Summary
Bu protokol, karmaşık hücreden hücreye interdigitasyonları ve membran mimarisini incelemek için periferik, olgun ve nükleer göz merceği fiber hücrelerini immünofloresan boyama için hazırlama yöntemlerini açıklar.
Abstract
Lens, gözün ön kamarasında bulunan ve net bir görüntü oluşturmak için ışığı retinaya ince bir şekilde odaklamak için şekil değiştiren şeffaf ve elipsoid bir organdır. Bu dokunun büyük kısmı, altıgen bir kesite sahip olan ve lensin ön kutuplarından arka kutuplarına kadar uzanan özel, farklılaşmış lif hücrelerinden oluşur. Bu uzun ve sıska hücreler, komşu hücrelere sıkı sıkıya karşıdır ve hücrenin uzunluğu boyunca karmaşık iç içe geçmelere sahiptir. Özel birbirine kenetlenme yapıları, lensin normal biyomekanik özellikleri için gereklidir ve elektron mikroskobu teknikleri kullanılarak kapsamlı bir şekilde tanımlanmıştır. Bu protokol, bu karmaşık şekilli hücreler içindeki proteinlerin ayrıntılı lokalizasyonuna izin vermek için tekil ve fare lens lifi hücrelerinin demetlerini korumak ve immün boyamak için ilk yöntemi gösterir. Temsili veriler, merceğin tüm bölgelerinde periferik, farklılaşan, olgun ve nükleer fiber hücrelerin boyandığını gösterir. Bu yöntem potansiyel olarak diğer türlerin lenslerinden izole edilen lif hücrelerinde kullanılabilir.
Introduction
Lens, gözün ön kamarasında epitelyal ve lif hücreleri 1 olmak üzere iki hücre tipinden oluşan şeffaf ve oval bir dokudur (Şekil 1). Lensin ön hemisferini kaplayan tek bir epitel hücresi tabakası vardır. Fiber hücreler epitel hücrelerinden ayrılır ve lensin büyük kısmını oluşturur. Son derece özelleşmiş lif hücreleri, lens çevresinden lens merkezinekadar hücre zarı morfolojisinde belirgin değişikliklerle işaretlenmiş bir uzama, farklılaşma ve olgunlaşma programlamasına tabi tutulur 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , lens çekirdeği olarak da bilinir. Merceğin retinaya çeşitli mesafelerden gelen ışığı ince odaklama işlevi, sertlik ve elastikiyetdahil olmak üzere biyomekanik özelliklerine bağlıdır 13,14,15,16,17,18,19. Lens liflerinin karmaşık interdigitasyonları20,21 olarak varsayılmıştır ve yakın zamanda lens sertliği22,23 için önemli olduğu gösterilmiştir.
Şekil 1: Lens anatomi diyagramları ve lens liflerinden temsili taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri. Karikatür, epitel hücrelerinin ön tek tabakasının (açık mavi gölgeli) uzunlamasına (yukarıdan aşağıya) ve lens lifi hücrelerinin (beyaz) toplu bir kütlesini göstermektedir. Merceğin merkezi (pembe gölgeli) çekirdek olarak bilinir ve oldukça sıkıştırılmış fiber hücrelerden oluşur. Sağ tarafta, enine kesitli bir karikatür, bal peteği deseninde paketlenmiş lens liflerinin uzatılmış altıgen hücre şeklini ortaya koyuyor. Fiber hücrelerin iki geniş kenarı ve dört kısa kenarı vardır. Alt kısımdaki temsili SEM görüntüleri, lensin farklı derinliklerindeki lens fiber hücreleri arasındaki karmaşık membran geçişlerini gösterir. Sağdan, lens çevresinde yeni oluşan lens fiberlerinin kısa kenarları boyunca küçük çıkıntıları ve geniş kenarı boyunca bilyeler ve yuvalar vardır (kırmızı kutular). Olgunlaşma sırasında, lens lifleri, kısa kenarlar (mavi kutular) boyunca küçük çıkıntılarla süslenmiş büyük kürek alanları geliştirir. Olgun lif hücreleri, küçük çıkıntılarla gösterilen büyük kürek alanlarına sahiptir. Bu birbirine kenetlenen alanlar, lensin biyomekanik özellikleri için önemlidir. Mercek çekirdeğindeki lif hücreleri, kısa kenarları boyunca daha az küçük çıkıntıya sahiptir ve karmaşık dil ve oluk aralarına (mor kutular) sahiptir. Hücrenin geniş kenarları küresel bir zar morfolojisi gösterir. Karikatür22,32'den değiştirildi ve ölçeğe göre çizilmedi. Ölçek çubuğu = 3 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Lens, önceki nesil liflerin üzerine bindirilmiş yeni lif hücrelerinin kabukları eklenerek büyür24,25. Fiber hücreler, iki geniş kenarı ve dört kısa kenarı olan uzun, altıgen bir kesit şekline sahiptir. Bu hücreler merceğin ön kutbundan arka kutbuna kadar uzanır ve türe bağlı olarak mercek liflerinin uzunluğu birkaç milimetre olabilir. Bu uzun ve ince hücrelerin yapısını desteklemek için, geniş ve kısa kenarlar boyunca özel interdigitasyonlar, lens şeklini ve biyomekanik özellikleri korumak için birbirine kenetlenen yapılar oluşturur. Fiber hücre farklılaşması ve olgunlaşması sırasında hücre zarı şeklindeki değişiklikler, elektron mikroskobu (EM) çalışmalarıile kapsamlı bir şekilde belgelenmiştir 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Yeni oluşan lif hücreleri, kısa kenarları boyunca çok küçük çıkıntılar ile geniş kenarları boyunca bilyeler ve yuvalara sahipken, olgun liflerin kısa kenarları boyunca birbirine kenetlenen çıkıntılar ve kürekler bulunur. Nükleer lifler, dil ve oluk arası sayısallıklar ve küresel zar morfolojisi gösterir. Bu karmaşık birbirine kenetlenen zarlar için gerekli olan proteinler hakkında çok az şey bilinmektedir. Fiber hücrelerde protein lokalizasyonu üzerine yapılan önceki çalışmalar, karmaşık hücre mimarisinin net bir şekilde görüntülenmesine izin vermeyen lens dokusu kesitlerine dayanıyordu.
