंख को हटाने के लिए उठाएं। आंखों को एक विच्छेदन ट्रे में ताजा 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में स्थानांतरित करें।
  3. ऑप्टिक तंत्रिका को अल्ट्रा-फाइन कैंची से जितना संभव हो उतना नेत्रगोलक के करीब काटें। आंख के पीछे ऑप्टिक तंत्रिका के निकास के माध्यम से आंखों की पुतली में सावधानीपूर्वक बारीक-टिप, सीधे चिमटी डालें।
  4. सावधानी पूर्वक चरण 1.3 में चिमटी के समान स्थान पर कैंची डालें और कॉर्नियल-स्क्लेरल जंक्शन की ओर पीछे से एक चीरा काटना शुरू करें।
    नोट: कृंतक लेंस उनकी आंखों के ~ 30% पर कब्जा कर लेते हैं। यदि चिमटी या कैंची को आंख में बहुत गहराई तक डाला जाता है तो आकस्मिक क्षति होगी।
  5. कॉर्नियल-स्क्लरल जंक्शन के साथ काटना जारी रखें जब तक कि जंक्शन का कम से कम आधा हिस्सा अलग न हो जाए।
  6. कॉर्निया पर धीरे से धक्का देने के लिए चिमटी का उपयोग करें ताकि लेंस चरण 1.4 और 1.5 के साथ किए गए चीरे के माध्यम से बाहर निकल सके।
  7. ठीक-टिप, सीधे चिमटी का उपयोग करके लेंस से ऊतक के किसी भी बड़े टुकड़े को सावधानीपूर्वक हटा दें। भूमध्यरेखीय क्षेत्र का पता लगाने के लिए लेंस का निरीक्षण करें।
  8. शैलो रूप से बारीक-टिप, सीधे चिमटी का उपयोग करके लेंस को छेदते हैं, और फिर लेंस कैप्सूल को हटा देते हैं। लेंस फाइबर कोशिकाओं का द्रव्यमान बरकरार रहेगा, और लेंस उपकला मोनोलेयर लेंस कैप्सूल से जुड़ा रहेगा। लेंस कैप्सूल को छोड़ दें।

2. लेंस सिंगल फाइबर सेल धुंधला

  1. लेंस फाइबर सेल द्रव्यमान को 500 μL ताजा बने 1% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए; 1x पीबीएस में) समाधान के साथ एक अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें और कोमल अखरोट के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें (चित्रा 2 ए)।
    नोट: दिए गए समाधानों के लिए वॉल्यूम 48-वेल प्लेटों के लिए अनुकूलित हैं। यदि किसी अन्य आकार की वेल-प्लेट या ट्यूब का उपयोग किया जाता है, तो तदनुसार समाधान की मात्रा को समायोजित करें। निर्धारण, अवरोधन और धुलाई (1x PTX, 1x PBS में 0.1% ट्राइटन X-100) समाधान 10x PBS और डबल आसुत जल (ddH2O) के साथ 1x PBS की अंतिम सांद्रता के लिए किए गए थे।
  2. लेंस फाइबर कोशिकाओं को 1% पीएफए के साथ 60 मिमी डिश में स्थानांतरित करें। फाइबर कोशिकाओं की गेंद को इसके पूर्ववर्ती-पीछे की धुरी (चित्रा 2 बी) के साथ आधे में विभाजित करने के लिए एक तेज स्केलपेल का उपयोग करें। क्वार्टर बनाने के लिए उसी धुरी के साथ फिर से आधे हिस्सों में काट लें।
    नोट: पूर्वकाल-पीछे की धुरी को ऊतक द्रव्यमान में फाइबर कोशिकाओं की दिशा से आसानी से पहचाना जाता है।
  3. लेंस फाइबर सेल क्वार्टर (चित्रा 2 सी) से नाभिक क्षेत्र को हटाने के लिए सीधे चिमटी का उपयोग करें।
    नोट: कृंतक लेंस में लेंस नाभिक क्षेत्र कठोर होता है, और लेंस का केंद्र नरम कॉर्टिकल फाइबर से आसानी से अलग हो जाएगा।
  4. हल्के झटकों (प्लेट शेकर पर 300 आरपीएम) के साथ कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए 1% पीएफए के 200 μL में लेंस कॉर्टेक्स क्षेत्र के क्वार्टर को ठीक करें।
  5. 1x PBS के 750 μL में दो बार 5 मिनट के लिए ऊतक क्वार्टर को आरटी पर हल्के झटकों के साथ धोएं।
  6. कोमल झटकों के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए ब्लॉकिंग समाधान (5% सीरम, 0.3% ट्राइटन एक्स -100, 1 एक्स पीबीएस) के 200 μL का उपयोग करके नमूने को ब्लॉक करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रतिनिधि डेटा के लिए, नमूने प्राथमिक या द्वितीयक एंटीबॉडी से सना नहीं थे। ब्लॉकिंग चरण के बाद, नमूनों को आरटी पर 3 घंटे के लिए गेहूं के रोगाणु एग्लूटीनिन (डब्ल्यूजीए; 1: 100) और फेलोइडिन (1: 100) (सामग्री की तालिका देखें) के साथ हल्के झटकों और प्रकाश से सुरक्षा के साथ इनक्यूबेट किया गया था। प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधलापन पिछले प्रकाशनों22,23 में प्रदर्शित किया गया है।
  7. हल्के झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 100 μL प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ इनक्यूबेट करें।
    नोट: अवरोध समाधान में एंटीबॉडी पतला हो जाते हैं। ऊतक वर्गों के साथ स्लाइड की तुलना में, इस प्रकार की तैयारी में अधिक कोशिकाएं होती हैं। अधिक कोशिकाओं को दागने के लिए पर्याप्त एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी सांद्रता में वृद्धि की जानी चाहिए। ऊतक वर्गों पर उपयोग की जाने वाली एंटीबॉडी एकाग्रता को दोगुना करने की सिफारिश की जाती है। माध्यमिक एंटीबॉडी पर भी यही बात लागू होती है।
  8. ऊतक क्वार्टरों को 1x PTX (0.1% Triton X-100, 1x PBS) के साथ तीन बार आरटी पर 5 मिनट के लिए हल्के झटकों के साथ धोएं।
  9. फाइबर कोशिकाओं को 100 μL द्वितीयक एंटीबॉडी / डाई समाधान के साथ आरटी पर 3 घंटे के लिए कोमल झटकों के साथ इनक्यूबेट करें। इस और बाद के चरणों के दौरान नमूने को प्रकाश से सुरक्षित रखें।
    नोट: डब्ल्यूजीए, फेलोइडिन, और अन्य फ्लोरोसेंट रंगों को प्राथमिक एंटीबॉडी को लेबल करते समय कोशिका झिल्ली, साइटोस्केलेटन या अन्य ऑर्गेनेल के एक साथ लेबलिंग के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान में जोड़ा जा सकता है।
  10. फाइबर कोशिकाओं को 1x PTX के साथ 4 बार 5 मिनट के लिए आरटी पर हल्के झटकों के साथ धोएं।
  11. ऊतक क्वार्टरों को स्लाइड में स्थानांतरित करने से पहले प्लस-चार्ज माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंटिंग मीडिया की एक बूंद या 50 μL जोड़ें।
  12. फाइबर कोशिकाओं को धीरे-धीरे एक दूसरे से अलग करने के लिए चिमटी का उपयोग करें और सेल बंडलों के ओवरलैपिंग को सीमित करने का प्रयास करें।
  13. धीरे से बढ़ते मीडिया में नमूने के शीर्ष पर # 1.5 कवरस्लिप लागू करें। बढ़ते मीडिया को कवरस्लिप के किनारे तक फैलना चाहिए; यदि ऐसा नहीं होता है, तो कवरस्लिप के किनारे पर कुछ अतिरिक्त माउंटिंग मीडिया जोड़ें। कवरस्लिप के किनारे के आसपास किसी भी अतिरिक्त बढ़ते मीडिया को हटा दें और स्लाइड पर कवरस्लिप के किनारों को सील करने के लिए नेल पॉलिश का उपयोग करें।
    नोट: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार किए गए किसी भी प्रकार के माउंटिंग माध्यम का उपयोग इन प्रयोगों के लिए किया जा सकता है।

