Summary
이 프로토콜은 복잡한 세포 간 간지화 및 막 구조를 연구하기 위해 면역형광 염색을 위해 말초, 성숙 및 핵 수정체 섬유 세포를 준비하는 방법을 설명합니다.
Abstract
수정체는 눈의 전방에 있는 투명한 타원체 기관으로, 모양을 바꾸어 빛을 망막에 미세하게 집중시켜 선명한 이미지를 형성합니다. 이 조직의 대부분은 육각형 단면을 가지고 수정체의 전방에서 후방까지 뻗어 있는 전문적이고 분화된 섬유 세포로 구성되어 있습니다. 이 길고 가느다란 세포는 이웃 세포와 밀접하게 대립하며 세포의 길이를 따라 복잡한 간지(interdigitation)를 가지고 있습니다. 특수 연동 구조는 렌즈의 일반적인 생체역학적 특성에 필요하며 전자 현미경 기술을 사용하여 광범위하게 설명되었습니다. 이 프로토콜은 생쥐 렌즈 섬유 세포의 단수 및 다발을 보존하고 면역염색하여 복잡한 모양의 세포 내에서 단백질의 상세한 국소화를 가능하게 하는 첫 번째 방법을 보여줍니다. 대표적인 데이터는 수정체의 모든 영역에 걸쳐 말초, 분화, 성숙 및 핵 섬유 세포의 염색을 보여줍니다. 이 방법은 잠재적으로 다른 종의 렌즈로부터 분리된 섬유 세포에 사용될 수 있습니다.
Introduction
수정체는 눈의 전방에 있는 투명하고 난형적인 조직으로, 상피 세포와 섬유 세포의 두 가지 세포 유형으로 구성되어있습니다 1(그림 1). 수정체의 전방 반구를 덮고 있는 상피 세포의 단층이 있습니다. 섬유 세포는 상피 세포와 분화되어 수정체의 대부분을 구성합니다. 고도로 전문화된 섬유 세포는 수정체 주변부에서 수정체 중심까지 세포막 형태의 뚜렷한 변화를 특징으로 하는 신장, 분화 및 성숙 프로그래밍을 거칩니다 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , 수정체 핵이라고도 합니다. 다양한 거리에서 망막으로 들어오는 빛의 초점을 미세하게 맞추는 수정체의 기능은 강성 및 탄성 13,14,15,16,17,18,19를 포함한 생체역학적 특성에 따라 달라집니다. 렌즈 섬유의 복잡한 interdigitations는 가설을 세웠으며20,21 최근에는 렌즈 강성(lens stiffness)22,23에 중요한 것으로 나타났습니다.
그림 1: 렌즈 해부학적 구조와 렌즈 섬유의 대표적인 주사전자현미경(SEM) 이미지. 이 만화는 상피 세포의 전방 단층(하늘색으로 음영 처리)과 수정체 섬유 세포의 벌크 덩어리(흰색)의 세로(위에서 아래로) 전방 단층을 보여줍니다. 수정체의 중앙(분홍색으로 음영 처리)은 핵으로 알려져 있으며 고도로 압축된 섬유 세포로 구성되어 있습니다. 오른쪽에는 단면 만화가 벌집 패턴으로 포장된 렌즈 섬유의 길쭉한 육각형 세포 모양을 보여줍니다. 섬유 전지에는 2개의 넓은 면과 4개의 짧은 면이 있습니다. 하단의 대표적인 SEM 이미지는 렌즈의 서로 다른 깊이에 있는 렌즈 섬유 셀 사이의 복잡한 막 삽입을 보여줍니다. 오른쪽부터 렌즈 주변부에 새로 형성된 렌즈 섬유는 짧은 면을 따라 작은 돌출부가 있고 넓은 면을 따라 볼과 소켓이 있습니다(빨간색 상자). 성숙하는 동안 렌즈 섬유는 짧은 면을 따라 작은 돌출부(파란색 상자)로 장식된 큰 패들 도메인을 발달시킵니다. 성숙한 섬유 세포는 작은 돌출부로 묘사된 큰 패들 도메인을 가지고 있습니다. 이러한 연동 영역은 렌즈의 생체역학적 특성에 중요합니다. 수정체핵의 섬유세포는 짧은 면을 따라 작은 돌출부가 적고 복잡한 혀와 홈이 있는 인터디지테이션(보라색 상자)이 있습니다. 세포의 넓은 면은 구형막 형태를 나타냅니다. 만화는22,32에서 수정되었으며 축척에 맞게 그려지지 않았습니다. 스케일 바 = 3 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
수정체는 이전 세대의 섬유24,25 위에 겹쳐진 새로운 섬유 세포의 껍질을 추가하여 성장합니다. 섬유 전지는 길쭉한 육각형 단면 모양으로 2개의 넓은 면과 4개의 짧은 면이 있습니다. 이 세포는 수정체의 전방에서 후극까지 뻗어 있으며, 종에 따라 수정체 섬유의 길이는 수 밀리미터에 달할 수 있습니다. 이러한 길고 가느다란 세포의 구조를 지원하기 위해 넓은 면과 짧은 면을 따라 특수한 간지(interdigitation)가 맞물리는 구조를 만들어 수정체 모양과 생체역학적 특성을 유지합니다. 섬유 세포 분화 및 성숙 중 세포막 모양의 변화는 전자 현미경 (EM) 연구 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29에 의해 광범위하게 문서화되었습니다 . 새로 형성된 섬유 세포는 넓은 면을 따라 볼과 소켓이 있고 짧은 면을 따라 매우 작은 돌출부가 있는 반면, 성숙한 섬유는 짧은 면을 따라 맞물리는 돌출부와 패들이 있습니다. 핵 섬유는 혀와 홈의 간지(tongue-and-groove interdigitations)와 구상막 형태(globular membrane morphology)를 나타낸다. 이러한 복잡한 맞물리는 막에 필요한 단백질에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 섬유 세포의 단백질 국소화에 대한 이전 연구는 복잡한 세포 구조를 명확하게 시각화할 수 없는 렌즈 조직 절편에 의존했습니다.
