Summary
Questo protocollo descrive i metodi per preparare le cellule delle fibre periferiche, mature e nucleari del cristallino per la colorazione in immunofluorescenza per studiare le complesse interdigitazioni cellula-cellula e l'architettura della membrana.
Abstract
Il cristallino è un organo trasparente ed ellissoide nella camera anteriore dell'occhio che cambia forma per focalizzare finemente la luce sulla retina per formare un'immagine chiara. La maggior parte di questo tessuto è costituita da cellule fibrose specializzate e differenziate che hanno una sezione trasversale esagonale e si estendono dai poli anteriori a quelli posteriori del cristallino. Queste cellule lunghe e sottili sono strettamente opposte alle cellule vicine e hanno complesse interdigitazioni lungo la lunghezza della cellula. Le strutture ad incastro specializzate sono necessarie per le normali proprietà biomeccaniche della lente e sono state ampiamente descritte utilizzando tecniche di microscopia elettronica. Questo protocollo dimostra il primo metodo per preservare e immunocolorare singole cellule di fibre di lenti di topo e fasci di cellule di fibre di lenti di topo per consentire la localizzazione dettagliata delle proteine all'interno di queste cellule di forma complessa. I dati rappresentativi mostrano la colorazione delle cellule periferiche, differenzianti, mature e nucleari in tutte le regioni del cristallino. Questo metodo può potenzialmente essere utilizzato su cellule fibrose isolate da lenti di altre specie.
Introduction
Il cristallino è un tessuto trasparente e ovoidale nella camera anteriore dell'occhio costituito da due tipi di cellule, cellule epiteliali e fibre 1 (Figura 1). C'è un monostrato di cellule epiteliali che copre l'emisfero anteriore del cristallino. Le cellule fibrose sono differenziate dalle cellule epiteliali e costituiscono la maggior parte del cristallino. Le cellule fibrose altamente specializzate subiscono una programmazione di allungamento, differenziazione e maturazione, caratterizzata da cambiamenti distinti nella morfologia della membrana cellulare dalla periferia del cristallino al centro del cristallino 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , noto anche come nucleo del cristallino. La funzione del cristallino di mettere a fuoco con precisione la luce proveniente da varie distanze sulla retina dipende dalle sue proprietà biomeccaniche, tra cui rigidità ed elasticità 13,14,15,16,17,18,19. Le complesse interdigitazioni delle fibre del cristallino sono state ipotizzate20,21 e recentemente hanno dimostrato di essere importanti per la rigidità del cristallino22,23.
Figura 1: Diagrammi anatomici della lente e immagini rappresentative di microscopia elettronica a scansione (SEM) dalle fibre della lente. La vignetta mostra una vista longitudinale (da anteriore a posteriore dall'alto verso il basso) del monostrato anteriore di cellule epiteliali (ombreggiato in azzurro) e una massa di cellule in fibra del cristallino (bianco). Il centro della lente (sfumato in rosa) è noto come nucleo e comprende cellule di fibre altamente compattate. A destra, una vignetta in sezione trasversale rivela la forma allungata delle celle esagonali delle fibre delle lenti che sono impacchettate in un motivo a nido d'ape. Le celle in fibra hanno due lati larghi e quattro lati corti. Immagini SEM rappresentative lungo il fondo mostrano le complesse interdigitazioni della membrana tra le cellule delle fibre della lente a diverse profondità della lente. Da destra, le fibre della lente appena formate alla periferia della lente hanno piccole sporgenze lungo i lati corti e sfere e prese lungo il lato largo (caselle rosse). Durante la maturazione, le fibre del cristallino sviluppano ampi domini a paletta che sono decorati da piccole sporgenze lungo i lati corti (scatole blu). Le cellule fibrose mature possiedono ampi domini a paletta illustrati da piccole sporgenze. Questi domini ad incastro sono importanti per le proprietà biomeccaniche delle lenti. Le cellule fibrose nel nucleo del cristallino hanno meno piccole sporgenze lungo i loro lati corti e hanno complesse interdigitazioni maschio-femmina (scatole viola). I lati larghi della cellula mostrano una morfologia di membrana globulare. Il cartone animato è stato modificato da22,32 e non disegnato in scala. Barra della scala = 3 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La lente cresce aggiungendo gusci di nuove celle di fibre sovrapposte alle precedenti generazioni di fibre24,25. Le celle in fibra hanno una forma a sezione trasversale allungata ed esagonale con due lati larghi e quattro lati corti. Queste cellule si estendono dal polo anteriore a quello posteriore del cristallino e, a seconda della specie, le fibre del cristallino possono essere lunghe diversi millimetri. Per sostenere la struttura di queste cellule allungate e sottili, interdigitazioni specializzate lungo i lati larghi e corti creano strutture ad incastro per mantenere la forma della lente e le proprietà biomeccaniche. I cambiamenti nella forma della membrana cellulare durante la differenziazione e la maturazione delle cellule delle fibre sono stati ampiamente documentati dagli studi di microscopia elettronica (EM) 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Le cellule fibrose di nuova formazione hanno sfere e prese lungo i loro lati larghi con sporgenze molto piccole lungo i loro lati corti, mentre le fibre mature hanno sporgenze e pale ad incastro lungo i loro lati corti. Le fibre nucleari mostrano interdigitazioni maschio-femmina e morfologia della membrana globulare. Poco si sa sulle proteine necessarie per queste complesse membrane ad incastro. Precedenti studi sulla localizzazione delle proteine nelle cellule fibrose si sono basati su sezioni di tessuto del cristallino, che non consentono una chiara visualizzazione della complessa architettura cellulare.