3. लेंस न्यूक्लियस सिंगल फाइबर सेल धुंधला

  1. खंड 1 में उल्लिखित विच्छेदन को पूरा करें।
  2. यांत्रिक रूप से लेंस फाइबर कोशिकाओं की गेंद से कॉर्टिकल फाइबर को हटा दें, लेंस नाभिक को छोड़ दें, धीरे से फाइबर सेल द्रव्यमान को गीले, घिसे हुए उंगलियों पर स्थानांतरित करें और ऊतक द्रव्यमान को धीरे से घुमाएं।
    नोट: माउस लेंस में, कठोर लेंस नाभिक28,30 से कॉर्टिकल फाइबर कोशिकाओं को हटाने के लिए उंगलियों के बीच लेंस फाइबर कोशिकाओं की गेंद को घुमाना एक प्रभावी तरीका है। लेंस के लिए जहां यह यांत्रिक विधि प्रभावी नहीं है, कॉर्टिकल फाइबर कोशिकाओं को हटाने के लिए सावधानीपूर्वक विच्छेदन या भंवर विधि29 का उपयोग किया जा सकता है।
  3. लेंस न्यूक्लियस को एक अच्छी तरह से प्लेट में ताजा बनाए गए 1% पीएफए घोल में स्थानांतरित करें और हल्के झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  4. नमूने को 1% पीएफए के साथ 60 मिमी डिश में स्थानांतरित करें और पूर्वकाल-पीछे की धुरी के साथ लेंस नाभिक को विभाजित करने के लिए एक तेज स्केलपेल का उपयोग करें। नाभिक क्वार्टर का उत्पादन करने के लिए ऊतक के नमूनों को फिर से आधा करें।
  5. इम्यूनोस्टेनिंग और नमूना माउंटिंग के लिए चरण 2.4-2.13 में उल्लिखित प्रक्रिया का पालन करें।

Figure 2
चित्रा 2: ग्राफिकल सारांश लेंस फाइबर कोशिकाओं की तैयारी और इम्यूनोस्टेनिंग का विवरण देता है। (ए) इस 48-वेल प्लेट को वर्णित विधियों के लिए एक नमूना प्लेट सेटअप प्रदर्शित करने के लिए कॉलम द्वारा रंग-कोडित किया गया है, जिससे बल का उपयोग करके कोमल हैंडलिंग द्वारा विभिन्न इम्यूनोस्टेनिंग चरणों के बीच नमूनों के आसान हस्तांतरण की अनुमति मिलती है। जबकि इस प्रोटोकॉल के लिए प्रतिनिधि डेटा को प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट नहीं किया जाता है, आरेख में प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के लिए एक कॉलम शामिल है, और धोने के लिए कुओं को एस्पिरेशन द्वारा उपयोग किए गए वॉश बफर को हटाने के बाद पुन: उपयोग किया जा सकता है। (बी) लेंस फाइबर सेल द्रव्यमान के निर्धारण के बाद, ऊतक को कोशिकाओं की मूल संरचना को संरक्षित करने के लिए पूर्वकाल-पीछे की धुरी (लाल डैश्ड लाइनों) के साथ विभाजित किया जाता है। एक बार ऊतक द्रव्यमान आधा हो जाने के बाद, नमूने घुमाए जाते हैं और आधे पूर्ववर्ती-पीछे की धुरी (लाल डैश्ड लाइनों) के साथ क्वार्टर में विभाजित होते हैं। (सी) लेंस नाभिक क्षेत्र (गुलाबी रंग में) को हटाना कॉर्टिकल फाइबर कोशिकाओं (नीले रंग में) से घने केंद्रीय ऊतक को खोदने के लिए चिमटी का उपयोग करके आसानी से किया जाता है। कार्टून आरेख आंशिक रूप से BioRender.com का उपयोग करके बनाए गए थे और पैमाने पर तैयार नहीं किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