이 연구는 복잡한 형태를 보존하고 세포막과 세포질 내에서 단백질에 대한 면역염색을 허용하기 위해 수정체 섬유 세포의 단일 및 다발을 고정하는 새로운 방법을 만들고 완성했습니다. 이 방법은 EM 연구의 데이터와 비교할 수 있는 세포막 구조를 충실하게 보존하고 특정 단백질에 대한 1차 항체로 염색할 수 있습니다. 우리는 이전에 분화 및 성숙을 겪는 면역 염색 된 피질 수정체 섬유를 가지고 있습니다22,23. 이 프로토콜에는 수정체 핵에서 섬유 세포를 염색하는 새로운 방법도 있습니다. 이 프로토콜은 섬유 세포 성숙 및 수정체 핵 압축 중 막 삽입의 형성 및 변화를 위한 메커니즘을 이해할 수 있는 문을 열어줍니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
생쥐는 인디애나 대학교 블루밍턴(Indiana University Bloomington)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 동물 프로토콜에 따라 관리되었습니다. 대표 데이터를 생성하는데 사용된 마우스는 C57BL6/J 배경의 대조군(야생형) 동물, 암컷, 생후 8-12주였다. 수컷과 암컷 쥐 모두 이 실험에 사용할 수 있는데, 이는 생쥐의 성별이 실험 결과에 영향을 미칠 가능성이 매우 낮기 때문이다.
1. 렌즈 해부 및 디캡슐레이션
- 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 "실험실 동물의 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)"와 해당 기관에서 승인한 동물 사용 프로토콜에 따라 쥐를 안락사시킵니다.
참고: 본 연구에서 마우스는 승인된 동물 프로토콜(인디애나 대학교)에 따라 CO2 과다 투여 후 자궁경부 탈구에 의해 안락사되었습니다. - 곡선형 집게를 사용하여 눈의 한쪽 면으로 눈 주위 조직을 눌러 눈을 소켓 밖으로 빼내어 쥐의 눈을 적출시킵니다. 그런 다음 눈 밑에 있는 집게를 닫고 들어 올려 소켓에서 눈을 제거합니다. 눈을 해부 트레이에 있는 신선한 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 옮깁니다.
- 초극세 가위로 시신경을 안구에 최대한 가깝게 자릅니다. 끝이 가늘고 곧은 핀셋을 눈 뒤쪽에 있는 시신경의 출구를 통해 안구에 조심스럽게 삽입합니다.
- 1.3단계에서 핀셋과 같은 위치에 가위를 조심스럽게 삽입하고 후방에서 각막-공막 접합부를 향해 절개를 시작합니다.
알림: 설치류 렌즈는 눈의 ~30%를 차지합니다. 핀셋이나 가위를 눈에 너무 깊숙이 삽입하면 우발적인 손상이 발생합니다. - 접합부의 절반 이상이 분리될 때까지 각막-공막 접합부를 따라 계속 절단합니다.
- 핀셋을 사용하여 각막을 부드럽게 눌러 수정체가 1.4단계와 1.5단계로 만든 절개를 통해 나올 수 있도록 합니다.
- 끝이 가는 직선 핀셋을 사용하여 렌즈에서 큰 조직 조각을 조심스럽게 제거합니다. 렌즈를 검사하여 적도 지역을 찾으십시오.
- 끝이 가는 직선 핀셋을 사용하여 렌즈를 얕게 뚫은 다음 렌즈 캡슐을 제거합니다. 수정체 섬유 세포의 질량은 그대로 유지되고 수정체 상피 단층은 수정체 캡슐에 부착된 상태로 유지됩니다. 렌즈 캡슐을 폐기하십시오.
2. 렌즈 단일 섬유 세포 염색
- 렌즈 섬유 세포 덩어리를 500μL의 갓 만든 1% 파라포름알데히드(PFA, 1x PBS) 용액이 있는 웰 플레이트에 옮기고 부드러운 너트레이션으로 4°C에서 밤새 샘플을 배양합니다(그림 2A).