Questo lavoro ha creato e perfezionato un nuovo metodo per fissare singole cellule e fasci di cellule a fibra del cristallino per preservare la complessa morfologia e per consentire l'immunocolorazione delle proteine alla membrana cellulare e all'interno del citoplasma. Questo metodo preserva fedelmente l'architettura della membrana cellulare, paragonabile ai dati degli studi EM, e consente la colorazione con anticorpi primari per proteine specifiche. In precedenza abbiamo immunocolorato le fibre del cristallino corticale in fase di differenziazione e maturazione22,23. In questo protocollo, c'è anche un nuovo metodo per colorare le cellule delle fibre dal nucleo del cristallino. Questo protocollo apre le porte alla comprensione dei meccanismi di formazione e dei cambiamenti nelle interdigitazioni di membrana durante la maturazione delle cellule fibrose e la compattazione del nucleo del cristallino.
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Protocol
I topi sono stati curati sulla base di un protocollo per animali approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Università dell'Indiana a Bloomington. I topi utilizzati per generare dati rappresentativi erano animali di controllo (wild-type) nel background C57BL6/J, femmine e di età compresa tra 8 e 12 settimane. Sia i topi maschi che quelli femmine possono essere utilizzati per questo esperimento, poiché è molto improbabile che il sesso dei topi influenzi il risultato dell'esperimento.
1. Dissezione e decapsulamento delle lenti
- Sopprimere i topi seguendo la "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" del National Institutes of Health e i protocolli per l'uso degli animali approvati dall'istituzione.
NOTA: Per il presente studio, i topi sono stati sottoposti a eutanasia mediante sovradosaggio di CO2 seguito da lussazione cervicale in conformità con un protocollo animale approvato (Università dell'Indiana). - Enucleare gli occhi dai topi usando una pinza curva premendo il tessuto intorno agli occhi con un lato della pinza per spostare l'occhio fuori dall'orbita. Quindi, chiudi la pinza sotto l'occhio e sollevala per rimuovere l'occhio dall'orbita. Trasferire gli occhi in 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) fresca in un vassoio di dissezione.
- Tagliare il nervo ottico con forbici ultrasottili il più vicino possibile al bulbo oculare. Inserire con cautela una pinzetta diritta a punta fine nel bulbo oculare attraverso l'uscita del nervo ottico nella parte posteriore dell'occhio.
- Inserire con cautela le forbici nella stessa posizione delle pinzette nel passaggio 1.3 e iniziare a praticare un'incisione dalla parte posteriore verso la giunzione corneale-sclerale.
NOTA: Le lenti dei roditori occupano ~ 30% dei loro occhi. Si verificheranno danni accidentali se le pinzette o le forbici vengono inserite troppo in profondità nell'occhio. - Continuare a tagliare lungo la giunzione corneale-sclerale fino a quando almeno metà della giunzione non è stata separata.
- Utilizzare una pinzetta per spingere delicatamente sulla cornea in modo che il cristallino possa uscire attraverso l'incisione effettuata con i passaggi 1.4 e 1.5.
- Rimuovere con cautela eventuali pezzi di tessuto di grandi dimensioni dall'obiettivo utilizzando una pinzetta dritta a punta fine. Ispeziona l'obiettivo per trovare la regione equatoriale.
- Forare superficialmente la lente usando una pinzetta dritta a punta fine, quindi rimuovere la capsula della lente. La massa delle cellule della fibra del cristallino rimarrà intatta e il monostrato epiteliale del cristallino rimarrà attaccato alla capsula del cristallino. Gettare la capsula dell'obiettivo.
2. Colorazione delle cellule a fibra singola della lente
- Trasferire la massa cellulare della fibra del cristallino in una piastra a pozzetti con 500 μL di soluzione di paraformaldeide all'1% (PFA; in 1x PBS) appena prodotta e incubare i campioni a 4 °C per una notte con una nutazione delicata (Figura 2A).