Bu çalışma, karmaşık morfolojiyi korumak ve hücre zarındaki ve sitoplazmadaki proteinler için immün boyamaya izin vermek için tek ve demet lens lifi hücrelerini sabitlemek için yeni bir yöntem yarattı ve mükemmelleştirdi. Bu yöntem, EM çalışmalarından elde edilen verilerle karşılaştırılabilir hücre zarı mimarisini aslına uygun olarak korur ve spesifik proteinler için birincil antikorlarla boyamaya izin verir. Daha önce farklılaşma ve olgunlaşma geçiren immün kortikal lens lifleri vardı22,23. Bu protokolde, lens çekirdeğinden lif hücrelerini boyamak için yeni bir yöntem de vardır. Bu protokol, fiber hücre olgunlaşması ve lens çekirdeği sıkıştırması sırasında membran interdigitasyonlarındaki oluşum ve değişikliklerin mekanizmalarını anlamak için kapıyı açar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fareler, Indiana Üniversitesi Bloomington'daki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan bir hayvan protokolüne göre bakılmıştır. Temsili veri üretmek için kullanılan fareler, C57BL6 / J arka planında, dişi ve 8-12 haftalık kontrol (vahşi tip) hayvanlardı. Bu deney için hem erkek hem de dişi fareler kullanılabilir, çünkü farelerin cinsiyetinin deneyin sonucunu etkilemesi pek olası değildir.
1. Lens diseksiyonu ve dekapsülasyonu
- Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu"na ve kurum tarafından onaylanan hayvan kullanım protokollerine uyarak farelere ötenazi uygulayın.
NOT: Bu çalışma için, farelere CO2 doz aşımı ve ardından onaylanmış bir hayvan protokolüne (Indiana Üniversitesi) uygun olarak servikal çıkık ile ötenazi uygulandı. - Gözü yuvadan çıkarmak için forsepsin bir tarafı ile göz çevresindeki dokuya bastırarak kavisli forseps kullanarak farelerden gözleri enüklee edin. Ardından, gözün altındaki forsepsleri kapatın ve gözü yuvadan çıkarmak için kaldırın. Gözleri bir diseksiyon tepsisindeki taze 1x fosfat tamponlu saline (PBS) aktarın.
- Optik siniri ultra ince makasla göz küresine mümkün olduğunca yakın kesin. İnce uçlu, düz cımbızları, gözün arkasındaki optik sinirin çıkışından göz küresine dikkatlice sokun.
- Makası adım 1.3'teki cımbızla aynı yere dikkatlice yerleştirin ve arkadan kornea-skleral bileşkeye doğru bir kesi kesmeye başlayın.
NOT: Kemirgen lensler gözlerinin ~%30'unu kaplar. Cımbız veya makas gözün çok derinine sokulursa kazara hasar meydana gelir. - Kavşağın en az yarısı ayrılana kadar kornea-skleral bileşke boyunca kesmeye devam edin.
- Merceğin 1.4 ve 1.5 adımlarla yapılan kesiden çıkabilmesi için korneayı hafifçe itmek için cımbız kullanın.
- İnce uçlu, düz cımbız kullanarak lensteki büyük doku parçalarını dikkatlice çıkarın. Ekvator bölgesini bulmak için lensi inceleyin.
- İnce uçlu, düz cımbız kullanarak lensi sığ bir şekilde delin ve ardından lens kapsülünü çıkarın. Lens fiber hücrelerinin kütlesi bozulmadan kalacak ve lens epitel tek tabakası lens kapsülüne bağlı kalacaktır. Lens kapsülünü atın.
2. Lens tek fiber hücre boyama
- Lens fiber hücre kütlesini, 500 μL taze yapılmış %1 paraformaldehit (PFA; 1x PBS'de) çözeltisi içeren bir kuyu plakasına aktarın ve numuneleri gece boyunca 4 °C'de hafif nütasyon ile inkübe edin (Şekil 2A).