참고: 주어진 용액의 부피는 48웰 플레이트에 최적화되어 있습니다. 다른 크기의 웰 플레이트 또는 튜브를 사용하는 경우 그에 따라 용액의 부피를 조정하십시오. 고정, 차단 및 세척(1x PBS에서 1x PTX, 0.1% Triton X-100) 용액을 10x PBS와 이중 증류수(ddH2O)로 최종 농도 1x PBS로 만들었습니다. - 렌즈 섬유 셀을 PFA가 1%인 60mm 접시에 옮깁니다. 날카로운 메스를 사용하여 전방 후방 축을 따라 섬유 세포 공을 반으로 나눕니다(그림 2B). 같은 축을 따라 반을 다시 반으로 잘라 4등분합니다.
참고: 전방-후방 축은 조직 덩어리에서 섬유 세포의 방향에 의해 쉽게 인식됩니다. - 직선 핀셋을 사용하여 렌즈 fiber cell quarters에서 핵 영역을 제거합니다(그림 2C).
참고: 설치류 렌즈에서 수정체 핵 영역은 단단하며 수정체의 중심은 부드러운 피질 섬유에서 쉽게 분리됩니다. - 수정체 피질 영역의 4분의 1을 실온(RT)에서 15분 동안 1% PFA 200μL로 부드럽게 흔듭니다(플레이트 셰이커에서 300rpm).
- 750μL의 1x PBS에서 각각 5분 동안 RT에서 부드럽게 흔들면서 조직 4분의 2를 두 번 세척합니다.
- 200μL의 차단 용액(5% 혈청, 0.3% Triton X-100, 1x PBS)을 사용하여 RT에서 1시간 동안 부드럽게 흔들면서 샘플을 차단합니다.
참고: 이 프로토콜의 대표 데이터의 경우, 샘플은 1차 또는 2차 항체로 염색되지 않았습니다. 블로킹 단계 후, 샘플을 밀 배아 응집체(WGA; 1:100) 및 팔로이딘(1:100)(재료 표 참조)으로 RT에서 3시간 동안 부드럽게 흔들고 빛으로부터 보호하면서 배양했습니다. 1차 항체 염색은 이전 간행물22,23에서 입증되었습니다. - 100 μL의 1차 항체 용액을 4°C에서 밤새 부드럽게 흔들어 배양합니다.
참고: 항체는 차단 용액에 희석됩니다. 조직 절편이 있는 슬라이드와 비교할 때 이러한 유형의 준비에는 더 많은 세포가 있습니다. 더 많은 세포를 염색할 수 있는 충분한 항체를 제공하기 위해 1차 항체 농도를 높여야 합니다. 조직 절편에 사용되는 항체 농도를 두 배로 늘리는 것이 좋습니다. 2차 항체도 마찬가지다. - 1x PTX(0.1% Triton X-100, 1x PBS)로 RT에서 각각 5분 동안 부드럽게 흔들면서 티슈 쿼터를 세 번 세척합니다.
- 섬유 세포를 100μL의 2차 항체/염료 용액으로 실온에서 3시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 이 단계와 후속 단계에서 빛을 차단하십시오.
참고: WGA, 팔로이딘 및 기타 형광 염료를 2차 항체 용액에 첨가하여 세포막, 세포골격 또는 기타 세포 기관을 동시에 라벨링하는 동시에 1차 항체를 라벨링할 수 있습니다. - 섬유 셀을 1x PTX로 RT에서 각각 5분 동안 부드럽게 흔들면서 4번 세척합니다.
- 조직 쿼터를 슬라이드로 옮기기 전에 플러스 충전 현미경 슬라이드에 한 방울 또는 50μL의 장착 매체를 추가합니다.
- 핀셋을 사용하여 섬유 세포를 서로 부드럽게 분리하고 세포 다발의 겹침을 제한하십시오.
- 마운팅 미디어의 샘플 위에 #1.5 커버슬립을 부드럽게 적용합니다. 장착 미디어는 커버슬립의 가장자리까지 퍼져야 합니다. 이것이 발생하지 않으면 커버슬립의 가장자리에 추가 장착 미디어를 추가하십시오. 커버슬립 가장자리 주위에 있는 과도한 장착 매체를 흡입하고 매니큐어를 사용하여 슬라이드의 커버슬립 가장자리를 밀봉합니다.
참고: 컨포칼 현미경 검사용으로 제조된 모든 유형의 장착 매체를 이러한 실험에 사용할 수 있습니다.
3. 수정체 핵 단일 섬유 세포 염색
- 섹션 1에 설명된 해부를 완료합니다.
- 수정체 섬유 세포의 볼에서 피질 섬유를 기계적으로 제거하고, 수정체핵을 남겨두고, 섬유 세포 덩어리를 젖은 장갑을 낀 손가락 끝으로 부드럽게 옮기고 조직 덩어리를 부드럽게 굴립니다.