लेंस फाइबर कोशिकाओं को लेंस कॉर्टेक्स (विभेदक फाइबर और परिपक्व फाइबर) और नाभिक से तैयार किया जाता है, और कोशिकाओं को एफ-एक्टिन के लिए फेलोइडिन और कोशिका झिल्ली के लिए डब्ल्यूजीए से दाग दिया जाता है। कोशिकाओं या एकल लेंस फाइबर (चित्रा 3) के बंडलों का मिश्रण देखा और चित्रित किया जाता है। लेंस कॉर्टेक्स से, दो प्रकार की कोशिकाएं (चित्रा 3 ए) पाई जाती हैं। लेंस परिधि में फाइबर कोशिकाओं को अलग करना सीधा होता है, जिसमें उनके छोटे किनारों के साथ बहुत छोटे प्रोट्रूशियंस होते हैं। जैसे-जैसे कोशिका अंतर करती है, फाइबर कोशिकाएं छोटे इंटरलॉकिंग प्रोट्रूशियंस के साथ लहरदार हो जाती हैं। इसके अलावा, परिपक्वता प्रक्रिया के साथ, फाइबर कोशिकाएं छोटे इंटरलॉकिंग प्रोट्रूशियंस से सजाए गए बड़े पैडल विकसित करती हैं। लेंस नाभिक माउस लेंस में अत्यधिक कॉम्पैक्ट और कठोर होता है, और परमाणु लेंस फाइबर के निर्धारण और धुंधला होने से पहले नरम लेंस कॉर्टेक्स के यांत्रिक निष्कासन के माध्यम से अलग किया जाता है। लेंस नाभिक से, लेंस फाइबर के बंडल पाए जाते हैं जो व्यास में छोटे होते हैं और उनमें ठीक झिल्ली संरचनाएं होती हैं जिन्हें कम-आवर्धन छवि पर आसानी से नहीं देखा जा सकता है।

लेंस के विभिन्न क्षेत्रों (चित्रा 3 बी) से लेंस फाइबर कोशिकाओं के उच्च-आवर्धन 3 डी पुनर्निर्माण में, यह पाया गया है कि एफ-एक्टिन और डब्ल्यूजीए कोशिका झिल्ली पर अंतर और परिपक्व फाइबर कोशिकाओं में अत्यधिक सह-स्थानीयकृत हैं। एफ-एक्टिन को कोशिका झिल्ली के साथ इंटरलॉकिंग प्रोट्रूशियंस में विभेदित और परिपक्व फाइबर (चित्रा 3 बी, एरोहेड) में समृद्ध किया जाता है। परिपक्व फाइबर कोशिकाएं बड़े इंटरलॉकिंग पैडल विकसित करती हैं (चित्रा 3 बी, तारांकन)। डब्ल्यूजीए धुंधला एफ-एक्टिन सिग्नल के साथ पूरी तरह से स्थानीयकृत नहीं है, विशेष रूप से परिपक्व फाइबर सेल में, यह सुझाव देते हुए कि कॉर्टिकल एक्टिन नेटवर्क कोशिका झिल्ली के साथ सभी छोटी संरचनाओं का समर्थन नहीं करता है। अप्रत्याशित रूप से, यह पाया गया है कि एफ-एक्टिन नेटवर्क परमाणु फाइबर कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म के भीतर है। जबकि एफ-एक्टिन सिग्नल परमाणु फाइबर सेल झिल्ली के साथ प्रोट्रूशियंस (चित्रा 3 बी, तीर) में फैला हुआ है, एक्टिन नेटवर्क अब कोशिका झिल्ली के पास या प्रोट्रूशियंस के भीतर समृद्ध नहीं है। परमाणु फाइबर सेल की आकृति विज्ञान में पैडल की कमी होती है, इसके अलावा संगठन और प्रोट्रूशियंस की आवृत्ति में कमी होती है।