NOT: Verilen çözeltilerin hacimleri 48 oyuklu plakalar için optimize edilmiştir. Başka boyutta kuyu plakası veya tüpler kullanılıyorsa, çözeltilerin hacimlerini buna göre ayarlayın. Fiksasyon, blokaj ve yıkama (1x PTX, 1x PBS'de %0.1 Triton X-100) çözeltileri, 10x PBS ve çift damıtılmış su (ddH2O) ile 1x PBS'lik bir nihai konsantrasyona kadar yapıldı. - Lens fiber hücrelerini %1 PFA'lı 60 mm'lik bir kaba aktarın. Fiber hücre topunu ön-arka ekseni boyunca ikiye bölmek için keskin bir neşter kullanın (Şekil 2B). Çeyrek üretmek için yarımları aynı eksen boyunca tekrar ikiye bölün.
NOT: Anterior-posterior aks, doku kütlesindeki lif hücrelerinin yönü ile kolayca tanınır. - Çekirdek bölgesini lens lifi hücre bölgelerinden çıkarmak için düz cımbız kullanın (Şekil 2C).
NOT: Lens çekirdeği bölgesi kemirgen lenslerde serttir ve lensin merkezi daha yumuşak kortikal liflerden kolayca ayrılacaktır. - Lens korteks bölgesinin dörtte birini 200 μL %1 PFA'da oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak (bir plaka çalkalayıcıda 300 rpm) sonradan sabitleyin.
- Doku çeyreklerini 750 μL 1x PBS'de her biri 5 dakika boyunca RT'de hafifçe çalkalayarak iki kez yıkayın.
- RT'de 1 saat boyunca 200 μL bloke edici solüsyon (%5 serum, %0.3 Triton X-100, 1x PBS) kullanarak numuneleri hafifçe çalkalayarak bloke edin.
NOT: Bu protokoldeki temsili veriler için, numuneler birincil veya ikincil antikorlarla boyanmamıştır. Bloklama adımından sonra, numuneler buğday tohumu aglütinini (WGA; 1:100) ve falloidin (1:100) (Malzeme Tablosuna bakınız) ile RT'de 3 saat boyunca hafifçe çalkalama ve ışıktan korunma ile inkübe edildi. Primer antikor boyaması önceki yayınlardagösterilmiştir 22,23. - 100 μL primer antikor çözeltisi ile gece boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
NOT: Antikorlar, bloke edici çözelti içinde seyreltilir. Doku kesitli slaytlarla karşılaştırıldığında, bu tür preparatlarda daha fazla hücre vardır. Daha fazla hücreyi boyamak için yeterli antikor sağlamak için birincil antikor konsantrasyonları arttırılmalıdır. Doku kesitlerinde kullanılandan antikor konsantrasyonunun iki katına çıkarılması önerilir. Aynısı ikincil antikorlar için de geçerlidir. - Mendil çeyreklerini 1x PTX (%0.1 Triton X-100, 1x PBS) ile RT'de her biri 5 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak üç kez yıkayın.
- Fiber hücrelerini 100 μL ikincil antikor/boya çözeltisi ile RT'de 3 saat boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Bu ve sonraki adımlar sırasında numuneleri ışıktan koruyun.
NOT: WGA, falloidin ve diğer floresan boyalar, hücre zarının, hücre iskeletinin veya diğer organellerin aynı anda etiketlenmesi ve aynı zamanda birincil antikorun etiketlenmesi için ikincil antikor çözeltisine eklenebilir. - Fiber hücreleri, RT'de her biri 5 dakika boyunca 1x PTX ile dört kez hafifçe çalkalayarak yıkayın.
- Doku çeyreklerini slayda aktarmadan önce artı şarjlı bir mikroskop lamına bir damla veya 50 μL montaj ortamı ekleyin.
- Fiber hücrelerini birbirinden nazikçe ayırmak için cımbız kullanın ve hücre demetlerinin üst üste binmesini sınırlamaya çalışın.
- Montaj ortamındaki s'nin üzerine yavaşça #1.5 lamel uygulayın. Montaj ortamı, lamel kenarına yayılmalıdır; Bu olmazsa, lamel kenarına ek montaj ortamı ekleyin. Lamelin kenarındaki fazla montaj malzemelerini aspire edin ve lamel kenarlarını sürgü üzerinde kapatmak için oje kullanın.
NOT: Bu deneyler için konfokal mikroskopi için formüle edilmiş her türlü montaj ortamı kullanılabilir.
3. Lens çekirdeği tek lif hücre boyama
- Bölüm 1'de özetlenen diseksiyonu tamamlayın.
- Fiber hücre kütlesini ıslak, eldivenli parmak uçlarına nazikçe aktararak ve doku kütlesini nazikçe yuvarlayarak kortikal lifleri lens lifi hücrelerinin topundan mekanik olarak çıkarın, lens çekirdeğini bırakın.
NOT: Fare lenslerinde, lens lifi hücrelerinin topunu eldivenli parmak uçları arasında yuvarlamak, kortikal lif hücrelerinin sert lens çekirdeğinden çıkarılması için etkili bir yöntemdir28,30. Bu mekanik yöntemin etkili olmadığı lensler için, kortikal lif hücrelerini çıkarmak için dikkatli bir diseksiyon veya vorteksleme yöntemi29 kullanılabilir. - Lens çekirdeğini bir kuyu plakasında yeni yapılmış %1 PFA çözeltisine aktarın ve gece boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
- Numuneyi %1 PFA içeren 60 mm'lik bir tabağa aktarın ve lens çekirdeğini ön-arka eksen boyunca bölmek için keskin bir neşter kullanın. Çekirdek çeyrekleri üretmek için doku örneklerini tekrar yarıya indirin.