참고: 마우스 렌즈에서 장갑을 낀 손가락 끝 사이로 수정체 섬유 세포의 볼을 굴리는 것은 경질 수정체 핵(28,30)에서 피질 섬유 세포를 제거하는 효과적인 방법입니다. 이러한 기계적 방법이 효과적이지 않은 렌즈의 경우, 피질 섬유 세포를 제거하기 위해 신중한 해부 또는 와류 방법(29)이 사용될 수 있다. - 렌즈 핵을 웰 플레이트에서 갓 만든 1% PFA 용액에 옮기고 부드럽게 흔들면서 4°C에서 밤새 배양합니다.
- 샘플을 PFA 1%가 함유된 60mm 접시에 옮기고 날카로운 메스를 사용하여 전방 후방 축을 따라 수정체 핵을 분할합니다. 조직 샘플을 다시 반으로 줄여 핵 분기를 생성합니다.
- 2.4-2.13 단계에 설명된 과정을 따라 면역염색 및 검체 장착을 수행합니다.
그림 2: 렌즈 섬유 세포의 준비 및 면역염색을 자세히 설명하는 그래픽 요약 . (A) 이 48웰 플레이트는 설명된 방법에 대한 샘플 플레이트 설정을 보여주기 위해 컬럼별로 색상으로 구분되어 있으며, 겸자를 사용하여 부드럽게 취급하여 다양한 면역염색 단계 간에 샘플을 쉽게 이동할 수 있습니다. 이 프로토콜의 대표 데이터는 1차 항체로 배양되지 않지만, 다이어그램에는 1차 항체 배양을 위한 컬럼이 포함되어 있으며, 세척용 웰은 흡인에 의해 사용된 세척 완충액을 제거한 후 재사용할 수 있습니다. (B) 수정체 섬유 세포 덩어리를 고정한 후 세포의 원래 구조를 보존하기 위해 전후 축(빨간색 점선)을 따라 조직을 분할합니다. 조직 덩어리가 반으로 줄어들면 샘플이 회전하고 반쪽이 전방 후방 축(빨간색 점선)을 따라 4등분으로 나뉩니다. (C) 수정체 핵 영역(분홍색)을 제거하는 것은 핀셋을 사용하여 피질 섬유 세포(파란색)에서 조밀한 중앙 조직을 파내는 데 쉽게 수행됩니다. 카툰 다이어그램은 부분적으로 BioRender.com 를 사용하여 만들어졌으며 축척에 맞게 그려지지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
수정체 섬유 세포는 수정체 피질(섬유와 성숙한 섬유를 분화)과 핵에서 제조되며, 세포는 F-액틴의 경우 팔로이딘으로, 세포막의 경우 WGA로 염색됩니다. 세포 다발 또는 단일 렌즈 섬유의 혼합물(그림 3)을 관찰하고 이미지화합니다. 수정체 피질에서 두 가지 유형의 세포가 발견됩니다(그림 3A). 수정체 주변부의 분화 섬유 세포는 직선이며 짧은 면을 따라 매우 작은 돌출부가 있습니다. 세포가 분화함에 따라 섬유 세포는 작은 맞물리는 돌출부로 물결 모양이 됩니다. 또한, 성숙 과정을 따라 섬유 세포는 작은 맞물리는 돌출부로 장식된 큰 패들을 발달시킵니다. 수정체핵은 마우스 렌즈에서 매우 작고 단단하며, 핵렌즈 섬유의 고정 및 염색 전에 부드러운 수정체 피 질을 기계적으로 제거하여 분리됩니다. 수정체핵에서 직경이 더 작고 저배율 이미지에서는 쉽게 볼 수 없는 미세한 막 구조를 가진 수정체 섬유 다발이 발견됩니다.
렌즈의 서로 다른 영역에서 렌즈 섬유 세포를 고배율 3D로 재구성한 결과(그림 3B), F-액틴과 WGA가 분화되고 성숙한 섬유 세포의 세포막에서 고도로 공국소화되어 있음을 알 수 있습니다. F-액틴은 분화되고 성숙한 섬유의 세포막을 따라 맞물리는 돌출부에 풍부합니다(그림 3B, 화살촉). 성숙한 섬유 세포는 큰 연동 패들을 발달시킵니다(그림 3B, 별표). WGA 염색은 특히 성숙한 섬유 세포에서 F-액틴 신호와 완전히 공국화되지 않으며, 이는 피질 액틴 네트워크가 세포막을 따라 모든 작은 구조를 지원하지 않는다는 것을 시사합니다. 뜻밖에도, F-액틴 네트워크가 핵섬유 세포의 세포질 내에 있다는 것이 밝혀졌다. F-액틴 신호는 핵섬유 세포막을 따라 돌출부(그림 3B, 화살표)로 확장되지만, 액틴 네트워크는 더 이상 세포막 근처나 돌출부 내에서 농축되지 않습니다. 핵 섬유 셀의 형태는 돌출부의 조직과 빈도가 감소하는 것 외에도 패들이 부족합니다.