Figure 3
चित्रा 3: लेंस के विभिन्न क्षेत्रों से फाइबर कोशिकाओं के बंडलों (कम-आवर्धन) और एकल (उच्च-आवर्धन) छवियों की कॉन्फोकल छवियां। कोशिकाओं को डब्ल्यूजीए (कोशिका झिल्ली, हरा), फेलोइडिन (एफ-एक्टिन, लाल), और डीएपीआई (नाभिक, नीला) से दाग दिया जाता है। (ए) इन तैयारियों में, लेंस फाइबर कोशिकाओं के बंडल अक्सर विभिन्न क्षेत्रों से पाए जाते हैं। कॉर्टिकल तैयारी में, विभेदक और परिपक्व फाइबर कोशिकाएं होती हैं। इन विभिन्न कोशिकाओं में अलग-अलग आकृति विज्ञान होते हैं, जिससे आसान पहचान की अनुमति मिलती है। लेंस नाभिक से नमूने में, फाइबर सेल बंडल ों के साथ-साथ विघटित फाइबर पाए जाते हैं। स्केल बार = 50 μm. (B) एकल विभेदक, परिपक्व और परमाणु फाइबर कोशिकाओं के माध्यम से जेड-स्टैक एकत्र किए जाते हैं, और दिखाए गए चित्रों के पुनर्निर्माण के लिए 3 डी रेंडरिंग का उपयोग किया जाता है। विभेदक और परिपक्व तंतुओं में उनके छोटे पक्षों के साथ कई छोटे प्रोट्रूशियंस होते हैं (एरोहेड चुनिंदा लोगों को चिह्नित करते हैं)। ये छोटे प्रोट्रूशियंस एफ-एक्टिन के लिए समृद्ध हैं। परिपक्व फाइबर में बड़े इंटरलॉकिंग पैडल डोमेन (तारांकन) भी होते हैं। परमाणु तंतुओं में डब्ल्यूजीए द्वारा दाग वाले छोटे झिल्ली जेब और डिवोट होते हैं और उनके छोटे किनारों (तीरों) के साथ कुछ प्रोट्रूशियंस बनाए रखते हैं। हैरानी की बात है, एफ-एक्टिन नेटवर्क अब कोशिका झिल्ली पर समृद्ध संकेतों के बिना सेल साइटोप्लाज्म में वितरित किया जाता है। एफ-एक्टिन नेटवर्क छोटे प्रोट्रूशियंस में विस्तारित होता है। स्केल बार = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

जब फाइबर कोशिकाओं की जांच की जाती है, तो किस प्रकार के सेल को देखा जा रहा है, इसके बारे में भ्रम से बचने के लिए कोशिकाओं के अभिविन्यास को नोट करना महत्वपूर्ण है। जेड-स्टैक्स को कोशिकाओं के माध्यम से एकत्र किया जाता है, और फिर एक्सवाई, एक्सजेड और वाईजेड विमानों में ऑर्थोगोनल 2 डी अनुमानों को देखने के लिए 3 डी पुनर्निर्माण का उपयोग किया जाता है। इस तैयारी में कोशिकाओं के यादृच्छिक अभिविन्यास के कारण, उन कोशिकाओं का होना संभव है जो ग्लास स्लाइड (चित्रा 4) पर पूरी तरह से सपाट नहीं हैं। इस प्रतिनिधि छवि में सभी कोशिकाएं परिपक्व लेंस फाइबर हैं, लेकिन प्रत्येक सेल में एक्सवाई विमान में काफी अलग उपस्थिति होती है। हरे रंग में छद्म रंग की कोशिका दृश्यमान पैडल और प्रोट्रूशियंस के साथ व्यापक साइड-अप उन्मुख होती है, जबकि गुलाबी रंग में सेल छद्म रंग छोटी साइड के साथ लेटा होता है। यह एक्सजेड विमान में अधिक आसानी से कल्पना की जाती है, जो एक्सवाई विमान में दिखाए गए दो कोशिकाओं के लंबवत झुकाव को दिखाती है। वाईजेड विमान की परीक्षा स्पष्ट रूप से परिपक्व फाइबर के पैडल दिखाती है जो एक्सवाई विमान से गुलाबी रंग की होती है।

Figure 4
चित्रा 4: एफ-एक्टिन के लिए फेलोइडिन से सना एकल परिपक्व लेंस फाइबर कोशिकाओं के एक समूह के माध्यम से 3 डी कॉन्फोकल जेड-स्टैक के ऑर्थोगोनल 2 डी अनुमान (एक्सवाई, एक्सजेड और वाईजेड विमान)। प्रत्येक विमान पर पहचान के लिए दो कोशिकाओं को गुलाबी या हरे रंग में छद्म रंग दिया जाता है। एक्सवाई विमान में, गुलाबी सेल अपनी छोटी तरफ ऊपर की ओर लेटा हुआ है, जबकि हरे रंग की कोशिका सपाट पड़ी हुई है और इसकी चौड़ी तरफ ऊपर की ओर है। एक्सजेड विमान में, यह देखा जाता है कि गुलाबी सेल अभिविन्यास में झुका हुआ है, जबकि हरी कोशिका ग्लास स्लाइड के समानांतर है। वाईजेड विमान में, गुलाबी कोशिकाओं के पैडल और प्रोट्रूशियंस देखे जाते हैं, यह पुष्टि करते हुए कि यह सेल एक परिपक्व फाइबर सेल है। स्केल बार = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चूंकि फाइबरमोटाई 25,31 में लगभग 2-4 μm हैं, इसलिए साइटोप्लाज्म के माध्यम से सेल की सतह या एक विमान को देखने के लिए जेड-स्टैक्स के संग्रह के माध्यम से संभव है (चित्रा 5)। यह उन कोशिकाओं पर सबसे अच्छा काम करता है जो कवरस्लिप के साथ लगभग समानांतर होते हैं, जिसमें सेल का व्यापक पक्ष ऊपर होता है। इस परिपक्व फाइबर सेल में सेल की सतह को डब्ल्यूजीए सिग्नल (चित्रा 5 ए) को देखकर सराहना की जा सकती है। एक्सजेड विमान स्पष्ट रूप से दिखाता है कि यह एक्सवाई विमान सेल के व्यापक पक्ष के साथ है। झिल्ली के साथ छोटे डब्ल्यूजीए + पंक्टा एक खुरदरी कोशिका सतह आकृति विज्ञान का सुझाव देते हैं। कम जोखिम वाली छवियों में छोटी तरफ के साथ छोटे प्रोट्रूशियंस एक बहुत समृद्ध एफ-एक्टिन सिग्नल दिखाते हैं। उच्च जोखिम पर, जहां प्रोट्रूशियंस में एफ-एक्टिन सिग्नल संतृप्त होता है, कोशिका झिल्ली (तारांकन) में एक ठीक जालीदार एफ-एक्टिन नेटवर्क देखा जाता है। जब एक एक्सवाई विमान को परिपक्व फाइबर (चित्रा 5 बी) के साइटोप्लाज्म के माध्यम से माना जाता है, तो डब्ल्यूजीए धुंधला मुख्य रूप से कोशिका झिल्ली के साथ देखा जाता है। कोशिका की सतह पर जो देखा जाता है, उसके समान, एफ-एक्टिन को छोटे पक्षों के साथ प्रोट्रूशियंस में समृद्ध किया जाता है, जिसमें उच्च जोखिम (तारांकन) पर एक जालीदार साइटोप्लाज्मिक एफ-एक्टिन नेटवर्क दिखाई देता है। हमारे पिछले काम ने सेल साइटोप्लाज्म22,23 के माध्यम से एक्सवाई विमानों में झिल्ली प्रोटीन के लिए धुंधलापन दिखाया है, लेकिन इस विधि के साथ, व्यापक साइड सेल सतह के साथ प्रोटीन को स्थानीयकृत करना भी संभव है।