- İmmün boyama ve numune montajı için 2.4-2.13 adımlarında özetlenen süreci izleyin.
Şekil 2: Lens fiber hücrelerinin hazırlanmasını ve immün boyamayı detaylandıran grafik özet . (A) Bu 48 oyuklu plaka, tarif edilen yöntemler için bir numune plakası kurulumunu göstermek için kolonla renk kodludur, bu da forseps kullanılarak nazik bir şekilde işlenerek numunelerin çeşitli immün boyama adımları arasında kolay transferine izin verir. Bu protokol için temsili veriler bir primer antikor ile inkübe edilmese de, diyagram primer antikor inkübasyonu için bir kolon içerir ve yıkama için kuyucuklar, kullanılmış yıkama tamponları aspirasyonla çıkarıldıktan sonra yeniden kullanılabilir. (B) Lens lifi hücre kütlesinin sabitlenmesinden sonra, hücrelerin orijinal yapısını korumak için doku ön-arka eksen (kırmızı kesikli çizgiler) boyunca bölünür. Doku kütlesi yarıya indirildikten sonra, numuneler döndürülür ve yarımlar ön-arka eksen boyunca dörde bölünür (kırmızı kesikli çizgiler). (C) Lens çekirdeği bölgesinin (pembe renkte) çıkarılması, kortikal lif hücrelerinden (mavi renkte) yoğun merkezi dokuyu çıkarmak için cımbız kullanılarak kolayca yapılır. Karikatür diyagramları kısmen BioRender.com kullanılarak oluşturuldu ve ölçeğe göre çizilmedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lens lifi hücreleri, lens korteksi (farklılaşan lifler ve olgun lifler) ve çekirdekten hazırlanır ve hücreler, hücre zarı için F-aktin ve WGA için falloidin ile boyanır. Hücre demetlerinin veya tek mercek liflerinin bir karışımı (Şekil 3) gözlenir ve görüntülenir. Lens korteksinden iki tip hücre bulunur (Şekil 3A). Lens çevresindeki farklılaşan fiber hücreler düzdür ve kısa kenarları boyunca çok küçük çıkıntılar vardır. Hücre farklılaştıkça, lif hücreleri birbirine kenetlenen küçük çıkıntılarla dalgalı hale gelir. Ayrıca, olgunlaşma süreci boyunca, lif hücreleri, birbirine kenetlenen küçük çıkıntılarla süslenmiş büyük kürekler geliştirir. Mercek çekirdeği, fare merceklerinde oldukça kompakt ve serttir ve nükleer mercek liflerinin sabitlenmesi ve boyanmasından önce daha yumuşak mercek korteksinin mekanik olarak çıkarılmasıyla izole edilir. Mercek çekirdeğinden, çapı daha küçük olan ve düşük büyütmeli bir görüntüde kolayca görülemeyen ince zar yapılarına sahip mercek lifi demetleri bulunur.
Merceğin farklı bölgelerinden mercek lifi hücrelerinin yüksek büyütmeli 3D rekonstrüksiyonlarında (Şekil 3B), F-aktin ve WGA'nın farklılaşan ve olgun lif hücrelerinde hücre zarında yüksek oranda kolokalize olduğu bulunmuştur. F-aktin, farklılaşan ve olgun liflerde hücre zarı boyunca birbirine kenetlenen çıkıntılarda zenginleştirilmiştir (Şekil 3B, ok uçları). Olgun lif hücreleri, birbirine kenetlenen büyük kürekler geliştirir (Şekil 3B, yıldız işaretleri). WGA boyama, özellikle olgun lif hücresinde, F-aktin sinyali ile tamamen kolokalize değildir, bu da kortikal aktin ağının hücre zarı boyunca tüm küçük yapıları desteklemediğini düşündürür. Beklenmedik bir şekilde, F-aktin ağının nükleer fiber hücrelerin sitoplazması içinde olduğu bulunmuştur. F-aktin sinyali, nükleer fiber hücre zarı boyunca çıkıntılara (Şekil 3B, oklar) uzanırken, aktin ağı artık hücre zarının yakınında veya çıkıntıların içinde zenginleştirilmemiştir. Nükleer fiber hücrenin morfolojisi, çıkıntıların organizasyonunda ve sıklığında bir azalmaya ek olarak küreklerden yoksundur.