그림 3: 렌즈의 서로 다른 영역에서 채취한 fiber cell의 bundle(low-magnification) 및 single(high-magnification) 이미지의 컨포칼 이미지. 세포는 WGA(세포막, 녹색), 팔로이딘(F-액틴, 빨간색) 및 DAPI(핵, 파란색)로 염색됩니다. (A) 이러한 제제에서, 수정체 섬유 세포의 다발은 종종 다른 영역에서 발견됩니다. 대뇌 피질 제제에는 분화하고 성숙한 섬유 세포가 있습니다. 이러한 서로 다른 세포는 뚜렷한 형태를 가지고 있어 쉽게 식별할 수 있습니다. 수정체 핵의 샘플에서는 fiber cell bundles와 dissociated fibers가 발견됩니다. 스케일 바 = 50 μm. (B) 단일 분화, 성숙 및 핵 섬유 셀을 통한 Z-스택을 수집하고 3D 렌더링을 사용하여 표시된 이미지를 재구성합니다. 분화되고 성숙한 섬유는 짧은면을 따라 많은 작은 돌출부를 가지고 있습니다 (화살촉은 선택된 것을 표시합니다). 이 작은 돌출부는 F-액틴을 위해 풍부합니다. 성숙한 섬유는 또한 큰 연동 패들 도메인(별표)을 가지고 있습니다. 핵 섬유에는 WGA에 의해 염색된 작은 멤브레인 포켓과 디봇이 있으며 짧은 면(화살표)을 따라 몇 개의 돌출부가 있습니다. 놀랍게도, F-액틴 네트워크는 이제 세포막에서 강화된 신호 없이 세포 세포질에 분포되어 있습니다. F-액틴 네트워크는 작은 돌출부로 확장됩니다. 눈금 막대 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
섬유 세포를 검사할 때 어떤 유형의 세포가 관찰되고 있는지에 대한 혼동을 피하기 위해 세포의 방향을 기록하는 것이 중요합니다. Z 스택은 셀을 통해 수집된 다음 3D 재구성을 사용하여 XY, XZ 및 YZ 평면에서 직교 2D 투영을 확인합니다. 이 준비에서 세포의 무작위 방향으로 인해 유리 슬라이드에서 세포가 완벽하게 평평하게 놓여 있지 않을 수 있습니다(그림 4). 이 대표 이미지의 모든 셀은 성숙한 렌즈 섬유이지만 각 셀은 XY 평면에서 크게 다른 모양을 가지고 있습니다. 초록색의 유사 세포는 패들과 돌출부가 보이는 넓은 면이 위로 향하고 있는 반면, 분홍색의 유사 세포는 짧은 면이 위로 향하게 놓여 있습니다. 이것은 XZ 평면에서 더 쉽게 시각화되어 XY 평면에 표시된 두 셀의 수직 방향을 보여줍니다. YZ 평면을 검사하면 XY 평면에서 분홍색으로 착색된 성숙한 섬유의 패들이 명확하게 표시됩니다.
그림 4: F-액틴에 대해 팔로이딘으로 염색된 단일 성숙 렌즈 섬유 세포 그룹을 통한 3D 공초점 z-스택의 직교 2D 투영(XY, XZ 및 YZ 평면). 두 개의 세포는 각 평면에서 식별을 위해 분홍색 또는 녹색으로 의사 색상이 지정됩니다. XY 평면에서 분홍색 셀은 짧은 면이 위를 향하도록 놓여 있는 반면, 녹색 셀은 넓은 면이 위를 향하도록 평평하게 놓여 있습니다. XZ 평면에서 분홍색 셀은 방향으로 기울어져 있고 녹색 셀은 유리 슬라이드와 평행한 것으로 관찰됩니다. YZ 평면에서는 분홍색 세포의 패들과 돌출부가 관찰되어 이 세포가 성숙한 섬유 세포임을 확인합니다. 눈금 막대 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
섬유의 두께가 약 2-4μm이기 때문에 25,31이므로 z-스택의 수집을 통해 세포질을 통해 세포 표면 또는 평면을 볼 수 있습니다(그림 5). 이것은 커버슬립과 거의 평행하고 셀의 넓은 면이 위를 향하는 셀에서 가장 잘 작동합니다. 이 성숙한 섬유 셀의 세포 표면은 WGA 신호를 관찰하여 이해할 수 있습니다(그림 5A). XZ 평면은 이 XY 평면이 셀의 넓은 쪽을 따라 있음을 명확하게 보여줍니다. 멤브레인을 따라 있는 작은 WGA+ 반점은 거친 세포 표면 형태를 시사합니다. 저노출 이미지에서 짧은 면을 따라 있는 작은 돌출부는 매우 풍부한 F-액틴 신호를 보여줍니다. 돌출부의 F-액틴 신호가 포화된 더 높은 노출에서는 세포막을 가로질러 미세한 망상 F-액틴 네트워크(별표)가 관찰됩니다. 성숙한 섬유의 세포질을 통해 XY 평면을 고려할 때(그림 5B), WGA 염색은 주로 세포막을 따라 관찰됩니다. 세포 표면에서 볼 수 있는 것과 유사하게, F-액틴은 짧은 면을 따라 돌출부에 풍부하며, 더 높은 노출(별표)에서 볼 수 있는 망상 세포질 F-액틴 네트워크가 있습니다. 이전 연구에서는 세포 세포질22,23을 통해 XY 평면에서 막 단백질에 대한 염색을 보여주었지만 이 방법을 사용하면 넓은 측면 세포 표면을 따라 단백질을 국소화할 수도 있습니다.