Figure 5
चित्रा 5: डब्ल्यूजीए (हरे) और फेलोइडिन (एफ-एक्टिन, लाल) से सना एकल परिपक्व फाइबर सेल के माध्यम से 3 डी कॉन्फोकल जेड-स्टैक्स के ऑर्थोगोनल 2 डी अनुमान (एक्सवाई और एक्सजेड विमान)। (ए) व्यापक पक्ष के साथ कोशिका की सतह से अनुमान कोशिका झिल्ली के साथ डब्ल्यूजीए दिखाते हैं, और डब्ल्यूजीए के पंक्टा से पता चलता है कि झिल्ली पूरी तरह से चिकनी नहीं है। एफ-एक्टिन को छोटे पक्षों के साथ प्रोट्रूशियंस में समृद्ध किया जाता है, और एफ-एक्टिन धुंधला होने की एक उच्च-जोखिम छवि कोशिका झिल्ली (तारांकन) के साथ एक जालीदार नेटवर्क का खुलासा करती है। (बी) उसी कोशिका के साइटोप्लाज्म के माध्यम से एक और विमान कोशिका झिल्ली के साथ डब्ल्यूजीए दिखाता है, कोशिका को फ्रेम करता है। एफ-एक्टिन साइटोप्लाज्म (तारांकन) के माध्यम से एक जालीदार नेटवर्क बनाता है और कोशिका झिल्ली के साथ प्रोट्रूशियंस में बहुत समृद्ध होता है। स्केल सलाखों = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इसके बाद, स्कैनिंग ईएम (एसईएम) और धुंधला प्रयोगों से लेंस फाइबर की छवियों की तुलना की जाती है। एसईएम प्रयोग ों को पहले वर्णित29 के रूप में किया जाता है, और छवियों को नमूने के केंद्र से परिधि तक क्रमिक रूप से लिया जाता है। सबसे पहले, छोटे प्रोट्रूशियंस (चित्रा 6, तीर) के साथ लेंस फाइबर को उनके छोटे किनारों के साथ और उनके व्यापक पक्षों के साथ एक बॉल-एंड-सॉकेट (एरोहेड) के साथ अलग करने की जांच की जाती है। एसईएम छवि (चित्रा 6 ए) के समान, उनके छोटे पक्षों के साथ उन्मुख विभेदित तंतुओं के एक बंडल में, बॉल-एंड-सॉकेट इंटरडिजिटेशन बड़े प्रोट्रूशियंस और खांचे हैं जो कोशिकाओं के व्यापक पक्ष के साथ फैले हुए हैं (चित्रा 6 बी, तीर के निशान)। एक सॉकेट पाया जाता है (चित्रा 6 सी, एरोहेड्स) जब एक्सवाई और एक्सजेड ऑर्थोगोनल 2 डी अनुमानों में सेल को एकल विभेदक लेंस फाइबर में देखा जाता है। एसईएम छवि (तीर) की तुलना में इन दाग वाले लेंस फाइबर कोशिकाओं में छोटे इंटरलॉकिंग प्रोट्रूशियंस भी ईमानदारी से संरक्षित होते हैं। इसके बाद, परिपक्व फाइबर कोशिकाओं की आकृति विज्ञान की जांच की जाती है (चित्रा 7)। एसईएम छवि और दाग वाली कोशिका में, कोशिकाओं के व्यापक पक्ष (चित्रा 7 ए, बी, एरोहेड) के साथ छोटे डिवोट होते हैं। संभवतः, ये बॉल-एंड-सॉकेट इंटरडिजिटेशन के अवशेष हैं जो परिपक्वता प्रक्रिया के दौरान सिकुड़ रहे हैं। छोटे इंटरलॉकिंग प्रोट्रूशियंस (तीर) द्वारा सजाए गए बड़े पैडल (तारांकन) एसईएम में कोशिकाओं और दाग वाले परिपक्व फाइबर के बीच तुलनीय हैं। एसईएम छवि में कोशिकाओं में स्पष्ट खांचे भी होते हैं जहां कोशिका झिल्ली में एक इंटरलॉकिंग प्रोट्रूशियंस डॉकिंग होता है (चित्रा 7 सी, तीर के निशान)। इन खांचे को इन दाग वाली कोशिकाओं में भी देखा जा सकता है और डब्ल्यूजीए सिग्नल (चित्रा 7 डी, तीर) द्वारा भरा जाता है। खांचे कोशिका झिल्ली से बाहर की ओर बढ़ने के बजाय कोशिका साइटोप्लाज्म की ओर अंदर की ओर जाने वाले प्रोट्रूशियंस की तरह दिख सकते हैं, और अक्सर केवल डब्ल्यूजीए धुंधला खांचे में दिखाई देता है जिसमें बहुत कम, यदि कोई हो, एफ-एक्टिन धुंधला संकेत होता है।