Şekil 3: Lensin farklı bölgelerinden demetlerin konfokal görüntüleri (düşük büyütmeli) ve fiber hücrelerin tekli (yüksek büyütmeli) görüntüleri. Hücreler WGA (hücre zarları, yeşil), falloidin (F-aktin, kırmızı) ve DAPI (çekirdekler, mavi) ile boyanır. (A) Bu preparatlarda, lens lifi hücrelerinin demetleri genellikle farklı bölgelerden bulunur. Kortikal preparatlarda farklılaşan ve olgunlaşan lif hücreleri vardır. Bu farklı hücreler, kolay tanımlamaya izin veren farklı morfolojilere sahiptir. Lens çekirdeğinden alınan örneklerde, lif hücre demetlerinin yanı sıra ayrışmış lifler bulunur. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Tek farklılaşan, olgun ve nükleer fiber hücreler aracılığıyla Z-yığınları toplanır ve gösterilen görüntüleri yeniden oluşturmak için 3B oluşturma kullanılır. Farklılaşan ve olgun liflerin kısa kenarları boyunca birçok küçük çıkıntı vardır (ok uçları seçilenleri işaretler). Bu küçük çıkıntılar F-aktin için zenginleştirilmiştir. Olgun lif ayrıca birbirine kenetlenen büyük kürek alanlarına (yıldız işaretleri) sahiptir. Nükleer lifler, WGA tarafından boyanmış küçük zar ceplerine ve bölmelere sahiptir ve kısa kenarları (oklar) boyunca birkaç çıkıntı tutar. Şaşırtıcı bir şekilde, F-aktin ağı artık hücre zarında zenginleştirilmiş sinyaller olmadan hücre sitoplazmasında dağılmıştır. F-aktin ağı küçük çıkıntılara kadar uzanır. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Fiber hücreler incelendiğinde, hangi tip hücrenin gözlemlendiği konusunda kafa karışıklığını önlemek için hücrelerin yönelimini not etmek önemlidir. Z yığınları hücreler aracılığıyla toplanır ve daha sonra XY, XZ ve YZ düzlemlerindeki ortogonal 2B projeksiyonlara bakmak için 3B rekonstrüksiyon kullanılır. Bu preparattaki hücrelerin rastgele oryantasyonu nedeniyle, cam slayt üzerinde tam olarak düz durmayan hücrelere sahip olmak mümkündür (Şekil 4). Bu temsili görüntüdeki tüm hücreler olgun mercek lifleridir, ancak her hücre XY düzleminde büyük ölçüde farklı bir görünüme sahiptir. Yeşil renkli hücre, görünür kürekler ve çıkıntılarla geniş tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirilirken, pembe renkli hücre kısa tarafı yukarı bakacak şekilde uzanır. Bu, XY düzleminde gösterilen iki hücrenin dikey yönelimlerini gösteren XZ düzleminde daha kolay görselleştirilir. YZ düzleminin incelenmesi, XY düzleminden pembe renkli olgun lifin küreklerini açıkça göstermektedir.
Şekil 4: F-aktin için falloidin ile boyanmış bir grup tek olgun lens fiber hücresi boyunca 3D konfokal z-yığınlarının ortogonal 2D projeksiyonları (XY, XZ ve YZ düzlemleri). İki hücre, her düzlemde tanımlama için pembe veya yeşil renkte sözde renklidir. XY düzleminde, pembe hücre kısa kenarı yukarı bakacak şekilde yatarken, yeşil hücre geniş kenarı yukarı bakacak şekilde düz yatar. XZ düzleminde, pembe hücrenin oryantasyonda eğildiği, yeşil hücrenin ise cam slayta paralel olduğu gözlenir. YZ düzleminde, pembe hücrelerin kürekleri ve çıkıntıları gözlemlenir ve bu hücrenin olgun bir lif hücresi olduğunu doğrular. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Lifler yaklaşık 2-4 μm kalınlığında25,31 olduğundan, hücre yüzeyini veya sitoplazma boyunca bir düzlemi görüntülemek z-yığınlarının toplanması yoluyla mümkündür (Şekil 5). Bu, hücrenin geniş tarafı yukarı bakacak şekilde, lamel ile neredeyse paralel olan hücrelerde en iyi sonucu verir. Bu olgun lif hücresindeki hücre yüzeyi, WGA sinyali gözlemlenerek takdir edilebilir (Şekil 5A). XZ düzlemi, bu XY düzleminin hücrenin geniş tarafı boyunca olduğunu açıkça göstermektedir. Zar boyunca küçük WGA+ punkta, pürüzlü bir hücre yüzeyi morfolojisi olduğunu gösterir. Düşük pozlamalı görüntülerde kısa kenar boyunca küçük çıkıntılar, büyük ölçüde zenginleştirilmiş bir F-aktin sinyali gösterir. Çıkıntılardaki F-aktin sinyalinin doygun olduğu daha yüksek maruziyette, hücre zarı boyunca (yıldız işaretleri) ince bir ağsı F-aktin ağı gözlenir. Olgun lifin sitoplazması yoluyla bir XY düzlemi düşünüldüğünde (Şekil 5B), WGA boyaması esas olarak hücre zarı boyunca gözlenir. Hücre yüzeyinde görülene benzer şekilde, F-aktin, daha yüksek maruziyette (yıldız işaretleri) görülebilen retiküle bir sitoplazmik F-aktin ağı ile kısa kenarlar boyunca çıkıntılarda zenginleştirilmiştir. Önceki çalışmamız, hücre sitoplazması22,23 yoluyla XY düzlemlerinde membran proteinlerinin boyandığını göstermiştir, ancak bu yöntemle, proteinleri geniş yan hücre yüzeyi boyunca lokalize etmek de mümkündür.