그림 5: WGA(녹색)와 팔로이딘(F-actin, 빨간색)으로 염색된 단일 성숙한 섬유 셀을 통과하는 3D 공초점 z-스택의 직교 2D 투영(XY 및 XZ 평면). (A) 넓은 면을 따라 세포 표면에서 돌출된 것은 세포막을 따라 WGA를 보여주며, WGA의 반점은 막이 완전히 매끄럽지 않다는 것을 시사합니다. F-액틴은 짧은 면을 따라 돌출부에 풍부하게 함유되어 있으며, F-액틴 염색의 고노출 이미지는 세포막을 따라 그물 모양의 네트워크(별표)를 보여줍니다. (B) 동일한 세포의 세포질을 통과하는 다른 평면은 세포막을 따라 WGA를 보여주며 세포를 프레이밍합니다. F-액틴은 세포질(별표)을 통해 망상 네트워크를 형성하고 세포막을 따라 돌출부에 크게 농축됩니다. 스케일 바 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다음으로, 스캐닝 EM(SEM)과 염색 실험의 렌즈 섬유 이미지를 비교합니다. SEM 실험은 전술한 바와 같이 수행되고(29), 이미지는 샘플의 중심에서 주변부로 순차적으로 촬영된다. 먼저, 짧은 면을 따라 작은 돌출부(그림 6, 화살표)가 있고 넓은 면을 따라 볼과 소켓(화살촉)이 있는 렌즈 섬유를 구별하는 것을 검사합니다. SEM 이미지(그림 6A)와 유사하게, 짧은 면을 따라 배향된 분화 섬유 다발에서 볼 및 소켓 간지는 셀의 넓은 면을 따라 확장되는 큰 돌출부와 홈입니다(그림 6B, 화살촉). 소켓(그림 6C, 화살촉)은 XY 및 XZ 직교 2D 투영의 셀을 단일 분화 렌즈 섬유에서 볼 때 발견됩니다. 짧은 면을 따라 맞물리는 작은 돌출부는 SEM 이미지(화살표)의 돌출부와 비교하여 이러한 염색된 렌즈 섬유 셀에서 충실하게 보존됩니다. 다음으로 성숙한 섬유 세포의 형태를 조사합니다(그림 7). SEM 이미지와 염색된 세포에는 세포의 넓은 면을 따라 작은 디봇이 있습니다(그림 7A,B, 화살촉). 아마도 이것들은 성숙 과정에서 줄어들고 있는 ball-and-socket interdigitations의 잔재일 것입니다. 작은 맞물리는 돌출부(화살표)로 장식된 큰 패들(별표)은 SEM의 세포와 염색된 성숙한 섬유 사이에서 비교할 수 있습니다. SEM 이미지의 세포에는 연동 돌출부가 세포막에 도킹되는 뚜렷한 홈도 있습니다(그림 7C, 화살촉). 이러한 홈은 염색된 세포에서도 볼 수 있으며 WGA 신호에 의해 채워집니다(그림 7D, 화살촉). 홈은 세포막에서 바깥쪽으로 돌출되지 않고 세포 세포질을 향해 안쪽으로 향하는 돌출부처럼 보일 수 있으며, F-액틴 염색 신호가 거의 없는 홈에서는 WGA 염색만 볼 수 있는 경우가 많습니다.
그림 6: 수정체 피질에서 섬유 세포를 분화하는 SEM 및 컨포칼 현미경 이미지. 컨포칼 현미경 검사용 섬유 셀은 WGA(녹색) 및 팔로이딘(F-actin, 빨간색)으로 염색됩니다. (A) 분화 렌즈 섬유 다발의 SEM은 세포의 짧은 면을 따라 작은 맞물리는 돌출부(화살표)와 함께 세포의 넓은 면을 따라 볼-소켓 간지(화살촉)를 보여줍니다. (B) 짧은 변에서 이미지화한 분화 섬유 다발의 공초점 이미지는 세포(화살촉)의 넓은 면을 따라 큰 공-소켓 간극을 보여줍니다. (C) 단일 분화 렌즈 섬유를 통한 직교 2D 투영(XY 및 XZ 평면)은 넓은 면을 따라 볼-소켓 삽입(화살촉)을 나타내고 짧은 면을 따라 작은 맞물리는 돌출부(화살표)를 보여줍니다. 스케일 바 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 수정체 피질에서 채취한 성숙한 섬유 세포의 SEM 및 컨포칼 현미경 이미지. 컨포칼 현미경 검사용 섬유 셀은 WGA(녹색) 및 팔로이딘(F-actin, 빨간색)으로 염색됩니다. (A) SEM 이미지에는 셀의 짧은 면을 따라 작은 돌출부(화살표)로 장식된 패들(별표)이 있는 두 개의 맞물리는 성숙한 섬유가 있습니다. 또한 세포의 넓은 면을 따라 작은 움푹 들어간 곳(화살촉)이 있습니다. 이것들은 아마도 볼-소켓 돌출부의 축소된 잔해일 것입니다. 