Figure 6
चित्रा 6: लेंस कॉर्टेक्स से फाइबर कोशिकाओं को अलग करने की एसईएम और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप छवियां। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए फाइबर कोशिकाओं को डब्ल्यूजीए (हरा) और फैलोइडिन (एफ-एक्टिन, लाल) से दाग दिया जाता है। (ए) विभेदित लेंस तंतुओं के एक बंडल का एसईएम कोशिकाओं के छोटे किनारों के साथ छोटे इंटरलॉकिंग प्रोट्रूशियंस (तीर) के साथ कोशिकाओं के व्यापक पक्ष के साथ बॉल-एंड-सॉकेट इंटरडिजिटेशन (एरोहेड्स) दिखाता है। (बी) छोटी भुजाओं से चित्रित विभेदित तंतुओं के एक बंडल की कॉन्फोकल छवियां कोशिकाओं (तीर) के व्यापक किनारों के साथ बड़े बॉल-एंड-सॉकेट इंटरडिजिटेशन दिखाती हैं। (सी) ऑर्थोगोनल 2 डी अनुमान (एक्सवाई और एक्सजेड विमान) एक एकल विभेदक लेंस फाइबर के माध्यम से व्यापक पक्ष के साथ एक बॉल-एंड-सॉकेट इंटरडिजिटेशन (एरोहेड) और शॉर्ट साइड (तीर) के साथ छोटे इंटरलॉकिंग प्रोट्रूशियंस दिखाते हैं। स्केल सलाखों = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: लेंस कॉर्टेक्स से परिपक्व फाइबर कोशिकाओं की एसईएम और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप छवियां। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए फाइबर कोशिकाओं को डब्ल्यूजीए (हरा) और फैलोइडिन (एफ-एक्टिन, लाल) से दाग दिया जाता है। (ए) एसईएम छवि में कोशिकाओं के छोटे किनारों के साथ छोटे प्रोट्रूशियंस (तीर) द्वारा सजाए गए पैडल (तारांकन) के साथ दो इंटरलॉकिंग परिपक्व फाइबर होते हैं। सेल के व्यापक पक्ष के साथ छोटे इंडेंटेशन (तीर) भी होते हैं। ये संभवतः बॉल-एंड-सॉकेट प्रोट्रूशियंस के सिकुड़ते अवशेष हैं। स्केल बार = 5 μm. (B) एकल परिपक्व लेंस फाइबर के माध्यम से ऑर्थोगोनल 2 डी प्रोजेक्शन (XY और XZ विमान) में कोशिकाओं के छोटे किनारों के साथ इंटरलॉकिंग बड़े पैडल (तारांकन) और छोटे प्रोट्रूशियंस (तीर) होते हैं। एसईएम छवि में इंडेंटेशन के समान छोटे डब्ल्यूजीए + रिंग (तीर) को सेल के व्यापक पक्ष के साथ देखा जाता है। इन डब्ल्यूजीए + संरचनाओं में एफ-एक्टिन धुंधला नहीं है। एफ-एक्टिन ज्यादातर छोटे प्रोट्रूशियंस में कोशिका झिल्ली पर समृद्ध होता है और साइटोप्लाज्म में एक कमजोर जालीदार धुंधला पैटर्न होता है। स्केल बार = 5 μm. (C) परिपक्व तंतुओं की एसईएम छवि कोशिका झिल्ली (तीर) में कई खांचे दिखाती है, जहां पड़ोसी कोशिकाओं से प्रोट्रूशियंस आराम करते हैं और इंटरलॉक करते हैं। स्केल बार = 2 μm. (D) परिपक्व तंतुओं की एक जोड़ी जो WGA द्वारा दागदार खांचे (तीर) दिखाते हुए अलग की जाती है। खांचे में एफ-एक्टिन धुंधलापन का संवर्धन नहीं होता है और एक इंटरलॉकिंग संरचना के रूप में बाहर की ओर विस्तार करने के बजाय साइटोसोल की ओर अंदर की ओर विस्तारित प्रोट्रूशियंस की तरह दिखते हैं। स्केल बार = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अंत में, सना हुआ परमाणु लेंस फाइबर एसईएम तैयारी से छवियों के साथ तुलना की जाती है। परमाणु लेंस फाइबर को ठीक करने और दागने की यह नई विधि लेंस के विभिन्न क्षेत्रों में परमाणु लेंस फाइबर की आकृति विज्ञान को ईमानदारी से संरक्षित करती है (चित्रा 8)। परमाणु फाइबर कोशिकाओं में उनके छोटे किनारों (तीरों) के साथ असंगत और बड़े इंटरलॉकिंग प्रोट्रूशियंस होते हैं। सबसे बाहरी परमाणु लेंस फाइबर में एक खुरदरी कोशिका झिल्ली बनावट होती है, जैसा कि एसईएम और सना हुआ सेल छवियों दोनों में देखा जाता है। चूंकि कोशिकाएं नाभिक के केंद्र की ओर आगे संघनन से गुजरती हैं, जीभ-और-नाली इंटरडिजिटेशन कोशिका झिल्ली (तारांकन) के साथ दिखाई देते हैं, और सबसे भीतरी परमाणु तंतुओं में एक गोलाकार झिल्ली आकृति विज्ञान होता है जिसे एसईएम छवि पर और डब्ल्यूजीए धुंधला होने के साथ सराहा जा सकता है। एफ-एक्टिन अब कोशिका झिल्ली पर समृद्ध नहीं होता है, लेकिन साइटोप्लाज्म को भरने और प्रोट्रूशियंस में कमजोर रूप से विस्तारित करने वाला एक नेटवर्क बनाता है।