Şekil 5: WGA (yeşil) ve falloidin (F-aktin, kırmızı) ile boyanmış tek bir olgun fiber hücre boyunca 3D konfokal z-yığınlarının ortogonal 2D projeksiyonları (XY ve XZ düzlemleri). (A) Geniş kenar boyunca hücre yüzeyinden gelen çıkıntılar, hücre zarı boyunca WGA'yı gösterir ve WGA'nın punktası, zarın tamamen pürüzsüz olmadığını gösterir. F-aktin, kısa kenarlar boyunca çıkıntılarda zenginleştirilmiştir ve F-aktin boyamanın yüksek pozlamalı bir görüntüsü, hücre zarı boyunca ağsı bir ağ (yıldız işaretleri) ortaya çıkarır. (B) Aynı hücrenin sitoplazmasından geçen başka bir düzlem, hücre zarı boyunca WGA'yı gösterir ve hücreyi çerçeveler. F-aktin, sitoplazma (yıldızlar) boyunca ağsı bir ağ oluşturur ve hücre zarı boyunca çıkıntılarda büyük ölçüde zenginleştirilir. Ölçek çubukları = 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Daha sonra, tarama EM (SEM) ve boyama deneylerinden elde edilen lens liflerinin görüntüleri karşılaştırılır. SEM deneyleri daha önce tarif edildiği gibigerçekleştirilir 29 ve görüntüler numunenin merkezinden çevreye doğru sırayla alınır. İlk olarak, kısa kenarları boyunca küçük çıkıntılar (Şekil 6, oklar) ve geniş kenarları boyunca bir top ve yuva (ok uçları) ile ayırt edici mercek lifleri incelenmiştir. SEM görüntüsüne benzer şekilde (Şekil 6A), kısa kenarları boyunca yönlendirilmiş farklılaşan liflerden oluşan bir demet içinde, bilye-soket interdigitasyonları, hücrelerin geniş kenarı boyunca uzanan büyük çıkıntılar ve oluklardır (Şekil 6B, ok uçları). XY ve XZ ortogonal 2D projeksiyonlarındaki hücre, tek diferansiyel mercek liflerinde görüntülendiğinde bir soket bulunur (Şekil 6C, ok uçları). Kısa kenarlar boyunca birbirine kenetlenen küçük çıkıntılar da SEM görüntüsündekilere (oklar) kıyasla bu lekeli lens fiber hücrelerinde aslına uygun olarak korunur. Daha sonra, olgun lif hücrelerinin morfolojisi araştırılır (Şekil 7). SEM görüntüsünde ve lekeli hücrede, hücrelerin geniş kenarı boyunca küçük bölmeler vardır (Şekil 7A,B, ok uçları). Muhtemelen, bunlar olgunlaşma sürecinde küçülen top ve soket interdigitasyonlarının kalıntılarıdır. Birbirine kenetlenen küçük çıkıntılar (oklar) ile süslenmiş büyük kürekler (yıldızlar), SEM'deki hücreler ile lekeli olgun lif arasında karşılaştırılabilir. SEM görüntüsündeki hücreler ayrıca, hücre zarında birbirine kenetlenen bir çıkıntının kenetlendiği belirgin oluklara sahiptir (Şekil 7C, ok uçları). Bu oluklar, bu lekeli hücrelerde de görülebilir ve WGA sinyali ile doldurulur (Şekil 7D, ok uçları). Oluklar, hücre zarından dışa doğru çıkıntı yapmak yerine hücre sitoplazmasına doğru içe doğru giden çıkıntılar gibi görünebilir ve genellikle çok az F-aktin boyama sinyali olan oluklarda sadece WGA boyaması görülebilir.
Şekil 6: Lens korteksinden farklılaşan lif hücrelerinin SEM ve konfokal mikroskop görüntüleri. Konfokal mikroskopi için fiber hücreler WGA (yeşil) ve phalloidin (F-aktin, kırmızı) ile boyanır. (A) Farklılaşan mercek liflerinden oluşan bir demetin SEM'i, hücrelerin kısa kenarları boyunca birbirine kenetlenen küçük çıkıntılar (oklar) ile hücrelerin geniş kenarı boyunca top ve soket aralamalarını (ok uçları) gösterir. (B) Kısa kenarlardan görüntülenen bir farklılaşan lif demetinin konfokal görüntüleri, hücrelerin geniş kenarları (ok uçları) boyunca büyük top ve soket kesişimlerini gösterir. (C) Tek bir diferansiyel mercek fiberi aracılığıyla yapılan ortogonal 2D projeksiyonlar (XY ve XZ düzlemleri), geniş kenar boyunca bir top ve soket arası sayısallık (ok uçları) ve kısa kenar boyunca birbirine kenetlenen küçük çıkıntılar (oklar) gösterir. Ölçek çubukları = 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Lens korteksinden olgun lif hücrelerinin SEM ve konfokal mikroskop görüntüleri. Konfokal mikroskopi için fiber hücreler WGA (yeşil) ve phalloidin (F-aktin, kırmızı) ile boyanır. (A) SEM görüntüsü, hücrelerin kısa kenarları boyunca küçük çıkıntılar (oklar) ile süslenmiş kürekler (yıldızlar) ile birbirine kenetlenen iki olgun