스케일 바 = 5 μm. (B) 하나의 성숙한 렌즈 섬유를 통한 직교 2D 투영(XY 및 XZ 평면)에는 셀의 짧은 면을 따라 맞물리는 큰 패들(별표)과 작은 돌출부(화살표)가 있습니다. SEM 이미지의 움푹 들어간 부분과 유사한 작은 WGA+ 고리(화살촉)가 셀의 넓은 면을 따라 보입니다. 이러한 WGA+ 구조에는 F-액틴 염색이 없습니다. F-액틴은 대부분 작은 돌기의 세포막에서 농축되어 있으며 세포질에서 약한 망상 염색 패턴을 가지고 있습니다. 눈금 막대 = 5 μm. (C) 세포막(화살촉)에 많은 홈이 있는 성숙한 섬유의 SEM 이미지로, 인접 세포의 돌출부가 쉬고 맞물리는 곳입니다. 눈금 막대 = 2 μm. (D) WGA로 염색된 홈(화살촉)을 보여주는 방금 분리된 한 쌍의 성숙한 섬유. 홈은 F-액틴 염색이 풍부하지 않으며 맞물리는 구조로 바깥쪽으로 확장되는 것이 아니라 세포질을 향해 안쪽으로 뻗어나가는 돌출부처럼 보입니다. 눈금 막대 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마지막으로, 염색된 핵렌즈 섬유를 SEM 제제의 이미지와 비교합니다. 핵렌즈 섬유를 고정하고 염색하는 이 새로운 방법은 렌즈의 다양한 영역에 걸쳐 핵렌즈 섬유의 형태를 충실하게 보존합니다(그림 8). 핵섬유 전지는 짧은 면(화살표)을 따라 드물고 더 큰 맞물리는 돌출부를 가지고 있습니다. 가장 바깥쪽에 있는 핵수정체 섬유는 SEM과 염색된 세포 이미지 모두에서 볼 수 있듯이 거친 세포막 질감을 가지고 있습니다. 세포가 핵의 중심을 향해 더 압축됨에 따라 세포막을 따라 혀와 홈이 있는 삽입물(별표)이 나타나고 가장 안쪽의 핵 섬유는 SEM 이미지와 WGA 염색에서 감상할 수 있는 구형막 형태를 갖습니다. F-액틴은 더 이상 세포막에서 농축되지 않고 세포질을 채우고 돌출부로 약하게 확장되는 네트워크를 형성합니다.
그림 8: 핵렌즈 섬유 셀의 SEM 및 컨포칼 현미경 이미지. 컨포칼 현미경 검사용 섬유 셀은 WGA(녹색) 및 팔로이딘(F-actin, 빨간색)으로 염색됩니다. (A) 가장 바깥쪽 층에서 렌즈 중심을 향한 핵 섬유의 SEM 이미지는 세포의 짧은 면(화살표)에 드물고 더 큰 맞물리는 돌출부를 보여줍니다. 이 세포의 세포막은 거칠며, 가장 안쪽 세포에는 혀와 홈이 있는 간지(별표)와 구형막 형태가 있습니다. (B) 단일 핵 렌즈 섬유를 통한 컨포칼 z-스택의 3D 재구성은 짧은 면을 따라 돌출부(화살표), 텅 앤 그루브 삽입(별표), WGA 염색에서 명백한 거친 막 형태 등 SEM 이미지와 유사한 특징을 가지고 있습니다. F-액틴은 세포 세포질을 채우고 돌출부로 약하게 확장되는 네트워크를 형성합니다. 스케일 바 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜은 렌즈의 다양한 깊이에서 번들 또는 단일 렌즈 섬유 세포의 3D 멤브레인 형태를 충실하게 보존하는 고정, 보존 및 면역염색 방법을 입증했습니다. 염색된 렌즈 섬유는 렌즈 섬유 세포 형태를 연구하는 데 오랫동안 사용되어 온 SEM 제제와 비교됩니다. 결과는 두 제제 간의 유사한 멤브레인 구조를 보여줍니다. EM은 세포 형태 연구의 황금 표준으로 남아 있지만, 단백질33,34,35의 국소화를 위한 SEM 샘플에서 면역 표지는 더 까다로우며 이미지를 이미지화하려면 전자 현미경이 필요합니다. 이 면역염색 방법의 장점은 여러 표적을 한 번에 라벨링할 수 있고 컨포칼 현미경에서 이미지를 수집할 수 있다는 것입니다.
이 방법은 복잡한 세포 형태를 보존하지만 SEM은 유전적 돌연변이, 노화, 약물 치료 등으로 인해 대조군과 변경된 수정체 섬유 간의 간극을 비교하는 데 여전히 필요합니다. 면역염색 제제는 수정체 피질 또는 핵에서 슬라이드에 무작위로 분포된 세포의 혼합물을 생성합니다. 따라서, 세포의 형태가 변경되면, 염색을 위해 해리되기 전에 수정체에 세포가 위치했던 깊이를 식별하기가 더 어려울 수 있습니다. 이러한 경우, 더 높은 공간 정확도를 위해 렌즈 섬유의 더 작은 다발을 고정하고 염색한 후 렌즈를 관심 영역으로 더 해부해야 할 수도 있습니다. 또한 염색 결과를 SEM 이미지와 비교하여 면역 염색된 섬유가 변형된 세포의 형태를 보존하는지 확인해야 합니다.