NOTA: I volumi per le soluzioni fornite sono ottimizzati per piastre a 48 pozzetti. Se si utilizzano piastre a pozzetto o provette di un'altra dimensione, regolare di conseguenza i volumi delle soluzioni. Le soluzioni di fissaggio, blocco e lavaggio (1x PTX, 0,1% Triton X-100 in 1x PBS) sono state realizzate con 10x PBS e acqua bidistillata (ddH2O) fino a una concentrazione finale di 1x PBS. - Trasferire le celle della fibra dell'obiettivo in un piatto da 60 mm con l'1% di PFA. Utilizzare un bisturi affilato per dividere la palla di cellule fibrose a metà lungo l'asse anteriore-posteriore (Figura 2B). Tagliate di nuovo le metà a metà lungo lo stesso asse per produrre dei quarti.
NOTA: L'asse antero-posteriore è facilmente riconoscibile dalla direzione delle cellule fibrose nella massa tissutale. - Utilizzare una pinzetta diritta per rimuovere la regione del nucleo dai quarti delle cellule della fibra del cristallino (Figura 2C).
NOTA: La regione del nucleo del cristallino è rigida nelle lenti per roditori e il centro del cristallino si separerà facilmente dalle fibre corticali più morbide. - Post-fissare i quarti della regione della corteccia del cristallino in 200 μL di PFA all'1% per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) agitando delicatamente (300 giri/min su uno shaker per piastre).
- Lavare i quarti di tessuto due volte in 750 μL di 1x PBS per 5 minuti ciascuno con agitare delicatamente a RT.
- Bloccare i campioni utilizzando 200 μL di soluzione bloccante (5% di siero, 0,3% Triton X-100, 1x PBS) per 1 ora a RT con agitazione delicata.
NOTA: Per i dati rappresentativi di questo protocollo, i campioni non sono stati colorati con anticorpi primari o secondari. Dopo la fase di blocco, i campioni sono stati incubati con agglutinina del germe di grano (WGA; 1:100) e falloidina (1:100) (vedi Tabella dei materiali) per 3 ore a RT con agitazione delicata e protezione dalla luce. La colorazione primaria degli anticorpi è stata dimostrata in precedenti pubblicazioni22,23. - Incubare con 100 μL di soluzione anticorpale primaria per una notte a 4 °C agitando delicatamente.
NOTA: Gli anticorpi sono diluiti in soluzione bloccante. Rispetto ai vetrini con sezioni di tessuto, ci sono più cellule in questo tipo di preparazione. Le concentrazioni di anticorpi primari devono essere aumentate per fornire un'ampia quantità di anticorpi per colorare più cellule. Si raccomanda di raddoppiare la concentrazione di anticorpi rispetto a quella utilizzata sulle sezioni di tessuto. Lo stesso vale per gli anticorpi secondari. - Lavare i quarti di tessuto tre volte con 1x PTX (0,1% Triton X-100, 1x PBS) per 5 minuti ciascuno a RT agitando delicatamente.
- Incubare le cellule fibrose con 100 μL di soluzione anticorpo/colorante secondaria per 3 ore a RT agitando delicatamente. Proteggere i campioni dalla luce durante questa e le fasi successive.
NOTA: WGA, falloidina e altri coloranti fluorescenti possono essere aggiunti alla soluzione anticorpale secondaria per la marcatura simultanea della membrana cellulare, del citoscheletro o di altri organelli, marcando anche l'anticorpo primario. - Lavare le celle in fibra quattro volte con 1x PTX per 5 minuti ciascuna a RT con agitazione delicata.
- Aggiungere una goccia o 50 μL di terreno di montaggio su un vetrino da microscopio caricato più prima di trasferire i quarti di tessuto sul vetrino.
- Usa le pinzette per separare delicatamente le cellule della fibra l'una dall'altra e cerca di limitare la sovrapposizione dei fasci cellulari.
- Applicare delicatamente un vetrino coprioggetto #1.5 sopra il campione nel terreno di montaggio. Il supporto di montaggio deve diffondersi fino al bordo del vetrino coprioggetto; Se ciò non si verifica, aggiungere altri supporti di montaggio sul bordo del vetrino coprioggetti. Aspirare il materiale di montaggio in eccesso attorno al bordo del vetrino coprioggetto e utilizzare lo smalto per unghie per sigillare i bordi del vetrino coprioggetto sul vetrino.
NOTA: Per questi esperimenti è possibile utilizzare qualsiasi tipo di mezzo di montaggio formulato per la microscopia confocale.
3. Colorazione delle cellule a fibra singola del nucleo del cristallino
- Completare la dissezione descritta nella sezione 1.
- Rimuovere meccanicamente le fibre corticali dalla sfera delle cellule delle fibre del cristallino, lasciando il nucleo del cristallino, trasferendo delicatamente la massa cellulare della fibra sulla punta delle dita bagnate e guantate e facendo rotolare delicatamente la massa tissutale.