liflere sahiptir. Hücrenin geniş kenarı boyunca küçük girintiler (ok uçları) da vardır. Bunlar muhtemelen bilyeli ve soketli çıkıntıların küçülen kalıntılarıdır. Ölçek çubuğu = 5 μm. (B) Tek bir olgun mercek lifi aracılığıyla ortogonal 2D projeksiyonlar (XY ve XZ düzlemleri), hücrelerin kısa kenarları boyunca birbirine kenetlenen büyük küreklere (yıldızlar) ve küçük çıkıntılara (oklar) sahiptir. SEM görüntüsündeki girintilere benzer küçük WGA+ halkaları (ok uçları), hücrenin geniş kenarı boyunca görülür. Bu WGA+ yapılarında F-aktin boyaması yoktur. F-aktin çoğunlukla küçük çıkıntılarda hücre zarında zenginleştirilir ve sitoplazmada zayıf bir ağsı boyama paternine sahiptir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (C) Komşu hücrelerden gelen çıkıntıların durduğu ve birbirine kenetlendiği hücre zarında (ok uçları) birçok oluk gösteren olgun liflerin SEM görüntüsü. Ölçek çubuğu = 2 μm. (D) WGA tarafından boyanmış olukları (ok uçları) gösteren, yeni ayrılmış bir çift olgun lif. Oluklar, F-aktin boyama bakımından zenginleştirilmemiştir ve birbirine kenetlenen bir yapı olarak dışa doğru uzanmak yerine, sitozole doğru içe doğru uzanan çıkıntılar gibi görünür. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Son olarak, lekeli nükleer mercek lifleri, SEM preparatlarından elde edilen görüntülerle karşılaştırılır. Nükleer mercek liflerini sabitlemek ve boyamak için kullanılan bu yeni yöntem, merceğin farklı alanları boyunca nükleer mercek liflerinin morfolojisini aslına uygun olarak korur (Şekil 8). Nükleer lif hücreleri, kısa kenarları (oklar) boyunca seyrek ve daha büyük birbirine kenetlenen çıkıntılara sahiptir. En dıştaki nükleer mercek lifleri, hem SEM hem de lekeli hücre görüntülerinde görüldüğü gibi pürüzlü bir hücre zarı dokusuna sahiptir. Hücreler çekirdeğin merkezine doğru daha fazla sıkıştırmaya maruz kaldıkça, hücre zarı boyunca dil ve oluk interdigitasyonları (yıldız işaretleri) ortaya çıkar ve en içteki nükleer lifler, SEM görüntüsünde ve WGA boyamasında takdir edilebilecek küresel bir membran morfolojisine sahiptir. F-aktin artık hücre zarında zenginleştirilmemiştir, ancak sitoplazmayı dolduran ve çıkıntılara zayıf bir şekilde uzanan bir ağ oluşturur.
Şekil 8: Nükleer mercek lif hücrelerinin SEM ve konfokal mikroskop görüntüleri. Konfokal mikroskopi için fiber hücreler WGA (yeşil) ve phalloidin (F-aktin, kırmızı) ile boyanır. (A) En dış katmanlardan mercek merkezine doğru nükleer liflerin SEM görüntüleri, hücrelerin kısa kenarlarında seyrek ve daha büyük birbirine kenetlenen çıkıntıları ortaya çıkarır (oklar). Hücre zarı bu hücrelerde pürüzlüdür, en içteki hücrelerde dil ve oluk arası sayısallıklar (yıldızlar) ve küresel zar morfolojisi vardır. (B) Tek nükleer mercek lifleri aracılığıyla konfokal z-yığınlarının 3D rekonstrüksiyonları, kısa kenarlar boyunca çıkıntılar (oklar), dil ve oluk arası sayısallıklar (yıldızlar) ve WGA boyama ile görülen pürüzlü membran morfolojisi dahil olmak üzere SEM görüntüleriyle karşılaştırılabilir özelliklere sahiptir. F-aktin, hücre sitoplazmasını dolduran ve çıkıntılara zayıf bir şekilde uzanan bir ağ oluşturur. Ölçek çubukları = 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, lensin çeşitli derinliklerinden demetlerin veya tekil lens fiber hücrelerinin 3D membran morfolojisini aslına uygun olarak koruyan fiksasyon, koruma ve immün boyama yöntemlerini göstermiştir. Lekeli lens lifleri, lens lifi hücre morfolojisini incelemek için uzun süredir kullanılan SEM preparatları ile karşılaştırılır. Sonuçlar, her iki preparat arasında karşılaştırılabilir membran yapılarını göstermektedir. EM, hücre morfolojisini incelemek için altın standart olmaya devam etmektedir, ancak immüno-etiketleme, proteinleri33,34,35 lokalize etmek için SEM örneklerinde daha zordur ve görüntülenmesi için bir elektron mikroskobu gerektirir. Bu immün boyama yönteminin avantajı, aynı anda birden fazla hedefin etiketlenebilmesi ve görüntülerin konfokal bir mikroskopta toplanmasıdır.
