आंख लेंस के कॉर्टेक्स और न्यूक्लियस से बंडलों और एकल फाइबर कोशिकाओं की तैयारी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
Summary
यह प्रोटोकॉल जटिल सेल-टू-सेल इंटरडिजिटेशन और झिल्ली वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के लिए परिधीय, परिपक्व और परमाणु आंख लेंस फाइबर कोशिकाओं को तैयार करने के तरीकों का वर्णन करता है।
Abstract
लेंस आंख के पूर्ववर्ती कक्ष में एक पारदर्शी और दीर्घवृत्त अंग है जो एक स्पष्ट छवि बनाने के लिए रेटिना पर प्रकाश को बारीक केंद्रित करने के लिए आकार बदलता है। इस ऊतक के थोक में विशेष, विभेदित फाइबर कोशिकाएं शामिल होती हैं जिनमें एक हेक्सागोनल क्रॉस सेक्शन होता है और लेंस के पूर्ववर्ती से पीछे के ध्रुवों तक फैलता है। ये लंबी और पतली कोशिकाएं पड़ोसी कोशिकाओं के कसकर विरोध करती हैं और सेल की लंबाई के साथ जटिल इंटरडिजिटेशन होती हैं। लेंस के सामान्य बायोमेकेनिकल गुणों के लिए विशेष इंटरलॉकिंग संरचनाओं की आवश्यकता होती है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग करके बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है। यह प्रोटोकॉल इन जटिल आकार की कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन के विस्तृत स्थानीयकरण की अनुमति देने के लिए माउस लेंस फाइबर कोशिकाओं के साथ-साथ माउस लेंस फाइबर कोशिकाओं के बंडलों को संरक्षित और इम्यूनोस्टेन करने की पहली विधि को प्रदर्शित करता है। प्रतिनिधि डेटा लेंस के सभी क्षेत्रों में परिधीय, विभेदक, परिपक्व और परमाणु फाइबर कोशिकाओं का धुंधलापन दिखाता है। इस विधि का उपयोग संभावित रूप से अन्य प्रजातियों के लेंस से अलग फाइबर कोशिकाओं पर किया जा सकता है।
Introduction
लेंस आंख के पूर्ववर्ती कक्ष में एक स्पष्ट और ओवॉइड ऊतक है जो दो सेल प्रकारों, उपकला और फाइबर कोशिकाओं से बना है1 (चित्रा 1)। उपकला कोशिकाओं का एक मोनोलेयर है जो लेंस के पूर्ववर्ती गोलार्ध को कवर करता है। फाइबर कोशिकाओं को उपकला कोशिकाओं से अलग किया जाता है और लेंस का बड़ा हिस्सा बनाते हैं। अत्यधिक विशिष्ट फाइबर कोशिकाएं एक बढ़ाव, भेदभाव और परिपक्वता प्रोग्रामिंग से गुजरती हैं, जो लेंस परिधि से लेंस केंद्र2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 तक कोशिका झिल्ली आकृति विज्ञान में अलग-अलग परिवर्तनों द्वारा चिह्नित होती हैं।, लेंस नाभिक के रूप में भी जाना जाता है। रेटिना पर विभिन्न दूरी से आने वाले ठीक-फोकस प्रकाश के लिए लेंस का कार्य इसके बायोमैकेनिकल गुणों पर निर्भर करता है, जिसमें कठोरता और लोच 13,14,15,16,17,18,19 शामिल हैं। लेंस फाइबर के जटिल इंटरडिजिटेशन की परिकल्पना20,21 की गई है और हाल ही में लेंस कठोरता22,23 के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है।
चित्रा 1: लेंस शरीर रचना आरेख और लेंस फाइबर से प्रतिनिधि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) छवियां। कार्टून उपकला कोशिकाओं (हल्के नीले रंग में छायांकित) और लेंस फाइबर कोशिकाओं (सफेद) के पूर्वकाल मोनोलेयर का एक अनुदैर्ध्य (पूर्वकाल से पीछे तक) दृश्य दिखाता है। लेंस के केंद्र (गुलाबी रंग में छायांकित) को नाभिक के रूप में जाना जाता है और इसमें अत्यधिक कॉम्पैक्ट फाइबर कोशिकाएं शामिल होती हैं। दाईं ओर, एक क्रॉस-सेक्शन कार्टून लेंस फाइबर के लम्बी षट्भुज कोशिका आकार को प्रकट करता है जो एक मधुकोश पैटर्न में पैक किया जाता है। फाइबर कोशिकाओं में दो व्यापक पक्ष और चार छोटे पक्ष होते हैं। नीचे के साथ प्रतिनिधि एसईएम छवियां लेंस की विभिन्न गहराई पर लेंस फाइबर कोशिकाओं के बीच जटिल झिल्ली इंटरडिजिटेशन दिखाती हैं। दाईं ओर, लेंस परिधि पर नवगठित लेंस फाइबर में छोटे किनारों के साथ छोटे प्रोट्रूशियंस होते हैं और चौड़ी तरफ (लाल बक्से) के साथ बॉल-एंड-सॉकेट होते हैं। परिपक्वता के दौरान, लेंस फाइबर बड़े पैडल डोमेन विकसित करते हैं जो छोटे पक्षों (नीले बक्से) के साथ छोटे प्रोट्रूशियंस द्वारा सजाए जाते हैं। परिपक्व फाइबर कोशिकाओं में छोटे प्रोट्रूशियंस द्वारा चित्रित बड़े पैडल डोमेन होते हैं। ये इंटरलॉकिंग डोमेन लेंस बायोमैकेनिकल गुणों के लिए महत्वपूर्ण हैं। लेंस नाभिक में फाइबर कोशिकाओं में उनके छोटे किनारों के साथ कम छोटे प्रोट्रूशियंस होते हैं और जटिल जीभ-और-नाली इंटरडिजिटेशन (बैंगनी बक्से) होते हैं। कोशिका के व्यापक पक्ष एक गोलाकार झिल्ली आकृति विज्ञान प्रदर्शित करते हैं। कार्टूनको 22,32 से संशोधित किया गया था और पैमाने पर तैयार नहीं किया गया था। स्केल बार = 3 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
लेंस फाइबर24,25 की पिछली पीढ़ियों के शीर्ष पर नई फाइबर कोशिकाओं के गोले जोड़कर बढ़ता है। फाइबर कोशिकाओं में दो व्यापक पक्षों और चार छोटे पक्षों के साथ एक लम्बी, हेक्सागोनल क्रॉस सेक्शन आकार होता है। ये कोशिकाएं लेंस के पूर्ववर्ती से पीछे के ध्रुव तक फैली हुई हैं, और प्रजातियों के आधार पर, लेंस फाइबर लंबाई में कई मिलीमीटर हो सकते हैं। इन लम्बी और पतली कोशिकाओं की संरचना का समर्थन करने के लिए, व्यापक और छोटे पक्षों के साथ विशेष इंटरडिजिटेशन लेंस आकार और बायोमैकेनिकल गुणों को बनाए रखने के लिए इंटरलॉकिंग संरचनाएं बनाते हैं। फाइबर सेल भेदभाव और परिपक्वता के दौरान कोशिका झिल्ली के आकार में परिवर्तन को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम)अध्ययन 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 द्वारा बड़े पैमाने पर प्रलेखित किया गया है।. नवगठित फाइबर कोशिकाओं में उनके छोटे किनारों के साथ बहुत छोटे प्रोट्रूशियंस के साथ बॉल-एंड-सॉकेट होते हैं, जबकि परिपक्व फाइबर में उनके छोटे किनारों के साथ इंटरलॉकिंग प्रोट्रूशियंस और पैडल होते हैं। परमाणु फाइबर जीभ-और-नाली इंटरडिजिटेशन और गोलाकार झिल्ली आकृति विज्ञान प्रदर्शित करते हैं। इन जटिल इंटरलॉकिंग झिल्ली के लिए आवश्यक प्रोटीन के बारे में बहुत कम जानकारी है। फाइबर कोशिकाओं में प्रोटीन स्थानीयकरण पर पिछले अध्ययनों ने लेंस ऊतक वर्गों पर भरोसा किया है, जो जटिल सेल आर्किटेक्चर के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति नहीं देते हैं।
इस काम ने जटिल आकृति विज्ञान को संरक्षित करने और कोशिका झिल्ली और साइटोप्लाज्म के भीतर प्रोटीन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग की अनुमति देने के लिए लेंस फाइबर कोशिकाओं के एकल और बंडलों को ठीक करने के लिए एक नई विधि बनाई और परिपूर्ण की है। यह विधि ईएम अध्ययनों के डेटा के बराबर सेल झिल्ली वास्तुकला को ईमानदारी से संरक्षित करती है, और विशिष्ट प्रोटीन के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने की अनुमति देती है। हमारे पास पहले इम्यूनोस्टेन्ड कॉर्टिकल लेंस फाइबर हैं जो भेदभाव और परिपक्वता22,23 से गुजर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल में, लेंस न्यूक्लियस से फाइबर कोशिकाओं को दागने का एक नया तरीका भी है। यह प्रोटोकॉल फाइबर सेल परिपक्वता और लेंस न्यूक्लियस संघनन के दौरान झिल्ली इंटरडिजिटेशन में गठन और परिवर्तन के लिए तंत्र को समझने के लिए दरवाजा खोलता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल ने निर्धारण, संरक्षण और इम्यूनोस्टेनिंग विधियों का प्रदर्शन किया है जो लेंस में विभिन्न गहराई से बंडलों या एकवचन लेंस फाइबर कोशिकाओं के 3 डी झिल्ली आकृति विज्ञान को ईमानदारी से संरक्षित ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय नेत्र संस्थान से अनुदान आर 01 EY032056 (सीसी को) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों के साथ उनकी सहायता के लिए स्क्रिप्स रिसर्च कोर माइक्रोस्कोपी सुविधा में डॉ थेरेसा फेसेल और किम्बर्ली वेंडरपूल को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
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