NOTA: Nelle lenti di topo, far rotolare la palla di cellule della fibra del cristallino tra i polpastrelli guantati è un metodo efficace per la rimozione delle cellule della fibra corticale dal nucleo del cristallinoduro 28,30. Per le lenti in cui questo metodo meccanico non è efficace, può essere utilizzata un'attenta dissezione o un metodo a vortice29 per rimuovere le cellule delle fibre corticali. - Trasferire il nucleo del cristallino in una soluzione di PFA all'1% appena preparata in una piastra a pozzetti e incubare per una notte a 4 °C agitando delicatamente.
- Trasferire il campione in un piatto da 60 mm con PFA all'1% e utilizzare un bisturi affilato per dividere il nucleo del cristallino lungo l'asse antero-posteriore. Dimezzare nuovamente i campioni di tessuto per produrre i quarti del nucleo.
- Seguire la procedura descritta nei passaggi 2.4-2.13 per l'immunocolorazione e il montaggio del campione.
Figura 2: Riepilogo grafico che descrive in dettaglio la preparazione e l'immunocolorazione delle cellule delle fibre del cristallino . (A) Questa piastra a 48 pozzetti è stata codificata a colori per colonna per dimostrare una configurazione della piastra campione per i metodi descritti, consentendo un facile trasferimento dei campioni tra le varie fasi di immunocolorazione mediante una manipolazione delicata con le pinze. Sebbene i dati rappresentativi di questo protocollo non siano incubati con un anticorpo primario, il diagramma include una colonna per l'incubazione degli anticorpi primari e i pozzetti per il lavaggio possono essere riutilizzati dopo aver rimosso i tamponi di lavaggio usati mediante aspirazione. (B) Dopo la fissazione della massa cellulare della fibra del cristallino, il tessuto viene diviso lungo l'asse anteriore-posteriore (linee tratteggiate rosse) per preservare la struttura originale delle cellule. Una volta che la massa tissutale è stata dimezzata, i campioni vengono ruotati e le metà divise in quarti lungo l'asse antero-posteriore (linee tratteggiate rosse). (C) La rimozione della regione del nucleo del cristallino (in rosa) è facilmente eseguibile utilizzando una pinzetta per estrarre il denso tessuto centrale dalle cellule della fibra corticale (in blu). I diagrammi dei cartoni animati sono stati parzialmente creati utilizzando BioRender.com e non disegnati in scala. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
Le cellule della fibra del cristallino vengono preparate dalla corteccia del cristallino (fibre differenzianti e fibre mature) e dal nucleo e le cellule vengono colorate con falloidina per la F-actina e WGA per la membrana cellulare. Una miscela di fasci di cellule o fibre di lenti singole (Figura 3) viene osservata e visualizzata. Dalla corteccia del cristallino si trovano due tipi di cellule (Figura 3A). Le cellule delle fibre differenzianti nella periferia del cristallino sono diritte, con sporgenze molto piccole lungo i loro lati corti. Man mano che la cellula si differenzia, le cellule della fibra diventano ondulate con piccole sporgenze ad incastro. Inoltre, lungo il processo di maturazione, le cellule fibrose sviluppano grandi pale decorate con piccole sporgenze ad incastro. Il nucleo del cristallino è altamente compatto e rigido nelle lenti di topo ed è isolato tramite la rimozione meccanica della corteccia del cristallino più morbida prima della fissazione e della colorazione delle fibre del cristallino nucleare. Dal nucleo della lente si trovano fasci di fibre della lente che hanno un diametro più piccolo e hanno strutture di membrana fini che non possono essere facilmente viste su un'immagine a basso ingrandimento.
Nelle ricostruzioni 3D ad alto ingrandimento di cellule della fibra del cristallino provenienti da diverse regioni del cristallino (Figura 3B), si è riscontrato che la F-actina e la WGA sono altamente colocalizzate sulla membrana cellulare nelle cellule a fibra differenziate e mature. La F-actina è arricchita nelle protrusioni ad incastro lungo la membrana cellulare in fibre differenzianti e mature (Figura 3B, punte di freccia). Le cellule fibrose mature sviluppano grandi palette ad incastro (Figura 3B, asterischi). La colorazione WGA non è completamente colocalizzata con il segnale F-actina, specialmente nella cellula matura della fibra, suggerendo che la rete corticale di actina non supporta tutte le strutture più piccole lungo la membrana cellulare. Inaspettatamente, si scopre che la rete F-actina si trova all'interno del citoplasma delle cellule delle fibre nucleari. Mentre il segnale di F-actina si estende nelle protrusioni (Figura 3B, frecce) lungo la membrana cellulare della fibra nucleare, la rete di actina non è più arricchita vicino alla membrana cellulare o all'interno delle protrusioni. La morfologia della cellula della fibra nucleare manca di pale, oltre a una diminuzione dell'organizzazione e della frequenza delle sporgenze.