이 새로 만들어진 방법을 사용하여 염색을 위해 핵 섬유 세포를 보존할 수도 있다는 것이 처음으로 밝혀졌습니다. 수정체를 고정하기 전에 수정체를 고정하기 전에 수정체를 제거하는 것이 중요한데, 그 이유는 수정체 전체를 고정할 때 고정제 침투가 수정체핵에 도달하지 않기 때문이다(27). 수정체핵을 분리하는 이 프로토콜의 방법은 더 부드러운 피질 수정체 섬유를 기계적으로 제거하는 것을 설명합니다. 이것은 설치류 렌즈에서 매우 단단하고 조밀한 수정체 핵(28,30,36)으로 인해 가능하다. 다른 종에서는 수정체 핵이 더 부드러워서 염색을 위해 해당 세포를 분리하기 위해 다른 방법이 필요할 수 있습니다. 이전에는, 기계적 제거에 의해 확실하게 분리될 수 없는 더 부드러운 수정체 핵을 가진 녹아웃 마우스 라인으로부터 피질 섬유 세포를 제거하기 위해 소용돌이 방법이 사용되었다29.
이러한 대표 데이터에서 1차 항체 염색을 입증하지는 못했지만, 이전에 1차 항체 및 적절한 2차 항체22,23을 사용하여 동일한 유형의 염색을 수행했습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 많은 막 단백질은 반점 신호를 가지고 있으므로 세포막 단백질의 국소화를 개선하고 세포 분화 및 성숙의 각 단계를 인식하기 위해 세포막을 명확하게 묘사하기 위해 대뇌 피질 섬유의 WGA 또는 F-actin 또는 핵 섬유의 WGA를 사용하는 것이 좋습니다. WGA 또는 F-액틴 염색은 관찰자가 접안렌즈를 사용하여 이미징에 적합한 세포를 쉽게 찾을 수 있도록 가시 채널(적색, 녹색 또는 청색)에 있어야 합니다. 이러한 유형의 멤브레인 염색은 또한 기계적으로 손상된 세포를 배제하기 위해 고정, 염색 및 장착 공정에서 세포의 손상을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 연구와 이전 연구(22,23)에서는 기계적으로 손상된 세포가 거의 관찰되지 않는다.
이 방법은 이미징을 위해 세포에 대한 인내심 있고 체계적인 검사가 필요합니다. 세포의 무작위 혼합은 언뜻 보기에는 상당히 어려울 수 있지만 일반적으로 최적의 방향으로 놓여 있는 세포를 찾을 수 있습니다. 이 방법은 다른 종에서 분리된 렌즈 섬유에 적용할 수 있습니다. 더 큰 렌즈에서는 면역염색 전에 세포의 여러 층을 분리하기 위해 신중한 절개를 사용할 수 있습니다. 요약하면, 이 연구는 섬유 다발 또는 단일 섬유 세포를 보존하여 복잡한 형태를 연구하고 이러한 특수 세포에서 단백질을 3D로 국소화할 수 있는 강력하고 신뢰할 수 있는 방법을 만들었습니다. 핵섬유 염색을 위한 이 독특한 프로토콜은 잘 연구되지 않은 수정체의 중심 섬유에 대한 새로운 연구 영역을 열어줍니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 미국 국립안과연구소(National Eye Institute)의 보조금 R01 EY032056(to CC)의 지원을 받았습니다. 저자들은 전자 현미경 이미지에 도움을 준 Scripps Research Core Microscopy Facility의 Theresa Fassel 박사와 Kimberly Vanderpool 박사에게 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
References
- Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
- Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).
- Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).
- Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens. Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).
- Lo, W. K., Harding, C. V. Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers. Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).
- Taylor, V. L., et al.
- Vrensen, G. F. Aging of the human eye lens-a morphological point of view. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).
- Vrensen, G. F., Duindam, H. J. Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations. Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation. Albrecht von Graefe's Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).
- Zhou, C. J., Lo, W. K. Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells. Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).
- Kuwabara, T. The maturation of the lens cell: a morphologic study. Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).
- Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G.
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).
- Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
- Lo, W. K., et al. Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).
- Cheng, C., et al. Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties. Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Kuszak, J. R.
- Bassnett, S., Costello, M. J. The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens. Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).
- Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice. Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).
- Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2 (2022).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. Journal of Visualized Experiments. (111), e53986 (2016).
- Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E. Anatomy of the eye and orbit. The Eye (Fourth Edition). Saunders, W. B. , 1 (2016).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).
- Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labeling for scanning electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
- Goldberg, M. W. High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex. Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).
- Hermann, R., Walther, P., Muller, M. Immunogold labeling in scanning electron microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