Figure 8
चित्रा 8: परमाणु लेंस फाइबर कोशिकाओं के एसईएम और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप छवियां। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए फाइबर कोशिकाओं को डब्ल्यूजीए (हरा) और फैलोइडिन (एफ-एक्टिन, लाल) से दाग दिया जाता है। (ए) लेंस केंद्र की ओर सबसे बाहरी परतों से परमाणु तंतुओं की एसईएम छवियां कोशिकाओं (तीरों) के छोटे किनारों पर असंगत और बड़े इंटरलॉकिंग प्रोट्रूशियंस को प्रकट करती हैं। इन कोशिकाओं में कोशिका झिल्ली खुरदरी होती है, जिसमें सबसे भीतरी कोशिकाओं में जीभ-और-नाली इंटरडिजिटेशन (तारांकन) और गोलाकार झिल्ली आकृति विज्ञान होता है। (बी) एकल परमाणु लेंस तंतुओं के माध्यम से कॉन्फोकल जेड-स्टैक्स के 3 डी पुनर्निर्माण में एसईएम छवियों के समान विशेषताएं हैं, जिसमें छोटे पक्षों (तीर), जीभ-और-नाली इंटरडिजिटेशन (तारांकन) के साथ प्रोट्रूशियंस और खुरदरी झिल्ली आकृति विज्ञान शामिल हैं जो डब्ल्यूजीए धुंधला होने के साथ स्पष्ट है। एफ-एक्टिन एक नेटवर्क बनाता है जो सेल साइटोप्लाज्म को भरता है और कमजोर रूप से प्रोट्रूशियंस में फैलता है। स्केल सलाखों = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल ने निर्धारण, संरक्षण और इम्यूनोस्टेनिंग विधियों का प्रदर्शन किया है जो लेंस में विभिन्न गहराई से बंडलों या एकवचन लेंस फाइबर कोशिकाओं के 3 डी झिल्ली आकृति विज्ञान को ईमानदारी से संरक्षित करते हैं। दाग वाले लेंस फाइबर की तुलना एसईएम तैयारी के साथ की जाती है जो लंबे समय से लेंस फाइबर सेल आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। परिणाम दोनों तैयारियों के बीच तुलनीय झिल्ली संरचनाओं को दिखाते हैं। ईएम सेल आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए स्वर्ण मानक बना हुआ है, लेकिन प्रोटीन33,34,35 के स्थानीयकरण के लिए एसईएम नमूनों में इम्यूनोलेबलिंग अधिक चुनौतीपूर्ण है और छवि बनाने के लिए एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। इस इम्यूनोस्टेनिंग विधि का लाभ यह है कि एक साथ कई लक्ष्यों को लेबल किया जा सकता है, और छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर एकत्र किया जाता है।

जबकि विधि जटिल कोशिका आकृति विज्ञान को संरक्षित करती है, एसईएम को अभी भी आनुवंशिक उत्परिवर्तन, उम्र बढ़ने, दवा उपचार आदि के कारण नियंत्रण और परिवर्तित लेंस फाइबर के बीच इंटरडिजिटेशन की तुलना करने की आवश्यकता होती है। इम्यूनोस्टेनिंग तैयारी लेंस कॉर्टेक्स या नाभिक से कोशिकाओं का मिश्रण बनाती है जो स्लाइड पर यादृच्छिक रूप से वितरित की जाती हैं। इस प्रकार, यदि कोशिकाओं की आकृति विज्ञान को बदल दिया जाता है, तो धुंधला होने के लिए पृथक्करण से पहले लेंस में कोशिकाओं की गहराई को समझना अधिक कठिन हो सकता है। इन मामलों में, उच्च स्थानिक सटीकता के लिए लेंस फाइबर के छोटे बंडलों को निर्धारित करने और धुंधला करने के बाद लेंस को रुचि के क्षेत्रों में विच्छेदित करना आवश्यक हो सकता है। धुंधला परिणामों की तुलना एसईएम छवियों से भी की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि इम्यूनोस्टेन्ड फाइबर परिवर्तित कोशिकाओं की आकृति विज्ञान को संरक्षित करते हैं।

यह पहली बार दिखाया गया है कि इस नई बनाई गई विधि का उपयोग करके परमाणु फाइबर कोशिकाओं को धुंधला करने के लिए भी संरक्षित किया जा सकता है। नाभिक के निर्धारण से पहले लेंस कॉर्टेक्स को हटाना महत्वपूर्ण है क्योंकि पूरे लेंस27 को ठीक करते समय फिक्सेटिव पेनेट्रेशन लेंस नाभिक तक नहीं पहुंचता है। लेंस नाभिक को अलग करने के लिए इस प्रोटोकॉल की विधि नरम कॉर्टिकल लेंस फाइबर के यांत्रिक निष्कासन का वर्णन करती है। यह बहुत कठोर और कॉम्पैक्ट लेंस नाभिक 28,30,36 के कारण कृंतक लेंस में संभव है। अन्य प्रजातियों में, लेंस नाभिक नरम होता है और धुंधला होने के लिए उन कोशिकाओं को अलग करने के लिए अन्य तरीकों की आवश्यकता हो सकती है। इससे पहले, एक नरम लेंस नाभिक के साथ नॉकआउट माउस लाइन से कॉर्टिकल फाइबर कोशिकाओं को हटाने के लिए एक भंवर विधि का उपयोग किया गया था जिसे यांत्रिक हटानेसे मज़बूती से अलग नहीं किया जा सकता था।