Figura 3: Immagini confocali di fasci (a basso ingrandimento) e immagini singole (ad alto ingrandimento) di cellule in fibra provenienti da diverse regioni dell'obiettivo. Le cellule sono colorate con WGA (membrane cellulari, verde), falloidina (F-actina, rosso) e DAPI (nuclei, blu). (A) In queste preparazioni, si trovano spesso fasci di cellule di fibre del cristallino provenienti da diverse regioni. Nei preparati corticali sono presenti cellule fibrose differenzianti e mature. Queste diverse cellule hanno morfologie distinte, che consentono una facile identificazione. Nei campioni prelevati dal nucleo del cristallino, si trovano fasci di cellule fibrose e fibre dissociate. Barra di scala = 50 μm. (B) Vengono raccolti Z-stack attraverso singole celle a fibra differenziante, mature e nucleari e viene utilizzato il rendering 3D per ricostruire le immagini mostrate. Le fibre differenzianti e mature hanno molte piccole sporgenze lungo i loro lati corti (le punte delle frecce segnano quelle selezionate). Queste piccole sporgenze sono arricchite per la F-actina. La fibra matura ha anche grandi domini di paletta ad incastro (asterischi). Le fibre nucleari hanno piccole tasche di membrana e avvallamenti colorati da WGA e conservano alcune sporgenze lungo i loro lati corti (frecce). Sorprendentemente, la rete di F-actina è ora distribuita nel citoplasma cellulare senza segnali arricchiti sulla membrana cellulare. La rete di F-actina si estende in piccole protrusioni. Barra della scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Quando si esaminano le cellule in fibra, è importante notare l'orientamento delle cellule per evitare confusione sul tipo di cellula osservata. Le pile Z vengono raccolte attraverso le celle, quindi la ricostruzione 3D viene utilizzata per esaminare le proiezioni 2D ortogonali nei piani XY, XZ e YZ. A causa dell'orientamento casuale delle cellule in questa preparazione, è possibile avere cellule che non giacciono perfettamente piatte sul vetrino (Figura 4). Tutte le cellule in questa immagine rappresentativa sono fibre mature del cristallino, ma ogni cellula ha un aspetto drasticamente diverso nel piano XY. La cellula pseudo-colorata in verde è orientata con il lato largo rivolto verso l'alto con pale e sporgenze visibili, mentre la cellula pseudo-colorata in rosa è sdraiata con il lato corto rivolto verso l'alto. Questo è più facilmente visualizzabile nel piano XZ, mostrando gli orientamenti perpendicolari delle due celle mostrate nel piano XY. L'esame del piano YZ mostra chiaramente le pale della fibra matura che è colorata di rosa dal piano XY.
Figura 4: Proiezioni 2D ortogonali (piani XY, XZ e YZ) di z-stack confocali 3D attraverso un gruppo di singole cellule di fibre del cristallino mature colorate con falloidina per la F-actina. Due celle sono pseudo-colorate in rosa o verde per l'identificazione su ciascun piano. Nel piano XY, la cellula rosa giace con il lato corto rivolto verso l'alto, mentre la cellula verde giace piatta con il lato largo rivolto verso l'alto. Nel piano XZ, si osserva che la cella rosa è inclinata nell'orientamento, mentre la cella verde è parallela al vetrino. Nel piano YZ si osservano le pale e le sporgenze delle cellule rosa, confermando che questa cellula è una cellula a fibra matura. Barra della scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Poiché le fibre hanno uno spessore di circa 2-4 μm25,31, è possibile attraverso la raccolta di z-stack visualizzare la superficie cellulare o un piano attraverso il citoplasma (Figura 5). Questo funziona meglio su celle che sono quasi parallele al vetrino coprioggetto, con il lato largo della cella rivolto verso l'alto. La superficie cellulare in questa cella a fibra matura può essere apprezzata osservando il segnale WGA (Figura 5A). Il piano XZ mostra chiaramente che questo piano XY si trova lungo il lato largo della cella. I piccoli punti WGA+ lungo la membrana suggeriscono una morfologia ruvida della superficie cellulare. Le piccole sporgenze lungo il lato corto nelle immagini a bassa esposizione mostrano un segnale di F-actina notevolmente arricchito. A un'esposizione più elevata, dove il segnale di F-actina nelle protrusioni è saturo, si osserva una rete di F-actina reticolata fine attraverso la membrana cellulare (asterischi). Quando si considera un piano XY attraverso il citoplasma della fibra matura (Figura 5B), la colorazione WGA si osserva principalmente lungo la membrana cellulare. Analogamente a quanto osservato sulla superficie cellulare, la F-actina è arricchita nelle protrusioni lungo i lati corti, con una rete citoplasmatica reticolata di F-actina visibile a una maggiore esposizione (asterischi). Il nostro lavoro precedente ha mostrato la colorazione per le proteine di membrana nei piani XY attraverso il citoplasma cellulare22,23, ma con questo metodo è anche possibile localizzare le proteine lungo l'ampia superficie laterale della cellula.