Yöntem karmaşık hücre morfolojisini korurken, genetik mutasyon, yaşlanma, farmasötik tedaviler vb. nedeniyle kontrol ve değiştirilmiş lens lifleri arasındaki interdigitasyonları karşılaştırmak için SEM'e hala ihtiyaç vardır. İmmün boyama preparatı, lens korteksi veya çekirdeğinden slayt üzerinde rastgele dağılmış hücrelerin bir karışımını oluşturur. Bu nedenle, hücrelerin morfolojisi değiştirilirse, boyama için ayrışmadan önce hücrelerin mercekte bulunduğu derinliği ayırt etmek daha zor olabilir. Bu durumlarda, daha yüksek uzamsal doğruluk için daha küçük lens lifi demetlerinin sabitlenmesi ve boyanmasından sonra lensi ilgilenilen bölgelere daha fazla incelemek gerekebilir. İmmün boyanmış liflerin değiştirilmiş hücrelerin morfolojisini koruduğundan emin olmak için boyama sonuçları da SEM görüntüleriyle karşılaştırılmalıdır.
Yeni oluşturulan bu yöntem kullanılarak nükleer fiber hücrelerin de boyama için korunabileceği ilk kez gösterilmiştir. Çekirdeğin sabitlenmesinden önce lens korteksinin çıkarılması önemlidir, çünkü tüm lensi sabitlerken fiksatif penetrasyon lens çekirdeğine ulaşmaz27. Bu protokolün lens çekirdeğini izole etme yöntemi, daha yumuşak kortikal lens liflerinin mekanik olarak çıkarılmasını tanımlar. Bu, çok sert ve kompakt lens çekirdeği 28,30,36 nedeniyle kemirgen lenslerde mümkündür. Diğer türlerde, lens çekirdeği daha yumuşaktır ve bu hücreleri boyama için izole etmek için başka yöntemler gerektirebilir. Daha önce, kortikal lif hücrelerini, mekanik olarak çıkarılarak güvenilir bir şekilde izole edilemeyen daha yumuşak bir lens çekirdeğine sahip nakavt bir fare hattından çıkarmak için bir vorteksleme yöntemi kullanılıyordu29.
Bu temsili verilerde primer antikor boyaması göstermemiş olsak da, daha önce primer antikorlar ve uygun sekonder antikorlar22,23 ile aynı tip boyamayı gerçekleştirmiştik. Deneyimlerimize göre, zar proteinlerinin birçoğu noktasal bir sinyale sahiptir ve bu nedenle, hücre zarı proteinlerini daha iyi lokalize etmek ve hücre farklılaşmasının ve olgunlaşmasının her aşamasını tanımak için hücre zarını açıkça tanımlamak için kortikal liflerde WGA veya F-aktin veya nükleer liflerde WGA kullanılması önerilir. WGA veya F-aktin boyama, gözlemcinin göz merceğini kullanarak görüntüleme için uygun hücreleri kolayca bulmasını sağlamak için görünür bir kanalda (kırmızı, yeşil veya mavi) olmalıdır. Bu tip membran boyama, mekanik olarak hasar görmüş hücreleri dışlamak için sabitleme, boyama ve montaj işleminden hücrelere gelebilecek herhangi bir hasarı belirlemeye de yardımcı olabilir. Bu ve önceki çalışmalarda22,23, mekanik olarak hasar görmüş hücreler nadiren gözlenir.
Bu yöntem, görüntüleme için hücrelerin hasta ve sistematik olarak incelenmesini gerektirir. Rastgele hücre karışımı ilk bakışta oldukça ürkütücü olabilir, ancak en uygun yönde yatan hücreler genellikle bulunabilir. Bu yöntem, diğer türlerden izole edilen lens lifleri için uyarlanabilir. Daha büyük lenslerde, immün boyamadan önce farklı hücre katmanlarını ayırmak için dikkatli diseksiyon kullanmak mümkün olabilir. Özetle, bu çalışma, karmaşık morfolojilerini incelemek ve bu özel hücrelerde proteinleri 3D olarak lokalize etmek için lif demetlerini veya tek lif hücrelerini korumak için sağlam ve güvenilir bir yöntem oluşturmuştur. Nükleer fiber boyama için bu benzersiz protokol, lensin daha az çalışılmış merkezi liflerine yeni bir çalışma alanı açar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Göz Enstitüsü'nden R01 EY032056 (CC'ye) hibesi ile desteklenmiştir. Yazarlar, elektron mikroskobu görüntülerine yardımları için Scripps Araştırma Çekirdek Mikroskopi Tesisi'nden Dr. Theresa Fassel ve Kimberly Vanderpool'a teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
References
- Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
- Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).
- Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).
- Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens. Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).
- Lo, W. K., Harding, C. V. Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers. Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).
- Taylor, V. L., et al.
- Vrensen, G. F. Aging of the human eye lens-a morphological point of view. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).
- Vrensen, G. F., Duindam, H. J. Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations. Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation. Albrecht von Graefe's Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).
- Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).
- Zhou, C. J., Lo, W. K. Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells. Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).
- Kuwabara, T. The maturation of the lens cell: a morphologic study. Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).
- Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G.
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).
- Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
- Lo, W. K., et al. Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).
- Cheng, C., et al. Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties. Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Kuszak, J. R.
- Bassnett, S., Costello, M. J. The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens. Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).
- Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice. Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).
- Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2 (2022).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. Journal of Visualized Experiments. (111), e53986 (2016).
- Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E. Anatomy of the eye and orbit. The Eye (Fourth Edition). Saunders, W. B. , 1 (2016).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).
- Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labeling for scanning electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
- Goldberg, M. W. High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex. Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).
- Hermann, R., Walther, P., Muller, M. Immunogold labeling in scanning electron microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