जबकि हमने इन प्रतिनिधि डेटा में प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला पन प्रदर्शित नहीं किया है, हमने पहले प्राथमिक एंटीबॉडी और उचित द्वितीयक एंटीबॉडी22,23 के साथ उसी प्रकार का धुंधलापन किया है। हमारे अनुभव में, कई झिल्ली प्रोटीनों में एक पुंटेट संकेत होता है, और इस प्रकार परमाणु फाइबर में कॉर्टिकल फाइबर या डब्ल्यूजीए में डब्ल्यूजीए या एफ-एक्टिन के उपयोग की सिफारिश कोशिका झिल्ली प्रोटीन को बेहतर स्थानीयकृत करने और सेल भेदभाव और परिपक्वता के प्रत्येक चरण को पहचानने के लिए कोशिका झिल्ली को स्पष्ट रूप से चित्रित करने के लिए की जाती है। डब्ल्यूजीए या एफ-एक्टिन धुंधला एक दृश्य चैनल (लाल, हरे या नीले) में होना चाहिए ताकि पर्यवेक्षक को आसानी से आईपीस का उपयोग करके इमेजिंग के लिए उपयुक्त कोशिकाओं को खोजने की अनुमति मिल सके। इस प्रकार की झिल्ली धुंधला होने से यांत्रिक रूप से क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को बाहर करने के लिए निर्धारण, धुंधला पन और बढ़ती प्रक्रिया से कोशिकाओं को किसी भी नुकसान की पहचान करने में भी मदद मिल सकती है। इस और पिछले कार्यों22,23 में, यांत्रिक रूप से क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को शायद ही कभी देखा जाता है।

इस विधि को इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की रोगी और व्यवस्थित परीक्षा की आवश्यकता होती है। कोशिकाओं का यादृच्छिक मिश्रण पहली नज़र में काफी चुनौतीपूर्ण हो सकता है, लेकिन इष्टतम अभिविन्यास में पड़ी कोशिकाएं आमतौर पर पाई जा सकती हैं। इस विधि को अन्य प्रजातियों से अलग लेंस फाइबर के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। बड़े लेंस में, इम्यूनोस्टेनिंग से पहले कोशिकाओं की विभिन्न परतों को अलग करने के लिए सावधानीपूर्वक विच्छेदन का उपयोग करना संभव हो सकता है। सारांश में, इस अध्ययन ने फाइबर या एकल फाइबर कोशिकाओं के बंडलों को संरक्षित करने के लिए एक मजबूत और विश्वसनीय तरीका बनाया है ताकि उनकी जटिल आकृति विज्ञान का अध्ययन किया जा सके और इन विशेष कोशिकाओं में 3 डी में प्रोटीन का स्थानीयकरण किया जा सके। परमाणु फाइबर धुंधला करने के लिए यह अनूठा प्रोटोकॉल लेंस के कम अच्छी तरह से अध्ययन किए गए केंद्रीय तंतुओं में अध्ययन का एक नया क्षेत्र खोलता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय नेत्र संस्थान से अनुदान आर 01 EY032056 (सीसी को) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों के साथ उनकी सहायता के लिए स्क्रिप्स रिसर्च कोर माइक्रोस्कोपी सुविधा में डॉ थेरेसा फेसेल और किम्बर्ली वेंडरपूल को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Triton X-100 FisherScientific BP151-500
60mm plate FisherScientific FB0875713A
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
10X phosphate buffered saline ThermoFisher 70011-044
1X phosphate buffered saline ThermoFisher 14190136
48-well plate CytoOne CC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm) FisherScientific 12-553-467
Curved tweezers World Precision Instruments 501981
Dissection microscope Carl Zeiss Stereo Discovery V8
Fine tip straight tweezers Electron Microscopy Sciences 72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides FisherScientific 12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software Carl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Phalloidin (rhodamine) ThermoFisher R415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 VWR 76241-186
Secondary antibody
Straight forceps World Precision Instruments 11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) FisherScientific 12-565-154
Ultra-fine scissors World Precision Instruments 501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein) Vector Laboratories FL-1021-5

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References

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तैयारी इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला बंडल एकल फाइबर कोशिकाएं कॉर्टेक्स नाभिक आंख लेंस पारदर्शी अंग पूर्वकाल कक्ष रेटिना स्पष्ट छवि विशेष फाइबर कोशिकाएं हेक्सागोनल क्रॉस सेक्शन पूर्वकाल ध्रुव पीछे का ध्रुव इंटरडिजिटेशन इंटरलॉकिंग संरचनाएं बायोमैकेनिकल गुण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक संरक्षित इम्यूनोस्टेन माउस लेंस फाइबर कोशिकाएं प्रोटीन का विस्तृत स्थानीयकरण जटिल आकार की कोशिकाएं।
आंख लेंस के कॉर्टेक्स और न्यूक्लियस से बंडलों और एकल फाइबर कोशिकाओं की तैयारी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
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Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and … More

Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens. J. Vis. Exp. (196), e65638, doi:10.3791/65638 (2023).

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