Figura 5: Proiezioni 2D ortogonali (piani XY e XZ) di z-stack confocali 3D attraverso una singola cellula a fibra matura colorata con WGA (verde) e falloidina (F-actina, rosso). (A) Le proiezioni dalla superficie cellulare lungo il lato largo mostrano WGA lungo la membrana cellulare e i punti di WGA suggeriscono che la membrana non è completamente liscia. La F-actina è arricchita nelle sporgenze lungo i lati corti e un'immagine ad alta esposizione della colorazione della F-actina rivela una rete reticolata lungo la membrana cellulare (asterischi). (B) Un altro piano attraverso il citoplasma della stessa cellula mostra WGA lungo la membrana cellulare, incorniciando la cellula. La F-actina forma una rete reticolata attraverso il citoplasma (asterischi) ed è notevolmente arricchita nelle sporgenze lungo la membrana cellulare. Barre di scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Successivamente, vengono confrontate le immagini delle fibre del cristallino dagli esperimenti di scansione EM (SEM) e colorazione. Gli esperimenti SEM vengono eseguiti come descrittoin precedenza 29 e le immagini vengono prese in sequenza dal centro del campione alla periferia. Innanzitutto, vengono esaminate le fibre differenzianti delle lenti con piccole sporgenze (Figura 6, frecce) lungo i loro lati corti e una sfera e una presa (punte di freccia) lungo i loro lati larghi. Analogamente all'immagine SEM (Figura 6A), in un fascio di fibre differenzianti orientate lungo i loro lati corti, le interdigitazioni sferiche e prese sono grandi sporgenze e scanalature che si estendono lungo il lato largo delle celle (Figura 6B, punte di freccia). Un invasamento viene trovato (Figura 6C, punte di freccia) quando la cellula nelle proiezioni 2D ortogonali XY e XZ viene visualizzata in singole fibre di lenti differenzianti. Piccole sporgenze ad incastro lungo i lati corti sono anche fedelmente conservate in queste celle di fibre di lenti colorate rispetto a quelle dell'immagine SEM (frecce). Successivamente, viene studiata la morfologia delle cellule fibrose mature (Figura 7). Nell'immagine SEM e nella cellula colorata, ci sono piccoli avvallamenti lungo il lato largo delle cellule (Figura 7A,B, punte di freccia). Presumibilmente, questi sono i resti delle interdigitazioni sferiche che si stanno restringendo durante il processo di maturazione. Le grandi pale (asterischi) decorate da piccole sporgenze ad incastro (frecce) sono comparabili tra le cellule in SEM e la fibra matura colorata. Le cellule nell'immagine SEM hanno anche scanalature evidenti in cui una sporgenza ad incastro si aggancia alla membrana cellulare (Figura 7C, punte di freccia). Queste scanalature possono essere viste anche in queste cellule colorate e sono riempite dal segnale WGA (Figura 7D, punte di freccia). I solchi possono sembrare sporgenze che vanno verso l'interno verso il citoplasma cellulare invece di proiettarsi verso l'esterno dalla membrana cellulare, e spesso solo la colorazione WGA è visibile nei solchi che hanno molto poco, se non nessuno, segnale di colorazione F-actina.
Figura 6: Immagini al microscopio SEM e confocale di cellule fibrose che differenziano dalla corteccia del cristallino. Le cellule in fibra per microscopia confocale sono colorate con WGA (verde) e falloidina (F-actina, rosso). (A) Il SEM di un fascio di fibre di lenti differenzianti mostra interdigitazioni sferiche (punte di freccia) lungo il lato largo delle cellule con piccole sporgenze ad incastro (frecce) lungo i lati corti delle cellule. (B) Le immagini confocali di un fascio di fibre differenzianti riprese dai lati corti mostrano grandi interdigitazioni sferiche lungo i lati larghi delle cellule (punte di freccia). (C) Proiezioni 2D ortogonali (piani XY e XZ) attraverso una singola fibra di lente differenziante mostrano un'interdigitazione sferica (punte di freccia) lungo il lato largo e piccole sporgenze ad incastro lungo il lato corto (frecce). Barre di scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Immagini al microscopio SEM e confocale di cellule fibrose mature dalla corteccia del cristallino. Le cellule in fibra per microscopia confocale sono colorate con WGA (verde) e falloidina (F-actina, rosso). (A) L'immagine SEM ha due fibre mature ad incastro con pale (asterischi) decorate da piccole sporgenze (frecce) lungo i lati corti delle cellule. Ci sono anche piccole rientranze (punte di freccia) lungo il lato largo della cella. Questi sono probabilmente i resti che si restringono delle sporgenze sferiche. Barra di scala = 5 μm. (B) Le proiezioni ortogonali 2D (piani XY e XZ) attraverso una singola fibra di lente matura hanno grandi pale (asterischi) e piccole sporgenze (frecce) ad incastro lungo i lati corti delle cellule. Piccoli anelli WGA+ (punte di freccia), simili alle rientranze nell'immagine SEM, sono visibili lungo il lato largo della cella. Queste strutture WGA+ non hanno colorazione F-actina. La F-actina è per lo più arricchita sulla membrana cellulare nelle piccole sporgenze e ha un debole modello di colorazione reticolato nel citoplasma. Barra della scala = 5 μm. (C) Immagine SEM delle fibre mature che mostra molti solchi nella membrana cellulare (punte di freccia), dove le sporgenze delle cellule vicine si appoggiano e si incastrano. Barra della scala = 2 μm. (D) Una coppia di fibre mature che sono appena separate che mostrano scanalature (punte di freccia) colorate da WGA. I solchi non hanno arricchimento di colorazione F-actina e sembrano sporgenze che si estendono verso l'interno verso il citosol, piuttosto che estendersi verso l'esterno come una struttura ad incastro. Barra della scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Infine, le fibre del cristallino nucleare colorate vengono confrontate con le immagini delle preparazioni SEM. Questo nuovo metodo per fissare e colorare le fibre del cristallino nucleare preserva fedelmente la morfologia delle fibre del cristallino nucleare in diverse aree del cristallino (Figura 8). Le cellule a fibra nucleare hanno sporgenze ad incastro poco frequenti e più grandi lungo i loro lati corti (frecce). Le fibre del cristallino nucleare più esterne hanno una struttura ruvida della membrana cellulare, come si vede sia nel SEM che nelle immagini delle cellule colorate. Man mano che le cellule subiscono un'ulteriore compattazione verso il centro del nucleo, lungo la membrana cellulare compaiono interdigitazioni maschio-femmina (asterischi) e le fibre nucleari più interne hanno una morfologia della membrana globulare che può essere apprezzata nell'immagine SEM e con colorazione WGA. La F-actina non è più arricchita sulla membrana cellulare, ma forma una rete che riempie il citoplasma e si estende debolmente nelle sporgenze.
Figura 8: Immagini al microscopio SEM e confocale di cellule di fibre di lenti nucleari. Le cellule in fibra per microscopia confocale sono colorate con WGA (verde) e falloidina (F-actina, rosso). (A) Le immagini SEM delle fibre nucleari dagli strati più esterni verso il centro della lente rivelano sporgenze ad incastro poco frequenti e più grandi sui lati corti delle cellule (frecce). La membrana cellulare è ruvida in queste cellule, con interdigitazioni maschio-femmina (asterischi) e morfologia della membrana globulare nelle cellule più interne. (B) Le ricostruzioni 3D di z-stack confocali attraverso singole fibre di lenti nucleari hanno caratteristiche paragonabili alle immagini SEM, comprese le sporgenze lungo i lati corti (frecce), le interdigitazioni maschio-femmina (asterischi) e la morfologia ruvida della membrana che è evidente con la colorazione WGA. La F-actina forma una rete che riempie il citoplasma cellulare e si estende debolmente nelle sporgenze. Barre di scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo ha dimostrato i metodi di fissazione, conservazione e immunocolorazione che preservano fedelmente la morfologia della membrana 3D di fasci o singole cellule di fibre del cristallino da varie profondità nel cristallino. Le fibre colorate del cristallino vengono confrontate con i preparati SEM che sono stati a lungo utilizzati per studiare la morfologia delle cellule delle fibre del cristallino. I risultati mostrano strutture di membrana comparabili tra le due preparazioni. L'EM rimane il gold standard per lo studio della morfologia cellulare, ma l'immunomarcatura è più impegnativa nei campioni SEM per localizzare le proteine33,34,35 e richiede un microscopio elettronico per essere visualizzata. Il vantaggio di questo metodo di immunocolorazione è che è possibile etichettare più bersagli contemporaneamente e le immagini vengono raccolte su un microscopio confocale.
Mentre il metodo preserva la complessa morfologia cellulare, il SEM è ancora necessario per confrontare le interdigitazioni tra il controllo e le fibre del cristallino alterate a causa di mutazioni genetiche, invecchiamento, trattamenti farmaceutici, ecc. Il preparato immunocolorante crea una miscela di cellule dalla corteccia o dal nucleo del cristallino che sono distribuite in modo casuale sul vetrino. Pertanto, se la morfologia delle cellule è alterata, può essere più difficile discernere la profondità alla quale le cellule si trovavano nel cristallino prima della dissociazione per la colorazione. In questi casi, potrebbe essere necessario sezionare ulteriormente la lente nelle regioni di interesse dopo la fissazione e colorare fasci più piccoli di fibre della lente per una maggiore precisione spaziale. I risultati della colorazione devono anche essere confrontati con le immagini SEM per garantire che le fibre immunocolorate preservino la morfologia delle cellule alterate.
È stato dimostrato per la prima volta che le cellule in fibra nucleare possono anche essere conservate per la colorazione utilizzando questo metodo di nuova creazione. È importante rimuovere la corteccia del cristallino prima della fissazione del nucleo perché la penetrazione del fissativo non raggiunge il nucleo del cristallino quando si fissa l'intero cristallino27. Il metodo di questo protocollo per isolare il nucleo del cristallino descrive la rimozione meccanica delle fibre corticali più morbide del cristallino. Questo è possibile nelle lenti per roditori grazie al nucleo molto duro e compatto della lente 28,30,36. In altre specie, il nucleo del cristallino è più morbido e può richiedere altri metodi per isolare quelle cellule per la colorazione. In precedenza, veniva utilizzato un metodo di vortex per rimuovere le cellule delle fibre corticali da una linea di topo knockout con un nucleo di cristallino più morbido che non poteva essere isolato in modo affidabile mediante rimozione meccanica29.
Sebbene non sia stata dimostrata la colorazione degli anticorpi primari in questi dati rappresentativi, in precedenza abbiamo effettuato lo stesso tipo di colorazione con anticorpi primari e anticorpi secondari appropriati22,23. Nella nostra esperienza, molte delle proteine di membrana hanno un segnale puntinato, e quindi l'uso di WGA o F-actina nelle fibre corticali o WGA nelle fibre nucleari è raccomandato per delineare chiaramente la membrana cellulare per localizzare meglio le proteine della membrana cellulare e riconoscere ogni fase della differenziazione e della maturazione cellulare. La colorazione WGA o F-actina deve trovarsi in un canale visibile (rosso, verde o blu) per consentire all'osservatore di trovare facilmente le cellule appropriate per l'imaging utilizzando l'oculare. Questo tipo di colorazione della membrana può anche aiutare a identificare eventuali danni alle cellule derivanti dal processo di fissazione, colorazione e montaggio per escludere le cellule danneggiate meccanicamente. In questo e nei precedenti lavori22,23, raramente si osservano cellule danneggiate meccanicamente.
Questo metodo richiede un esame paziente e sistematico delle cellule per l'imaging. La miscela casuale di cellule può essere piuttosto scoraggiante a prima vista, ma di solito è possibile trovare cellule che si trovano nell'orientamento ottimale. Questo metodo potrebbe essere adattato per fibre di lenti isolate da altre specie. Nelle lenti più grandi, può essere possibile utilizzare un'attenta dissezione per separare i diversi strati di cellule prima dell'immunocolorazione. In sintesi, questo studio ha creato un metodo robusto e affidabile per preservare fasci di fibre o singole cellule a fibra per studiare la loro complessa morfologia e localizzare le proteine in 3D in queste cellule specializzate. Questo protocollo unico per la colorazione delle fibre nucleari apre una nuova area di studio sulle fibre centrali meno studiate del cristallino.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione R01 EY032056 (a CC) del National Eye Institute. Gli autori ringraziano la dottoressa Theresa Fassel e Kimberly Vanderpool della Scripps Research Core Microscopy Facility per la loro assistenza con le immagini al microscopio elettronico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
References
- Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
- Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).
- Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).
- Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens. Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).
- Lo, W. K., Harding, C. V. Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers. Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).
- Taylor, V. L., et al.
- Vrensen, G. F. Aging of the human eye lens-a morphological point of view. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).
- Vrensen, G. F., Duindam, H. J. Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations. Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation. Albrecht von Graefe's Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).
- Zhou, C. J., Lo, W. K. Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells. Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).
- Kuwabara, T. The maturation of the lens cell: a morphologic study. Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).
- Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G.
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).
- Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
- Lo, W. K., et al. Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).
- Cheng, C., et al. Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties. Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Kuszak, J. R.
- Bassnett, S., Costello, M. J. The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens. Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).
- Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice. Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).
- Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2 (2022).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. Journal of Visualized Experiments. (111), e53986 (2016).
- Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E. Anatomy of the eye and orbit. The Eye (Fourth Edition). Saunders, W. B. , 1 (2016).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).
- Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labeling for scanning electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
- Goldberg, M. W. High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex. Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).
- Hermann, R., Walther, P., Muller, M. Immunogold labeling in scanning electron microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
